Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

एक एंजाइम का क्रिस्टलीकरण और संरचनात्मक निर्धारण: एक बहुमुखी माइक्रोफ्लुइडिक चिप में सीरियल क्रिस्टलोग्राफी द्वारा सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स

Published: March 20, 2021 doi: 10.3791/61972
Automatic Translation
1,4, 1,2, 3, 2, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Université de Strasbourg, Architecture et Réactivité de l’ARN, UPR 9002, CNRS, Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2Biochemistry and Molecular Biology, Institute for Biochemistry, Leipzig University, 3Paul Scherrer Institute, Swiss Light Source, 4European XFEL GmbH

Summary

एक बहुमुखी माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का वर्णन किया गया है जो काउंटर-प्रसार विधि का उपयोग करके एंजाइम के क्रिस्टलीकरण को सक्षम बनाता है, भिगोने से क्रिस्टल में सब्सट्रेट की शुरूआत, और एंजाइम का 3 डी संरचना निर्धारण: कमरे के तापमान पर चिप के अंदर क्रिस्टल के सीरियल विश्लेषण द्वारा सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स।

Abstract

उनके एक्स-रे विश्लेषण से पहले अच्छी तरह से विवर्तन क्रिस्टल और उनकी हैंडलिंग की तैयारी बायोक्रिस्टाग्राफिक अध्ययन के दो महत्वपूर्ण कदम हैं। हम एक बहुमुखी माइक्रोफ्लुइडिक चिप का वर्णन करते हैं जो काउंटर-प्रसार की कुशल विधि द्वारा क्रिस्टल के उत्पादन को सक्षम बनाता है। माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों द्वारा प्रदान किया गया संवहन मुक्त वातावरण क्रिस्टल विकास के लिए आदर्श है और क्रिस्टलीय एंजाइम की सक्रिय साइट में एक सब्सट्रेट को फैलाना उपयोगी है। यहां हमने प्रस्तुत उदाहरण में साइकोरोफिलिक जीवाणु प्लैनोकोकस हेलोक्रायोफिलस के सीसीए-एडिंग एंजाइम के लिए इस दृष्टिकोण को लागू किया। क्रिस्टलीकरण और सब्सट्रेट प्रसार/भिगोने के बाद, एंजाइम की क्रिस्टल संरचना: सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स को कमरे के तापमान पर धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी और चिप के अंदर सीधे कई क्रिस्टल के विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था। पूरी प्रक्रिया नमूनों के वास्तविक विवर्तन गुणों को बरकरार रखता है क्योंकि इसके लिए कोई क्रिस्टल हैंडलिंग की आवश्यकता नहीं होती है।

Introduction

क्रिस्टलोग्राफी जैविक मैक्रोमॉलिक्यूल्स के 3 डी आर्किटेक्चर को समझने की एक विधि है। उत्तरार्द्ध यह समझना महत्वपूर्ण है कि एक एंजाइम अपने सब्सट्रेट्स का चयन और प्रक्रिया कैसे करता है। क्रिस्टल संरचना के निर्धारण के लिए लक्ष्य मैक्रोमॉल्यूल के क्रिस्टलीकरण और एक्स-रे विवर्तन1द्वारा उनके विश्लेषण के लिए क्रिस्टल की कंडीशनिंग की आवश्यकता होती है। क्रिस्टल तैयारी और हैंडलिंग दोनों महत्वपूर्ण लेकिन नाजुक कदम हैं जो क्रिस्टल गुणवत्ता और विवर्तन गुणों को प्रभावित कर सकते हैं, और इस प्रकार, परिणामस्वरूप 3 डी संरचना का संकल्प (यानी, सटीकता) । उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल की तैयारी को सुविधाजनक बनाने और उनके विवर्तन गुणों को संरक्षित करने के लिए अनावश्यक हैंडलिंग को खत्म करने के लिए,हमने चिपएक्स2,3,4नामक उपयोगकर्ता के अनुकूल और बहुमुखी माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस तैयार किया।

इस लेख में, हम यह प्रदर्शित करेंगे कि काउंटर-प्रसार द्वारा क्रिस्टल तैयार करने के लिए पारंपरिक प्रयोगशाला सामग्री का उपयोग करके चिपएक्स चैनलों में प्रोटीन समाधान को कैसे लोड किया जाए। यह क्रिस्टलीकरण विधि क्रिस्टलाइजिंग एजेंट5,6के प्रसार से उत्पन्न एकाग्रता ढाल के कारण एंजाइम समाधान वाले एंजाइम समाधान वाले माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के साथ अतिसतर्क और संभावित नाभिक स्थितियों की एक कुशल स्क्रीनिंग प्रदान करती है ।

चिप सेटअप सरल है, यह केवल मानक प्रयोगशाला pipets का उपयोग करता है और किसी भी महंगे उपकरण की आवश्यकता नहीं है। जब चिपएक्स में क्रिस्टल बड़े हो गए हैं, तो एंजाइम के लिगामेंट्स को प्रसार द्वारा पेश किया जा सकता है। विवर्तन डेटा तो एक सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे स्रोत का उपयोग कर चिप के चैनलों में निहित क्रिस्टल की एक श्रृंखला पर कमरे के तापमान पर एकत्र कर रहे हैं । यहां वर्णित संरचनात्मक अध्ययन ने अपने एपीओ रूप में एक ट्रान परिपक्वता एंजाइम की संरचनाओं का निर्धारण किया और परिसर में भिगोने के द्वारा पेश किए गए अपने सीटीपी सब्सट्रेट के अनुरूप के साथ। सीसीए-एडिंग एंजाइम नामक यह प्रोटीन टीआरएनए के 3 ' अंत में सीसीए ट्राइन्यूक्लियोटाइड पूंछ को बहुलित करता है । धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी द्वारा प्राप्त दो 3 डी छवियों की तुलना उन स्थितियों में लिगांड के बंधन से संबंधित स्थानीय अनुरूप परिवर्तनों का पता चलता है जो क्रायो-क्रिस्टलोग्राफी में उपयोग किए जाने वाले लोगों की तुलना में अधिक शारीरिक हैं। इस वीडियो में वर्णित प्रोटोकॉल आम तौर पर किसी भी बायोमॉलिक्यूल पर लागू होता है, चाहे वह प्रोटीन हो, न्यूक्लिक एसिड हो या मल्टी-कंपोनेंट कॉम्प्लेक्स हो ।

