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Developmental Biology

从特纳综合征（45XO）胎儿细胞生成诱导多能干细胞，用于与该综合征相关的神经功能障碍的下游建模

Published: December 4, 2021 doi: 10.3791/62240
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Karnataka, India-576104, 2Department of Medical Genetics, Manipal Hospitals
* These authors contributed equally

Summary

该协议描述了通过核切除递递递外体质粒，然后描述用于iPSC表征和神经元分化的方法，从胎儿组织成纤维细胞中产生整合的游离iPSCs。

Abstract

染色体非整倍体可引起严重的先天性畸形，包括中枢神经系统畸形和胎儿死亡。产前遗传学筛查纯粹是诊断性的，并不能阐明疾病机制。虽然来自非整倍体胎儿的细胞是带有染色体非整倍性的宝贵生物材料，但这些细胞的寿命很短，限制了它们在下游研究实验中的应用。诱导多能干细胞（iPSC）模型的生成是细胞制备非整倍体性状永久保存的有效方法。它们是自我更新的，并分化成特化细胞，让人联想到胚胎发育。因此，iPSC是研究早期发育事件的极好工具。特纳综合征（TS）是一种与完全或部分缺失的X染色体相关的罕见疾病。该综合征的特征是不孕症，身材矮小，内分泌，代谢，自身免疫和心血管疾病以及神经认知缺陷。以下方案描述了从TS（45XO）胎儿组织中分离和培养成纤维细胞，通过细胞核切除递送表观体重编程质粒，然后进行表征，从而产生整合游离的TsiPSCs。重新编程的TSIPSCs最初通过活细胞碱性磷酸酶染色进行筛选，然后对多能性生物标志物进行广泛的探测。对选定的菌落进行机械解剖，传代几次，并使用稳定的自我更新细胞进行进一步的实验。细胞表达多能转录因子OCT4、NANOG、SOX2、细胞表面标志物SSEA 4和TRA1-81是典型的多能干细胞。最初的45XO核型在重新编程后保留。TSiPSCs能够形成胚状体并分化成内胚层，中胚层和表达外胚层的细胞谱系特异性生物标志物（（SRY BOX17），（肌球蛋白室重性CHAINα / β），（βIII管蛋白））。外源性外生体质粒自发丢失，在细胞中第15代后未检测到。这些TSiPSCs是一种宝贵的细胞资源，用于模拟导致与特纳综合征相关的神经认知缺陷的有缺陷的分子和细胞神经发育。

Introduction

非整倍体导致人类出生缺陷/先天性畸形和妊娠丢失。~50%-70%的妊娠丢失标本显示细胞遗传学异常。在怀孕早期丢失的非整倍体胚胎不容易获得用于实验分析，因此需要开发其他密切代表人类胚胎发生的模型。来自被诊断患有遗传疾病的细胞的诱导多能干细胞（iPSCs）已被用于模拟代表性的遗传不规则性及其对胎儿发育的影响1，2，3，4。这些iPSC类似于发育中胚胎的外胚层细胞，可以概括胚胎形成的早期事件。它们允许理解和表征早期哺乳动物胚胎中细胞谱系和模式的发育程序。iPSCs以前来自皮肤成纤维细胞和羊膜细胞，来自非整倍性综合征的产前诊断测试，如单体X（特纳综合征），8三体性（Warkany综合征2），13三体性（Patau综合征）和部分三体11;22（伊曼纽尔综合征）提供了有关失败发展的宝贵见解4。

特纳综合征（TS）是一种罕见的疾病，其特征是女性不育，身材矮小，内分泌和代谢紊乱，自身免疫性疾病风险增加以及心血管疾病易感性5。虽然它是唯一可存活的单体综合征，但它对导致自然流产的发育中的胚胎也是致命的6。TS的存活个体表现出细胞中X染色体物质的改变程度。核型的范围从完全失去一条X染色体（45，XO）到像45，XO / 46，XX这样的马赛克;45，XO / 47，XXX，环形染色体的存在，Y染色体物质的存在等5。

该综合征的诊断通常通过对有症状个体的血液进行核型分析，并进行绒毛膜绒毛取样 （CVS） 以检测早期非整倍性综合征。由于非整倍性综合征约占自然流产的30%，因此在自然流产时对受孕产物（POC）进行核型分析是常规的。这些胎儿细胞包括具有细胞遗传学异常的绒毛膜绒毛和衍生自它们的iPSCs，为研究非整倍性综合征4，6提供了宝贵的生物材料来源。TS iPSCs先前已通过逆转录病毒重编程4从羊膜细胞，通过逆转录病毒重编程6从羊膜细胞，通过逆转录病毒重编程6从绒毛膜绒毛的成纤维细胞（通过产前诊断获得）建立，通过仙台病毒重编程从血液单核细胞7通过慢病毒重编程从TS个体的皮肤成纤维细胞4建立。.由于我们实验室的主要重点是了解发育障碍，因此我们从POC中产生了TS iPSCs，特别是自然流产的绒毛膜绒毛成分8。从该胎儿组织中分离出的所有细胞均具有45XO核型，并产生具有相同核型的iPSCs。这些iPSC是独一无二的，因为它们是第一个从流产胎儿产生的，并为研究非整倍性相关的妊娠失败提供了宝贵的资源。本文提供了通过外显体重编程从这种独特的细胞源产生iPSCs的详细方法。

