Summary
En allsidig mikrofluidisk enhet er beskrevet som muliggjør krystallisering av et enzym ved hjelp av motdiffusjonsmetoden, innføring av et substrat i krystallene ved bløtlegging, og 3D-strukturen bestemmelse av enzymet:substrat kompleks av en seriell analyse av krystaller inne i brikken ved romtemperatur.
Abstract
Utarbeidelsen av godt diffracting krystaller og deres håndtering før deres røntgenanalyse er to kritiske trinn i biokrystallografiske studier. Vi beskriver en allsidig mikrofluidisk chip som muliggjør produksjon av krystaller ved effektiv metode for motdypfusjon. Det konveksjonsfrie miljøet fra mikrofluidiske kanaler er ideell for krystallvekst og nyttig for å spre et substrat i det aktive stedet for det krystallinske enzymet. Her brukte vi denne tilnærmingen til CCA-legge enzymet i den psykiske bakterien Planococcus halocryophilus i det presenterte eksemplet. Etter krystallisering og substratdiffusjon/soaking ble krystallstrukturen til enzymet:substratkomplekset bestemt ved romtemperatur ved seriell krystallografi og analyse av flere krystaller rett inne i brikken. Hele prosedyren bevarer de ekte diffraksjonsegenskapene til prøvene fordi det ikke krever krystallhåndtering.
Introduction
Krystallografi er en metode for å tyde 3D-arkitekturen til biologiske makromolekyler. Sistnevnte er viktig å forstå hvordan et enzym velger og behandler sine substrater. Fastsettelsen av en krystallstruktur krever krystallisering av målet makromolekyl og kondisjonering av krystallene for deres analyse ved røntgendiffraksjon1. Både krystallforberedelse og håndtering er avgjørende, men delikate trinn som kan påvirke krystallkvalitet og diffraksjonsegenskaper, og dermed oppløsningen (det vil si nøyaktigheten) til den resulterende 3D-strukturen. For å lette utarbeidelsen av krystaller av høy kvalitet og eliminere unødvendig håndtering for å bevare deres diffraksjonsegenskaper, designet vi en brukervennlig og allsidig mikrofluidisk enhet kalt ChipX2,3,4.
I denne artikkelen vil vi demonstrere hvordan du laster proteinløsningen inn i ChipX-kanaler ved hjelp av konvensjonelt laboratoriemateriale for å forberede krystaller ved motdypfusjon. Denne krystalliseringsmetoden gir en effektiv screening av supermetning og potensielle kjerneforhold langs mikrofluidiske kanaler som inneholder enzymløsningen på grunn av konsentrasjonsgradienten som genereres av diffusjonen av krystalliseringsmiddelet5,6.
Chip oppsettet er enkelt, den bruker bare standard laboratoriepipetter og krever ikke noe kostbart utstyr. Når krystaller har vokst i ChipX, kan ligander av enzymet innføres ved diffusjon. Diffraksjonsdata samles deretter ved romtemperatur på en rekke krystaller som finnes i kanalene til brikken ved hjelp av en synchrotron røntgenkilde. Den strukturelle studien beskrevet her førte til bestemmelse av strukturer av et tRNA modningsenzym i sin apoform og i kompleks med en analog av CTP-substratet introdusert av soaking. Dette proteinet kalles CCA-tilføyende enzym polymeriserer CCA trinukleotid halen på 3 'slutten av tRNAs. Sammenligningen av de to 3D-bildene oppnådd ved seriekrystallografi avslører de lokale konformasjonsendringene knyttet til bindingen av ligande i forhold som er mer fysiologiske enn de som brukes i kryokrystallografi. Protokollen som er beskrevet i denne videoen, gjelder generelt for biomolekyl, det være seg et protein, en nukleinsyre eller et multikomponentkompleks.
Protocol
1. Sette opp krystalliseringsanalyser i ChipX
MERK: ChipX mikrofluidisk enhet kan fås fra forfatterne. En beskrivelse av brikken er gitt i figur 1. Løsninger som inneholder det krystalliske (eller krystalliserende middelet) som brukes til å utløse krystallisering, kan være av kommersiell opprinnelse eller utarbeidet av eksperimentereren.
