拟南芥中局部与系统性伤口信号的宽场实时成像

摘要

胞外谷氨酸触发的系统性钙信号在植物响应机械损伤和食草动物攻击的防御反应诱导中起关键作用。本文介绍了一种利用表达钙离子和谷氨酸敏感型荧光生物传感器的拟南芥（Arabidopsis thaliana）植株，来可视化这两种因子时空动态的方法。

摘要

植物在受到机械胁迫（如损伤和食草动物取食）时，会在受损部位及远离损伤的未受损部位诱导产生防御反应。当叶片受到损伤时，细胞质内钙离子浓度（Ca²⁺）迅速升高，这一变化作为早期信号触发长距离系统性信号传导。该过程涉及多种信号分子的级联反应，包括茉莉酸（jasmonic acid, JA）、乙烯（ethylene, ET）和活性氧（reactive oxygen species, ROS）。这些信号分子通过维管系统在植物体内传播，激活远端组织中防御相关基因的表达，从而增强对后续胁迫的抗性。系统性信号的传播速度可达每分钟数厘米，依赖于韧皮部和木质部的连通性。此外，电化学信号（如动作电位和系统电位）也被认为在快速响应中发挥重要作用。通过遗传学和成像技术（如GCaMP钙探针）的研究表明，Ca²⁺波的传播与系统性防御反应的启动密切相关。该机制使植物能够在局部损伤后迅速协调全株范围的防御准备，提高生存适应性。 关键词：植物防御反应，机械损伤，钙信号，系统性信号，茉莉酸，乙烯，活性氧，电化学信号，GCaMP²⁺ 信号）出现在伤口部位。该信号会迅速传递至未受损的叶片，从而激活防御反应。我们近期的研究发现，叶片受伤细胞泄漏到周围胞外空间（apoplast）中的谷氨酸可作为伤口信号。该谷氨酸激活类谷氨酸受体的Ca²⁺ 可渗透通道，进而引发长距离的 Ca²⁺ 信号在植物体内的传播。通过实时成像表达基因编码荧光生物传感器的活体植物，可捕捉这些事件的空间和时间特征。本文介绍一种全植株水平的实时成像方法，用于监测Ca²⁺ 响应损伤时胞外谷氨酸的信号与变化。该方法采用宽场荧光显微镜和转基因植株 拟南芥 表达基于绿色荧光蛋白（GFP）的Ca²⁺ 和谷氨酸生物传感器。此外，我们介绍了可简便诱导伤口引发、谷氨酸触发的快速长距离Ca²⁺ 信号传导。该方案也可应用于其他植物胁迫的研究，有助于探究植物系统性信号在这些胁迫的信号传导与响应网络中的作用。

引言

植物无法逃避生物胁迫，例如昆虫取食，因此它们进化出了复杂的胁迫感知和信号转导系统，以检测并抵御诸如植食性动物取食等威胁¹。在受到机械损伤或植食性动物攻击后，植物会迅速启动防御反应，不仅在受伤部位，而且在未受损的远端器官中积累植物激素茉莉酸（jasmonic acid, JA）²。这种茉莉酸不仅在直接受损组织中触发防御反应，还能预先诱导植物未受损部位的防御机制。在拟南芥（Arabidopsis）中，机械损伤诱导的茉莉酸积累可在植株其他部位受损后的几分钟内就在远端完整叶片中被检测到，这表明存在一种快速的长距离信号从受伤叶片传递至其他部位³。目前已有多种候选信号分子被提出可能作为植物中的长距离损伤信号，包括Ca²⁺、活性氧（reactive oxygen species, ROS）以及电信号等^4,5。

