Summary
Skjelettmuskelregenerering er drevet av vev bosatt muskel stamceller, som er svekket i mange muskelsykdommer som muskeldystrofi, og dette resulterer i manglende evne til muskel å regenerere. Her beskriver vi en protokoll som tillater undersøkelse av muskelregenerering i sebrafiskmodeller av muskelsykdom.
Abstract
Skjelettmuskulaturen har en bemerkelsesverdig evne til å regenerere etter skade, som drives av obligatoriske vev bosatt muskel stamceller. Etter skade aktiveres muskelstammecellen og gjennomgår celleproliferasjon for å generere et basseng av myoblaster, som senere skiller seg ut for å danne nye muskelfibre. I mange muskelsløse forhold, inkludert muskeldystrofi og aldring, er denne prosessen svekket, noe som resulterer i manglende evne til muskel å regenerere. Prosessen med muskelregenerering i sebrafisk er høyt bevart med pattedyrsystemer som gir et utmerket system for å studere muskelstammecellefunksjon og regenerering, i muskelsvjerningsforhold som muskeldystrofi. Her presenterer vi en metode for å undersøke muskelregenerering i sebrafiskmodeller av muskelsykdom. Det første trinnet innebærer bruk av en genotypingsplattform som tillater bestemmelse av larvens genotype før det fremkaller en skade. Etter å ha bestemt genotypen, blir muskelen skadet ved hjelp av et nålestikk, hvoretter polariserende lysmikroskopi brukes til å bestemme omfanget av muskelregenerering. Vi gir derfor en høy gjennomstrømningsrørledning som gjør det mulig å undersøke muskelregenerering i sebrafiskmodeller av muskelsykdom.
Introduction
Skjelettmuskulatur står for 30-50% av kroppsmassen, og er ikke bare uunnværlig for bevegelse, men det fungerer også som et kritisk metabolsk og lagringsorgan1. Til tross for at den er postmitotisk, er skjelettmuskelen svært dynamisk og beholder en enorm regenerativ kapasitet etter skade. Dette tilskrives tilstedeværelsen av vev bosatt stamceller (også kalt satellittceller), plassert under basal lamina av myofibers og preget av transkripsjonsfaktorene parret boksprotein 7 (pax7) og / eller parret boksprotein 3 (pax3), blant annet2,3. Etter skade aktiveres satellittcellen og gjennomgår celleproliferasjon for å generere et basseng av myoblaster, som senere skiller seg ut for å danne nye muskelfibre. Den svært konserverte kaskaden av pro-regenerative signaler som regulerer satellittcelleaktivering og robust muskelreparasjon påvirkes under ulike forhold som myopatier og homeostatiskaldring 4,5.
En slik mangfoldig gruppe myopatier er muskeldystrofi, preget av progressiv muskels kaste bort og degenerasjon6. Disse sykdommene er konsekvensen av genetiske mutasjoner i viktige proteiner, inkludert dystrofin og laminin-α2 (LAMA2), ansvarlig for vedlegg av muskelfibre til den ekstracellulære matrisen7,8. Gitt at proteiner implisert i muskeldystrofi spiller en så sentral rolle i å opprettholde muskelstruktur, ble det i mange år antatt at en svikt i denne prosessen var mekanismen som var ansvarlig for sykdomspatogenese9. Nyere studier har imidlertid identifisert feil i reguleringen av muskelstammeceller og påfølgende svekkelse i muskelregenerering som andre mulige grunnlag for muskelpatologien observert i muskeldystrofi10,11. Som sådan er det nødvendig med ytterligere studier for å undersøke hvordan en svekkelse i muskel stamcellefunksjon og tilhørende nisjeelementer bidrar til muskeldystrofi.
