拟南芥中局部与系统性伤口信号的宽场实时成像

摘要

胞外谷氨酸触发的系统性钙信号在植物响应机械损伤和食草动物攻击的防御反应诱导中起关键作用。本文介绍了一种利用表达钙离子和谷氨酸敏感型荧光生物传感器的拟南芥（Arabidopsis thaliana）植株，来可视化这两种因子时空动态的方法。

摘要

植物在受到机械胁迫（如损伤和食草动物取食）时，会在受损部位及远离损伤的未受损部位诱导产生防御反应。当叶片受到损伤时，细胞质内钙离子浓度（Ca²⁺）迅速升高，这一变化作为早期信号触发长距离系统性信号传导。该过程涉及多种信号分子的级联反应，包括茉莉酸（jasmonic acid, JA）、乙烯（ethylene, ET）和活性氧（reactive oxygen species, ROS）。这些信号分子通过维管系统在植物体内传播，激活远端组织中防御相关基因的表达，从而增强对后续胁迫的抗性。系统性信号的传播速度可达每分钟数厘米，依赖于韧皮部和木质部的连通性。此外，电化学信号（如动作电位和系统电位）也被认为在快速响应中发挥重要作用。通过遗传学和成像技术（如GCaMP钙探针）的研究表明，Ca²⁺波的传播与系统性防御反应的启动密切相关。该机制使植物能够在局部损伤后迅速协调全株范围的防御准备，提高生存适应性。 关键词：植物防御反应，机械损伤，钙信号，系统性信号，茉莉酸，乙烯，活性氧，电化学信号，GCaMP²⁺ 信号）出现在伤口部位。该信号会迅速传递至未受损的叶片，从而激活防御反应。我们近期的研究发现，叶片受伤细胞泄漏到周围胞外空间（apoplast）中的谷氨酸可作为伤口信号。该谷氨酸激活类谷氨酸受体的Ca²⁺ 可渗透通道，进而引发长距离的 Ca²⁺ 信号在植物体内的传播。通过实时成像表达基因编码荧光生物传感器的活体植物，可捕捉这些事件的空间和时间特征。本文介绍一种全植株水平的实时成像方法，用于监测Ca²⁺ 响应损伤时胞外谷氨酸的信号与变化。该方法采用宽场荧光显微镜和转基因植株 拟南芥 表达基于绿色荧光蛋白（GFP）的Ca²⁺ 和谷氨酸生物传感器。此外，我们介绍了可简便诱导伤口引发、谷氨酸触发的快速长距离Ca²⁺ 信号传导。该方案也可应用于其他植物胁迫的研究，有助于探究植物系统性信号在这些胁迫的信号传导与响应网络中的作用。

引言

植物无法逃避生物胁迫，例如昆虫取食，因此它们进化出了复杂的胁迫感知和信号转导系统，以检测并抵御诸如植食性动物取食等威胁¹。在受到机械损伤或植食性动物攻击后，植物会迅速启动防御反应，不仅在受伤部位，而且在未受损的远端器官中积累植物激素茉莉酸（jasmonic acid, JA）²。这种茉莉酸不仅在直接受损组织中触发防御反应，还能预先诱导植物未受损部位的防御机制。在拟南芥（Arabidopsis）中，机械损伤诱导的茉莉酸积累可在植株其他部位受损后的几分钟内就在远端完整叶片中被检测到，这表明存在一种快速的长距离信号从受伤叶片传递至其他部位³。目前已有多种候选信号分子被提出可能作为植物中的长距离损伤信号，包括Ca²⁺、活性氧（reactive oxygen species, ROS）以及电信号等^4,5。

Ca²⁺ 是真核生物中最多功能且普遍存在的第二信使元素之一。在植物中，毛虫啃食和机械损伤会导致胞质Ca²⁺浓度急剧升高²⁺ 浓度（[Ca²⁺]_细胞毒性在受伤叶片以及未受伤的远端叶片中