Ca²⁺ 是真核生物中最多功能且普遍存在的第二信使元素之一。在植物中，毛虫啃食和机械损伤会导致胞质Ca²⁺浓度急剧升高²⁺ 浓度（[Ca²⁺]_细胞毒性在受伤叶片以及未受伤的远端叶片中^6,7. 这种全身性Ca²⁺ 信号由细胞内Ca²⁺-感应蛋白，可导致 激活包括JA生物合成在内的下游防御信号通路^8,9. 尽管已有大量此类报道支持Ca的重要性²⁺ 植物伤口响应中的信号，关于Ca时空特性的信息²⁺ 伤口诱导的信号是有限的。

使用基因编码的钙指示剂进行实时成像²⁺ 指示剂是监测和量化Ca时空动态的有力工具²⁺ 信号。迄今为止，已开发出此类传感器的多个版本，能够实现对Ca的可视化²⁺ 从单个细胞水平的信号到组织、器官乃至整个植株的信号¹⁰首个可遗传编码的Ca生物传感器²⁺ 在植物中使用的发光蛋白是源自水母的生物发光蛋白aequorin Aequorea victoria¹¹尽管这种化学发光蛋白已被用于检测Ca²⁺ 植物在响应各种胁迫时的变化^{12,13,14,15,16,17,18}，由于其产生的发光信号极弱，不适合用于实时成像。基于荧光共振能量转移（FRET）的Ca²⁺ 指示剂，例如黄色彩虹蛋白（Yellow cameleons），也已成功用于研究多种 Ca 的动态变化²⁺ 植物中的信号事件^{19,20,21,22,23,24}这些传感器可与成像方法兼容，通常由Ca²⁺ 结合蛋白钙调蛋白（CaM）以及来自肌球蛋白轻链激酶的CaM结合肽（M13），全部融合于两个荧光蛋白之间，通常为青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白变体（YFP）¹⁰钙²⁺ 与CaM结合会促进CaM与M13之间的相互作用，导致传感器发生构象变化。该变化促进CFP与YFP之间的能量转移，从而增强YFP的荧光强度，同时降低CFP的荧光发射。通过监测CFP向YFP荧光的这种转移变化，即可反映Ca²⁺浓度的升高。²⁺ 水平。除了这些FRET传感器外，还有基于单一荧光蛋白（FP）的Ca²⁺ 生物传感器，例如 GCaMP 和 R-GECO，也适用于植物成像方法，并被广泛用于研究 [Ca²⁺]_细胞毒性 由于其高灵敏度和使用便捷性而发生变化^{25,26,27,28,29,30}GCaMP包含一个单体环状排列（cp）的GFP，再次与CaM和M13肽段融合。该Ca²⁺依赖性相互作用引起CaM与M13之间的结合，导致传感器发生构象变化，促进cpGFP质子化状态的转变，从而增强其荧光信号。因此，随着Ca²⁺²⁺ 水平升高时，cpGFP信号增强。

为了研究机械损伤或植食性动物取食所引发的 Ca²⁺ 信号动态变化，我们使用了表达 GCaMP 变体 GCaMP3 的转基因Arabidopsis thaliana植株，并结合宽场荧光显微镜技术⁶。该方法成功实现了对从叶片损伤部位向整株植物传播的长距离 Ca²⁺ 信号的可视化观察。结果显示，在损伤部位立即检测到 [Ca²⁺]_cyt 升高，随后该 Ca²⁺ 信号在数分钟内通过维管组织传播至邻近叶片。此外，我们发现，在两个谷氨酸受体样基因Glutamate Receptor Like（GLR）GLR3.3 和 GLR3.6 发生突变的Arabidopsis植株中，这种快速的系统性损伤信号传递被完全阻断⁶。GLR 蛋白似乎作为氨基酸门控的 Ca²⁺ 通道，参与多种生理过程，包括损伤响应³、花粉管生长³¹、根系发育³²、低温响应³³以及先天免疫³⁴。尽管 GLR 的广泛生理功能已被较为深入地认识，但关于其功能特性（如配体特异性、离子选择性和亚细胞定位）的信息仍然有限³⁵。然而，最近的研究报道显示，GLR3.3 和 GLR3.6 分别定位于韧皮部和木质部。植物 GLR 与哺乳动物中的离子型谷氨酸受体（iGluRs）具有相似性³⁶，后者在哺乳动物神经系统中可被谷氨酸、甘氨酸和 D-丝氨酸等氨基酸激活³⁷。事实上，我们已证明，在损伤部位施加 100 mM 谷氨酸（而非其他氨基酸）可在Arabidopsis中诱导产生快速的长距离 Ca²⁺ 信号，表明胞外谷氨酸可能在植物中充当损伤信号分子⁶。该反应在glr3.3/glr3.6 突变体中被消除，提示谷氨酸可能通过其中一个或两个受体样通道发挥作用；事实上，AtGLR3.6 最近已被证实可被该浓度的谷氨酸激活³⁸。