- Laste biomolekylprøven
MERK: Prøvevolumet som faktisk kreves for å utføre en individuell motdypfusjonsanalyse i den rette delen av hver kanal av ChipX, er 300 nL. Men for enkelhets skyld foreslår vi å laste 5 μL for å fylle de åtte kanalene helt med hensyn til den variable lengden på deres buede seksjon og innløp døde volumer.- Pipet 5 μL av enzymløsninger ved hjelp av standard 10 μL pipet og tupp.
- Introder spissen vertikalt i prøveinntaket og injiser oppløsningen til de åtte kanalene er fylt opp til motsatt ende (oppføring av det krystallklare reservoaret).
- Injiser 1 μL parafinolje i prøveinntaket for å koble kanalene fra hverandre.
- Gjenopprett den ekstra løsningen i det krystallklare reservoaret på ekstremiteten til hver kanal ved hjelp av en standard 10 μL pipet.
- Forsegle prøveinntaket med et 1 cm x 1 cm stykke tape.
- Lasting av krystalliseringsløsningene
- Pipet 5 μL krystalliseringsløsning ved hjelp av standard 10 μL pipet og tupp. Reservoarvolumet er 10 μL, men lasting bare halvparten av det unngår overløp når tetting med tape og forenkler ytterligere tillegg av ligand for soaking eksperimenter. Hvis de første krystalliseringsforholdene ble oppnådd ved dampdiffusjon, øker du den krystallklare konsentrasjonen med en faktor på 1,5 - 2. Løsninger kan være forskjellige i hvert reservoar (i det presenterte tilfellet ble 1 M diammoniumhydrogenfosfat, 100 mM natriumacetat, pH 4,5 brukt gjennom).
- Orienter pipetspissen mot inngangen til kanalen i trakten formet en del av reservoaret for å unngå dannelse av en luftboble ved løsningsdeponering. Det ville hindre kontakten mellom de to løsningene og krystallventilen diffusjon inn i kanalen.
- Injiser den krystallklare oppløsningen i reservoaret.
- Forsegle reservoarene med et 2,5 cm x 1 cm stykke tape.
- Inkuber brikken ved 20 °C (temperaturen kan justeres avhengig av målet, vanligvis mellom 4 og 37 °C 4).
2. Proteinmerking med karboksyrhodamin for fluorescensdeteksjon
MERK: Dette trinnet er valgfritt. Det må utføres før prøvelasting for å lette påvisning av krystaller i brikken ved hjelp av fluorescens. Den detaljerte metoden for spor fluorescerende merking ble beskrevet av Pusey og kolleger7. Alle trinnene utføres ved romtemperatur.
- Oppløs 5 mg karboksyrhodamin esterpulver i 1 ml vannfri dimetylformamid, del oppløsningen i 0,6 μL aliquots som skal lagres ved -20 °C.
- Forbered en 1 M Na-borate pH 8,75 lagerløsning.
- Fortynn aksjen for å klargjøre reaksjonsbufferen ved 0,05 M Na-borate pH 8,75.
- Skyll en avsaltingskolonne (7 kDa MWCO, 0,5 ml) med 800 μL reaksjonsbuffer.
- Sentrifuger kolonnen i 1 min ved 1400 x g, fjern filtratet.
- Gjenta denne operasjonen to ganger (trinn 2,4-2,5) for å vaske kolonnen.
- Deponer 80 μL protein i lagringsbufferen på kolonnen (proteinet kan fortynnes ned til 1 mg/ml for å øke volumet om nødvendig).
- Sentrifuger kolonnen i 1 min ved 1400 x g. Dette trinnet er ment å overføre proteinet fra lagringsbufferen til reaksjonsbufferen.
- Gjenopprett gjennomstrømningen (som inneholder proteinet i reaksjonsbufferen) og bland det med 0,6 μL karboksyrhodaminoppløsning.