I løpet av det siste tiåret har sebrafisk (Danio rerio) dukket opp som en viktig virveldyrmodell for sykdomsmodellering12. Dette tilskrives den raske eksterne utviklingen av sebrafiskembryoet, kombinert med sin optiske klarhet, noe som gjør det mulig direkte visualisering av muskeldannelse, vekst og funksjon. I tillegg er ikke bare utviklingen og strukturen av muskel høyt bevart i sebrafisk, de viser også en svært bevart prosess med muskelregenerering13. Følgelig representerer sebrafisk et utmerket system for å studere patobiologien til muskelsykdommer, og utforske hvordan muskelregenerering påvirkes i den. For dette formål har vi utviklet en metode som muliggjør rettidig studie av skjelettmuskulaturregenerering i sebrafiskmodeller av muskelsykdom. Denne rørledningen med høy gjennomstrømning innebærer en metode for å genotype levende embryoer14, hvoretter en nålstikkskade utføres og omfanget av muskelregenerering er avbildet ved hjelp av polariserende lysmikroskopi. Utnyttelsen av denne teknikken vil derfor avsløre den regenerative kapasiteten til muskler i sebrafiskmodeller av muskelsykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sebrafiskvedlikehold ble utført i henhold til standard driftsprosedyrer godkjent av Monash University Animal Ethics Committee under avlskolonilisens ERM14481.
1. Bestemmelse av genotypen av levende embryoer ved hjelp av en embryogenotypingsplattform.
- Bedøv 3 dager etter befruktning (dpf) sebrafiskembryoer ved å tilsette trikainmetansulfat til en endelig konsentrasjon på 0,016% (v / v) i embryomedium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 i vann). Vent i 10 minutter for å sikre at fisken er helt bedøvet, tydelig når fisken slutter å svømme.
- Forbered DNA-ekstraksjonsbrikken med 24 kammer ved å skrelle den klare beskyttelsesfilmen fra den øverste overflaten av brikken (figur 1A).
- Klipp spissen på en 20 μL filterspiss for å utvide åpningen. Bruk dette, velg et enkelt embryo i et 13 μL volum embryomedium og last inn i det første kammeret på brikken. Gjenta denne prosessen til embryoer er dispensert i hvert kammer.
MERK: Dette trinnet bør utføres i et område med minimale luftutkast, da høy luftstrøm kan forårsake overdreven fordampning av væsken som senere resulterer i redusert genotyping følsomhet og overlevelse av embryoene. - Når ønsket antall embryoer er lastet på DNA-ekstraksjonsbrikken, laster du den på zebrafish embryo genotyping-plattformen. Dette oppnås best ved å plassere på den ene siden først, etterfulgt av resten av den.
MERK: Unngå å legge for mye trykk på plattformen, da dette kan overbelaste og skade de underliggende fjærene. - Fest det magnetiske plattformlokket over brikken, som forhindrer fordampning av embryomedier under DNA-ekstraksjonsprotokollen, og lukk plattformlokket.
- Sett baseenheten til 2,4 volt, 0,051 A og 0,12 W og start DNA-ekstraksjonsprotokollen ved å trykke på "ON/OFF"-knappen. Plattformen skal begynne å vibrere, noe som kan vurderes ved å berøre lokket forsiktig. Protokollen bør kjøres i 8 minutter.
MERK: Den kraftige vibrasjonen resulterer i utskillelse av epidermale celler, hvorfra genomisk DNA ekstraheres. - Mens programmet kjører, lag en 24 brønnplate ved å legge til 1 ml embryomedium til hver brønn, noe som er nødvendig for å skille individuelle embryoer mens nedstrøms genotypinganalyser utføres.
- I tillegg merkes passende 8 brønnstrimmelrør, som vil bli brukt til innsamling av DNA-materiale fra hvert embryo.
- Når protokollen på 8 minutter er fullført, trykker du på PÅ/AV-knappen for å stoppe vibrasjonen på plattformen.
- Åpne lokket på plattformen, og fjern forsiktig det magnetiske lokket som sikrer minimalt trykk på plattformen.
- Fjern DNA-ekstraksjonsbrikken forsiktig fra plattformen og legg den på en flat overflate.
