阿拉伯多普西斯局部和系统伤口信号的广域实时成像

植物无法摆脱生物应力，例如，以它们为食的昆虫，因此它们已经进化出复杂的应力感应和信号转导系统来检测，然后保护自己免受诸如食草动物¹这样的挑战。在受伤或食草动物攻击时，植物会启动快速防御反应，包括植物激素茉莉酸（JA）的积累，不仅在受伤部位，而且在未损坏的解剖器官^2。然后，此 JA 都会触发直接受损组织的防御响应，并先发制人地在植物未损坏的部分诱导防御。在阿拉伯多普西斯，在植物其他地方的损伤后几分钟内，就检测到由伤痕引起的JA积累，这说明从^{受伤的叶3}中传输了快速和远距离的信号。一些候选者，如^Ca2+，活性氧物种（ROS）和电信号，已被建议作为这些远程伤口信号在植物^4，5。

Ca²⁺是真核生物中最通用和无处不在的第二信使元素之一。在植物中，毛毛虫咀嚼和机械伤害导致细胞溶胶Ca²⁺浓度（[Ca^2]_细胞）在受伤的叶子和未缠绕的远处叶^6，7急剧增加。此系统 Ca²⁺信号由细胞内 Ca²⁺感应蛋白接收，导致下游防御信号通路（包括 JA 生物合成 8^、9）的激活。尽管许多此类报告支持Ca²⁺信号在植物伤口反应中的重要性，但关于Ca²⁺信号的空间和时间特征的信息有限。

使用基因编码的 Ca²⁺指示器进行实时成像是监控和量化 Ca²⁺信号的空间和时间动态的强大工具。迄今为止，已经开发出这种传感器的版本，使Ca²⁺信号在单个细胞的水平，组织，器官，甚至整个植物¹⁰的可视化。在植物中用于Ca²⁺的第一个基因编码生物传感器是来自水母Eequorea维多利亚¹¹的生物发光蛋白 aquorin。虽然这种化疗蛋白已被用于检测Ca²⁺的变化，以响应植物的各种应力12，13，14，15，16，17，18，它不适合实时成像，因为它产生的极低的发光信号。基于 Fürster 共振能量转移 （FRET） 的Ca²⁺指标（如黄骆驼）也已成功用于调查^{19、20、21、22、23、24}工厂中一系列 Ca²⁺信号事件的动态。这些传感器与成像方法兼容，最常见的是由来自肌素光链激酶的Ca²⁺结合蛋白（CAM）和CAM结合肽（M13）组成，全部融合在两种荧光蛋白之间，通常是青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白变种（YFP）10。Ca²⁺与 CaM 的绑定可促进 CAM 和 M13 之间的交互，从而导致传感器的构象更改。这一变化促进了 CFP 和 YFP 之间的能量转移，这增加了 YFP 的荧光强度，同时减少了 CFP 的荧光排放。监控从 CFP 到 YFP 荧光的这种转变，然后提供 Ca²⁺水平增加的度量。除了这些FRET传感器，单荧光蛋白（FP）为基础的Ca²⁺生物传感器，如GCaMP和R-GECO，也与植物成像方法兼容，并广泛用于研究[Ca^2+]_细胞的变化，由于其高灵敏度和易用性25，26，27，28，29，30。GCAMP 包含单个圆形排列 （cp） GFP，再次融合到 CaM 和 M13 肽中。CaM 和 M13 之间的 Ca²⁺依赖互导致传感器的构象变化，从而促进 cpGFP 质子状态的改变，增强其荧光信号。因此，随着 Ca²⁺级别的上升，cpGFP 信号会增加。