iPSC生成的早期方法使用病毒转导和转座子来传递重编程因子。诱导细胞多能性的方法已经从使用整合逆转录病毒载体9、可切除慢病毒载体10、11和基于转座子的方法12发展到非整合性腺病毒载体13和仙台病毒载体14。基于逆转录病毒和慢病毒的重编程虽然有效，但涉及将重编程因子整合到宿主染色体中，导致插入突变，从而在iPSC中产生不可预见的影响。此外，基于病毒的重编程可防止 iPSC 的转化应用。已经探索了基于RNA的系统15和直接蛋白递送16，以完全消除与使用病毒和DNA转染相关的潜在风险。然而，这些方法已被证明是低效的。

2011年，Okita等人报道了通过shRNA增强TP53抑制的外生质粒来提高重编程效率。他们还用非转化性LMYC（与MYC相关的小细胞肺癌）代替了cMYC，以提高hiPSC的安全性。这些外生体质粒表达5种重编程因子：OCT4，LIN28，SOX2，KLF4，LMYC和shRNA用于TP5317，18。这些载体在染色体外保持，并在连续培养时从重编程的细胞中丢失，从而使品系在10-15次传代内无转基因。核细胞分离是一种特殊形式的电穿孔，可将核酸直接输送到宿主细胞的细胞核中。它是将重编程质粒递送到各种细胞类型的有效方法。外显体质粒具有成本效益，并补偿了细胞核摘除的高成本。该方法在优化条件下高效且可重复，可从各种体细胞中产生稳定的iPSC。在该协议中，我们描述了通过对外显体重编程质粒进行核切除术，从胎儿组织中分离的成纤维细胞产生iPSCs的方法。以下是从胎儿绒毛膜绒毛中分离成纤维细胞，质粒纯化，核切除，从重编程板中挑选集落以及建立稳定的iPSCs的详细方案。

必须确认新生成的iPSC中存在多能性状。这包括多能性相关因素的证明（例如，碱性磷酸酶表达，NANOG，SSEA4，Tra 1-80，Tra 1-81，E-钙粘蛋白;通常用免疫荧光或基因表达测定显示），通过体外分化测定鉴定三个胚层以验证其分化潜力，核型分析以确定染色体含量，STR分型以建立与亲本细胞的身份，验证外源性基因的丢失， 以及更严格的体内检测，如畸胎瘤形成和四倍体互补。在这里，我们描述了核型分析的表征方案，活细胞碱性磷酸酶染色，通过免疫荧光检测多能性相关生物标志物，体外分化测定和证明外源基因丢失的方法19。

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Protocol

FCV是在马尼帕尔医院伦理委员会的批准下从班加罗尔的马尼帕尔医院获得的。

注：所有缓冲液和溶液的组成见表1。

1. 从胎儿绒毛膜绒毛（FCV）中分离成纤维细胞

  1. 胶原酶中的样本采集和组织分解
    1. 在无菌条件下在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中收集FCV，并将（室温下）转运到细胞培养设施。
    2. 将绒毛转移到60毫米培养皿中，并在含有1x抗生素抗真菌剂溶液（PBS-AA）的PBS中洗涤几次（至少4次）。通过移液完全去除PBS-AA。
    3. 用1 mL胶原酶混合物（5mg / mL）在37°C下处理绒毛膜绒毛5分钟。
    4. 用含有10%胎牛血清（FBS）的细胞培养基中和，将消化物转移到15mL管中，并以225×g离心5分钟以收集分解的绒毛和释放的细胞作为沉淀。
  2. 亚文化和种群扩张
    1. 将绒毛与释放的细胞一起在含有5mL完整培养基（例如AmnioMAX）的T25培养瓶中分解，并生长直至获得汇合成纤维细胞培养物。
    2. 扩增培养物中的成纤维细胞，以制备储液，用于随后的转染和表征实验，如下所示：
      1. 将2mL0.05%胰蛋白酶加入含有FCV成纤维细胞的T25烧瓶中，并在37°C下孵育3-5分钟以解离细胞。
      2. 孵育后，通过添加FBS（与胰蛋白酶相同体积）中和胰蛋白酶。
        注意：当以1：3的胰蛋白酶：培养基比例加入时，含有FBS的培养基也可用于中和胰蛋白酶。
      3. 将解离的细胞收集在15mL管中，并以225×g离心5分钟以获得细胞沉淀。
      4. 倾析上清液并将细胞沉淀重悬于1mL完整培养基中。
      5. 将500μL每个转移到60mm组织培养皿中，并将体积组成5mL。这种1：2的分裂比例也用于后续的段落。
  3. 冷冻保存
    1. 按照步骤1.2.2.1 - 1.2.2.3中所述，使用0.05%胰蛋白酶进行酶解解离并获得细胞沉淀。
    2. 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于1mL冷冻混合物中，该混合物包含1：9二甲基亚砜（DMSO）：FBS。
    3. 将内容物转移到无菌冷冻管中，并将小瓶置于冷冻容器中。
    4. 在-80°C下冷冻过夜，然后第二天将小瓶转移到液氮（-196°C）中。