- Fra det første kammeret fjerner du 10 μL embryomedier rundt embryoet og plasserer det i riktig brønn av 8-brønns striperøret. Mediene inneholder det genetiske materialet fra det embryoet, som vil bli brukt til nedstrømsanalyser.
MERK: Unngå å berøre embryoet med pipettespissen under medieoppsamling, da dette kan skade embryoet. - Bruk en plastpipette, legg umiddelbart to dråper friskt embryomedium til samme kammer. Samle embryoet og flytt det til den første brønnen på en 24 brønnplate.
- Gjenta trinn 1.12 og 1.13 for alle gjenværende kamre. Ved ferdigstillelse av dette kan den 24 brønnplaten som inneholder levende embryoer flyttes til en 28 ° C inkubator.
- Utfør passende nedstrøms genotypingsanalyser for å bestemme embryoenes genotype.
MERK: DNA-et fra embryogenotypingsplattformen kan forsterkes med hell av PCR og kan brukes til etterfølgende analyse, inkludert sekvensering, gelelektroforese eller høyoppløselig smelteanalyse14. For å genotype lama2-stammen som er beskrevet i de representative resultatene, ble PCR, begrensningsfordøyetid og gelelektroforese brukt. Gitt at konsentrasjonen av DNA oppnådd fra hvert embryo er lav, foreslås det å bruke det meste, om ikke alle, av det genetiske materialet som er oppnådd for nedstrømsanalysen. - Når genotypen til hver larver er identifisert, overfør dem til 90 mm Petri-retter, plasser hver genotype i en annen tallerken. Fyll parabolen med 25 ml embryomedium og oppbevar dem i inkubatoren på 28 °C.
2. Utføre muskelskader ved hjelp av et nålstikk
- Når larvene er 4 dpf, bedøv dem ved å legge trikain metansulfat til en endelig konsentrasjon på 0,016% (v / v) i embryo medium. Vent i 10 minutter for å sikre at fisken er helt bedøvet, tydelig når fisken slutter å svømme.
MERK: For å unngå skjevheter, bør genotypens identitet blindes til etterforskeren som utfører stabene og nedstrømsanalysene. - I løpet av denne tiden, forberede 24 brønnplater ved å fylle hver brønn med 1 ml friskt embryomedium, og sett opp stereomikroskopet med svart bakgrunn og høyeffektslys, for å lette visualiseringen av de somite grensene.
- Bruk en plastpipette, overfør en bedøvet larve til en ny Petri-tallerken.
- Fjern forsiktig overflødig embryomedium med en pipette, og under et dissekerende mikroskop orienter fisken slik at hodet er til venstre, hale til høyre, dorsal region opp og ventral region ned (Figur 1B).
- Arbeid under et dissekerende mikroskop, bruk en 30-gauge nål for å utføre et raskt, men presist stikk i epaxialmuskelen som ligger over det horisontale myoseptumet. For å sikre konsistens i fremre bakre stilling, sikt på 1-2 somitter plassert over analporene (figur 1B).
MERK: Unngå å stikke nevralrøret og notokordet, og arbeid raskt for å unngå tørking av fisken under prosessen. - Bruk en plastpipette, hell en dråpe embryomedium på den stukket sebrafisken og overfør den forsiktig til en brønn på 24 brønnplaten.
- Gjenta trinn 2.3 til 2.6. til all fisken er knivstukket.
MERK: Flere larver kan bli stukket sammen avhengig av undersøkerens prosesseringshastighet og ferdighet, så lenge fisken ikke tørker ut under prosessen. - Når alle larvene er stukket, plasser den 24 brønnplaten i 28 ° C inkubatoren til etterfølgende avbildning utføres.
3. Avbildning av muskelskade og restitusjon
- Ved 1 dag etter skade (1 dpi) bedøves de stukket larver ved å legge trikain metansulfonat til en endelig konsentrasjon på 0,016% (v / v) i embryo medium. Vent i 10 minutter for å sikre at fisken er helt bedøvet, tydelig når fisken slutter å svømme.