在植物中，谷氨酸除了作为结构氨基酸外，还被认为是一种关键的发育调控因子³⁹；然而，其时空动态尚不清楚。与Ca²⁺类似，已有多种基因编码的谷氨酸探针被开发出来，用于监测活细胞中这种氨基酸的动态变化^40,41。iGluSnFR是一种基于GFP的单荧光蛋白谷氨酸生物传感器，由cpGFP和来自Escherichia coli的谷氨酸结合蛋白（GltI）组成^42,43。当谷氨酸结合到GltI上时，会引起iGluSnFR的构象变化，从而增强GFP的荧光发射。为了研究细胞外谷氨酸是否在植物伤口响应中充当信号分子，我们将iGluSnFR序列与基本几丁质酶信号肽分泌序列（CHIB-iGluSnFR）连接，以使该生物传感器定位于质外体空间⁶。该方法使得利用表达该传感器的转基因Arabidopsis植株对质外体谷氨酸浓度（[Glu]_apo）的任何变化进行成像成为可能。我们在伤口部位检测到iGluSnFR信号迅速升高。这些数据支持了如下观点：损伤后，谷氨酸从受损的细胞/组织泄漏至质外体，作为损伤信号激活GLRs，从而引发植物体内远距离的Ca²⁺信号⁶。

本文介绍了一种利用基因编码的生物传感器进行全植株实时成像的方法，用于监测和分析机械损伤后长距离传递的Ca²⁺和细胞外谷氨酸信号的动力学过程⁶。宽场荧光显微镜与表达基因编码生物传感器的转基因植物的结合，为检测快速传播的长距离信号（如Ca²⁺波）提供了一种强大且易于实施的技术手段。

方案

1. 植物材料准备

1. 在1.5 mL离心管中，对种子进行表面灭菌 拟南芥 （Col-0生态型）植物，表达GCaMP3或CHIB-iGluSnFR，用20% (v/v) NaClO振荡处理3分钟，然后用无菌蒸馏水洗涤5次。
   注意：转基因品系的 拟南芥 表达 GCaMP3 或 CHIB-iGluSnFR 的方法此前已有描述⁶.
2. 在无菌操作台中，将13粒表面灭菌的种子播种于盛有30 mL无菌（经高压灭菌）Murashige和Skoog（MS）培养基（1× MS盐、1%（w/v）蔗糖、0.01%（w/v）肌醇、0.05%（w/v）MES）的10 cm方形塑料培养皿中 和0.5%（w/v）结冷胶；用1N KOH调节pH至5.7]。盖上盖子，并用医用胶带封好。
3. 在4 °C避光孵育2天后，将培养皿水平放置于生长室中，在22 °C下持续光照（90–100 µmol m⁻² s⁻¹）条件下培养^-2 s^-1）约2周后使用。2周后，统计数量 拟南芥 从最老到最年轻的叶片⁴⁴ (图1）。伤口反应优先从受损叶片（n）传递至编号为 n ± 3 和 n ± 5 的叶片⁶.
   注意：在本实验方案中，将打开培养皿以在荧光显微镜下观察伤口及谷氨酸效应。因此，本实验的后续步骤应在温度和湿度受控的环境中进行。这是因为 Ca²⁺ 信号也会由这些环境条件的变化所引发。此外，已知在记录过程中显微镜发出的蓝光（用于激发生物传感器蛋白的荧光）可能引起细胞质Ca²⁺浓度升高²⁺ 浓度⁴⁵ 因此，在开始实验前，应将植物在蓝光照射下适应数分钟。