2. 质粒DNA分离和验证

  1. 细菌细胞制备
    1. 在单独的Luria Bertani-氨苄青霉素琼脂平板上含有三种单一质粒pCXLE-hOCT3/4-shp53-F，pCXLE-hSK和pCXLE-hUL（来自Addgene） 的大肠 杆菌条纹甘油储备。
    2. 将单个菌落接种到5 mL Luria Bertani-氨苄西林培养基的发酵培养物中。在37°C下摇动（10×g）孵育8小时。
    3. 将200μL该起始培养物接种到100mL Luria Bertani-氨苄西林培养基中。在37°C振荡孵育过夜。
    4. 通过在4°C下以6000×g离心15分钟收获过夜细菌培养物。
  2. 使用Midi质粒纯化试剂盒进行质粒分离
    1. 将细菌沉淀重悬于4 mL重悬缓冲液中。
    2. 加入4mL裂解缓冲液，通过剧烈倒置4-6次彻底混合，并在室温下孵育5分钟。
    3. 加入4 mL预冷中和缓冲液，倒置管4-6次，充分混合。在冰上孵育15分钟。
    4. 在4°C下以≥20，000×g离心30分钟。 在新鲜管中收集上清液，并在4°C下以≥20，000×g重新离心15分钟。
    5. 通过施用4mL平衡缓冲液来平衡色谱柱。
    6. 将上清液涂在色谱柱上。
    7. 用10 mL洗涤缓冲液洗涤柱两次。
    8. 用5 mL温（65°C）洗脱缓冲液洗脱DNA。
    9. 通过将3.5mL异丙醇加入洗脱的DNA来沉淀DNA。混合均匀。在4°C下以≥15，000×g离心30分钟。 小心倾析上清液。
    10. 用2mL 70%乙醇洗涤DNA沉淀，并以≥15，000×g离心10分钟。小心倾析上清液。
    11. 风干沉淀5-10分钟，并将DNA溶解在合适体积的PCR级水中，以获得1μg/ mL的最终浓度。
      注意：不要将DNA溶解在缓冲液中，因为它不适合电穿孔。旧的质粒DNA制备不会产生重编程的菌落。
  3. 通过 EcoRI 限制性酶切进行质粒验证
    1. 混合15μL无核酸酶水，2μL10x缓冲液，1μg质粒DNA和1μL EcoRI酶。轻轻混合。
    2. 将混合物在37°C下在热块中孵育15分钟。
    3. 将消化的质粒样品与6x DNA凝胶上样染料混合，并在1%琼脂糖凝胶上电泳，在1x TAE缓冲液中加入0.5μg/ mL溴化乙锭。包括标准 DNA 分子量标准品。在DNA适当解析后对凝胶进行成像。pCXLE-hOCT3 / 4-shp53-F的预期EcoRI条带尺寸为6，834 bp，3，758 bp和1，108 bp;pCXLE-hUL为10，200 bp和1，900 bp;pCXLE-hSK为10，200 bp和2，500 bp。

3. 细胞核切除术

  1. 细胞造粒
    1. 将分离的胎儿绒毛膜绒毛膜成纤维细胞放入 T25 培养瓶中，以 5 mL 完全培养基培养至 80-90% 汇合度。
    2. 用PBS洗涤细胞两次，并按照步骤1.2.2.1 - 1.2.2.3中所述进行胰蛋白酶消化。
    3. 除去上清液，将沉淀重悬于 5 mL 还原血清培养基（例如 Opti-MEM）中。用血细胞计数器计数细胞，取106 个细胞进行细胞核切除。以225×g离心5分钟。完全去除上清液。
  2. 试剂制备和核切除
    1. 通过混合0.5 mL补充剂和2.25 mL核电极溶液（均在试剂盒中提供）来制备核电极试剂。
    2. 在1.5mL管中加入100μL核电极溶液。将pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL各1μg加入试管中。在此混合物中轻轻重悬106 个细胞（从步骤3.1.2开始）。
    3. 将细胞DNA悬浮液转移到比色皿中，确保样品覆盖比色皿的底部（在试剂盒中提供）没有任何气泡。盖上比色皿并插入支架。选择核电筒程序U-23（用于高效率）并应用。
    4. 从支架中取出比色皿，然后加入 1 mL 完整培养基。将内容物轻轻转移到装有4mL完整培养基（共5mL培养基）的60mm组织培养皿中。将细胞在37°C的加湿CO2 培养箱中孵育。
    5. 24小时后，检查细胞是否附着。完全更换介质。
      注意：细胞核传染的细胞死亡率很高，留下很少的活细胞附着。
    6. 将细胞在完整培养基中保持10天，并在接下来的20天内转向多能培养基。
      注意：定期可视化细胞以跟踪重编程细胞中发生的形态变化（如上皮形态和致密集落形成），以确认实验是否有效。在多能培养基中培养20天后，可以看到大约25个iPSC菌落。