MERK: Ved 0 dpi inneholder sårstedet en stor mengde cellulært rusk, noe som gjør det vanskelig å kvantifisere omfanget av muskelskade (Supplerende figur 1A-B). Det tar omtrent 18-20 timer før dette rusket blir ryddet fra sårstedet, og som sådan er det mer pålitelig å avbilde larver ved 1 dpi, i stedet for 0 dpi, for å bestemme omfanget av skade som fremkalles. - Plasser en ren og tom glassbunnbasert tallerken på scenen i det polariserende mikroskopet og sett bakgrunnen ved hjelp av den integrerte programvaren.
MERK: Ikke bruk Petri-retter i plast til å avbilde birefringence, da de ikke overfører brytet lys på riktig måte. Avhengig av det polariserte mikroskopet som brukes, kan det være nødvendig med flere innstillinger i henhold til produsentens retningslinjer. - Etter å ha satt bakgrunnen, fjern den glassbunnbaserte parabolen fra mikroskopstadiet, og bruk en glasspipette, overfør den bedøvede, stukket fisken til glassbunnsbaserte parabolen.
- Fjern forsiktig overskuddet av embryomedium ved hjelp av en pipette, og orienter fisken i henhold til 2,5 - hodet er til venstre, halen til høyre, dorsalområdet opp og ventralområdet ned.
MERK: Sørg for at larvene er montert så flatt som mulig, da ujevn montering resulterer i forskjellige birefringence-intensiteter på tvers av forskjellige somitter. - Plasser den glassbunnbaserte parabolen med bedøvede larver på mikroskopstadiet og bilde muskelen ved hjelp av polarisert lys (Figur 1C &1D).
MERK: Avhengig av hvilken type mikroskop/polarisert linse som brukes, kan fiskeretningen på den fremre bakre aksen påvirke den totale birefringen15. Sørg for å inkludere minst 5 somitter på hver side av skadestedet ved avbildning. - Bruk en plastpipette, hell en dråpe embryomedium for å rehydrere fisken og legg fisken i en brønn på en 24 brønnplate fylt opp med embryomedium.
MERK: Det er viktig å utføre avbildningen så raskt som mulig for å hindre at fisken tørker. - Gjenta trinn 3.3. til 3,6. til all fisken er avbildet.
- Når alle bildene er anskaffet, lagrer du dem i .tiff format for senere analyser.
- Sett fisken tilbake i 28 °C inkubatoren til den utfører etterfølgende avbildning ved 3 dpi (7 dpf).
- Når fisken er 3 dpi, bilde fisken i henhold til 3,3 til 3,8.
- Når all fisk er avbildet, euthanize dem ved å legge trikain metansulfat til en endelig konsentrasjon på 0,2% (v / v) i embryo medium. Vent i minst 10 minutter for å sikre at fisken blir euthanized, tydelig ved tap av svømmeevne, pumping av gilldekslene og mangel på flyrespons etter berøring.
4. Kvantifisering av muskelregenerering
- Åpne et bilde på 1 ppt på en bildeanalyseprogramvare, for eksempel den fritt tilgjengelige Image J-programvaren.
- Bruk polygonverktøyet til å tegne rundt sårstedet, og mål området og gjennomsnittlig birefringenceintensitet for denne regionen (Figur 1C &1D). Kopier disse verdiene til celle D3 og E3 i malen (Supplerende tabell 1).
- Tegn to ekstra regioner, som hver spenner over 1-2 uskadede somitter, og mål området og gjennomsnittlige birefringintensitetsintensiteter for hver av disse regionene (Figur 1C &1D). Kopier disse verdiene til cellene D4-D5 og E4-E5 i malen (Supplerende tabell 1).