2. 化学试剂的制备

1. 将L-谷氨酸溶解于液体培养基[1/2×MS盐、1% (w/v) 蔗糖 和0.05% (w/v) MES；用1N KOH调节pH至5.1]中，配制成100 mM的工作液。
   注意：避免使用谷氨酸盐类（如谷氨酸钠），以防止阳离子对Ca²⁺动态的潜在影响。

3. 显微镜设置与实时成像操作

1. 打开配备有1倍物镜（NA = 0.156）和sCMOS相机的电动荧光体视显微镜图2）并将设备设置为使用470/40 nm激发光照射，同时采集透过535/50 nm滤光片的发射光。
   注意：任何对GFP敏感的荧光显微镜均可用于检测GCaMP3和iGluSnFR信号 实时成像推荐使用低倍物镜以及配备大尺寸sCMOS芯片的高灵敏度相机，以捕获整株植物的信号。低倍物镜可实现对整株植物的成像 拟南芥 植物的响应，并利用高灵敏度相机实现快速数据采集，以捕捉伤口诱导的Ca²⁺信号的快速动态过程²⁺ 波。本研究中使用的荧光显微镜，其视场最大值为3 cm × 3 cm，时间分辨率最高为每秒30帧（fps）。
2. 移去盖子，将培养皿置于物镜下方。
3. 检测植物的荧光信号，然后在黑暗中等待约30分钟，直至植物适应新的环境条件。此适应步骤是必要的，因为湿度的变化会引发[Ca²⁺]_细胞毒性 植物中可能干扰任何与伤口相关事件的升高现象。
4. 调整焦距和放大倍数，使整个植株位于视野中。在本实验方案中，使用了0.63倍的放大倍数。
5. 开始实时成像前，使用显微镜成像软件设置采集参数以检测荧光信号。本实验方案中的成像设置如下：曝光时间设为1.8 s，时间间隔设为2 s（即0.5 fps），记录时间设为11 min。
6. 实验开始前，先对植物进行5分钟的成像，使其适应显微镜的蓝光照射，然后点击开始记录 立即运行，或所用显微镜软件中的等效命令。为确定平均基础荧光值，在划痕损伤或谷氨酸处理前至少记录10帧图像（即本实验方案中至少20秒）（见第4节）。
   1. 用于伤口诱导的[Ca²⁺]_细胞毒性 和 [Glu]_apo 变化，用剪刀剪断L1叶片的叶柄或中部区域（图3 和 图 4).
   2. 用于谷氨酸触发的[Ca²⁺]_细胞毒性 变化，用剪刀沿主脉横切第一片叶子的叶缘（距叶尖约1 mm）。经过至少20分钟的恢复期后，将10 µL 100 mM 谷氨酸溶液施加到叶片的切面上图5).
      注意：预先切割叶片是必要的，以便谷氨酸能够进入叶片的质外体，从而触发响应。此外，研究发现，在施加谷氨酸之前恢复期间，向叶片L1的切面滴加一滴蒸馏水对于防止样品失水干燥至关重要。
7. 完成11分钟的记录后，保存数据。