- Inkuber 5 min ved romtemperatur.
- Skyll i mellomtiden kolonnen 3 x med lagringsbufferen, sentrifuger kolonnen i 1 min ved 1400 x g og kast filtratet.
- Deponer reaksjonsløsningen på kolonnen.
- Sentrifuger kolonnen i 1 min ved 1400 x g og gjenopprett gjennomstrømningen (det vil vil at oppløsningen av merket protein i lagringsbufferen).
- Supplere lagerproteinoppløsningen med 0,1-1 % (w/w) merket protein.
- Sett på ChipX-krystalliseringsanalysene som beskrevet i avsnitt 1.
- Kontroller tilstedeværelsen av proteinkrystaller i analysene ved å spenne fluorescerende sonde med en 520 nm bølgelengde lyskilde.
3. Krystallobservasjon
MERK: ChipX-enheten kan håndteres uten spesiell forsiktighet, selv med krystaller inni, unntatt hvis temperaturen må kontrolleres.
- Bruk et hvilket som helst stereomikroskop for å kontrollere utfallet av krystalliseringsanalyser i ChipX. Fotavtrykket har standarddimensjonene til mikroskopsklier og er kompatibel med alle system- og glideholdere.
- Kontroller innholdet i mikrofluidiske kanaler fra reservoaret der den krystallklare konsentrasjonen er den høyeste til prøveinntaket der den krystalliske konsentrasjonen er den laveste. ChipX-materialet er gjennomsiktig for synlig lys, kompatibelt med bruk av polarisatorer, samt med UV-belysning for proteinkrystallidentifikasjon ved iboende tryptofanefluorescens8.
- Ta opp krystallposisjoner ved hjelp av etikettene preget langs kanalene eller merk krystallsteder med en permanent markør ved å tegne fargeprikker ved siden av dem på chipoverflaten.
4. Krystall soaking med ligands
MERK: Denne fremgangsmåten er valgfri. Den brukes til å introdusere ligands, enzym underlag eller tunge atomer i krystallene og bør utføres minst 24-48 h før røntgenanalyse for å tillate sammensatt diffusjon langs kanalene og inn i krystallene.
- Fjern forsiktig tetningstapen fra reservoarene.
- Legg til opptil 5 μL ligandløsning i ett eller flere reservoarer ved hjelp av en 10 μL mikropipe (i eksempel ble 3 μL på 10 mM cytidin-5'-[(α,β)-methyleno] trifosfat (CMPcPP) løsning lagt til for å oppnå en endelig konsentrasjon på 3,75 mM). CMPcPP er en ikke-hydrolizable analog av CTP, et naturlig substrat av enzymet.
- Forsegle reservoarene med et 2,5 cm x 1 cm stykke tape.
- Inkuber brikken under kontrollert temperatur i 24-48 timer for å tillate ligand diffusjon langs kanalene på brikken.
5. Krystallanalyse ved seriekrystallografi
MERK: Denne delen av protokollen må tilpasses avhengig av strålelinjeoppsettet og krystallenes diffraksjonsegenskaper. Kun generelle indikasjoner er gitt for den krystallografiske analysen basert på eksperimenter utført ved X06DA beamline (SLS, Villigen, Sveits).
- ChipX montering på beamline goniometer
MERK: Filen for 3D-utskrift av ChipX-holderen er angitt i ref4.- Slå av kryostrålen på strålelinjen. Analysen her utføres ved romtemperatur.
- Monter ChipX på en dedikert holder med kanalen som inneholder krystallene som skal analyseres plassert i midten av holderen. ChipX holder4 krever ingen skrue eller ekstra del, da den ble designet for å gi en perfekt passform for ChipX.
- Fest holderen til goniometeret.
- Datainnsamling
- Orienter det tykkeste laget (topplag, figur 1) av ChipX (i denne retningen etikettene langs kanalene er direkte lesbare ved hjelp av bjelkens sentreringskamera), mot den direkte strålen og det tynneste ansiktet bak krystallen for å minimere dempingen av det diffracted signalet som beskrevet i ref3.