MERK: Selv om det er å foretrekke å velge de samme uskadede somittene i 1 dpi- og 3 dpi-bildene, kan sporadisk løsrivelse av muskelfibre og påfølgende reduksjon i birefringence hos mutanter gjøre dette umulig. Derfor, i tilfelle de samme somites ikke kan velges på 1 dpi og 3 dpi på grunn av reduksjon i muskelintegritet hos mutanter, velg to forskjellige, men upåvirkede områder på hvert av tidspunktene. - Beregn normalisert birefringence for hvert område ved å dele gjennomsnittlig birefringence-intensitet for dette området med området - vist i kolonne F i malen som er angitt (Supplerende tabell 1).
- Gjenta trinn 4.1-4.4 for alle bilder med 1 ppt og 3 ppt.
MERK: Når du bruker malen som følger med (Supplerende tabell 1), bør verdiene for 1 ppt-område og gjennomsnittlig birefringenceintensitet settes inn i henholdsvis kolonne D og E, og verdiene for 3 ppt-området og gjennomsnittlig birefringenceintensitet bør settes inn i henholdsvis kolonne J og K. - For hvert tidspunkt beregner du gjennomsnittlig normalisert birefringence for de to ikke-skadde regionene. Denne verdien gir et referansepunkt for uskadet muskel.
MERK: I den angitte malen (Tilleggstabell 1) beregnes denne verdien i kolonne G og M for henholdsvis 1 ppt- og 3 ppt-bildene. - Deretter bestemmer du omfanget av muskelskade ved 1 dpi, ved å dele den normaliserte birefringence av skadeområdet med gjennomsnittlig normalisert birefringence av de uskadede regionene (beregnet i 4,6).
MERK: Ved hjelp av ovennevnte detaljerte nålestikkprosedyre viser wildtype larver vanligvis en normalisert birefringence på 48,5 ± 14,3% på sårstedet ved 1 dpi, noe som indikerer at birefringence har redusert med ca. 50% sammenlignet med uskadede somitter. Når du bruker malen (Supplerende tabell 1), beregnes denne verdien som en prosent i kolonne H. - For å bestemme omfanget av muskelregenerering, del den normaliserte birefringence av skadeområdet i 3 dpi-bildet, med den gjennomsnittlige normaliserte intensiteten til de uskadede regionene på dette stadiet.
MERK: Ved 3 dpi viser wildtype larver vanligvis en normalisert birefringence på 60 ± 15,3% på sårstedet. Gitt at normalisert birefringence innenfor sårstedet ved 1 dpi var 48,5 ± 14,3% (trinn 4,7), indikerer økningen i birefringence ved 3 dpi til 60 ± 15,3% en gjenoppretting på ca. 11,5%. Når du bruker malen (Supplerende tabell 1), beregnes denne verdien som en prosent i kolonne N. - Hold fisken innenfor hver genotype separat, utfør en parret t-test som sammenligner den normaliserte birefringensen av sårstedet ved 3 dpi (trinn 4.8) med den på 1 dpi (trinn 4.7). Dette vil avsløre banen til muskelregenerering som vises av hver fisk i hver genotype, og markere om omfanget av muskelregenerering som vises av hver genotype har endret seg betydelig.
- Til slutt beregner du den regenerative indeksen ved å dele verdien oppnådd i trinn 4.8, som er omfanget av muskelregenerering ved 3 dpi, med verdien oppnådd i trinn 4.7, som er omfanget av muskelskade ved 1 dpi. En regenerativ indeks på 1 indikerer at skaden ved 1 dpi er sammenlignbar med 3 dpi og at muskelregenerering ikke har skjedd; en verdi over 1 indikerer at ved 3 dpi har ny muskel dannet seg på sårstedet og fremhevet at muskelen har regenerert; og en regenerativ indeks på mindre enn 1 fremhever at såret ved 3 dpi er verre enn 1 dpi, og at muskelregenerering i svekket. En t-test eller en enveis ANOVA kan utføres for å statistisk sammenligne omfanget av muskelregenerering mellom de forskjellige genotypene. Når du bruker malen som følger med (Supplerende tabell 1), beregnes denne verdien i kolonne O.