为了研究Ca²⁺信号的动态，以响应机械伤害或食草动物喂养，我们使用了转基因阿拉比多普西塔利亚纳植物表达GCaMP变种，GCaMP3，和广域荧光显微镜^6。这种方法成功地可视化从叶子上的伤口部位到整个工厂的长途Ca²⁺信号的快速传输。因此，在伤口部位立即检测到 [Ca^2]_细胞的增加，但随后在受伤后几分钟内通过血管向邻近的叶子传播此 Ca²⁺信号。此外，我们发现，这种快速全身伤口信号的传输在阿拉伯多皮西斯植物中被废除，在两个谷氨酸受体样基因，谷氨酸受体喜欢（GLR）， GLR3.3和GLR3.6 6突变.GLR似乎作为氨基酸门卡²⁺通道参与不同的生理过程，包括伤口反应^3，花粉管生长^31，根发育^32，冷反应^33，和先天免疫^34。尽管GLR具有这种广为人知的、广泛的生理功能，但有关其功能特性的信息，如配体特异性、离子选择性和亚细胞定位，^{是有限的。}然而，最近的研究表明，GLR3.3和GLR3.6分别在胶合板和二甲苯中本地化。植物GLR与哺乳动物的电电性谷氨酸受体（iGlluRs）36有相似之处，后者由氨基酸激活，如谷氨酸、甘氨酸和D-塞林在哺乳动物神经系统^37。事实上，我们证明，在伤口部位应用100m谷氨酸，但不是其他氨基酸，在阿拉伯多维西斯诱导一个快速的长途Ca²⁺信号，表明细胞外谷氨酸可能作为伤口信号在植物^6。这种反应在glr3.3/glr3.6突变体中被废除，这表明谷氨酸可能通过其中一个或两个受体样通道起作用，事实上，AtGL3.6最近被这些水平的谷氨酸³⁸所封闭。

在植物中，除了其作为结构氨基酸的作用外，谷氨酸还被提议为关键的发育调节器^39:然而，其空间和时间动态却鲜为人知。正如Ca^2+，已经开发出几个基因编码的谷氨酸指标，以监测这种氨基酸在活细胞^40，41的动态。iGluSnFR是一种基于GFP的单FP谷氨酸生物传感器，由cpGFP和来自埃斯切里西亚大肠杆菌^42，43的谷氨酸结合蛋白（GltI）组成。由谷氨酸与 GltI 结合引起的 iGluSnFR 的构象变化导致 GFP 荧光排放增强。为了调查细胞外谷氨酸是否在植物伤口反应中起到信号分子的作用，我们将 iGluSnFR 序列与基本的奇蒂纳塞信号肽分泌序列 （CHIB-iGluSnFR） 连接起来，以便在肿瘤空间⁶中本地化这种生物传感器。这种方法使使用表达此传感器的转基因阿拉伯多普西斯植物能够成像丙酮谷氨酸浓度（[Glu]_apo）的任何变化。我们检测到受伤现场的 iGluSnFR 信号迅速增加。这些数据支持了谷氨酸在受伤时从受损的细胞/组织泄漏到凋亡者的想法，并充当激活GLR的损伤信号，并导致^植物6中的长途Ca²⁺信号。

在这里，我们描述了一种全植物的实时成像方法，使用基因编码的生物传感器来监测和分析长途Ca²⁺ 和细胞外谷氨酸信号的动态，以回应伤害^6。宽场荧光显微镜和转基因植物表达基因编码的生物传感器提供了一个强大但易于实施的方法来检测快速传输的远距离信号，如Ca²⁺ 波。

1. 植物材料制备

1. 在1.5 mL微管中，表面用20%（v/v）NaClO摇动3分钟，然后用无菌蒸馏水清洗5次，对 阿拉伯多普西斯塔利亚纳 （Col-0加入）植物的种子进行消毒，表达GCaMP3或CHIB-iGlusnFR。
   注:阿拉伯多普西斯表达GCaMP3或CHIB-iGluSnFR的转基因线已经描述过前^6。
2. 在无菌罩中，在装满 30 mL 无菌（自动切割）Murashige 和 Skoog （MS） 介质 [1 倍 MS 盐] 的 10 厘米方形塑料培养皿上播种 13 个表面消毒种子， 1% （w/v） 蔗糖， 0.01% （w/v） 肌醇， 0.05% （w/v） MES 和 0.5% （w/v） 胶质胶; pH 5.7 调整与 1N KOH].更换盖子，用手术胶带包裹。
3. 在黑暗中潜伏4°C2天后，将板水平置于连续光下的生长室中的22°C（90-100微米^-2-1），在使用前约2周。2周后，数一数阿拉伯树叶的数量，从最老到最小的^44（图1）。伤口反应优先从受损的叶子 （n） 移动到编号为 n 的叶子± 3 和 n ± 5⁶。
   注:在此协议中，Petri 盘将被打开，用于在荧光显微镜下对伤口和谷氨酸效果进行成像。因此，本实验的后续步骤应在温度和湿度控制的房间条件下进行。这是因为 Ca²⁺ 信号也因这些环境条件的变化而引起。另据了解，在记录生物传感器蛋白荧光激发过程中从显微镜中发出的蓝光可能会导致细胞溶胶 Ca²⁺ 浓度⁴⁵ 的增加，因此植物应在开始实验前适应蓝光辐照几分钟。