Protocol

1. चिपएक्स में क्रिस्टलीकरण परख की स्थापना

नोट: चिपएक्स माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस लेखकों से प्राप्त किया जा सकता है। चिप का विवरण चित्र 1में दिया गया है । क्रिस्टलीकरण को ट्रिगर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले क्रिस्टललैंट (या क्रिस्टलाइजिंग एजेंट) वाले समाधान वाणिज्यिक मूल के हो सकते हैं या प्रयोगकर्ता द्वारा तैयार किए जा सकते हैं।

  1. बायोमॉलिक्यूल नमूना लोड करना
    नोट: नमूना मात्रा वास्तव में चिपएक्स के प्रत्येक चैनल के सीधे खंड में एक व्यक्तिगत काउंटर प्रसार परख प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक 300 nL है। हालांकि सुविधा के लिए हम अपने घुमावदार अनुभाग की चर लंबाई को ध्यान में रखते हुए आठ चैनलों को पूरी तरह से भरने के लिए 5 माइक्रोन लोड करने का सुझाव देते हैं और मृत मात्रा को इनलेट करते हैं।
    1. मानक 10 माइक्रोल पिपेट और टिप का उपयोग करके एंजाइम समाधानों का पिपेट 5 माइक्रोन।
    2. नमूना प्रवेश में खड़ी टिप का परिचय दें और समाधान इंजेक्ट करें जब तक कि आठ चैनल उनके विपरीत छोर (क्रिस्टललैंट जलाशय का प्रवेश) तक नहीं भरे जाते।
    3. चैनलों को एक दूसरे से डिस्कनेक्ट करने के लिए सैंपल इनलेट में पैराफिन ऑयल का 1 माइक्रोल इंजेक्ट करें।
    4. एक मानक 10 μL पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक चैनल के चरम पर क्रिस्टललैंट जलाशय में अतिरिक्त समाधान को ठीक करें।
    5. टेप के 1 सेमी x 1 सेमी टुकड़े के साथ नमूना इनलेट सील करें।
  2. क्रिस्टलीकरण समाधान लोड हो रहा है
    1. मानक 10 माइक्रोन पाइप और टिप का उपयोग करके क्रिस्टलीकरण समाधान के 5 माइक्रोन। जलाशय की मात्रा 10 माइक्रोल है, लेकिन इसे लोड करने से टेप के साथ सील करते समय ओवरफ्लो से बचा जाता है और प्रयोगों को भिगोने के लिए लिगामेंट को और अधिक बढ़ाने की सुविधा होती है। यदि वाष्प प्रसार द्वारा प्रारंभिक क्रिस्टलीकरण की स्थिति प्राप्त की गई थी, तो क्रिस्टललैंट एकाग्रता को 1.5 - 2 के कारक द्वारा बढ़ाएं। समाधान हर जलाशय में अलग हो सकते हैं (प्रस्तुत मामले में, 1 एम डायमोनियम हाइड्रोजन फॉस्फेट, 100 m सोडियम एसीटेट, पीएच 4.5 का उपयोग किया गया था)।
    2. समाधान जमाव पर एक हवा बुलबुला के गठन से बचने के लिए जलाशय के कीप के आकार के हिस्से में चैनल के प्रवेश की ओर पिपेट टिप ओरिएंट। यह चैनल में दो समाधान और क्रिस्टललैंट प्रसार के बीच संपर्क को रोकेगा।
    3. जलाशय में क्रिस्टललैंट समाधान इंजेक्ट करें।
    4. जलाशयों को 2.5 सेमी x 1 सेमी टेप के टुकड़े के साथ सील करें।
    5. चिप को 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (तापमान को लक्ष्य के आधार पर समायोजित किया जा सकता है, आमतौर पर 4 और 37 डिग्री सेल्सियस 4के बीच)।

2. फ्लोरेसेंस डिटेक्शन के लिए कार्बोक्सिरोडामाइन के साथ प्रोटीन लेबलिंग

नोट: यह कदम वैकल्पिक है। यह फ्लोरेसेंस का उपयोग कर चिप में क्रिस्टल का पता लगाने की सुविधा के लिए नमूना लोडिंग से पहले किया जाना चाहिए। फ्लोरोसेंट लेबलिंग का पता लगाने की विस्तृत विधि का वर्णन पुसी और सहकर्मियों द्वाराकियागया था । सभी कदम कमरे के तापमान पर किए जाते हैं।