MERK: Det anbefales å utføre hele eksperimentet i triplikater, med fisk fra hvert eksperiment hentet fra forskjellige biologiske foreldre, og hvert eksperiment utført på forskjellige dager, for å unngå skjevheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evnen til å kvantifisere birefringence av skjelettmuskulatur gir en ikke-invasiv, men svært reproduserbar metode for å undersøke og sammenligne nivåer av muskelskader, og undersøke muskelregenerering in vivo. Birefringence skyldes diffraksjon av polarisert lys gjennom pseudo-krystallinsk matrise av muskel sarcomeres15, og etter skade eller skade på muskelen, en reduksjon i birefringence er tydelig. På samme måte resulterer aktivering og differensiering av stamceller i dannelsen av nye muskelfibre på skadestedet, og øker deretter birefringence intensiteten i denne regionen. Ved hjelp av dette systemet har vi undersøkt muskelregenerering i en sebrafiskmodell av medfødt muskeldystrofi type 1A (MDC1A), forårsaket av mangel i Lama216. En kobling av embryoer fra en krysning mellom to lama2+/- sebrafisk ble samlet inn, og ved 3 dpf ble embryoene overført til en DNA-ekstraksjonsbrikke (figur 1A) og deretter genotypet ved hjelp av en embryogenotypingsteknologi. Etter å ha identifisert genotypen, lama2-/- larver, hvilken modell MDC1A16, og lama2+/+ søsken ble skadet ved hjelp av en nålstikk i henhold til figur 1B, og avbildet på et polariserende mikroskop ved 1 dpi, og 3 dpi, og birefringence-intensitetene ble kvantifisert. Mens muskelskade resulterer i en reduksjon i birefringence intensitet ved 1 dpi (Figur 1Ci og Di), resulterer vellykket regenerering av muskel i økt birefringence i samme region (Figur 1Cii og Dii). Det er også bemerkelsesverdig at mens lama2+/+ larver viser jevn birefringence intensitet (Figur 1C), på grunn av normal muskel mønster, birefringence intensiteten i muskelen av lama2-/- var ujevn og svært sporadisk (Figur 1D), tilskrives redusert muskel integritet.
Ved hjelp av denne tilnærmingen avslører vi at begge wildtype larver (lama2+/+; Figur 2A), og larver mangelfulle i lama2 (lama2-/-; Figur 2B), viser signifikant økt birefringence intensitet i sårstedet ved 3 dpi sammenlignet med 1 dpi (Figur 2C), noe som indikerer at muskelen har regenerert. For å sammenligne det regenerative potensialet til larver i hver genotype, den regenerative indeksen ble bestemt, og vi avslører at lama2-/- larver viste en slående økning i muskelregenerering sammenlignet med lama2+/+ larver (Figur 2D; gjennomsnitt i lama2-/- = 1,30 ±- 0,251; gjennomsnitt i lama2-/- = 1,83 ± 0,439). For ytterligere å validere den forbedrede regenereringen i lama2-/- larver, farget vi muskelen med et antistoff mot F-Actin (Supplerende figur 1B-D). Mens disse resultatene bekrefter at lama2-/- faktisk regenererer, tydelig ved tilstedeværelsen av differensierte muskelfibre i sårstedet, begrenser manglende evne til å undersøke den samme fisken ved 1 dpi og 3 dpi evnen til å kvantifisere og sammenligne den regenerative responsen mellom lama2+/+ og lama2-/- fisk. Selv om det mekanistiske grunnlaget for denne forbedrede regenereringskapasiteten i lama2-/- larver forblir unnvikende, tror vi at tapet av lama2 øker antall aktiverte stamceller, noe som senere resulterer i forbedret muskelregenerering. Videre studier er imidlertid nødvendig for å bestemme dette. Samlet fremhever disse resultatene den beskrevne teknikkens evne til å identifisere endringer i muskelregenerering i sebrafiskmodeller av muskelsykdom.