4. iPSC菌落的采摘和繁殖

  1. 从重编程板中挑选菌落
    1. 使用拉动的玻璃移液管或1 mL注射器针头手动解剖在重编程皿中形成的胚胎干细胞样菌落，并使用多能培养基将小鼠胚胎成纤维细胞饲养器转移到先前制备的板中，或在具有mTESR培养基的Matrigel涂层板上建立无饲养层培养物。
      注意：小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）使用从小鼠胚胎中酶分离（从怀孕13-14天的雌性小鼠中解剖）衍生出来，并通过丝裂霉素C处理进行有丝分裂灭活。通过将许多菌落从重编程板转移到单个培养皿来建立单克隆种群，或者通过将许多菌落从重编程板转移到单个培养皿来建立混合克隆种群。
  2. 将新兴菌落机械转移到新鲜饲养者和传代，以建立稳定的iPSC
    1. 通过每隔一天进食并在多能培养基中传播iPSCs，每5-7天分裂1：3。通过冷冻保存在KnockOut血清替代物和DMSO的冷冻混合物中以9：1的比例制备库存。
      注意：KnockOut血清替代物用于冷冻混合物中，用于iPSCs而不是FBS的冷冻保存，因为FBS中的组分可以在长期保存期间诱导多能细胞的分化。

5. iPSC的表征

注意：包括PCR和多能性生物标志物免疫染色在内的表征研究在第五代号之后进行。核型分析是在后来的段落编号处进行的。

  1. 核型分析
    1. 在37°C的加湿CO2 培养箱中将iPSCs与colcemid混合的60mm培养皿处理45分钟。
    2. 通过0.05%胰蛋白酶处理和离心收获。除去上清液并移取剩余的培养基痕迹以疏松细胞沉淀。
    3. 加入 5 mL 低渗溶液。通过倒置管混合并在37°C下孵育20分钟。 以225×g离心5分钟。
      注意：获得的颗粒应显得蓬松。
    4. 缓慢加入2.5毫升Carnoy的固定溶液，同时轻敲以松开沉淀。
    5. 通过将细胞悬浮液滴在干净的载玻片上来准备用于核型的涂抹酱。
    6. 用0.15%胰蛋白酶处理载玻片1分钟，并用PBS洗涤一次。然后用Giemsa溶液染色4分钟，最后用蒸馏水洗涤。使用适当的软件进行采集和处理。
  2. 无转基因状态的证明
    1. 基因组DNA分离
      1. 将20μL蛋白酶移入1.5mL微量离心管的底部。
      2. 将200μL重悬于PBS中的TSiPSCs加入微量离心管中。
      3. 向样品中加入200μL缓冲液AL，并通过脉冲涡旋混合15 s。
      4. 在56°C下孵育10分钟。
      5. 短暂离心微量离心管以除去盖子内侧的液滴。
      6. 向样品中加入200μL乙醇（96-100%），并通过脉冲涡旋再次混合15秒。混合后，短暂离心管以除去盖子内侧的滴剂。
      7. 小心地将上一步中的混合物涂抹到迷你离心柱（在2 mL收集管中）上，而不会润湿轮辋。合上盖子，以6000×g离心1分钟。丢弃含有滤液的管，并将迷你离心柱置于干净的2 mL收集管中。
      8. 小心打开迷你离心柱，在不润湿轮辋的情况下，加入500μL缓冲液AW1。合上盖子，以6000×g离心1分钟。将迷你离心柱放入干净的2 mL收集管中，并丢弃含有滤液的收集管。
      9. 小心打开迷你离心柱，加入500μL缓冲液AW2，不要润湿轮辋。合上盖子，全速（20，000 x g）离心3分钟。
      10. 将迷你离心柱放入新的2 mL收集管中，并丢弃带有滤液的旧收集管。全速离心1分钟，以消除缓冲液AW2可能残留的可能性。
      11. 将微型离心柱置于干净的1.5 mL微量离心管中，并丢弃含有滤液的收集管。小心打开迷你离心柱，加入200μL缓冲液AE或蒸馏水。在室温（15-25°C）下孵育5分钟，然后以6000×g离心1分钟。
    2. 无转基因状态 PCR（使用 KAPA 高保真聚合酶链试剂盒 KR0368）
      1. 确保所有试剂都正确解冻和混合。
      2. 根据 表2 制备含有适当体积的所有反应组分的PCR预混液（在冰上设置反应）。
      3. 将适当体积的 PCR 预混液、模板和引物转移到各个 PCR 管中。
      4. 盖上单个反应的盖子，混合并短暂离心。
      5. 执行PCR 操作，见表 3。
  3. 多能性生物标志物鉴定
    1. 碱性磷酸酶 （AP） 染色
      1. 通过将3μL500x储备溶液稀释在1.5mL DMEM / F-12中，每10cm 2培养区域，制备1x AP活染色工作溶液。
      2. 从iPSC培养皿中取出培养基。用DMEM / F-12洗涤培养物一次。将 1x AP 活性染色液加入 iPSC 中。在37°C孵育45分钟。
      3. 取出AP污渍，用DMEM / F-12洗涤两次。加入新鲜的DMEM / F-12，并在染色后30-90分钟内使用标准FITC滤光片在荧光显微镜下成像。
    2. 多能性生物标志物的免疫染色
      1. 在4°C下将融合的iPSC培养物与4%多聚甲醛固定过夜。 用PBS吐温20（PBST）洗涤三次，每次洗涤5分钟。
      2. 在室温下用0.3%Triton X-100在PBST中透化细胞15分钟。用PBST清洗三次。
        注意：仅对细胞内抗原进行通透。
      3. 在室温下用3%牛血清白蛋白（BSA）在PBST中阻断细胞30分钟。用一抗（在1%BSA中稀释1：1000）染色细胞过夜。一抗孵育后，用PBST洗涤三次。
      4. 用二抗（在1%BSA中稀释1：1000）在室温下孵育细胞5小时。用PBST清洗三次。
      5. 用0.5μg/ mL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）标记细胞核1分钟。用PBST洗涤细胞一次。
      6. 在荧光显微镜下捕获图像。