4. 数据分析

1. 为进行随时间变化的荧光强度分析，在需要分析荧光强度的位置定义一个感兴趣区域（ROI）（图6 和 图7）。为计算 Ca²⁺ 波的速度，定义两个用于分析的 ROI（ROI1 和 ROI2）。在成像软件中，点击 Time Measurement | Define | Circle。通过点击 Annotations and Measurement | Length | Simple Line 测量 ROI1 与 ROI2 之间的距离（图6）。
2. 点击 Measure，测量每个 ROI 随时间变化的原始荧光值（F）。将原始数据导出至 电子表格软件，通过点击 All to Excel | Export 将荧光信号转换为每个时间点的数值。
3. 通过计算记录数据中前10帧（即处理前）F 的平均值，确定基线荧光值，记为 F₀。
4. 使用公式 ΔF/F = (F−F₀)/F₀ 对 F 数据进行归一化处理（即计算 ΔF/F），其中 ΔF 表示荧光随时间的变化量。
5. 对于 Ca²⁺  波速度分析，将每个 ROI 中显著高于刺激前水平的信号上升点定义为检测到 Ca²⁺ 增加的时间点（t₁ 和 t₂），判定标准为信号上升至基于 F₀ 数据计算所得标准差的2倍（2×SD）。统计学上，95% 的 F₀ 数据落在均值 ±2×SD 范围内，表明信号随机超过该水平的概率 ≤5%。计算 ROI1 与 ROI2 之间 Ca²⁺ 增加的时间差 [t₂ - t₁，即时间滞后（Δt）]，并测量 ROI1 与 ROI2 之间的距离，进而确定 Ca²⁺ 波的传播速度。

结果

对机械损伤响应的细胞质[Ca²⁺]_cyt和胞外[谷氨酸]_apo信号传播如图3、图4、视频S1和视频S2所示。在表达GCaMP3的植株中切割第1片叶片的叶柄（0秒时），导致[Ca²⁺]_cyt显著升高，该信号迅速在维管组织局部被诱导（40秒时）（图3和视频S1）。随后，该信号在数分钟内快速传播至邻近叶片（第3和第6片叶）（80秒时）（图3和视频S1）。

在表达 CHIB-iGlu...

讨论

系统性信号传导对于植物响应局部外界环境刺激并在整体植株水平上维持其稳态至关重要。尽管植物不具备动物那样发达的神经系统，但它们依赖于器官内部及器官之间快速的通讯机制，其基础包括可移动的电信号（可能还包括液压信号）以及活性氧（ROS）和Ca^2+ 46,47的传播性波动。上述方案可通过监测创伤响应中Ca²⁺和质外体谷氨酸的动力学变化，实现对整个植株信号系统活动的实时成像。该方法结合了高时空分辨率和操作简便性，为研究植物中快速、长距离信号传递提供了强有力的工具。此外，该方案还具有揭示长距离创伤信号传导背后分子机制新生理见解的潜力，例如利用在快速信号系统中假定组分存在缺陷的突变体，或通过药理学试剂（如Ca²⁺通道阻断剂LaCl₃）及其他潜在关键信号活动抑制剂的作用进行探索⁶。

所述生物传感器成像方法的一个重要优势是使用了具有高荧光产...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Arabidopsis 表达GCaMP3	埼玉大学
Arabidopsis 表达CHIB-iGluSnFR	埼玉大学
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-谷氨酸	FUJIFILM Wako	072-00501	溶于液体培养基[1/2×MS盐、1%（w/v）蔗糖和0.05%（w/v）MES；用1N KOH调节pH至5.1]。
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige和Skoog（MS）培养基	FUJIFILM Wako	392-00591	成分：1×MS盐、1%（w/v）蔗糖、0.01%（w/v）肌醇、0.05%（w/v）MES和0.5%（w/v）结冷胶；用1N KOH调节pH至5.7。
Nikon SMZ25体视显微镜	Nikon
NIS-Elements AR分析软件	Nikon
1×物镜（P2-SHR PLAN APO）	Nikon
sCMOS相机（ORCA-Flash4.0 V2）	滨松光子学	C11440-22CU
方形塑料培养皿	Simport	D210-16