  1. 1 मिलीग्राम निर्जल डिमेथाइल-फॉर्ममाइड में 5 मिलीग्राम कार्बोक्सिरोडामाइन एस्टर पाउडर को भंग करें, समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने के लिए 0.6 माइक्रोन एलिकोट में विभाजित करें।
  2. 1 एम ना-बोरेट पीएच 8.75 स्टॉक समाधान तैयार करें।
  3. 0.05 एम एनए-बोरेट पीएच 8.75 पर प्रतिक्रिया बफर तैयार करने के लिए स्टॉक को पतला करें।
  4. 800 माइक्रोन ऑफ रिएक्शन बफर के साथ एक डीसल्टिंग कॉलम (7 केडीए एमडब्ल्यूसीओ, 0.5 एमएल) कुल्ला करें।
  5. 1400 x g पर 1 मिनट के लिए कॉलम को सेंट्रलाइज करें, फिलट्रेट को हटा दें।
  6. कॉलम को धोने के लिए इस ऑपरेशन को दो बार दोहराएं (चरण 2.4-2.5)।
  7. कॉलम पर अपने स्टोरेज बफर में प्रोटीन के ८० μL जमा (प्रोटीन को जरूरत पड़ने पर वॉल्यूम बढ़ाने के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल तक पतला किया जा सकता है) ।
  8. 1400 x g पर 1 मिनट के लिए कॉलम सेंट्रलाइज करें। इस चरण का उद्देश्य प्रोटीन को अपने स्टोरेज बफर से रिएक्शन बफर में स्थानांतरित करना है।
  9. प्रवाह के माध्यम से ठीक (प्रतिक्रिया बफर में प्रोटीन युक्त) और यह कार्बोक्सिरोडामाइन समाधान के 0.6 μL के साथ मिश्रण।
  10. कमरे के तापमान पर 5 मिनट इनक्यूबेट।
  11. इस बीच, स्टोरेज बफर के साथ कॉलम 3 एक्स को कुल्ला करें, 1400 x g पर 1 मिनट के लिए कॉलम को अपकेंद्रित्र करें और फिलट्रेट को त्यागें।
  12. प्रतिक्रिया समाधान कॉलम पर जमा करें।
  13. 1400 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए कॉलम को अपकेंद्रित्र करें और प्रवाह-थ्रिल करें (यानी, इसके भंडारण बफर में लेबल प्रोटीन का समाधान)।
  14. लेबल वाले प्रोटीन के 0.1-1% (w/w) के साथ स्टॉक प्रोटीन समाधान को पूरक करें।
  15. सेटअप चिपएक्स क्रिस्टलीकरण परख के रूप में धारा 1 में वर्णित है ।
  16. 520 एनएम तरंगदैर्ध्य प्रकाश स्रोत के साथ फ्लोरोसेंट जांच को रोमांचक बनाकर परख में प्रोटीन क्रिस्टल की उपस्थिति की जांच करें।

3. क्रिस्टल अवलोकन

नोट: चिपएक्स डिवाइस को विशेष देखभाल के बिना संभाला जा सकता है, यहां तक कि अंदर क्रिस्टल के साथ, सिवाय इसके कि तापमान को नियंत्रित करने की आवश्यकता है।

  1. चिपएक्स में क्रिस्टलीकरण परख के परिणाम की जांच करने के लिए किसी भी स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करें। इसके पदचिह्न में माइक्रोस्कोप स्लाइड के मानक आयाम हैं और यह किसी भी सिस्टम और स्लाइड धारक के साथ संगत है।
  2. जलाशय से शुरू होने वाले माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों की सामग्री की जांच करें जहां क्रिस्टललैंट एकाग्रता नमूना इनलेट के लिए सबसे अधिक है जहां क्रिस्टललैंट एकाग्रता सबसे कम है। चिपएक्स सामग्री दृश्यमान प्रकाश के लिए पारदर्शी है, ध्रुवीकरण के उपयोग के साथ-साथ आंतरिक ट्रिप्टोफेन फ्लोरेसेंस8द्वारा प्रोटीन क्रिस्टल पहचान के लिए यूवी रोशनी के साथ संगत है।
  3. चैनलों के साथ उभरे लेबल का उपयोग करके क्रिस्टल की स्थिति रिकॉर्ड करें या चिप की सतह पर उनके बगल में रंग डॉट्स खींचकर एक स्थायी मार्कर के साथ क्रिस्टल स्थानों को चिह्नित करें।

4. लिगामेंट्स के साथ क्रिस्टल भिगोने

नोट: यह प्रक्रिया वैकल्पिक है। इसका उपयोग क्रिस्टल में लिगांड, एंजाइम सब्सट्रेट्स या भारी परमाणुओं को पेश करने के लिए किया जाता है और एक्स-रे विश्लेषण से पहले कम से कम 24-48 घंटे किया जाना चाहिए ताकि चैनलों के साथ और क्रिस्टल में यौगिक प्रसार की अनुमति दी जा सके।

  1. जलाशयों से सीलिंग टेप को धीरे-धीरे हटा दें।
  2. 10 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके एक या कई जलाशयों में लिगांड समाधान के 5 माइक्रोल जोड़ें (उदाहरण में, 10 एमएम साइटिडीन-5'-[α,β-मिथाइलेनो] ट्राइथोस्फेट (सीएमपीसीपी) समाधान 3.75 मीटर की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जोड़ा गया था। सीएमपीसीपी सीटीपी का एक गैर-हाइड्रोलिजेबल एनालॉग है, जो एंजाइम का एक प्राकृतिक सब्सट्रेट है।
  3. जलाशयों को 2.5 सेमी x 1 सेमी टेप के टुकड़े के साथ सील करें।
  4. चिप के चैनलों के साथ लिगांड प्रसार की अनुमति देने के लिए 24-48 घंटे के लिए नियंत्रित तापमान के तहत चिप को इनक्यूबेट करें।

5. धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी द्वारा क्रिस्टल विश्लेषण

नोट: प्रोटोकॉल के इस हिस्से को बीमलाइन सेटअप और क्रिस्टल के विवर्तन गुणों के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता है। X06DA बीमलाइन (एसएलएस, विलिगेन, स्विट्जरलैंड) पर किए गए प्रयोगों के आधार पर क्रिस्टलीय विश्लेषण के लिए केवल सामान्य संकेत दिए जाते हैं।