6.体外 分化测定

  1. 胚体 （EB） 分化
    1. 将iPSC菌落切成小块，收集并装入胚质体培养基中的低附着培养皿中。通过每3天更换培养基来培养细胞15天。
      注意：第15天的EB可以直接用于检测三个胚层生物标志物。或者，可以用生长因子诱导特定的细胞谱系，然后进行生物标志物检测。
  2. 内胚层（肝细胞）分化
    1. 在多能性培养基的单层培养物中培养iPSCs。
    2. 一旦汇合，转至RPMI 1640培养基，加1x亚硒酸盐胰岛素转铁蛋白和100ng / mL激活素A 2天，然后在RPMI 1640培养基中生长，30 ng / mL bFGF和20 ng / mL BMP4持续9天。每 2 天更换一次培养基。
    3. 从第10天开始，用0.1μM地塞米松补充培养基。在第 20 天终止实验。
  3. 中胚层（心肌细胞）分化
    1. 在胚状体培养基中0.5%基质凝胶包被的板上平板第8天EB。允许 EB 附加和折叠。
    2. 用20 ng / mL BMP4补充培养基并生长20天。每 2-3 天更换一次培养基。在第 20 天终止实验。
  4. 外胚层（神经元）分化
    1. 在胚状体培养基中的2μg/ cm2 胶原IV型包被板上平板第4天EB。允许 EB 附加和折叠。
    2. 第二天，将培养基转移到 DMEM F-12，含 2mg/mL 葡萄糖、1x 亚硒酸转铁蛋白和 2.5μg/mL 纤连蛋白。在第 15 天终止实验。
  5. 脑类器官的形成
    1. 在MEF上的35mm组织培养皿中培养TSiPSCs，直到70-80%汇合。切除菌落并收集在15 mL管中。将细胞以225×g离心5分钟。丢弃上清液。
    2. 通过在2mLPBS中重悬来洗涤菌落块，然后离心以除去上清液。
    3. 加入1mL0.05%胰蛋白酶，轻敲管以移走细胞。将管在37°C孵育3-4分钟，以将集落块解离成单个细胞悬浮液。
    4. 用含有10μg/ mL rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂Y-27632二盐酸盐（ROCKi）的4mL多能性培养基稀释胰蛋白酶，以防止解离诱导细胞死亡。
    5. 离心机得到一个沉淀。弃去上清液并将细胞重悬于含有10μg/ mL ROCKi的2mL胚状体培养基中。
    6. 除去10μL细胞悬浮液进行细胞计数。加入10μL台盼蓝以检测死细胞。使用血细胞计数器计数细胞。
    7. 将适当体积的含有ROCKi的胚珠状体培养基加入细胞悬浮液中，以获得每150μL9，000个活细胞。
    8. 在低附着96孔板的每个孔中加入150μL板，并在37°C的加湿CO2培养箱中孵育。 24小时后检查板是否聚集。在第2天，轻轻取出培养基，并用不含ROCKi的新鲜胚芽培养基代替。
    9. 在第6天，将EB转移到含有500μL神经诱导培养基的低连接24孔板的孔中，该培养基由DMEM-F12组成，其中含有1%N2补充剂，2mM GlutaMAX补充剂和1mM非必需氨基酸和1μg/ mL肝素。每 2 天更换一次培养基。
    10. 在神经诱导培养基中5天后，通过将2 cm x 2 cm见方的parafilm分层在200μL尖端的空尖端托盘上，将神经上皮聚集体嵌入Matrigel中。用戴着手套的手指将胶片压在尖端托盘的每个孔上，以产生小凹痕。用70%乙醇清洁副膜以进行灭菌。
    11. 将石板方块转移到60毫米的培养皿中。使用切割的200μL尖端将神经上皮聚集体转移到副膜中的凹痕上。通过移液去除多余的培养基。
    12. 在神经上皮聚集体上加入30μL解冻的基质胶，并使用移液器吸头将聚集体置于基质胶的中心。将60mm培养皿置于37°C培养箱中20-30分钟，以使基质凝胶聚合。
    13. 加入5 mL由1：1 DMEM-F12组成的脑类器官分化培养基：神经基础培养基，0.5%N2补充剂，2.5μg/ mL胰岛素，2mM GlutaMAX补充剂，0.5mM NEAA，1%B27补充剂和2.5mL青霉素链霉素。
    14. 使用无菌镊子将副膜片翻转并搅拌培养皿，直到基质凝胶嵌入的聚集体从片材上掉落到培养基中。将嵌入的聚集体在37°C的加湿CO2 培养箱中培养4天，隔天更换培养基。
    15. 静态培养4天后，将60mm培养皿置于安装在培养箱内的轨道振荡器上，以50rpm振荡。每 3 天培养一次类器官，使用脑类器官分化培养基进行 3 个月完全改变培养基。