2. 化学制备

1. 溶解L-谷氨酸在液体生长介质 [1/2 倍 MS 盐， 1% （w/v） 蔗糖和 0.05% （w/v） MES; pH 5.1 调整与 1N KOH] 使 100 mM 工作解决方案.
   注意:避免使用谷氨酸盐，如谷氨酸钠，以防止潜在的与酸化相关的影响，Ca²⁺ 动力学。

3. 显微镜设置和进行实时成像

1. 打开配备 1 倍目标镜头 （NA = 0.156） 和 sCMOS 相机 （图 2）的电动荧光立体显微镜，并配置设备设置，以 470/40 nm 激发光进行辐照，并获取通过 535/50 nm 滤光器的发射灯。
   注:任何 GFP 敏感荧光显微镜均可用于实时检测 GCaMP3 和 iGluSnFR 信号，但建议使用宽 SCMOS 芯片的低功耗目标镜头和高度敏感的摄像头从整个工厂获取信号。低功率目标允许成像整个 阿拉伯多普西斯 工厂的反应，并使用高度敏感的摄像头允许快速数据采集所需的捕捉伤口触发的Ca²⁺ 波的快速时间过程。对于本研究中使用的荧光显微镜，视场和时间分辨率的最大值分别为每秒 3 厘米 x 3 厘米和 30 帧（fps）。
2. 取下盖子，将盘子放在客观镜头下。
3. 检查植物的荧光信号，然后在黑暗中等待约30分钟，直到植物适应新的环境条件。需要这个适应步骤，因为湿度的变化会导致植物的细胞高程[Ca^2+]，这些_细胞 升高会干扰任何与伤口相关的事件。
4. 调整焦点和放大倍数，查看整个工厂的视野。在当前协议中，使用了 0.63 倍的放大倍数。
5. 在开始实时成像之前，使用显微镜成像软件设置采集参数来检测荧光信号。当前协议中的成像设置为:曝光和间隔时间分别设置为 1.8 s 和 2 s（即 0.5 fps）。将录制时间设置为 11 分钟。
6. 在开始实验之前，图像为 5 分钟，以便将工厂适应显微镜的蓝光照射，然后通过单击 "立即运行"或正在使用的显微镜软件中的等效命令开始录制。要确定平均基线荧光，请在伤害或谷氨酸应用之前记录至少 10 帧（即当前协议中至少 20 帧）（见第 4 节）。
   1. 要实时成像伤口引起的 [Ca^2]_细胞和 [Glu]_apo变化，请用剪刀切割叶 L1 的娇小或中间区域（图3和图 4）。
   2. 要实时成像谷氨酸触发 [Ca^2]_细胞变化，用剪刀将叶 1 的边缘（约 1 mm 从尖端切开）切过主静脉。至少20分钟恢复期后，将10微升的100m谷氨酸涂抹在叶子的切面上（图5）。
      注意:这种预切是必要的，使谷氨酸进入叶凋亡，以触发反应。此外，在叶 L1 的切口表面涂抹一滴蒸馏水对于防止样品在施用谷氨酸之前在回收过程中干燥至关重要。
7. 完成 11 分钟录制后，保存数据。