  1. बीमलाइन गोनियोमीटर पर बढ़ते चिपएक्स
    नोट: 3डी प्रिंटिंग के लिए फाइल चिपएक्स धारक रेफरी4में प्रदान की गई है ।
    1. बीमलाइन के क्रायो-जेट को बंद कर दें। यहां विश्लेषण कमरे के तापमान पर किया जाता है ।
    2. क्रिस्टल युक्त चैनल के साथ एक समर्पित धारक पर चिपएक्स माउंट धारक के केंद्र में तैनात विश्लेषण किया जाना है। चिपएक्स धारक4 को किसी भी पेंच या अतिरिक्त भाग की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि इसे चिपएक्स के लिए एक आदर्श फिट प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया था।
    3. धारक को गोनियोमीटर से अटैच करें।
  2. डेटा संग्रह
    1. चिपएक्स की सबसे मोटी परत (शीर्ष परत, चित्रा 1)को ओरिएंट करें (चैनलों के साथ इस अभिविन्यास लेबल में बीमलाइन के केंद्रित कैमरे का उपयोग करके सीधे पठनीय हैं), सीधे बीम और क्रिस्टल के पीछे सबसे पतले चेहरे की ओर, जैसा कि रेफरी3में वर्णित विवर्तित संकेत के क्षीणन को कम करने के लिए है।
    2. आसपास की सामग्री (बीमस्टॉप, कोलिमेटर) के साथ चिपएक्स की टक्कर से बचने के लिए, एक्स-रे बीम के लंबवत होने वाले चैनलों के अनुरूप ±30 डिग्री (0 डिग्री) में गोनियोमीटर आंदोलनों को प्रतिबंधित करें।
    3. चैनलों के साथ उभरे लेबल की मदद से क्रिस्टल की स्थिति का पता लगाएं।
    4. एक क्रिस्टल स्थिति का चयन करें।
    5. मानक कम खुराक ग्रिड/रैस्टर स्क्रीनिंग या 1-क्लिक प्रक्रिया द्वारा क्रिस्टल को केंद्रित करें (वीडियो ग्रिड स्क्रीनिंग का एक उदाहरण दिखाता है)।
    6. रेंज -30 डिग्री /+30° के भीतर विवर्तन डेटा एकत्र करें।
    7. चिप के अनुवाद के बाद एक ही चैनल में एक और क्रिस्टल पर कदम 5.2.4-5.2.6 पर प्रक्रिया पुनः आरंभ करें ।
    8. मैन्युअल रूप से धारक के केंद्र में एक और चिपएक्स चैनल को फिर से संगठित करें और इस चैनल में मौजूद क्रिस्टल पर डेटा संग्रह को ले जाएं।
    9. डेटा को संसाधित करने और विलय करने के लिए मानक क्रिस्टलीय पैकेज और प्रक्रियाओं का उपयोग करें, फिर संरचना को हल करने और परिष्कृत करने के लिए।

Representative Results

यहां वर्णित माइक्रोफ्लुइडिक चिप को कमरे के तापमान पर क्रिस्टलीकरण परख और क्रिस्टल विश्लेषण के आसान सेटअप को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। ऊपर और वीडियो में वर्णित प्रक्रिया को ठंडे अनुकूलित जीवाणु प्लोक्रिनोफिलस से सीसीए-जोड़ने वाले एंजाइम के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के फ्रेम में लागू किया गया था। यह एंजाइम एक आवश्यक बहुलक परिवार से संबंधित है जो सीटीपी और एटीपी9,10का उपयोग करके टीआरएनए पर 3 सीसीए अनुक्रम के अनुक्रम को उत्प्रेरित करता है।

चिप का इस्तेमाल सबसे पहले काउंटर-डिफ्यूजन की विधि से संरचनात्मक विश्लेषण के लिए एंजाइम के क्रिस्टल तैयार करने के लिए किया जाता था । इस उद्देश्य के लिए, एंजाइम समाधान चिप के नमूना इनलेट में एक इंजेक्शन द्वारा आठ माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों (क्रिस्टलीकरण कक्षों) में लोड किया गया था (चित्रा 1देखें)। एंजाइम का उपयोग इसके भंडारण बफर में 5.5 मिलीग्राम/एमएल पर किया गया था जिसमें 20 एमएम ट्रिस/एचसीएल पीएच 7.5, 200 एमसीएम एनएसीएल और 5 एमएमएम एमजीसीएल2शामिल थे। यह चरण मैन्युअल रूप से मानक 10 माइक्रोपिपेट के साथ किया गया था। क्रिस्टलीकरण समाधान (100 m सोडियम एसीटेट पीएच 4.5,1 एम डायमोनियम हाइड्रोजन फॉस्फेट) तब चैनलों के अन्य छोर पर जलाशयों में जमा किए गए थे।

लोडिंग प्रक्रिया सीधी है और इसमें पांच मिनट(चित्र 2)से अधिक समय नहीं लगता है। क्रिस्टललैंट फिर चैनलों में फैलता है, एकाग्रता का एक ढाल बनाता है जो क्रिस्टल नाभिक और विकास को ट्रिगर करता है। यह ढाल गतिशील रूप से विकसित होता है और चैनलों और जलाशय के बीच क्रिस्टलेंट एकाग्रता के संतुलन तक पहुंचने तक5,6 राज्यों के एक सातत्य की पड़ताल करता है। क्रिस्टलीकरण परख आम तौर पर क्रिस्टल के विकास को ट्रैक करने के लिए 2 -4 सप्ताह की अवधि में माइक्रोस्कोप के तहत जांच की जाती है। सीसीए-एडिंग एंजाइम के बिपिरामिडल क्रिस्टल 20 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 3)पर इनक्यूबेशन के कुछ दिनों के बाद पूरे चैनलों में दिखाई दिए। प्रोटीन के वैकल्पिक फ्लोरोसेंट लेबलिंग7 प्रोटीन क्रिस्टल की पहचान और नमक क्रिस्टल(चित्रा 4)से उनके भेदभाव की सुविधा प्रदान करता है।