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Representative Results

从具有45XO核型的自发流产胎儿中生成无整合的iPSC
我们从具有特纳综合征（TS）特异性45XO核型的FCV中分离出成纤维细胞，并用外显体重编程质粒对其进行核感染，以产生可用于综合征下游建模的TSIpSC，特别是相关的神经功能缺陷（图1a&b）。我们使用非整合的表观载体和核检点进行转染实验（图1 c&d）。我们跟踪细胞的形态变化，以监测重编程的成功。观察到从成纤维细胞到上皮形态的转变，随后是描绘的致密菌落形成（图2a）。TSiPSCs在转染后第20天左右获得了具有独特边缘和高细胞核与细胞质比的人类胚胎干细胞样形态（图2b）。相反，不完全重编程的细胞获得上皮形态，但未能形成致密的集落。（图2c）。

TSiPSCs的表征
TSiPSCs的核型分析揭示了与特纳综合征相关的45XO核型（图3a）。TSiPSCs的免疫荧光显示多能转录因子OCT4，NANOG，SOX2和细胞表面标志物SSEA4，E-钙粘蛋白和TRA-1-81的表达。人类胚胎干细胞是多能干细胞的黄金标准。我们同时对HUES 1进行了免疫荧光，其被用作TSiPSC比较多能性生物标志物表达的阳性对照（图3b）。TSiPSCs的无转基因状态通过对表观体质粒标记OriP和EBNA的基因组DNA PCR进行了验证。到第15代，OriP和EBNA基因在TSiPSCs中丢失，对上生体基因OriP和EBNA进行扩增，并在第9代TsiPSCs中显示条带，表明该阶段存在上生质粒。然而，这些基因在15代TSSiPSCs中没有扩增，这表明外生质粒的丢失，因此是转基因游离状态（图3c）。

体外 分化检测
在体外证明了TSiPSC系的分化潜力。TSiPSCs在低附着板中聚集时形成胚体（图4a）。生长因子诱导的TSSiPSCs分化用于生成3个胚层的细胞类型。使用谱系特异性生物标志物的免疫荧光分析证实，TSiPSCs分化为内胚层（SOX17），中胚层（肌球蛋白室重链/β）和外胚层（βIII微管蛋白）的代表性衍生物（图4b）。

脑类器官分化。
TSiPSCs以阶段明智的方式被分化为脑类器官。将TSiPSCs的单细胞悬浮液聚集到胚状体中以刺激生殖层的发育，最初6天，然后诱导神经上皮发育5天。神经上皮聚集的是它们嵌入基质凝胶中，基质胶提供细胞外基质和基底膜成分，支持正确的心小叶定向，神经上皮芽的生长，其扩张并形成腔。使用神经上皮标志物NETIN进行免疫荧光以观察类器官的整体形态（图5b）。神经上皮围绕着心室样腔（图5c - 白线）。类器官在形态学上显示心室区（VZ），心室下区（SVZ）和皮层样区域（图5c - 分别为红色，橙色和黄色线）