- For å unngå kollisjon av ChipX med det omkringliggende materialet (beamstop, collimator), begrense goniometerbevegelser i området ±30° (0° tilsvarende kanalene som er vinkelrett på røntgenstrålen).
- Finn krystaller posisjon ved hjelp av etikettene preget langs kanalene.
- Velg en krystallposisjon.
- Midtstill krystallen enten ved standard lavdoserutenett/rasterscreening eller 1-klikks prosedyre (videoen viser et eksempel på rutenettscreening).
- Samle inn diffraksjonsdata innenfor området -30° / +30°.
- Start prosedyren på nytt ved trinn 5.2.4-5.2.6 på en annen krystall i samme kanal etter oversettelse av brikken.
- Manuell omstill en annen ChipX-kanal i midten av holderen og fortsett datainnsamling på krystaller som finnes i denne kanalen.
- Bruk standard krystallografiske pakker og prosedyrer for å behandle og slå sammen dataene, og deretter for å løse og avgrense strukturen.
Representative Results
Den mikrofluidiske brikken som er beskrevet her, ble designet for å muliggjøre enkelt oppsett av krystalliseringsanalyser og krystallanalyse ved romtemperatur. Prosedyren beskrevet ovenfor og i videoen ble brukt i rammen av den strukturelle karakteriseringen av CCA-tilsetningsenzymet fra den kaldtilpassede bakterien Planococcus halocryophilus. Dette enzymet tilhører en viktig polymerasefamilie som katalyserer sekvensiell tillegg av 3'CCA-sekvensen på tRNAs ved hjelp av CTP og ATP9,10.
Brikken ble først brukt til å forberede krystaller av enzymet for strukturell analyse ved metoden for motdypfusjon. For dette formål ble enzymoppløsningen lastet i de åtte mikrofluidiske kanalene (krystalliseringskamrene) ved en enkelt injeksjon i prøveinntaket på brikken (se figur 1). Enzymet ble brukt ved 5,5 mg/ml i lagringsbufferen som inneholdt 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 200 mM NaCl og 5 mM MgCl2. Dette trinnet ble utført manuelt med en standard 10 μL mikropipe. Krystalliseringsløsninger (100 mM natriumacetat pH 4,5,1 M diammoniumhydrogenfosfat) ble deretter deponert i reservoarene ved den andre ekstremiteten til kanalene.
Lasteprosedyren er enkel og tar ikke lengre tid enn fem minutter (figur 2). Krystallen sprer seg deretter inn i kanalene, skaper en gradient av konsentrasjon som utløser krystallkjerner og vekst. Denne gradienten utvikler seg dynamisk og utforsker et kontinuum av overmetningstilstander5,6 til den når en likevekt av krystalllig konsentrasjon mellom kanalene og reservoaret. Krystalliseringsanalyser kontrolleres vanligvis under micoscope over en periode på 2 - 4 uker for å spore veksten av krystaller. Bipyramidale krystaller av CCA-leggende enzym dukket opp gjennom kanalene etter noen dager med inkubasjon ved 20 °C (figur 3). Den valgfrie fluorescerendemerking 7 av proteinet forenkler i stor grad identifisering av proteinkrystaller og deres diskriminering fra saltkrystaller (figur 4).
Vi utnyttet det diffusive miljøet i chipkanaler for å levere et substrat til enzymet som bygger opp krystallene. I det foreliggende tilfellet ble CMPcPP, en CTP-analog, lagt til reservoarløsningene ved en endelig konsentrasjon på 3,75 mM (figur 5). Dette tillegget ble utført to dager før den krystallografiske analysen for å tillate CMPcPP å nå og okkupere det katalytiske stedet for enzymet, som senere bekreftet av krystallstrukturen (se nedenfor).