हमने क्रिस्टल को बनाने वाले एंजाइम को सब्सट्रेट देने के लिए चिप चैनलों में डिफ्यूजिव वातावरण का दोहन किया । वर्तमान मामले में, सीएमपीसीपी, एक सीटीपी एनालॉग, 3.75 m(चित्रा 5)की अंतिम एकाग्रता पर जलाशय समाधान में जोड़ा गया था। यह अतिरिक्त क्रिस्टलीय विश्लेषण से दो दिन पहले किया गया था ताकि सीएमपीसीपी को एंजाइम की उत्प्रेरक साइट तक पहुंचने और कब्जा करने की अनुमति दी जा सके, जैसा कि बाद में क्रिस्टल संरचना द्वारा पुष्टि की गई (नीचे देखें)।

हमने 3डी प्रिंटर का उपयोग करके पॉलीलैक्टिक एसिड में एक चिप धारक(चित्रा 6)का निर्माण किया। धारक मानक चुंबकीय सिर का उपयोग कर गोनियोमीटर पर बढ़ते चिप सक्षम बनाता है । इसलिए चिप आसानी से तैनात किया जा सकता है और एक्स-रे बीम में अनुवाद के लिए विवर्तन स्थिति में क्रिस्टल लाने के लिए । डेटा संग्रह रणनीति को बीमलाइन विशेषताओं और क्रिस्टल गुणों के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता है। सीसीए जोड़ने वाले एंजाइम के मामले में, क्रमशः 1.0 Å और पिलाटस 2एम-एफ और 6M पिक्सल डिटेक्टरों के एक्स-रे तरंग दैर्ध्य के साथ X06DA और X10SA बीमलाइन, स्विस लाइट सोर्स (एसएलएस) में डेटा एकत्र किया गया था। 0.1 डिग्री या 0.2 डिग्री और 0.1 एस एक्सपोजर (तालिका 1 देखें) की छवियों के साथ कमरे के तापमान पर प्रत्येक क्रिस्टल पर 30-60 डिग्री रोटेशन एकत्र किए गए थे। आंशिक डेटासेट व्यक्तिगत रूप से संसाधित किए गए थे और कटौती की गई थी जब विकिरण क्षति के कारण विवर्तन पैटर्न का समाधान क्षय होना शुरू हो गया था (सिग्नल-टू-शोर अनुपात Equation 1 और सीसी1 /2की कमी और उच्च संकल्प खोल में आरमीस की वृद्धि) से पता चला। 5 क्रिस्टल(टेबल 1)से डेटा को मिलाकर पूर्ण डेटासेट का पुनर्गठन किया गया था। क्रिस्टल संरचनाएं आणविक प्रतिस्थापन द्वारा डेटा प्रोसेसिंग11 और शोधन12के लिए मानक क्रिस्टलीय पैकेज और प्रक्रियाओं का उपयोग करके प्राप्त की गई थीं। एंजाइम की संरचनाओं की तुलना और सीएमपीसीपी के साथ इसके परिसर की तुलना स्थानीय अनुरूप अनुकूलन का पता चलता है जो सीसीए-जोड़ने वाले एंजाइम(चित्र 7)की सक्रिय साइट में सब्सट्रेट बाध्यकारी के साथ होता है।