Figure 1
图1：通过核切除分离和重编程成纤维细胞。 （a） 胶原酶治疗前胎儿绒毛膜绒毛的显微图像。（b） 从胎儿绒毛膜绒毛中分离出的成纤维细胞用于重编程实验。（c） 通过 EcoRI 限制性酶切验证重编程质粒。（d） 使用通过核细胞进行外观体重编程质粒，从胎儿绒毛膜绒毛成纤维细胞生成iPSC的转染方案示意图。请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 2
图2：特纳综合征诱导多能干细胞的建立。（a）在重编程过程中观察到的细胞形态变化。（b） 完全重编程的 TSiPSC 菌落。（c） 具有未正确重编程细胞的菌落的代表性图像。请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 3
图3：TSiPSC的表征。 （a） TSiPSCs的核型。（b） TSiPSCs中多能性生物标志物OCT4、NANOG、SOX2、SSEA-4和TRA-1-81与胚胎干细胞HUES1的比较的免疫荧光分析。用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色细胞核。3c.展示 TSiPSC 的无转基因状态。泳道1-DNA阶梯，泳道2-OriP阳性对照与pCXLE-hSK，泳道3-EBNA阳性对照与pCXLE-hSK，泳道4-OriP与TSiPSCs，泳道5-EBNA与TsiPSCs。请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 4
图4：TSiPSCs的体外分化潜力。 （a）TSiPSC分化为胚胎体。（b） TSiPSCs对内胚层标志物SOX17、中胚层标志物肌球蛋白室重链α/β和外胚层标志物βIII小管蛋白和SOX2的免疫荧光分析。用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色细胞核。请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 5
图5：TSiPSCs的神经元和脑类器官分化。 （ a ）为了了解分化神经元的细胞结构，对肌动蛋白进行了染色。TSiPSC衍生的神经元显示出锥体形的神经元体（箭头），具有树突和轴突（箭头）。用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色细胞核。免疫染色。（a） 对雀巢素和肌动蛋白进行免疫染色，以观察类器官的大体形态。（c） 对雀巢素进行染色，以可视化顶端和基部组织的神经元层。用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色细胞核。请点击此处查看此图的放大版本。

表1：介质、缓冲液和溶液的组成请单击此处下载此表。

表2：PCR反应混合物请点击这里下载此表。

表3：PCR循环程序请单击此处下载此表。

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Discussion

生成细胞遗传学异常胎儿组织的稳定细胞模型对于使有缺陷的表型永久化是必要的。iPSC途径是永久保存缺陷特性的最有效的细胞制备方法20。

多能干细胞（PSC）显示出自我更新和分化成特化细胞的特性，让人联想到早期裂解胚胎21。因此，PSC可以作为研究过早流产胎儿的早期分子，细胞和发育缺陷的优秀模型。

在本文中，我们描述了使用核细胞分离结合改进的外生体载体产生人类iPSC。结果表明，这种组合包含一种用于生成无整合的人iPSC谱系的稳健方法，单次转染足以成功重编程这一事实证明了这一点。我们在显微镜下追踪了FCV成纤维细胞向多能细胞的渐进转化。转染后20天，我们观察到被未重编程的FCV成纤维细胞包围的重编程TSiPSCs菌落。从形态学上讲，衍生的人类iPSCs类似于在实验室中生长的胚胎干细胞。通常，细胞聚集为具有光泽边界的紧凑菌落。集落的细胞具有大细胞核并且紧密堆积，表明细胞之间的膜接触紧密。未重编程的成纤维细胞拱起并包围了这些菌落。在转移到iMEFs后，它们继续在文化中扩散30多次，表明具有持续自我更新的特性。

由于TSiPSCs是从45XO成纤维细胞产生的，因此我们对细胞进行了核型分析，以检查它们是否保留了染色体组成。TSiPSCs在细胞连续培养物中维持45XO核型，表明稳定的45XO染色体基因组成。为了用作代表45XO非整倍性的细胞资源，TSiPSCs应该不含重编程实验中使用的外源性DNA。我们通过对表观体特异性标记物-OriP和EBNA进行基因组DNA PCR来检查残留的表观体质粒的存在。在15次传代后，我们在TSiPS细胞中没有发现这些标记物的痕迹，这表明TSiPSCs在长期培养中逐渐丢失了外观体重编程载体。

多能细胞的标志是其 在体外 和体内分化为三种生殖谱系的细胞的潜力 。 为了在衍生的TSiPSCs中测试这种能力，我们将它们 在体外 进行由指定细胞因子和生长因子的谱系指导的胚状体形成和分化测定。TSiPSCs形成胚胎样体并分化为表达神经元标志物的外胚层细胞，表达心脏标志物的中胚层细胞和表达SOX17的内胚层细胞内胚层细胞，这是内胚层命运的生物标志物。我们还测试了TsiPSCs使用先前建立的协议22分化成高阶3D脑类器官的能力。TSiPSCs由于其自身的内在发育程序而逐渐自组织成称为类器官的迷你组织。TSiPSCs产生脑类器官，显示出类似于脑组织的细胞结构，神经上皮围绕着心室样腔。然而，这些类器官必须进一步广泛表征，以揭示确切的细胞类型，并与正常的iPSC进行比较，以区分TSiPSCs的内在神经组织模式特性。这些脑类器官和由TSPsCs产生的其他类型的脑类器官可用于模拟可能导致TS个体神经缺陷症状的发育和功能不一致。TSiPSCs表现出多能性的生物标志物特征以及分化的标志性特征，从而突出了重编程为诱导多能性的成功。