4. 数据分析

1. 对于荧光强度分析，定义要分析荧光强度的地方的兴趣区域 （ROI）（图 6 和 图 7）。有关 Ca²⁺ 波的速度计算，定义 2 个投资回报率 （ROI1 和 ROI2） 以进行分析。在成像软件中，单击 时间测量|定义|圆圈。通过单击 注释和测量|来测量 ROI1 和 ROI2 之间的距离长度|简单行 （图 6）。
2. 通过单击" 量度"来测量每个投资回报率中的原始荧光值 （F）。将原始数据导出到电子表格软件，通过单击"全部"到Excel，将荧光信号转换为每个时间点 的数字，从而|出口。
3. 通过计算记录数据中前 10 帧（即治疗前）的 F 平均值来确定基线荧光值（定义为 F_0）。
4. 使用方程ΔF/F = （F −F_{0）/F 0}使 F 数据正常化（通过计算ΔF/F），其中ΔF是荧光时间依赖的变化。
5. 对于 Ca²⁺ 波速波分析，使用使用统计软件从 F 0 数据计算的标准偏差 （2 倍 SD） 中，使用上升到² ×标准偏差 （2x SD） 的标准值，定义为表示每个投资回报率（t₁ 和 t_2）中的 Ca₂ + 增加的检测。95% 的 F₀ 数据低于平均值的 2 倍 SD，表明超过此级别的信号偶然上升≤5%。计算 ROI1 和 ROI2 之间 Ca²⁺ 增加的时差[t₂- t₁ 时差（Δt）]，测量 ROI1 和 ROI2 之间的距离，然后确定任何 Ca^{2 +} 波的速度。

[Ca2]细胞和 [Glu]apo的信号传播，以回应伤害，呈现在图 3，图 4，电影S1和电影 S2.在表达 GCaMP3 （在 0s） 的植物中切割叶 1 的娇小导致 [Ca2]细胞显著增加，这些细胞通过血管（40s） （图 3和电影S1）在当地迅速诱发。随后，信号在几分钟内（80秒）（图3和电影S1）内迅速传播到邻近的叶子（叶3和6）。

在表达 CHIB-iGlusnFR 的植物中切割叶 1 时，观察到切片区域周围（在 2 s）周围快速 [Glu]apo 增加。这个信号在几分钟内（160秒）通过血管在当地传播，但在系统叶（图4 和 电影S2）中未观察到。

对于应用谷氨酸触发的Ca2+信号传播的实时成像，在表达GCaMP3的植物中叶1的边缘（约1毫米从尖端）被切割，如图5A和电影S3所示。切割叶 1 的边缘导致局部 [Ca2]细胞增加 （在 40s）， 但这个信号在几分钟内消失 （在 124 s） 。在等待植物恢复约10分钟后，10 μL的100m谷氨酸被应用到叶1的切面上，这导致[Ca2]细胞局部（在56s）和信号传播到树叶（在104秒）（图5B和电影S4）迅速，显著增加。

为了测量系统叶中伤口引起的 [Ca2+]细胞的变化，在基区设置了两个 ROI（ROI1 和 ROI2），在表示 GCaMP3 的植物中设置了叶尖6，如图 6A所示。测量了GCaMP3信号强度在ROI1和ROI2中切割叶1的时程变化（图6B）。在 ROI1 中检测到的 [Ca2+]细胞显著增加，比 ROI2 （图 6B）早。[卡2+]cyt在受伤后达到约 100 秒的峰值，持续了 10 分钟以上，并呈现了两个阶段（图 6B）。

为了确定机械伤害时的Ca2+ 波的速度，确定重大信号的时点高于ROI1和ROI2中预刺激值（时滞;见第4节）（图6C）。由于ROI1和ROI2之间的距离是2.7毫米（图6A），因此将第6页中的Ca2+ 信号速度计算为0.15毫米/s。为了测量 [Glu]apo 因机械损坏而发生的变化，ROI1 设置在叶子的切割点附近，如 图 7A所示，标记为 L1 。[格鲁]ROI1 的apo 签名在受伤时在大约 100 s 处表现出一个峰值 （图 7B）。