Figur 1: Oversikt over genotyping og muskelregenereringsprotokoll. (A) Bilde av en DNA-ekstraksjonsbrikke som inneholder 24, 3 dpf sebrafisk larver. (B) Skjematisk av retningen der de 4 dpf larver skal plasseres for å utføre nålstikket, med hodet til venstre, halen til høyre, dorsalområdet opp og ventralområdet ned. Nålestikket skal utføres ved hjelp av en 30-gauge nål, rettet mot 1-2 somitter av epaxial muskel. Opprettet med BioRender.com. (CD) Bilder av birefringence i en lama2+/+ og lama2-/- larver på 1 dpi og 3 dpi. Regioner vist i hvitt og rødt reflekterer områdene som brukes til å kvantifisere birefringence i sårstedet og uskadede somitter henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kvantifisering av muskelregenerering i lama2 mangelfulle sebrafisk larver. Bilder av birefringence i lama2+/+ (A) og lama2-/- (B) larver ved 1 dpi og 3 dpi. Såret på 3 dpi i begge, lama2+/+ og lama2-/- larver er fylt med ny muskel. (C) Graf over normalisert birefringence av hver larver på 1 dpi og 3 dpi. Den normaliserte birefringence i sårstedet i lama2+/+ og lama2-/- larver økes betydelig ved 3dpi, som bestemt ved hjelp av en parret t-test. (D) Regenerativ indeks i lama2+/+, og lama2-/- med sistnevnte viser økt muskelregenerering, som bestemt ved hjelp av en t-test. Feilfelt representerer SEM med larver fra tre uavhengige eksperimenter (lama2+/+n=28 og lama2-/- n=16). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Undersøkelse av muskelregenerering i lama2 mangelfulle larver. Bilder av birefringence i lama2+/+ (Ai) og lama2-/- (Aii) larver på 0 dpi som demonstrerer tilstedeværelsen av cellulær rusk i sårstedet. Maksimal projeksjon konfokale bilder av larval myonom farget for F-aktin ved 0 dpi (B), 1 dpi (C) og 3 dpi (D). Ved 3 dpi er sårstedet til lama2+/+ og lama2-/- larver preget av utseendet på F-aktinmerkede muskelfibre. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 1: Mal for kvantifisering av muskelregenerering. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skjelettmuskelregenerering er drevet av obligatoriske vev bosatt muskel stamceller, hvis funksjon er endret i mange muskelsykdommer som muskeldystrofi, og deretter hindrer prosessen med muskelregenerering. Her beskriver vi en protokoll med høy gjennomstrømning for å undersøke muskelregenerering i levende sebrafiskmodeller av muskelsykdom. Det første trinnet i rørledningen bruker en embryo genotyping plattform14, som er en brukervennlig og nøyaktig metode for å bestemme genotypen av levende larver, før du utfører nedstrøms regenereringsanalysen. En direkte fordel med dette er at det tillater valg av genotyper som bare er av interesse, og / eller sammenlignbart antall fisk i hver genotypegruppe, og reduserer derfor antall fisk som må behandles gjennom resten av protokollen betydelig. Det er imidlertid bemerkelsesverdig at mengden genomisk DNA hentet fra embryogenotypingsenheten er relativt lav, noe som kan kompromittere nedstrøms genotypingsanalyser. Det er derfor viktig at alle genotypingsanalyser testes og optimaliseres før de brukes til hovedeksperimentet. I tillegg er kilden til DNA først og fremst epidermal, og som sådan kan embryogenotypingssystemet ikke med hell brukes til genotype larver som viser vevsspesifikke mutasjoner.
Den andre delen av protokollen demonstrerer bruken av en nål-stikkskade, som er en kostnadseffektiv og høy gjennomstrømningsteknikk som ikke bare resulterer i en svært reproduserbar skadestørrelse, men er også tilstrekkelig til å utløse aktivering av muskelstammeceller som resulterer i muskelregenerering. En alternativ tilnærming til å indusere skjelettmuskulaturskade i sebrafisk er å bruke lasermediert celleablasjon13,17,18 . Selv om dette gir muligheten til å fokusere på spesifikke x-, y- og z-fly og deretter målrette enkeltmuskelceller, begrenser den ekstremt små sårstørrelsen som er indusert nøyaktig kvantifisering av muskelregenerering, spesielt i muskelsykdomsmodeller der muskelens integritet allerede er kompromittert. Vi favoriserer derfor bruk av nålestikkskader når vi undersøker muskelregenerering i sebrafisk muskelsykdomsmodeller.