上述方法在重编程来自我们实验室各种来源的真皮成纤维细胞和间充质细胞方面具有有效的作用（未显示其他品系的数据）。根据我们的经验，以下步骤对于重编程实验的成功至关重要：

a） 质粒制备的质量：旧制剂不产生iPSCs。
b） 用于转染的细胞的质量：增殖细胞对于iPSC的产生至关重要。每次转染0.5至100万个细胞产生可重复的重编程效率。
c） 新鲜复构的核电极试剂：储存超过一个月的复构核核代托体试剂未产生 iPSC。
d） 通过iPSCs的机械传代培养维持主细胞库，产生稳定的细胞系。根据实验要求使用酶解离。

该实验室的未来目标是使用这种有效的方法建立一组染色体异常的iPSCs，用于下游开发，功能和疾病建模。胎儿非整倍体导致妊娠丢失和活产器官畸形。来自自发流产组织的非整倍体iPSCs是建模和研究失败的胚胎发育事件的宝贵资源。 体外 2D和3D培养系统，包括胚状体和组织特异性类器官22， 将使研究人员能够了解分子和细胞不规则性，例如谱系特定细胞中的异常细胞增殖和细胞死亡，这些细胞可能表现为发育异常和与非整倍性综合征相关的妊娠失败。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

上述研究的财政支持由马尼帕尔高等教育学院提供。该生产线的表征部分在NCBS的M.M. Panicker实验室进行。我们感谢阿南德诊断实验室在核型分析方面的帮助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.15% trypsin Thermo Fisher Scientific 27250018 G Banding
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023 Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindole Sigma Aldrich D8417 Immunocytochemistry
Activin A Sigma Aldrich SRP3003 Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353 AP staining
AMAXA Nucleofector II Lonza - Nucleofection
AmnioMAX II complete media Thermo Fisher Scientific, Gibco 11269016 Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
Ampicillin HiMedia TC021 Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Invitrogen A11059 Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Invitrogen A11034 Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 Invitrogen A11035 Immunocytochemistry
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific, Gibco 15240096 Contamination control
Anti-E-Cadherin BD Biosciences 610181 Immunocytochemistry
Anti-Nanog BD Biosciences 560109 Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4 BD Biosciences 611202 Immunocytochemistry
Anti-SOX17 BD Biosciences 561590 Immunocytochemistry
Anti-SOX2 BD Biosciences 561469 Immunocytochemistry
Anti-SSEA4 BD Biosciences 560073 Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81 Millipore MAB4381 Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2] Sigma Aldrich F0291 Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4 Sigma Aldrich SRP3016 Differentiation assays
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059 Blocking
Collagen Human Type IV BD Biosciences 354245 Differentiation assays
Collagenase blend Sigma Aldrich C8051 Digestion of foetal chorionic villi
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902 Differentiation assays
DMEM F12 Thermo Fisher Scientific 11320033 Differentiation assays
FastDigest EcoR1 Thermo Scientific FD0274 Restriction digestion
Fibronectin Sigma Aldrich F2518 Differentiation assays
Giemsa Stain HiMedia S011 G Banding
Glacial Acetic Acid HiMedia AS001 Fixative for karyotyping
Glucose Sigma Aldrich G7528 Differentiation assays
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodium Sigma Aldrich H3149 Differentiation assays
Insulin solution human Sigma Aldrich I9278 Differentiation assays
Insulin Transferrin Selenite Sigma Aldrich I1884 Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kit Kapa Biosystems KR0368 OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid Thermo Fisher Scientific 15210040 Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEM Thermo Fisher Scientific 10829018 Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agar HiMedia M1151F Plasmid purification
Matrigel BD Biosciences 356234 Differentiation assays
MEM Non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140035 Pluripotency and Embryoid body medium
Methanol HiMedia MB113 Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/β Millipore MAB1552 Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector Kit Lonza VAPD-1001 Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148 Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F Addgene 27077 Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSK Addgene 27078 Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hUL Addgene 27080 Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin   Thermo Fisher Scientific,  15070063 Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma Aldrich P1951 Immunocytochemistry
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving
Storage: Room temperature.
PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS.
Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prep QIAGEN 12143 Plasmid purification
Potassium Chloride Solution HiMedia MB043 Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood Kit Qiagen 51104 Genomic DNA isolation
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875093 Hepatocyte differentiation medium
Sodium Citrate HiMedia RM255 Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100 HiMedia MB031 Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Gibco 25300054 Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20 HiMedia MB067 Preparation of PBST
β III tubulin Sigma Aldrich T8578 Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochloride Sigma Aldrich Y0503 Differentiation assays

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References

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发育生物学，第178期，重编程，人类诱导多能干细胞，非整倍体，先天性畸形，自发性胎儿死亡，特纳综合征，神经功能缺陷
从特纳综合征（45XO）胎儿细胞生成诱导多能干细胞，用于与该综合征相关的神经功能障碍的下游建模
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Veerasubramanian, N., Karthikeyan,… More

Veerasubramanian, N., Karthikeyan, V., Hegde, S., Dhanushkodi, A., Parveen, S. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome. J. Vis. Exp. (178), e62240, doi:10.3791/62240 (2021).

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