图1:阿拉伯玫瑰叶的数量。阿拉伯叶从最老到最年轻（左面板）都有编号。右面板中指示叶子位置的示意图图。L: 叶子， C: 科泰莱顿。请单击此处查看此图的较大版本。

图2:本研究中使用的荧光显微镜。 [Ca2]细胞和 [Glu]apo动力学被用广域荧光立体显微镜成像。R:遥控器，O:1倍目标镜头，C:sCMOS相机，T:三角倾斜管，S:舞台，P:植物材料。请单击此处查看此图的较大版本。

图3:伤口引起的长途Ca2+信号传输。在表示 GCaMP3 的植物中切割叶 1 （L1） 的娇小（白箭头，0 s）触发了局部 [Ca2]细胞增加（红色箭头，40s），该增量被传输到系统叶 [叶 3 （L3） 和叶 6 （L6）] （橙色箭头， 80 s）。比例栏， 5 毫米。请点击这里查看此图的更大版本。

图4:伤口触发[格鲁]阿波 高程。 在表达 CHIB-iGlusnFR 的植物中切割叶 1 （L1） （白箭头， 0 s） 导致 [Glu]apo （红色箭头， 80s） 的快速提升，通过血管繁殖（橙色箭头，160 s）。比例栏， 2 毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。

图5:谷氨酸触发的长途Ca2+信号传输。 （A） 在表示 GCaMP3 （白箭头， 0 s） 的植物中切割叶 1 （L1） 的边缘 （约 1 mm） 导致 [Ca2]细胞增加 （红色箭头， 40 s）。（B） 将 100 mM 谷氨酸应用于 L1 （白箭头， 0 s） 的切割表面，导致局部 [Ca2+]细胞增加 （红色箭头， 56s）， 迅速传播到树叶 [例如， 叶 3 （L3）， 叶 4 （L4） 和叶 6 （L6） ] （橙色箭头， 104 s）.比例杆， 5 毫米。请点击这里查看此图的更大版本。

图6:[Ca2]细胞特征在系统叶中，以回应机械伤害。 （A）表示GCaMP3的植物中叶6（L6）的扩展图像显示在图3中。ROI1（蓝色圆圈）和ROI2（粉红色圆圈）分别设置在基座和尖端区域。白箭头表示叶 1 的皮蒂奥尔 （L1） 的切割部位。在这种情况下，ROI1 和 ROI2 之间的距离为 2.7 mm.（B）在 ROI1 和 ROI2 中对 [Ca2+]细胞签名进行量化。使用成像软件分析荧光强度变化。（C） 在 （B） 中扩展的数据示踪，范围在 0 至 80 之间。RoI1 和 ROI2 增加的 Ca2+检测点分别定义为t1和t2，用作标准，将预刺激值的标准偏差（2 倍 SD，虚线）提高到 2 倍。t2 - t1值在当前协议中定义为时滞（Δt）。黑色箭头表示切割时间。请单击此处查看此图的较大版本。

图7:[Glu]apo签名，以回应机械伤害。 （A） 在植物中表达CHIB-iGlusnFR的叶1（L1）的扩展图像显示在图4中。ROI1 设置在切割站点附近。白箭头表示切割区域。（B） 使用成像软件监测 ROI1 中 [Glu]apo签名的量化。黑色箭头表示切割时间。请单击此处查看此图的较大版本。

电影S1:机械受伤后长途Ca2+变速器。叶1（L1）的皮毛的机械伤造成[Ca2]细胞增加，传染给树叶[例如，叶3（L3）和叶6（L6）]。请点击这里下载这部电影。

电影 S2: 为响应切割而提升可塑性谷氨酸水平。 叶1（L1）的机械伤造成[格鲁]阿波立即增加。请点击这里下载这部电影。

电影 S3: 响应切割而提升 [Ca2]细胞水平。叶1 （L1） 边缘的机械伤害立即造成局部 [Ca2]细胞高程。请点击这里下载这部电影。

电影 S4: 谷氨酸的应用触发系统 [Ca2+]细胞增加。应用 100 mM 谷氨酸触发 Ca2+传输到系统叶 [例如， 叶 3 （L3）， 叶 4 （L4） 和叶 6 （L6）].请点击这里下载这部电影。

作者没有任何利益冲突。