For å nøyaktig kvantifisere omfanget av muskelregenerering, utnytter vi den birefringente naturen til skjelettmuskulaturen, som lett kan avbildes ved hjelp av et standard polariserende mikroskop. Det er to kritiske punkter som må vurderes når du bruker denne tilnærmingen. For det første, avhengig av hvilken type mikroskop og / eller polarisert linse som brukes, kan fiskens orientering i sin fremre bakre akse påvirke generell birefringence intensitites15, og dette må vurderes under avbildning. Til slutt, selv om muskelregenerering ikke er fullstendig fullført med 3 dpi, er omfanget av utvinning tilstrekkelig til å muliggjøre distinksjon av regenereringskapasitet i forskjellige stammer13 (Figur 1). Vårt tidligere arbeid har vist at ved hjelp av protokollen vi har skissert, regenererer wildtype larver fullt ut etter 14 dpi19, og derfor, for å avgjøre om en stamme ikke kan regenerere eller om muskelregenerering er forsinket, kan det være nødvendig å undersøke birefringenceintensitetene utover 3 dpi.
Det må bemerkes at i teleostfisk oppstår muskelvekst gjennom hele dyrets liv20, og som sådan er det svært viktig å normalisere sårstedets birefringenceintensiteter, med det av uskadede somitter i samme fisk. Dette trinnet gir en intern kontroll og fjerner skjevheter i analysene på grunn av forskjeller i muskelmengden ved de ulike tidspunktene, eller forskjeller i bildeparametere under ulike økter. Dette normaliseringstrinnet er også viktig for å nøyaktig kvantifisere muskelregenerering i modeller av muskelsykdom, som i seg selv kan ha redusert myofibrils og / eller vise kompromittert muskelintegritet, og deretter redusere generelle birefringence intensiteter. I tillegg, mens denne protokollen effektivt kan avsløre endringer i muskelens regenerative kapasitet, er det mulig at de er et resultat av indirekte effekter på stamcellefunksjonen. Muskelregenerering er en kompleks prosess som involverer signaler fra flere celletyper, inkludert muskelceller, makrofager, fibro-adepogene forfedre og interstitielle celler. Det er mulig at den endrede kapasiteten til muskel for å regenerere kanskje forklart av endringer i biologien til noen av disse andre celletypene som senere påvirker muskel stamcellefunksjonen og den regenerative prosessen. Derfor, mens denne protokollen kan identifisere endringer i muskelregenerering i modeller av muskelsykdom, må nedstrøms cellulære og molekylære analyser utføres for å identifisere mekanismen (e) som er ansvarlig for de observerte endringene.
Til slutt er den regenerative kapasiteten til muskel i ulike muskelsykdommer ikke fullt ut forstått, og fremveksten av nye teknikker for å undersøke muskelregenerering in vivo gir en plattform for å takle slike spørsmål. Metoden kan brukes som grunnlag for utforskning av cellulære og molekylære signaler som regulerer muskelregenerering i sebrafiskmodeller av muskelsykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil takke Dr. Alex Fulcher og Monash Micro Imaging for hjelp med vedlikehold og oppsett av mikroskop. Australian Regenerative Medicine Institute støttes av tilskudd fra delstatsregjeringen i Victoria og den australske regjeringen. Dette arbeidet ble finansiert av et muskeldystrofiforening (USA) prosjektstipend til P.D.C (628882).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E.
- Emery, A. E. H. Duchenne muscular dystrophy. , Oxford University Press. Oxford; New York. (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), New York, N.Y. (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