方案

1. 植物材料准备

1. 在1.5 mL离心管中，对种子进行表面灭菌 拟南芥 （Col-0生态型）植物，表达GCaMP3或CHIB-iGluSnFR，用20% (v/v) NaClO振荡处理3分钟，然后用无菌蒸馏水洗涤5次。
   注意：转基因品系的 拟南芥 表达 GCaMP3 或 CHIB-iGluSnFR 的方法此前已有描述⁶.
2. 在无菌操作台中，将13粒表面灭菌的种子播种于盛有30 mL无菌（经高压灭菌）Murashige和Skoog（MS）培养基（1× MS盐、1%（w/v）蔗糖、0.01%（w/v）肌醇、0.05%（w/v）MES）的10 cm方形塑料培养皿中 和0.5%（w/v）结冷胶；用1N KOH调节pH至5.7]。盖上盖子，并用医用胶带封好。
3. 在4 °C避光孵育2天后，将培养皿水平放置于生长室中，在22 °C下持续光照（90–100 µmol m⁻² s⁻¹）条件下培养^-2 s^-1）约2周后使用。2周后，统计数量 拟南芥 从最老到最年轻的叶片⁴⁴ (图1）。伤口反应优先从受损叶片（n）传递至编号为 n ± 3 和 n ± 5 的叶片⁶.

结果

对机械损伤响应的细胞质[Ca²⁺]_cyt和胞外[谷氨酸]_apo信号传播如图3、图4、视频S1和视频S2所示。在表达GCaMP3的植株中切割第1片叶片的叶柄（0秒时），导致[Ca²⁺]_cyt显著升高，该信号迅速在维管组织局部被诱导（40秒时）（图3和视频S1）。随后，该信号在数分钟内快速传播至邻近叶片（第3和第6片叶）（80秒时）（图3和视频S1）。

在表达 CHIB-iGlu.......

讨论

系统性信号传导对于植物响应局部外界环境刺激并在整体植株水平上维持其稳态至关重要。尽管植物不具备动物那样发达的神经系统，但它们依赖于器官内部及器官之间快速的通讯机制，其基础包括可移动的电信号（可能还包括液压信号）以及活性氧（ROS）和Ca^2+ 46,47的传播性波动。上述方案可通过监测创伤响应中Ca²⁺和质外体谷氨酸的动力学变化，实现对整个植株信号系统活动的实时成像。该方法结合了高时空分辨率和操作简便性，为研究植物中快速、长距离信号传递提供了强有力的工具。此外，该方案还具有揭示长距离创伤信号传导背后分子机制新生理见解的潜力，例如利用在快速信号系统中假定组分存在缺陷的突变体，或通过药理学试剂（如Ca²⁺通道阻断剂LaCl₃）及其他潜在关键信号活动抑制剂的作用进行探索⁶。

所述生物传感器成像方法的一个重要优势是使用了具有高荧光产.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Arabidopsis 表达GCaMP3	埼玉大学
Arabidopsis 表达CHIB-iGluSnFR	埼玉大学
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-谷氨酸	FUJIFILM Wako	072-00501	溶于液体培养基[1/2×MS盐、1%（w/v）蔗糖和0.05%（w/v）MES；用1N KOH调节pH至5.1]。
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige和Skoog（MS）培养基	FUJIFILM Wako	392-00591	成分：1×MS盐、1%（w/v）蔗糖、0.01%（w/v）肌醇、0.05%（w/v）MES和0.5%（w/v）结冷胶；用1N KOH调节pH至5.7。
Nikon SMZ25体视显微镜	Nikon
NIS-Elements AR分析软件	Nikon
1×物镜（P2-SHR PLAN APO）	Nikon
sCMOS相机（ORCA-Flash4.0 V2）	滨松光子学	C11440-22CU
方形塑料培养皿	Simport	D210-16