Vi produserte en sponholder (figur 6) i polylaktisk syre ved hjelp av en 3D-skriver. Holderen gjør det mulig å montere chip på goniometer ved hjelp av standard magnetiske hoder. Derfor kan brikken enkelt plasseres og oversettes i røntgenstrålen for å bringe krystallene i diffraksjonsposisjon. Datainnsamlingsstrategien må tilpasses avhengig av strålelinjeegenskaper og krystallegenskaper. I tilfelle av CCA-legge enzymet, data ble samlet inn på X06DA og X10SA strålelinjer, Swiss Light Source (SLS), med en røntgen bølgelengde på 1,0 Å og Pilatus 2M-F og 6M pixel detektorer, henholdsvis. 30-60° rotasjon ble samlet på hver krystall ved romtemperatur med bilder på 0,1° eller 0,2° og 0,1 s eksponering (se tabell 1). Delvise datasett ble behandlet individuelt og kuttet når oppløsningen av diffraksjonsmønstre begynte å forfalle på grunn av strålingsskader (oppdaget ved reduksjon av signal-til-støy-forhold 
og CC1/2, og en økning avR-mål i høyoppløsningsskallet). Fullstendige datasett ble rekonstituert ved å slå sammen data fra 5 krystaller (tabell 1). Krystallstrukturer ble avledet ved molekylær erstatning ved hjelp av standard krystallografiske pakker og prosedyrer for databehandling11 og raffinement12. Sammenligningen av enzymets strukturer og komplekset med CMPcPP avslører den lokale konformasjonstilpasningen som følger med substratbinding i det aktive stedet for CCA-tilføyende enzym (figur 7).
Figur 1: ChipX-design. Brikken består av et topplag laget av COC (tykkelse: 1 mm) der åtte mikrofluidiske kanaler og reservoarer er trykt. Hele brikken er forseglet med et lag med COC (tykkelse: 0,1 mm). Alle kanaler er koblet til et enkelt innløp på venstre side for samtidig prøveinjeksjon og til individuelle reservoarer på høyre side der krystalliseringsløsninger deponeres. Kanalene, som utgjør de faktiske krystalliseringskamrene til brikken, er 4 cm lange og har et tverrsnitt på 80 μm x 80 μm. Etiketter (A1, A2, A3, etc.) preget langs kanalene letter krystallposisjonering under mikroskopet og utarbeidelsen av en prøveliste for datainnsamling. ChipX har størrelsen på et standard mikroskopsklie (7,5 cm x 2,5 cm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sette opp krystalliseringsanalyser i ChipX. 1) Sett 5-6 μL enzymløsninger ved hjelp av standard 10 μL pipet og tupp. 2) Introder spissen vertikalt i prøveinntaket og injiser oppløsningen i de åtte kanalene. 3) Pipet 1 μL parafinolje. 4) Introder spissen vertikalt i prøveinntaket og injiser oljen for å koble kanalene fra hverandre. 5) Forsegle innløpet med et stykke tape. 6) Pipet 5 μL krystalliseringsløsning ved hjelp av standard 10 μL pipet og tupp. Løsningene kan være forskjellige i hvert reservoar (f.eks. fra et screeningsett). 7) Orienter pipetspissen mot inngangen til kanalen i trakten formet en del av reservoaret (for å unngå dannelse av en luftboble ved løsningsdeponering) og injiser den krystallklare oppløsningen i reservoaret. 8) Forsegle reservoarene med et stykke tape og inkubere brikken ved kontrollert temperatur. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Krystaller av CCA-tilføyende enzym dyrket ved motdypfusjon i mikrofluidiske kanaler av ChipX. Skalalinjen er 0,1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Crystal soaking prosedyre. 1) Fjern forsiktig båndet fra reservoarene. 2) Deponer opptil 5 μL ligand oppløsning ved hjelp av en 10 μL mikropipe. 3) Legg ligand til ett eller flere reservoarer. 