Figure 1
चित्रा 1:चिपएक्स डिजाइन। चिप में सीओसी (मोटाई: 1 मिमी) से बना एक शीर्ष परत होती है जिसमें आठ माइक्रोफ्लुइडिक चैनल और जलाशय अंकित होते हैं। पूरी चिप को सीओसी (मोटाई: 0.1 मिमी) की परत के साथ सील किया जाता है। सभी चैनल एक साथ नमूना इंजेक्शन के लिए बाएं हाथ की ओर एक ही इनलेट से जुड़े होते हैं और दाहिने हाथ की ओर व्यक्तिगत जलाशयों के लिए होते हैं जिसमें क्रिस्टलीकरण समाधान जमा किए जाते हैं। चैनल, जो चिप के वास्तविक क्रिस्टलीकरण कक्षों का गठन करते हैं, 4 सेमी लंबे होते हैं और 80 माइक्रोन x 80 माइक्रोन का क्रॉस सेक्शन होता है। चैनलों के साथ उभरे लेबल्स (A1, A2, A3, आदि) माइक्रोस्कोप के नीचे क्रिस्टल पोजिशनिंग और डेटा संग्रह के लिए एक नमूना सूची तैयार करने की सुविधा प्रदान करते हैं। चिपएक्स में एक मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड (7.5 सेमी x 2.5 सेमी) का आकार है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:चिपएक्स में क्रिस्टलीकरण परख स्थापित करना। 1) मानक 10 माइक्रोन पाइप और टिप का उपयोग करके एंजाइम समाधानों का 5-6 माइक्रोन जमा करें। 2) नमूना प्रवेश में खड़ी टिप परिचय और आठ चैनलों में समाधान सुई। 3) पैराफिन तेल का 1 माइक्रोल पिपेट। 4) नमूना प्रवेश में खड़ी टिप परिचय और एक दूसरे से चैनलों डिस्कनेक्ट करने के लिए तेल सुई। 5) टेप के एक टुकड़े के साथ इनलेट सील। 6) मानक 10 माइक्रोल पिपेट और टिप का उपयोग करके क्रिस्टलीकरण समाधान के 5 माइक्रोन। समाधान हर जलाशय में अलग हो सकता है (उदाहरण के लिए, एक स्क्रीनिंग किट से)। 7) जलाशय के कीप के आकार के हिस्से में चैनल के प्रवेश की ओर पिपेट टिप उन्मुख करें (समाधान जमाव पर हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए) और जलाशय में क्रिस्टल्ट समाधान इंजेक्ट करें। 8) जलाशयों को टेप के टुकड़े से सील करें और नियंत्रित तापमान पर चिप को इनक्यूबेट करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: चिपएक्स के माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में काउंटर-प्रसार द्वारा उगाए गए सीसीए-एडिंग एंजाइम के क्रिस्टल। स्केल बार 0.1 मिमी है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4:क्रिस्टल भिगोने की प्रक्रिया। 1) जलाशयों से धीरे-धीरे टेप हटा दें। 2) 10 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके लिगांड समाधान के 5 माइक्रोल तक जमा करें। 3) एक या कई जलाशयों में लिगामेंट जोड़ें। 4) टेप के एक टुकड़े के साथ जलाशयों को फिर से सील करें और डेटा संग्रह से पहले 24-48 घंटे के लिए नियंत्रित तापमान के तहत चिप को इनक्यूबेट करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:ट्रेस फ्लोरोसेंट लेबलिंग नमक (दाएं) क्रिस्टल से प्रोटीन (बाएं) भेदभाव करती है। सीसीए जोड़ने वाले एंजाइम समाधान में कार्बोक्सिरोडामाइन के साथ लेबल प्रोटीन का ०.४% (w/w) निहित था । दाईं ओर, क्रिस्टल को 520 एनएम तरंगदैर्ध्य प्रकाश स्रोत से प्रकाशित किया जाता है और छवि को 550 एनएम (एलपी 550) पर कम पास फिल्टर के साथ लिया जाता है; (इनसेट) कार्बोक्सिरोडामाइन-सक्सिनिमिडिल एस्टर की संरचना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:(बाएं) चिपएक्स धारक की ड्राइंग और (दाएं) चिपएक्स सीरियल क्रिस्टल विश्लेषण के लिए एसएलएस (विलिगेन, स्विट्जरलैंड) में बीमलाइन X06DA के गोनियोमीटर पर घुड़सवार । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7:पीसीए-जोड़ने एंजाइम सक्रिय साइट की तुलना एपीओ रूप में (गुलाबी में) और परिसर में सीटीपी एनालॉग (हरे रंग में) के साथ। यद्यपि एंजाइम की समग्र संरचना प्रभावित नहीं होती है, लेकिन सीएमपीसीपी लिगांड की बाध्यकारी सक्रिय साइट में साइड चेन के मामूली पुनर्गठन के साथ होती है। 2फो-एफसी इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र (नीले रंग में) 1.2 सिग्मा पर समोच्च है। 4 सिग्मा (हरे रंग में) पर समोच्च अंतर इलेक्ट्रॉन घनत्व नक्शा सक्रिय साइट में लिगामेंट की उपस्थिति की पुष्टि करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सघन नमूना सीसीए जोड़ने एंजाइम सीसीए-एंजाइम जोड़ना + सीएमपीसीपी
क्रिस्टल विश्लेषण
एक्स-रे बीमलाइन एसएलएस - X06DA एसएलएस - X10SA
तरंगदैर्ध्य (Å) 1.000 1.000
तापमान (कश्मीर) 293 293
वेक्षक पिलाटस 2एम-एफ पिलाटस 6M
क्रिस्टल डिटेक्टर दूरी (मिमी) 300 400
क्रिस्टल एकत्र 6 14
क्रिस्टल का चयन 5 5
प्रति छवि रोटेशन रेंज (°) 0.1 0.2
प्रति छवि एक्सपोजर समय (एस) 0.1 0.1
नहीं। चयनित छवियों की 1000 540
कुल रोटेशन रेंज (°) 100 108
अंतरिक्ष समूह पी 43212 पी 43212
ए, ग (Å) 71.5, 293.8 71.4, 293.6
मतलब मोज़ेकिटी (°) 0.04 0.04
संकल्प रेंज (Å) 46 – 2.54 (2.6 – 2.54) 48 – 2.3 (2.4 – 2.3)
कुल नहीं । प्रतिबिंबों की 176105 (9374) 232642 (32937)
नहीं। अद्वितीय प्रतिबिंब की 23922 (1598) 34862 (4066)
पूर्णता (%) 90.6 (84.6) 99.5 (100.0)
अतिरेक 7.5 (6.0) 6.7 (8.1)
Equation 1 8.1 (1.3) 6.9 (0.7)
Rmeas (%) § 18.6 (126.0) 18.0 (231.2)
CC1/2 (%) £ 98.7 (55.0) 98.7 (46.9)
विल्सन प्लॉट से कुल मिलाकर बी फैक्टर (Å2) 57.4 60.6
क्रिस्टलोग्राफिक परिष्करण
नहीं। प्रतिबिंब, वर्किंग सेट/टेस्ट सेट की 23583 / 1180 34840 / 3405
अंतिम Rcryst (%)/आरमुक्त (%) 18.8 / 21.4 20.0 / 22.9
नहीं। गैर-एच परमाणुओं का: समग्र/प्रोटीन/लिगांड/विलायक 2998 / 2989 / 0 / 9 3057 / 2989 / 29 / 10
बांड (Å) के लिए आर .m विचलन /कोण (°) 0.009 / 1.23 0.010 / 1.22
औसत बी कारक (Å2):समग्र/प्रोटीन/ligand/विलायक 60.1 / 60.1 / 0 / 52.7 62.5 / 62.6 / 60.1 / 55.5
रामचंद्रन प्लॉट: सबसे इष्ट (%)/अनुमति (%) 98.1 / 1.9 97.2 /  2.8
पीडीबी आईडी 6IBP 6Q52

तालिका 1:डेटा संग्रह और परिष्करण के आंकड़े

§ अतिरेक-स्वतंत्र Rmeas = Σhkl(N/N-1)1/2Σमैं | मैं(एचकेएल)- (hkl)>gt;| ΣएचकेएलΣआई आई(एचकेएल)जहां एन डेटा बहुलता 17है ।

£ बाहरी खोल (<2.0) में कम CC1/2 मापदंड के आधार पर शामिल किए गए थे (डेटासेट के दो यादृच्छिक हिस्सों के बीच सहसंबंध और 50%) जैसा कि कारप्लस एंड डेडरिच 18द्वारा प्रस्तावित किया गया है .

Discussion

बायोक्रिस्टॉलोग्राफी में वर्तमान प्रोटोकॉल में वाष्प प्रसार या बैच13,14जैसे तरीकों का उपयोग करके क्रिस्टल की तैयारी और क्रायोजेनिक स्थितियों में नाइट्रोजन जेट में विवर्तन विश्लेषण करने से पहले क्रायो-कूलिंग15,16 के लिए एक माइक्रोलूप में उनका हस्तांतरण शामिल है। इसके विपरीत, चिपएक्स3 में प्रत्यक्ष क्रिस्टल क्रायो-कूलिंग संभव नहीं है और क्रिस्टल को उनके माइक्रोफ्लुइडिक चैनल से नहीं निकाला जा सकता है, जिसे इस सेटअप की सीमाओं के रूप में देखा जा सकता है। हालांकि, लेख में वर्णित प्रोटोकॉल कमरे के तापमान पर क्रिस्टल संरचनाओं के निर्धारण के लिए एक पूरी तरह से एकीकृत पाइपलाइन प्रदान करता है (यानी, अधिक शारीरिक परिस्थितियों में)। हालांकि कमरे के तापमान पर डेटा संग्रह विकिरण क्षति19की वृद्धि का कारण बनता है, इस प्रभाव को तेजी से डेटा अधिग्रहण समय (प्रत्येक क्रिस्टल पर अधिकतम 60 डिग्री रोटेशन एकत्र किया जाता है) और कई आंशिक डेटासेट के विलय से प्रतिसंतुलित किया जाता है। पृष्ठभूमि बिखरने और विवर्तन सिग्नल तनुपन3को कम करने के लिए चिपएक्स डिजाइन और सामग्री दोनों को अनुकूलित किया गया था, और डेटा संग्रह क्रिस्टल पर किया जा सकता है जो चैनलों (40 माइक्रोन) 4 के आधे आकार के बराबरआयामोंके साथ किया जा सकता है।

संक्षेप में, प्रोटोकॉल के मुख्य फायदे निम्नलिखित हैं। क्रिस्टल एक संवहन मुक्त वातावरण (माइक्रोफ्लुइडिक चैनल) में उत्पादित होते हैं, जो उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल के विकास के लिए बहुत अनुकूल है। चिपएक्स में लागू काउंटर-प्रसार विधि सुपरसैचुरेशन परिदृश्य की स्क्रीनिंग में बहुत कुशल है; चिप चैनल में क्रिस्टलेंट के प्रसार एक एकाग्रता और सुपरसैचुरेशन वेव कि उचित नाभिक और विकास की स्थिति5निर्धारित करने में मदद करता है बनाता है . क्रिस्टल को कभी भी सीधे नहीं संभाला जाता है, लेकिन चिप के अंदर सीटू में विश्लेषण किया जाता है, जो उनके वास्तविक विवर्तन गुणों को बरकरार रखता है (यानी, शारीरिक बातचीत या क्रायोकूलिंग द्वारा क्रिस्टल मोज़ेकता को नहीं बदलता है)20। विवर्तन विश्लेषण विकिरण क्षति को कम करने के लिए कम खुराक जोखिम के साथ चिप चैनलों के साथ वितरित क्रिस्टल की एक श्रृंखला पर किया जाता है, और श्रृंखला से आंशिक डेटा को मिलाकर एक पूर्ण डेटासेट इकट्ठा किया जाता है। चिपएक्स के मानक पदचिह्न और सरल डिजाइन भविष्य में सिंक्रोट्रॉन या एक्सफेल सुविधाओं का उपयोग करके सीटू डेटा संग्रह में पूर्ण स्वचालन की अनुमति देंगे। प्रोटोकॉल के सभी कदम चिपएक्स में किए जाते हैं। प्रयोगकर्ता बिंदु-दृश्य से, चिप सेटअप मानक पिपेट के साथ प्रदर्शन करने के लिए सरल और आसान है और किसी अतिरिक्त उपकरण की आवश्यकता नहीं है। नमूना प्रवेश पर पेड़ की तरह चैनल कनेक्शन प्रणाली में मृत मात्रा को कम करता है, जो महत्वपूर्ण है जब नमूनों के साथ काम कर रहे है कि शुद्ध करने के लिए मुश्किल है या कि केवल सीमित मात्रा में उपलब्ध हैं ।