4) Forsegle igjen reservoarene med et stykke tape og inkubere brikken under kontrollert temperatur i 24-48 timer før datainnsamling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Spor fluorescerende merking diskriminerer protein (venstre) fra salt (høyre) krystaller. Den CCA-tilføyende enzymoppløsningen inneholdt 0,4 % (w/w) protein merket med karboksyrhodamin. Til høyre lyser krystaller med en 520 nm bølgelengdelyskilde, og bildet er tatt med et lavpassfilter på 550 nm (LP550); (innfeltet) struktur av carboxyrhodamine-succinimidyl ester. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: (Venstre) Tegning av ChipX holderen og (Høyre) ChipX montert på goniometeret av beamline X06DA på SLS (Villigen, Sveits) for seriell krystallanalyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Sammenligning av CCA-legge til enzymaktivt sted i apoform (i rosa) og i komplekset med en CTP-analog (i grønt). Selv om den generelle konformasjonen av enzymet ikke påvirkes, er bindingen av CMPcPP ligand ledsaget av en liten omorganisering av sidekjeder på det aktive stedet. 2Fo-Fc elektron tetthet kartet (i blått) er formet på 1,2 sigma. Forskjellen elektron tetthet kart profilert på 4 sigma (i grønt) bekrefter tilstedeværelsen av ligand i det aktive stedet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Krystallisert prøve | CCA-tilføyende enzym | CCA-legge enzymet + CMPcPP |
| Krystall analyse | ||
| Røntgenstrålelinje | SLS – X06DA | SLS – X10SA |
| Bølgelengde (Å) | 1.000 | 1.000 |
| Temperatur (K) | 293 | 293 |
| Detektor | Pilatus 2M-F Leilighet | Pilatus 6M Leilighet |
| Avstand for krystalldetektor (mm) | 300 | 400 |
| Krystaller samlet | 6 | 14 |
| Krystaller valgt | 5 | 5 |
| Rotasjonsområde per bilde (°) | 0.1 | 0.2 |
| Eksponeringstid per bilde (er) | 0.1 | 0.1 |
| Nei. av bilder valgt | 1000 | 540 |
| Totalt rotasjonsområde (°) | 100 | 108 |
| Romgruppe | P43212 | P43212 |
| a, c (Å) | 71.5, 293.8 | 71.4, 293.6 |
| Gjennomsnittlig mosaikkitet (°) | 0.04 | 0.04 |
| Oppløsningsområde (Å) | 46 – 2.54 (2.6 – 2.54) | 48 – 2.3 (2.4 – 2.3) |
| Totalt antall nr. av refleksjoner | 176105 (9374) | 232642 (32937) |
| Nei. av unike refleksjoner | 23922 (1598) | 34862 (4066) |
| Fullstendighet (%) | 90.6 (84.6) | 99.5 (100.0) |
| Redundans | 7.5 (6.0) | 6.7 (8.1) |
|
8.1 (1.3) | 6.9 (0.7) |
| Rmeas (%) § | 18.6 (126.0) | 18.0 (231.2) |
| CC1/2 (%) | 98.7 (55.0) | 98.7 (46.9) |
| Total B faktor fra Wilson tomten (Å2) | 57.4 | 60.6 |
| Krystallografisk raffinement | ||
| Nei. av refleksjoner, arbeidssett / testsett | 23583 / 1180 | 34840 / 3405 |
| Endelig Rcryst (%) / Rgratis (%) | 18.8 / 21.4 | 20.0 / 22.9 |
| Nei. av ikke-H atomer: samlet / protein / ligand / løsemiddel | 2998 / 2989 / 0 / 9 | 3057 / 2989 / 29 / 10 |
| R.m avvik for obligasjoner (Å) / vinkler (°) | 0.009 / 1.23 | 0.010 / 1.22 |
| Gjennomsnittlig B faktorer (Å2): samlet / protein / ligand / løsningsmiddel | 60.1 / 60.1 / 0 / 52.7 | 62.5 / 62.6 / 60.1 / 55.5 |
| Ramachandran tomten: mest favorisert (%) / tillatt (%) | 98.1 / 1.9 | 97.2 / 2.8 |
| PDB-id | 6IBP | 6Q52 (andre kvartal 2015) |
Tabell 1: Statistikk for datainnsamling og avgrensing
§ Redundansuavhengige Rmeas = Σhkl(N/N-1)1/2Σi | Jegi(hkl)-
£ Data med lav i ytre skall (<2.0) var inkludert basert på CC1/2-kriteriet (korrelasjon mellom to tilfeldige halvdeler av datasettet > 50 %) som foreslått av Karplus & Diederichs 18.
Discussion
Nåværende protokoller i biokrystallografi innebærer fremstilling av krystaller ved hjelp av metoder som dampdiffusjon eller batch13,14,og deres overføring til en mikroloop for kryokjøling15,16 før du utfører diffraksjonsanalysen i en nitrogenstråle ved kryogene forhold. Direkte krystallkryokjøling er derimot ikke mulig i ChipX3, og krystaller kan ikke ekstraheres fra mikrofluidisk kanal, som kan ses på som begrensninger i dette oppsettet. Protokollen som er beskrevet i artikkelen, gir imidlertid en fullt integrert rørledning for bestemmelse av krystallstrukturer ved romtemperatur (det vil at i mer fysiologiske forhold). Selv om datainnsamling ved romtemperatur forårsaker en økning av strålingsskader19, motvirkes denne effekten av rask datainnsamlingstid (maksimalt 60 ° rotasjon samles på hver krystall) og ved sammenslåing av flere delvise datasett. Både ChipX design og materiale ble optimalisert for å redusere bakgrunnsspømming og diffraksjonssignal demping3,og datainnsamling kan utføres på krystaller med dimensjoner som tilsvarer halvparten av størrelsen på kanalene (40 μm)4.
For å oppsummere er de viktigste fordelene med protokollen følgende. Krystallene produseres i et konveksjonsfritt miljø (mikrofluidiske kanaler), noe som er svært gunstig for veksten av krystaller av høy kvalitet. Motdypfusjonsmetoden implementert i ChipX er svært effektiv til å screene supermetningslandskapet; diffusjonen av krystalllanter inn i chipkanalen skaper en konsentrasjons- og supermetningsbølge som bidrar til å bestemme passende kjerne- og vekstforhold5. Krystaller håndteres aldri direkte, men analyseres in situ, inne i brikken, som bevarer deres ekte diffraksjonsegenskaper (det vil si at det ikke endrer krystallmosaikkitet ved fysisk interaksjon eller kryoooling)20. Diffraksjonsanalysen utføres på en rekke krystaller fordelt langs chipkanalene med lav doseeksponering for å minimere strålingsskader, og et fullstendig datasett er montert ved å slå sammen delvise data fra serien. Standardfotavtrykket og den enkle utformingen av ChipX vil i fremtiden tillate en fullstendig automatisering av in situ-datainnsamling ved hjelp av synchrotron- eller XFEL-anlegg. Alle trinnene i protokollen utføres i ChipX. Fra eksperimenterersynspunktet er chipoppsettet enkelt og enkelt å utføre med standard pipetter og krever ikke noe ekstra utstyr. Den trelignende kanaltilkoblingen ved prøveinntaket minimerer døde volumer i systemet, noe som er viktig når du arbeider med prøver som er vanskelige å rense eller som bare er tilgjengelige i begrenset antall.
Til slutt forenkler og effektivt miniaturizes prosessen med krystallisering ved motdiffusjon og krystallstrukturbestemmelse, slik at den kan gå fra prøven til 3D-strukturen i en enkelt enhet. Det er allment aktuelt og tilbyr en brukervennlig, kostnadseffektiv løsning for rutinemessige seriell biokrystallografi undersøkelser ved romtemperatur.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner den sveitsiske lyskilden (Villigen, Sveits) for stråletid tildeling til prosjektet på beamlines X10SA (PXII) og X06DA (PXIII), Alexandra Bluhm for hennes bidrag til struktur raffinement, Clarissa Worsdale for innspillingen av voiceover og François Schnell (Université de Strasbourg) for hans hjelp i videoredigering og SFX. Dette arbeidet ble støttet av det franske senteret National de la Recherche Scientifique (CNRS), Universitetet i Strasbourg, LabEx-konsortiet "NetRNA" (ANR-10-LABX-0036_NETRNA), en ph.d.-finansiering til R.dW fra Excellence-initiativet (IdEx) ved Universitetet i Strasbourg i rammen av det franske nasjonale programmet "Investissements d'Avenir", en ph.d.-finansiering til K.R. fra det fransk-tyske universitetet (UFA-DFH, gir nei. CT-30-19), Deutsche Forschungsgemeinschaft (gi nr. Mo 634/10-1). Forfatterne dro nytte av PROCOPE Hubert Curien samarbeidsprogram (det franske utenriksdepartementet og Deutscher Akademischer Austauschdienst).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axioscope A1 stereomicroscope | Zeiss | Crystal observation (step 3) | |
| Carboxyrhodamine succinimidyl ester | Invitrogen | C-6157 | Protein labeling (step 2) |
| CMPcPP | Jena Bioscience | NU-438 | Crystal soaking (step 4) |
| Crystal clear sealing tape | Hampton research | HR3-511 | ChipX sealing (step 1) |
| Parafin oil | Hampton research | HR3-411 | ChipX loading (step 1) |
| Ultimaker 2 extended+ | Ultimaker | 3D printer - Representative results | |
| UV light source | Xtal Concepts Gmbh | XtalLight100c | Crystal observation (step 3) |
| Zeba spin desalting column 7K MWCO | ThermoFisher Scientific | 89882 | Protein labeling (step 2) |
References
- Giegé, R., Sauter, C.
- Dhouib, K., et al. Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis. Lab on a Chip. 9 (10), 1412-1421 (2009).
- Pinker, F., et al. ChipX: A Novel Microfluidic Chip for Counter-Diffusion Crystallization of Biomolecules and in Situ Crystal Analysis at Room Temperature. Crystal Growth & Design. 13 (8), 3333-3340 (2013).
- de Wijn, R., et al. A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography. IUCrJ. 6 (3), 454-464 (2019).
- García-Ruiz, J. M.
- Otálora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., García-Ruiz, J. M. Counterdiffusion methods applied to protein crystallization. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).
- Pusey, M., Barcena, J., Morris, M., Singhal, A., Yuan, Q., Ng, J. Trace fluorescent labeling for protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (7), 806-814 (2015).
- Meyer, A., Betzel, C., Pusey, M. Latest methods of fluorescence-based protein crystal identification. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (2), 121-131 (2015).
- Betat, H., Rammelt, C., Mörl, M. tRNA nucleotidyltransferases: ancient catalysts with an unusual mechanism of polymerization. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (9), 1447-1463 (2010).
- Ernst, F. G. M., Erber, L., Sammler, J., Jühling, F., Betat, H., Mörl, M. Cold adaptation of tRNA nucleotidyltransferases: A tradeoff in activity, stability and fidelity. RNA Biology. 15 (1), 144-155 (2018).
- Kabsch, W.
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
- Dessau, M. A., Modis, Y.
- Sauter, C., Lorber, B., McPherson, A., Giegé, R. Crystallization - General Methods. International Tables of Crystallography, Vol. F, Crystallography of Biological Macromolecules. Arnold, E., Himmel, D. M., Rossmann, M. G. , 99-120 (2012).
- Garman, E. "Cool" crystals: macromolecular cryocrystallography and radiation damage. Current Opinion in Structural Biology. 13 (5), 545-551 (2003).
- Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4001 (2012).
- Diederichs, K., Karplus, P. A. Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. Nature Structural Biology. 4 (4), 269-275 (1997).
- Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking Crystallographic Model and Data Quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
- de la Mora, E., Coquelle, N., Bury, C. S., Rosenthal, M., Holton, J. M., Carmichael, I., Garman, E. F., Burghammer, M., Colletier, J. -P., Weik, M. Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 4142-4151 (2020).
- Nave, C. A.