अंत में, चिपएक्स में लागू लैब-ऑन-ए-चिप दृष्टिकोण काउंटर-प्रसार और क्रिस्टल संरचना निर्धारण द्वारा क्रिस्टलीकरण की प्रक्रिया को सरल और कुशलता से कम करता है, जिससे नमूना से एक ही डिवाइस में इसकी 3 डी संरचना में जाने की अनुमति होती है। यह व्यापक रूप से लागू है और कमरे के तापमान पर नियमित धारावाहिक बायोक्रिस्टलोग्राफी जांच के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल, लागत प्रभावी समाधान प्रदान करता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने वीडियो संपादन और एसएफएक्स में अपनी सहायता के लिए वॉयसओवर और फ्रैंकोइस श्नेल (यूनीवर्सिट डी स्ट्रासबर्ग) की रिकॉर्डिंग के लिए, संरचना शोधन में उनके योगदान के लिए, क्लेरिसा वर्स्डेल, संरचना शोधन में उनके योगदान के लिए बीमलाइन X10SA (PXII) और X06DA (PXIII) पर परियोजना के लिए बीमटाइम आवंटन के लिए स्विस लाइट सोर्स (विलिगेन, स्विट्जरलैंड) को स्वीकार करते हैं। इस काम को फ्रेंच सेंटर नेशनल डी ला रेचेचे Scientifique (CNRS), स्ट्रासबर्ग विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था, LabEx कंसोर्टियम "NetRNA" (ANR-10-LABX-0036_NETRNA), फ्रेंच राष्ट्रीय कार्यक्रम "Investissements डी Avenir", फ्रांसीसी जर्मन विश्वविद्यालय (UFA-DFH, अनुदान नहीं) से केआर के लिए एक पीएचडी धन के फ्रेम में स्ट्रासबर्ग विश्वविद्यालय के उत्कृष्टता पहल (IdEx) से आरडब्ल्यू के लिए एक पीएचडी धन । सीटी-30-19), ड्यूश Forschungsgemeinschaft (अनुदान नहीं । मो 634/10-1) । लेखकप्रोप ह्यूबर्ट क्यूरेन सहयोग कार्यक्रम (फ्रांसीसी विदेश मंत्रालय और ड्यूशर अकादमीशर ऑस्टौश्डिएंस्ट) से लाभान्वित हुए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axioscope A1 stereomicroscope Zeiss Crystal observation  (step 3)
Carboxyrhodamine succinimidyl ester Invitrogen C-6157 Protein labeling (step 2)
CMPcPP Jena Bioscience NU-438 Crystal soaking (step 4)
Crystal clear sealing tape Hampton research HR3-511 ChipX sealing  (step 1)
Parafin oil Hampton research HR3-411 ChipX loading  (step 1)
Ultimaker 2 extended+ Ultimaker 3D printer - Representative results
UV light source Xtal Concepts Gmbh XtalLight100c Crystal observation  (step 3)
Zeba spin desalting column 7K MWCO ThermoFisher Scientific 89882 Protein labeling  (step 2)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giegé, R., Sauter, C. Biocrystallography: past, present, future. HFSP Journal. 4 (3-4), 109-121 (2010).
  2. Dhouib, K., et al. Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis. Lab on a Chip. 9 (10), 1412-1421 (2009).
  3. Pinker, F., et al. ChipX: A Novel Microfluidic Chip for Counter-Diffusion Crystallization of Biomolecules and in Situ Crystal Analysis at Room Temperature. Crystal Growth & Design. 13 (8), 3333-3340 (2013).
  4. de Wijn, R., et al. A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography. IUCrJ. 6 (3), 454-464 (2019).
  5. García-Ruiz, J. M. A supersaturation wave of protein crystallization. Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 149-155 (2001).
  6. Otálora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., García-Ruiz, J. M. Counterdiffusion methods applied to protein crystallization. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).
  7. Pusey, M., Barcena, J., Morris, M., Singhal, A., Yuan, Q., Ng, J. Trace fluorescent labeling for protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (7), 806-814 (2015).
  8. Meyer, A., Betzel, C., Pusey, M. Latest methods of fluorescence-based protein crystal identification. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (2), 121-131 (2015).
  9. Betat, H., Rammelt, C., Mörl, M. tRNA nucleotidyltransferases: ancient catalysts with an unusual mechanism of polymerization. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (9), 1447-1463 (2010).
  10. Ernst, F. G. M., Erber, L., Sammler, J., Jühling, F., Betat, H., Mörl, M. Cold adaptation of tRNA nucleotidyltransferases: A tradeoff in activity, stability and fidelity. RNA Biology. 15 (1), 144-155 (2018).
  11. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  12. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
  13. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein Crystallization for X-ray Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (47), e2285 (2011).
  14. Sauter, C., Lorber, B., McPherson, A., Giegé, R. Crystallization - General Methods. International Tables of Crystallography, Vol. F, Crystallography of Biological Macromolecules. Arnold, E., Himmel, D. M., Rossmann, M. G. , 99-120 (2012).
  15. Garman, E. "Cool" crystals: macromolecular cryocrystallography and radiation damage. Current Opinion in Structural Biology. 13 (5), 545-551 (2003).
  16. Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4001 (2012).
  17. Diederichs, K., Karplus, P. A. Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. Nature Structural Biology. 4 (4), 269-275 (1997).
  18. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking Crystallographic Model and Data Quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  19. de la Mora, E., Coquelle, N., Bury, C. S., Rosenthal, M., Holton, J. M., Carmichael, I., Garman, E. F., Burghammer, M., Colletier, J. -P., Weik, M. Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 4142-4151 (2020).
  20. Nave, C. A. Description of Imperfections in Protein Crystals. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 54 (5), 848-853 (1998).

Tags

बायोकेमिस्ट्री अंक 169 क्रिस्टलीकरण धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी 3 डी संरचना काउंटर-प्रसार चिपएक्स माइक्रोफ्लुइडिक्स सीसीए-जोड़ने वाले एंजाइम भिगोने सीडिंग
एक एंजाइम का क्रिस्टलीकरण और संरचनात्मक निर्धारण: एक बहुमुखी माइक्रोफ्लुइडिक चिप में सीरियल क्रिस्टलोग्राफी द्वारा सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Wijn, R., Rollet, K., Olieric,… More

de Wijn, R., Rollet, K., Olieric, V., Hennig, O., Thome, N., Noûs, C., Paulus, C., Lorber, B., Betat, H., Mörl, M., Sauter, C. Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip. J. Vis. Exp. (169), e61972, doi:10.3791/61972 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter