Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Generering af inducerede pluripotente stamceller fra Turner Syndrom (45XO) Fosterceller til downstream modellering af neurologiske underskud forbundet med syndromet

Published: December 4, 2021 doi: 10.3791/62240
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Karnataka, India-576104, 2Department of Medical Genetics, Manipal Hospitals
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver generering af integrationsfrie iPSC'er fra føtal væv fibroblaster gennem levering af episomal plasmid ved nucleofection efterfulgt af beskrivelse af metoder, der anvendes til iPSC-karakterisering og neuronal differentiering.

Abstract

Kromosom aneuploidies forårsage alvorlige medfødte misdannelser, herunder centralnervesystemet misdannelser og fosterdød. Prænatal genetisk screening er rent diagnostisk og belyser ikke sygdomsmekanisme. Selv om celler fra aneuploid fostre er værdifulde biologiske materiale, der bærer kromosom aneuploidi, disse celler er kortvarige, begrænser deres anvendelse til downstream forskningsforsøg. Generering af inducerede pluripotente stamcelle (iPSC) modeller er en effektiv metode til celleforberedelse til evig bevarelse af aneuploid træk. De er selvfornyende og differentierer sig i specialiserede celler, der minder om embryonal udvikling. Således tjener iPSC'er som fremragende værktøjer til at studere tidlige udviklingshændelser. Turner syndrom (TS) er en sjælden tilstand forbundet med en helt eller delvist mangler X kromosom. Syndromet er karakteriseret ved infertilitet, kort statur, endokrine, metaboliske, autoimmune og kardiovaskulære lidelser og neurokognitive defekter. Følgende protokol beskriver isolering og dyrkning af fibroblaster fra TS (45XO) fostervæv, generering af integrationsfrie TSIPSCs gennem levering af episomal omprogrammering plasmider ved nucleofection efterfulgt af karakterisering. Den omprogrammering TSIPSCs blev oprindeligt screenet af levende celle alkaliske fosfatase farvning efterfulgt af omfattende sondering for pluripotency biomarkører. Udvalgte kolonier blev mekanisk dissekeret, passager flere gange og stabile selvfornyende celler blev brugt til yderligere eksperimenter. Cellerne udtrykte pluripotency transskription faktorer OCT4, NANOG, SOX2, celle overflade markører SSEA 4 og TRA1-81 typisk for pluripotente stamceller. Den oprindelige 45XO karyotype blev bevaret efter omprogrammering. TSIPSC'erne var i stand til at danne embryonale organer og differentiere sig til celler af endoderm, mesoderm og ectoderm udtrykke afstamning specifikke biomarkører ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). De udefrakommende episomale plasmider gik tabt spontant og blev ikke opdaget efter passage 15 i celler. Disse TSIPSCs er en værdifuld cellulær ressource til modellering defekt molekylær og cellulær neuroudvikling forårsager neurokognitive underskud forbundet med Turner syndrom.

Introduction

Aneuploidies føre til fødselsdefekter / medfødte misdannelser og graviditet tab hos mennesker. ~ 50%-70% af prøverne fra graviditet tab viser cytogenetiske abnormiteter. Aneuploid embryoner tabt tidligt i graviditeten kan ikke let opnås til eksperimentel analyse øge behovet for at udvikle andre modeller, der nøje repræsenterer human embryogenese. Inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) fra celler diagnosticeret med genetiske sygdomme er blevet anvendt til at modellere de repræsentative genetiske uregelmæssigheder og deres konsekvenser for fostrets udvikling1,2,3,4. Disse iPSC'er ligner epiblastceller i det udviklende embryo og kan generobre de tidlige begivenheder af embryodannelse. De tillader forståelse og karakterisering af udviklingsprogrammet af celle slægter og mønstre i tidlige pattedyr embryoner. iPSC'er, der tidligere stammede fra hudfibroblaster og fostervand fra prænatale diagnostiske tests af aneuploidy syndromer som monosomi X (Turner syndrom), trisomi 8 (Warkany syndrom 2), trisomi 13 (Patau syndrom) og delvis trisomi 11; 22 (Emanuel syndrom) har givet værdifuld indsigt i fejlslagen udvikling4.

Turner syndrom (TS) er en sjælden tilstand karakteriseret ved kvindelig infertilitet, kort statur, endokrine og metaboliske lidelser, en øget risiko for autoimmun sygdom og en disposition for hjerte-kar-sygdom5. Selv om det er den eneste overlevende monosomi syndrom er det også dødeligt for den udviklende embryo forårsager spontane aborter6. Overlevende individer med TS til stede med grader af ændring af X-kromosommateriale i deres celler. Karyotyper spænder fra fuldstændigt tab af et X-kromosom (45,XO) til mosaikker som 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, tilstedeværelsen af ringkromosomer, tilstedeværelsen af Y-kromosommateriale, etc5.

Diagnose af syndromet er generelt gjort ved karyotyping blod symptomatiske individer og chorionic villi prøveudtagning (CVS) til at opdage tidlige aneuploidy syndromer. Da aneuploidy syndromer tegner sig for ~ 30% af spontane aborter, er det rutine at karyotype produktet af undfangelse (POC) på en spontan abort. Disse fosterceller, herunder chorionic villi besidder cytogenetiske abnormitet og iPSCs stammer fra dem giver en værdifuld kilde til biologisk materiale til at studere aneuploidy syndromer4,6. TS iPSCs er tidligere blevet etableret fra fostervande via retroviral omprogrammering4, fibroblaster af chorionic villi (opnået gennem prænatal diagnose) via retroviral omprogrammering6, fra blod mononuklear celler7 via Sendai virus omprogrammering og fra huden fibroblaster af TS individer via lentiviral omprogrammering4 . Da det primære fokus for vores laboratorium er at forstå udviklingssvigt, har vi genereret TS iPSCs fra POC, specielt den chorionic villi komponent i en spontan abort8. Alle celler isoleret fra dette fostervæv havde en 45XO karyotype og gav iPSCs med samme karyotype. Disse iPSCs er unikke, da de er de første til at blive genereret fra en aborteret foster og give en værdifuld ressource til at studere aneuploidy relaterede graviditet fiaskoer. Denne artikel indeholder en detaljeret metode til generering af iPSCs fra denne unikke cellekilde via episomal omprogrammering.

De tidlige metoder til iPSC-generation brugte viral transduktion og transposoner til at levere omprogrammeringsfaktorerne. Metoder til at inducere celler til pluripotency har udviklet sig fra at bruge integration af retrovirale vektorer9, excisable lentiviral vektorer10,11 og transposon-baserede metoder12 til ikke-integrere adenoviral vektorer13 og Sendai virus baseret vektorer14. Retroviral og lentiviral baseret omprogrammering, selv om den er effektiv, indebærer integration af omprogrammeringsfaktorerne i værtskromosomerne, hvilket forårsager indsættelsesmutationer, der har uforudsete virkninger i iPSC'erne. Desuden forhindrer viral omprogrammering translationel anvendelse af iPSC'er. RNA-baserede systemer15 og direkte proteinlevering16 er blevet undersøgt for helt at eliminere de potentielle risici forbundet med brugen af vira og DNA-transinfektioner. Disse metoder har imidlertid vist sig at være ineffektive.

I 2011 rapporterede Okita et al. forbedret effektivitet af omprogrammering ved episomal plasmid forstærket med TP53 undertrykkelse via shRNA. De erstattede også cMYC med ikke-transformerende LMYC (småcellet lungekarcinom forbundet MYC) for at øge sikkerheden af hiPSCs. Disse episomale plasmider udtrykker 5 omprogrammeringsfaktorer: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC og shRNA for TP5317,18. Disse vektorer opretholdes ekstrakromosomt og går tabt fra de omprogrammerede celler på kontinuerlig kultur, hvilket gør linjerne transgenefri inden for 10-15 passager. Nucleofection er en specialiseret form for elektroporation, der leverer nukleinsyrer direkte ind i kernen af værtsceller. Det er en effektiv metode til levering af omprogrammering plasmider i forskellige celletyper. Episomal plasmid er omkostningseffektive og kompenserer for de høje omkostninger ved nucleofection. Denne metode er effektiv og reproducerbar under optimerede forhold, der giver stabile iPSCs fra en række somatiske celler. I denne protokol beskriver vi metoden til generering af iPSCs fra fibroblaster isoleret fra fostervæv ved nucleofection af episomal omprogrammering plasmider. Her er de detaljerede protokoller for fibroblast isolation fra føtal chorionic villi, plasmid rensning, nucleofection, picking af kolonier fra omprogrammering plade og etablering af stabile iPSCs.

Det er vigtigt at bekræfte tilstedeværelsen af pluripotency træk i de nygenererede iPSCs. Dette omfatter demonstration af pluripotency relaterede faktorer (f.eks alkaliske fosfatase udtryk, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherin, normalt vist med immunofluorescence eller genekspression assays), identifikation af de tre kimlag ved in vitro differentiering assays til at validere deres differentiering potentialer, karyotyping at bestemme kromosomt indhold, STR skrive for at etablere identitet med moderceller, kontrollere tab af udefrakommende gener, og strengere in vivo-analyser såsom teratomadannelse og tetraploid komplementering. Her beskriver vi karakterisering protokoller af karyotyping, levende celler alkaliske fosfatase farvning, påvisning af pluripotency relaterede biomarkører ved immunofluorescence, in vitro differentiering assays og metode til at påvise tab af udefrakommende gener19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

FCV blev opnået fra Manipal Hospital, Bengaluru, under etisk komité for Manipal Hospitaler godkendelse.

BEMÆRK: Se tabel 1 for sammensætning af alle buffere og løsninger.

1. Isolering af fibroblaster fra føtal chorionic villi (FCV)

  1. Prøveindsamling og vævsopløsning i kollagen
    1. Saml FCV under sterile forhold i fosfatbufferet saltvand (PBS) og transport (ved stuetemperatur) til cellekulturanlægget.
    2. Overfør villi til en 60 mm petriskål og vask flere gange (minimum 4 gange) i PBS indeholdende 1x antimykotisk opløsning (PBS-AA). Fjern PBS-AA helt ved pipettering.
    3. Den chorionic villi må behandles med 1 mL kollagenaseblanding (5 mg/mL) i 5 min ved 37 °C.
    4. Neutralisere med cellekulturmedium indeholdende 10% fosterkvægsserum (FBS), overfør fordøje til et 15 mL rør og centrifuge ved 225 x g i 5 minutter for at opsamle de opløste villi og frigivne celler som en pellet.
  2. Subkultur og lagerudvidelse
    1. Plade opløst villi sammen med frigivne celler i en T25 kultur kolbe indeholdende 5 mL af komplette medier (f.eks AmnioMAX) og vokse indtil en sammenflyttet fibroblast kultur er opnået.
    2. Udvid fibroblaster i kultur for at forberede lagre til brug i efterfølgende transfection og karakterisering eksperimenter som følger:
      1. Der tilsættes 2 mL 0,05% trypsin til T25 kolbe indeholdende FCV fibroblaster og inkuberes ved 37 °C i 3-5 min for at adskille cellerne.
      2. Efter inkubation neutralisere trypsin ved at tilføje FBS (på samme volumen som trypsin).
        BEMÆRK: Kulturmedium, der indeholder FBS, kan også bruges til at neutralisere trypsin, når det tilføjes ved en 1:3 trypsin: medieforhold.
      3. Saml de dissocierede celler i et 15 ML rør og centrifuge ved 225 x g i 5 min for at opnå celle pellet.
      4. Dekanteret supernatant og genanvende celle pellet i 1 mL af komplette medier.
      5. Overfør 500 μL hver til 60 mm vævskulturbehandlede retter og op udgør volumen til 5 mL. Dette opdelingsforhold på 1:2 blev også brugt til efterfølgende passager.
  3. Kryopræservering
    1. Udfør enzymatisk dissociation ved hjælp af 0,05% trypsin som beskrevet i trin 1.2.2.1 - 1.2.2.3 og opnå celle pellet.
    2. Supernatanten kasseres, og cell pelleten genudtages i 1 mL fryseblanding, der består af 1:9 dimethylsulfoxid (DMSO): FBS.
    3. Overfør indholdet til en steril cryovial og læg hætteglasset i en frysebeholder.
    4. Frys natten over ved -80 °C, og overfør derefter hætteglas til flydende nitrogen (-196 °C) den næste dag.

2. Plasmids DNA Isolation og verifikation

  1. Bakteriecellepræparat
    1. Streak glycerol lagre af E. coli indeholdende de tre individuelle plasmider pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK og pCXLE-hUL (fra Addgene) på separate Luria Bertani-ampicillin agar plader.
    2. Pode enkelte kolonier i starter kulturer på 5 mL af Luria Bertani-ampicillin medium. Inkuberes i 8 timer ved 37 °C med rysten (10 x g).
    3. Pod 200 μL af denne startkultur i 100 mL Luria Bertani-ampicillin medium. Inkuberes natten over ved 37 °C med rysten.
    4. Høst bakteriekultur natten over ved centrifugering ved 6000 x g i 15 min ved 4 °C.
  2. Plasmid isolation med Midi Plasmid rensningssæt
    1. Resuspend bakteriel pellet i 4 mL resuspension buffer.
    2. Tilsæt 4 mL lysis buffer og bland grundigt ved kraftigt at invertere 4-6 gange og inkubere ved stuetemperatur i 5 min.
    3. Tilsæt 4 mL forkølet neutraliseringsbuffer og inverter rør 4-6 gange for at blande grundigt. Inkuber på is i 15 minutter.
    4. Centrifuge ved ≥ 20.000 x g i 30 min ved 4 °C. Supernatant opsamles i et friskrør og centrifuge ved ≥20.000 x g i 15 min ved 4 °C.
    5. Ekvilibrere kolonnen ved at anvende 4 mL ekvilibreringsbuffer.
    6. Anvend supernatanten på kolonnen.
    7. Vask kolonnen to gange med 10 mL vaskebuffer.
    8. Eluter DNA med 5 mL varm (65 °C) elutionsbuffer.
    9. Udfælde DNA ved at tilføje 3,5 mL isopropanol til det eluterede DNA. Bland godt. Centrifuge ved ≥15.000 x g i 30 min ved 4 °C. Dekanteret supernatant omhyggeligt.
    10. Dna-pelleten vaskes med 2 mL 70% ethanol og centrifuge ved ≥15.000 x g i 10 min. Dekanteret supernatant omhyggeligt.
    11. Lufttørre pellet i 5-10 min og opløse DNA i et passende volumen af PCR-kvalitet vand for at opnå en endelig koncentration på 1 μg/mL.
      BEMÆRK: Dna må ikke opløses i buffere, da det ikke er egnet til elektroporering. Gamle plasmid DNA-forberedelse giver ikke omprogrammerede kolonier.
  3. Plasmid Verifikation af EcoRI begrænsning fordøjelsen
    1. Kombiner 15 μL nucleasefrit vand, 2 μL 10x buffer, 1 μg plasmid-DNA og 1 μL ecoRI-enzym. Bland forsigtigt.
    2. Blandingen inkuberes ved 37 °C i 15 min i en varmeblok.
    3. Bland de fordøjede plasmidprøver med 6x DNA gel loading dye og elektrophorese på 1% agarose gel i 1x TAE buffer med 0,5 μg/mL etiumbromid. Medtag standard DNA stige. Billede gelen, efter at DNA'et er løst korrekt. Forventede EcoRI-båndstørrelser af pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F er 6.834 bp, 3.758 bp og 1.108 bp; pCXLE-hUL er 10.200 bp og 1.900 bp; pCXLE-hSK er 10.200 bp og 2.500 bp.

3. Nucleofection

  1. Sletning af celle pel
    1. Kultur de isolerede føtale chorionic villi fibroblaster i T25 kolbe i 5 mL af komplette medier indtil 80-90% sammenløb.
    2. Vaske celler to gange med PBS og trypsinisere som beskrevet i trin 1.2.2.1 - 1.2.2.3.
    3. Fjern supernatanten, genbrugspillen i 5 mL af reduceret serummedie (f.eks Opti-MEM). Tæl celler med hæmocytometer og tag 106 celler til nukleofektion. Centrifuge ved 225 x g i 5 min. Fjern supernatanten helt.
  2. Reagensforberedelse og nukleofection
    1. Kernerengøringsreagens ved blanding af 0,5 mL tillæg og 2,25 mL kerneopløsning (begge i sættet).
    2. Der tilsættes 100 μL kerneopløsning i et 1,5 mL rør. Tilsæt 1μg hver af pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK og pCXLE-hUL til røret. Forsigtigt resuspend 106 celler (fra trin 3.1.2) i denne blanding.
    3. Celle-DNA-affjedringen overføres til cuvette, så prøven dækker bunden af cuvette (leveres i kit) uden luftbobler. Hætten af cuvette og sæt i holderen. Vælg nucleofector Program U-23 (for høj effektivitet) og anvende.
    4. Fjern cuvette ud af holderen og tilsæt 1 mL komplet medie. Overfør indholdet forsigtigt til en 60 mm vævskulturbehandlet petriskål fyldt med 4 mL komplette medier (til i alt 5 mL medier). Inkuberes cellerne i en befugtet CO 2-inkubator ved 37 °C.
    5. Efter 24 timer skal du kontrollere, om cellerne har fastgjort. Udskift mediet helt.
      BEMÆRK: Antallet af celledød er højt i nucleofection forlader få levedygtige celler, der vedhæfter.
    6. Vedligehold cellerne i hele medier i 10 dage, og skift til pluripotency-medier i de næste 20 dage.
      BEMÆRK: Visualiser celler regelmæssigt for at følge morfologiske ændringer, der forekommer i omprogrammeringscellerne (som epitelmorfologi og kompakt kolonidannelse) for at bekræfte, om eksperimentet virker. Omkring 25 iPSC kolonier kan ses efter 20 dages kultur i pluripotency medier.

4. Plukning og udbredelse af iPSC-kolonier

  1. Plukke koloni fra omprogrammering plade
    1. Disseker manuelt de embryonale stamcellelignende kolonier, der dannes i omprogrammeringsskålen ved hjælp af trukket glaspipetter eller 1 mL sprøjtenåle og overføres til tidligere forberedt plade med inaktiverede museememnal fibroblastfodere med pluripotency medium eller etablerer feederfrie kulturer på Matrigel-coatede plader med mTESR medium.
      BEMÆRK: Museememne fibroblaster (MEFs) blev udledt ved hjælp af enzymatisk isolering fra musefostre (dissekeret fra 13-14 dage gravide hunmus) og blev mitotisk inaktiveret ved mitomycin C-behandling. Etablere enkelt klon befolkninger ved at dyrke enkelte kolonier fra omprogrammering plade i separate retter eller blandet klon befolkninger ved at overføre mange kolonier fra omprogrammering plade til en enkelt skål.
  2. Mekanisk overførsel af nye kolonier til friske foderautomater og frempassning for at etablere stabile iPSC'er
    1. Former iPSCs i pluripotency medium ved at fodre hver anden dag og split 1:3 hver 5-7 dage. Forbered lagre ved cryopreserving i en frysende blanding af KnockOut Serum Replacement og DMSO i forholdet 9:1.
      BEMÆRK: KnockOut Serum Replacement anvendes i fryseblandingen til kryopræservering af iPSCs i stedet for FBS, da komponenter i FBS kan fremkalde differentiering af de pluripotente celler under langvarig konservering.

5. Karakterisering af iPSC'er

BEMÆRK: Karakteriseringsundersøgelser, herunder PCR og immunstainning for pluripotency biomarkør, blev udført efter det femte passagenummer. Karyotyping blev udført på et senere passage nummer.

  1. Karyotyping
    1. Forkæl et sammenflyttet 60 mm petriskål af iPSC'er med colcemid i 45 min i befugtet CO 2-inkubator ved 37 °C.
    2. Høst med 0,05% trypsin behandling og centrifuge. Fjern supernatanten og pipette de resterende spor af medium for at løsne cellepillen.
    3. Tilsæt 5 mL hypotonisk opløsning. Blandes med inverteringsrør og inkuberes i 20 minutter ved 37 °C. Centrifuge ved 225 x g i 5 min.
      BEMÆRK: Den opnåede pellet skal virke fluffy.
    4. Tilsæt 2,5 mL af Carnoys fiksative opløsning langsomt, mens du trykker for at løsne pellet.
    5. Forbered spreads til karyotyping ved at droppe celleaffjedringen på rene glasrutschebaner.
    6. Behandl diasene med 0,15% trypsin i 1 minut, og vask en gang med PBS. Derefter plette med Giemsa opløsning i 4 min og ende med en destilleret vand vask. Erhverve og behandle med passende software.
  2. Demonstration af transgene fri status
    1. Genomisk DNA-isolation
      1. Pipette 20 μL protease i bunden af et 1,5 mL mikrocentrifugerør.
      2. Der tilsættes 200 μL TSiPSCs, der er suspenderet igen i PBS, til mikrocentrifugerøret.
      3. Der tilsættes 200 μL buffer AL til prøven, og blandes i 15 s ved puls-vortexing.
      4. Inkuberes i 10 min ved 56 °C.
      5. Centrifuge mikrocentrifugerøret for at fjerne dråber fra indersiden af låget.
      6. Prøven tilsættes 200 μL ethanol (96-100%) og blandes igen i 15 s ved puls-hvirvlende. Efter blanding centrifugere røret kortvarigt for at fjerne dråber fra indersiden af låget.
      7. Forsigtigt anvende blandingen fra det foregående trin til mini spin kolonne (i en 2 mL indsamling rør) uden befugtning fælgen. Luk hætten, og centrifuge ved 6000 x g i 1 min. Kassér røret, der indeholder filtratet, og læg minispinsøjlen i et rent 2 mL opsamlingsrør.
      8. Åbn forsigtigt mini spin-kolonnen, og uden at fugte fælgen tilsættes 500 μL Buffer AW1. Luk hætten og centrifugen ved 6000 x g i 1 min. Placer mini spin-kolonnen i et rent 2 mL opsamlingsrør, og kassér opsamlingsrøret, der indeholder filtratet.
      9. Åbn forsigtigt mini spin-kolonnen, og tilsæt 500 μL Buffer AW2 uden at fugte fælgen. Luk hætten og centrifugen ved fuld hastighed (20.000 x g) i 3 min.
      10. Placer mini spin-kolonnen i et nyt 2 mL opsamlingsrør, og kassér det gamle opsamlingsrør med filtratet. Centrifuge ved fuld hastighed i 1 minut for at eliminere chancen for mulig Buffer AW2-fremførsel.
      11. Minispinsøjlen placeres i et rent 1,5 mL mikrocentrifugrør, og kassér opsamlingsrøret, der indeholder filtratet. Åbn forsigtigt mini spin-kolonnen, og tilsæt 200 μL Buffer AE eller destilleret vand. Inkuberes ved stuetemperatur (15-25 °C) i 5 min, og centrifuge ved 6000 x g i 1 min.
    2. Transgene-free status PCR (ved hjælp af KAPA HiFi PCR Kit KR0368)
      1. Sørg for, at alle reagenser er ordentligt optøet og blandet.
      2. Forbered en PCR master mix, der indeholder den passende mængde af alle reaktionskomponenter baseret på tabel 2 (opsætning af reaktioner på is).
      3. Overfør de relevante mængder PCR master mix, skabelon og primer til individuelle PCR rør.
      4. Cap individuelle reaktioner, mix og centrifuge kort.
      5. Udfør PCR efter tabel 3.
  3. Identifikation af biomarkør for pluripotency biomarkør
    1. Alkalisk fosfatase (AP) farvning
      1. Forbered en 1x AP levende plet arbejdsløsning ved at fortynde 3 μL af 500x lageropløsning i 1,5 mL DMEM /F-12 for hver 10 cm2 af kulturområdet.
      2. Fjern mediet fra iPSC-kulturskålen. Vask kulturen med DMEM/F-12 én gang. Tilføj 1x AP live plet løsning på iPSCs. Inkuberes ved 37 °C i 45 min.
      3. Fjern AP pletten og vask to gange med DMEM/F-12. Tilsæt frisk DMEM/F-12 og billede under fluoresc mikroskop ved hjælp af en standard FITC filter inden for 30-90 min af farvning.
    2. Immunstaining til pluripotency biomarkører
      1. Fix sammenflyttede iPSC-kulturer med 4% paraformaldehyd natten over ved 4 °C. Vask tre gange med PBS Tween 20 (PBST), hver vask i 5 min.
      2. Permeabilize cellerne med 0,3% Triton X-100 i PBST i 15 minutter ved stuetemperatur. Vask tre gange med PBST.
        BEMÆRK: Permeabilisering bør kun ske for intracellulære antigener.
      3. Bloker celler med 3% kvægserum albumin (BSA) i PBST i 30 min ved stuetemperatur. Plet cellerne med primære antistoffer (fortyndet 1:1000 i 1% BSA) natten over. Efter primær antistofinkubation vaskes tre gange med PBST.
      4. Inkuber celler med det sekundære antistof (fortyndet 1:1000 i 1% BSA) i 5 timer ved stuetemperatur. Vask tre gange med PBST.
      5. Mærk kernerne med 0,5 μg/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i 1 minut. Vask cellerne én gang med PBST.
      6. Tag billeder under fluorescerende mikroskop.

6.In vitro differentiering assays

  1. Embryoid Body (EB) Differentiering
    1. Skær iPSC kolonier i små stykker, indsamle og plade i lav vedhæftet fil Petri retter i embryoid krop medium. Dyrk cellerne i 15 dage ved at erstatte medium hver 3. dag.
      BEMÆRK: Dag 15 EBs kan bruges direkte til påvisning af de tre kimlag biomarkører. Alternativt kan specifikke celle slægter induceres med vækstfaktorer, efterfulgt af biomarkør afsløring.
  2. Endoderm (Hepatocyte) differentiering
    1. Dyrk iPSCs i monolayer kulturer i pluripotency medium.
    2. Når du er sammenstillet, skiftes til RPMI 1640 medier med 1x Insulin Transferrin Selenite og 100 ng/mL aktivi A i 2 dage, efterfulgt af vækst i RPMI 1640 medier med 30 ng/mL bFGF og 20 ng/mL BMP4 i 9 dage. Udskift medium hver anden dag.
    3. Fra dag 10 og fremefter supplere medier med 0,1 μM dexamethason. Afslut eksperimentet på dag 20.
  3. Mesoderm (Cardiomyocyte) differentiering
    1. Plade dag 8 EBs på 0,5% Matrigel-belagt plader i embryoid krop medium. Lad EBs at fastgøre og kollapse.
    2. Suppler medier med 20 ng/mL BMP4 og vokse i 20 dage. Udskift medium hver 2-3 dage. Afslut eksperimentet på dag 20.
  4. Ectoderm (Neuronal) differentiering
    1. Pladedag 4 EBs på 2 μg/cm2 kollagen type IV-coatede plader i embryonale kropsmedium. Lad EBs at fastgøre og kollapse.
    2. Næste dag skal du skifte medium til DMEM F-12 med 2 mg/mL glukose, 1x insulinoverførsels selenit og 2,5μg/mL fibronectin. Afslut eksperimentet på dag 15.
  5. Dannelse af cerebrale organoider
    1. Dyrk TSIPSCs i en 35 mm vævskulturret på MEF'er indtil 70-80% sammenløb. Skær kolonierne og saml i et 15 ML rør. Centrifugere cellerne ved 225 x g i 5 min. Kassér supernatanten.
    2. Vask stykker af kolonier ved at genoplive i 2 mL PBS og centrifuge at fjerne supernatant.
    3. Tilsæt 1 mL på 0,05% trypsin og tryk på røret for at løsne cellerne. Inkuberes røret ved 37 °C i 3-4 min for at adskille kolonistykkerne i en enkelt celleaffjedring.
    4. Neutralisere trypsin ved fortynding med 4 mL pluripotency medier, der indeholder 10 μg/mL rho-associerede protein kinase (ROCK) hæmmer Y-27632 dihydrochlorid (ROCKi) for at forhindre dissociation induceret celledød.
    5. Centrifuge for at få en pille. Supernatanten kasseres, og cellerne genbruges i 2mL embryoidkropsmedium, der indeholder 10 μg/mL ROCKi.
    6. Fjern 10 μL celleaffjedring til celletælling. Der tilsættes 10 μL Trypan blå for at detektere døde celler. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer.
    7. Der tilsættes passende volumen af embryoid kropsmedium med ROCKi til celleaffjedringen for at opnå 9.000 levende celler pr. 150 μL.
    8. Plade 150 μL i hver brønd af en 96-brøndsplade med lav fastgørelse og inkuberes i en befugtet CO2-inkubator ved 37 °C. Kontroller pladerne for sammenlægning efter 24 timer. På dag 2 forsigtigt fjerne mediet og erstatte med frisk embryoid medium uden ROCKi.
    9. På dag 6 overføres EBs til brønde af en lav fastgørelse 24 brøndplade indeholdende 500 μL neural induktion medium bestående af DMEM-F12 med 1% N2 supplement, 2 mM GlutaMAX supplement og 1 mM ikke-essentielle aminosyrer og 1 μg/mL heparin. Skift medium hver anden dag.
    10. Efter 5 dage i neural induktion medium integrere neuroepithelial aggregater i Matrigel ved lagdeling en 2 cm x 2 cm kvadrat af parafilm over en tom spids bakke på 200 μL tips. Tryk på parafilm med behandskede fingre over hvert hul i spidsen bakken for at gøre små buler. Rengør parafilm med 70% ethanol for at sterilisere.
    11. Overfør parafilmpladsen til en 60 mm skål. Brug udskårne 200 μL tips til at overføre neuroepithelial aggregater på buler i parafilm. Fjern overskydende medium ved pipettering.
    12. Tilsæt 30 μL optøet Matrigel på neuroepithlial aggregater og placere aggregatet til midten af Matrigel ved hjælp af en pipettespids. 60 mm fadet i 20-30 min i en 37 °C inkubator, som Matrigel kan polymerisere.
    13. Der tilsættes 5 mL cerebral organoiddifferentieringsmedium bestående af 1:1 DMEM-F12: Neurobasal medium, 0,5% N2-tillæg, 2,5 μg/mL insulin, 2 mM GlutaMAX-tillæg, 0,5 mM NEAA, 1% B27-tilskud og 2,5 mL penicillin-streptomycin.
    14. Brug en sterile sammenkværn vend parafilmarket om og omrør skålen, indtil matrigel indlejrede aggregater falder af arket i mediet. De indlejrede aggregater dyrkes i en befugtet CO 2-inkubator ved 37 °C i 4 dage, hvilket giver medieændringer på alternative dage.
    15. Efter 4 dages statisk kultur placere 60 mm retter på en orbital shaker installeret inde i inkubatoren ryster ved 50 rpm. Kultur organoider i 3 måneder giver komplette medieændringer med cerebral organoid differentiering medium hver 3 dage.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generering af integrationsfrie iPSC'er fra et spontant aborteret foster med 45XO karyotype
Vi isolerede fibroblaster fra FCV med et Turner syndrom (TS) specifikke 45XO karyotype og nucleofected dem med episomal omprogrammering plasmider til at generere TSIPSCs, som kan bruges til downstream modellering af syndromet, specielt de tilknyttede neurologiske underskud (Figur 1a&b). Vi brugte ikkeintegrerende episomale vektorer og nucleofection til transfection eksperimenter (Figur 1 c&d). Vi fulgte morfologiske ændringer af celler for at overvåge succesen med omprogrammering. Skiftet fra fibroblast til epitelmorfologi, efterfulgt af en afgrænset kompakt kolonidannelse blev observeret (Figur 2a). TSIPSCs erhvervet menneskelige embryonale stamcelle som morfologi med forskellige kanter og en høj kerne-til-cytoplasma ratio omkring dag 20 post transfection (Figur 2b). I modsætning hertil erhverver ufuldstændigt omprogrammerede celler epitelmorfologier, men danner ikke kompakte kolonier. (Figur 2c).

Karakterisering af TSIPSCs
Karyotyping af TSiPSCs afslørede 45XO karyotype forbundet med Turner Syndrom (Figur 3a). Immunofluorescence af TSIPSCs viste udtryk for pluripotency transskription faktorer OCT4, NANOG, SOX2, og celle overflade markører SSEA4, E-Cadherin, og TRA-1-81. Menneskelige embryonale stamceller er guldstandarden for pluripotente stamceller. Vi udførte samtidig immunofluorescence af HUES 1, som blev brugt som positiv kontrol til sammenligning af pluripotency biomarkør udtryk ved TSiPSC (Figur 3b). Transgene fri status af TSIPSCs blev demonstreret af en genomisk DNA PCR for episomal plasmid markører OriP og EBNA. Ved passage 15, OriP og EBNA genet gik tabt i TSiPSCs.De episomale gener OriP og EBNA blev forstærket og viste bands i passage 9 TSIPSCs angiver tilstedeværelsen af episomal plasmid på dette stadium. Disse gener blev dog ikke forstærket i passage 15 TSIPSC'er, der indikerede et tab af episomal plasmid og dermed en transgene fri tilstand (Figur 3c).

In vitro differentiering assays
TSiPSC-linjernes differentieringspotentiale blev påvist in vitro. TSIPSC'er ved sammenlægning i lavhæftsplader dannede embryonale organer (figur 4a). Vækstfaktor induceret differentiering af TSIPSCs blev brugt til at generere celletyper af de tre kimlag. Immunofluorescenceanalyse ved hjælp af slægtsspecifikke biomarkører bekræftede, at TSIPSCs differentierede i repræsentative derivater af endoderm (SOX17), mesoderm (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β) og ectoderm (βIII TUBULIN) (Figur 4b).

Cerebral organoid differentiering.
TSIPSCs blev differentieret som cerebrale organoider på en fase klog måde. Enkeltcelleophæng af TSIPSCs blev samlet i embryonale organer for at stimulere udviklingen af kimlag i de første 6 dage efterfulgt af induktion af neuroepithelial udvikling i 5 dage. De neuroepithelial aggregerede var dem indlejret i Matrigel, som gav den ekstracellulære matrix og kældermembrankomponenter, der understøtter korrekt apicobasal orientering, udvækst af neuroepithelial knopper, der udvider og danner lumen. Immunofluorescence med neuroepithelial markør NESTIN blev udført for at observere den samlede morfologi af organoider (Figur 5b). Neuroepithelium omgiver en ventrikel som hulrum(Figur 5c - hvid linje). Organoiderne morfologisk viser ventrikulære zoner (VZ), subtrikulær zone (SVZ) og cortexlignende regioner (henholdsvisfigur 5c - rød, orange og gul linje)

Figure 1
Figur 1: Fibroblast isolation og omprogrammering via nucleofection.  (a) Mikroskopisk billede af føtal chorionic villi før kollagenasebehandling. (b) Fibroblaster isoleret fra føtal chorionic villi til omprogrammering eksperimenter. c) EcoRI's kontrol af omprogrammering af plasmid ved ecoRI-begrænsningsfornøjelse. (d) Skematisk diagram over transfection protokol ansat til iPSC generation fra føtal chorionic villi fibroblaster ved hjælp af episomal omprogrammering plasmids via nucleofection. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Etablering af Turner syndrom induceret pluripotente stamceller. (a) Cellemorfologien ændrer sig i løbet af omprogrammeringen. (b) En fuldt omprogrammeret TSiPSC-koloni. (c) Et repræsentativt billede af en koloni med forkert omprogrammerede celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Karakterisering af TSIPSC'er.  (a) Karyotype af TSIPSCs. (b) Immunofluorescenceanalyse af pluripotencybiomarkører OCT4, NANOG, SOX2, SSEA-4 og TRA-1-81 i TSIPSC'er sammenlignet med embryonale stamcelleFARVER1. Kerner er plettet med 4', 6-diamidino-2-phenylindole. 3c. Demonstration af transgenefri status for TSIPSCs. Lane 1- DNA stige, Lane 2- OriP positiv kontrol med pCXLE-hSK, Lane 3- EBNA positiv kontrol med pCXLE-hSK, Lane 4-OriP med TSIPSCs, Lane 5-EBNA med TSIPSCs. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: In vitro differentiering potentiale TSIPSCs.  (a) TSiPSC differentieret til Embryoid Organer. (b) Immunofluorescence analyser af TSIPSCs for endodermal markør SOX17, mesodermal markør myosin ventrikulær tung kæde α/β og ectodermal markører βIII tubulin og SOX2. Kerner er plettet med 4', 6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Neuronal og cerebral organoid differentiering af TSIPSCs.  (a) For at forstå cytoarkitktur af differentierede neuroner blev der foretaget phalloidinfarvning af Actin. TSiPSC-afledte neuroner viste pyramideformet neuronal soma (pilespids) med dendritter og axoner (pile). Kerner er plettet med 4', 6-diamidino-2-phenylindole. Immunstaining. (a) Immunostaining for Nestin og actin at observere brutto morfologi af organoider. (c) Farvning for Nestin at visualisere apically og basalt organiseret neuronale lag. Kerner er plettet med 4', 6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: Sammensætning af medier, buffere og løsninger Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: PCR Reaction Mix Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: PCR Cycling Program Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Generering af stabile cellulære modeller af cyto genetisk unormalt fostervæv er nødvendig for at forevige defekt fænotype. IPSC-ruten er den mest effektive metode til celleforberedelse til evig bevarelse af defekte egenskaber20.

Pluripotente stamceller (PSC) viser egenskaber af selvfornyelse og differentiering i specialiserede celler, der minder om tidlige kavalergangsembryoner21. Derfor kan PSC'er tjene som fremragende modeller til at studere tidlige molekylære, cellulære og udviklingsmæssige defekter i for tidligt aborterede fostre.

I denne artikel har vi beskrevet menneskelig iPSC generation ved hjælp af nucleofection kombineret med de forbedrede episomale vektorer. Resultaterne viser, at denne kombination omfatter en robust metode til at generere integrationsfrie menneskelige iPSC-linjer, hvilket fremgår af, at enkelte transinfektioner var tilstrækkelige til en vellykket omprogrammering. Vi spores den progressive konvertering af FCV fibroblaster til pluripotente celler mikroskopisk. 20 dage efter transfection observerede vi kolonier af omprogrammerede TSIPSCs omgivet af ikke-omprogrammerede FCV fibroblaster. Morfologisk lignede de afledte menneskelige iPSCs embryonale stamceller dyrket sammen med i laboratoriet. Typisk, cellerne aggregeret som kompakte kolonier med skinnende kanter. Cellerne i kolonierne havde store kerner og tæt pakket tyder på tæt membran kontakt mellem cellerne. De ikke-omprogrammerede fibroblaster buede og omringede disse kolonier. Ved overførsel til iMEF'er fortsætter de med at formere sig i kultur i over 30 overførsler, der viser, at der er grund til fortsat selvfornyelse.

Da TSIPSCs blev genereret fra 45XO fibroblaster vi karyotyped cellerne for at kontrollere, om de beholdt kromosomsammensætningen. TSIPSCs opretholdt 45XO karyotype i celle kontinuerlig kultur tyder på en stabil 45XO kromosom genetisk makeup. For at være nyttig som cellulær ressource, der repræsenterer 45XO aneuploidi TSIPSCs bør være fri for udefrakommende DNA, der anvendes i omprogrammering eksperimenter. Vi kontrollerede tilstedeværelsen af resterende episomale plasmider ved at udføre en genomisk DNA PCR for episomale specifikke markører-OriP og EBNA. Vi fandt ingen spor af disse markører i TSiPS celler efter 15 passager tyder på, at TSIPSCs gradvist mistet episomal omprogrammering vektorer i langvarig kultur.

Kendetegnende for en pluripotente celler er dens potentiale til at differentiere sig til celler af tre kim slægter både in vitro og in vivo. For at teste denne evne i de afledte TSIPSCs vi udsat dem in vitro til embryoid organ dannelse og differentiering assays instrueret af afstamning angiver cytokiner og vækstfaktorer. TSIPSCs dannede embryonale kroppe og differentierede sig til ectodermale celler, der udtrykker neuronale markører, mesodermale celler, der udtrykker hjertemarkører og endodermale celler, der udtrykker SOX17 en biomarkør for endoderm skæbne. Vi testede også TSIPSCs evne til at differentiere sig til højere orden 3D cerebral organoider ved hjælp af tidligere etablerede protokoller22. TSIPSCs gradvist selvorganisere på grund af deres egne iboende udviklingsprogrammer i minivæv kaldet organoider. TSIPSCs gav cerebral organoider viser en cytoarchitecture ligner hjernevæv med neuroepithelium omkring en ventrikel som hulrum. Men disse organoider skal karakteriseres yderligere i vid udstrækning for at afsløre de nøjagtige celletyper og sammenlignet med normale iPSCs for at skelne de iboende neurale vævsmønsteregenskaber af TSIPSCs. Disse cerebrale organoider og andre typer af hjerneorganoider genereret fra TSIPSCs kan bruges til at modellere udviklingsmæssige og funktionelle uoverensstemmelser, der kan bidrage til symptomerne på neurologiske mangler hos TS-individer. TSIPSCs udstillet biomarkør egenskaber pluripotency samt kendetegnende træk differentiering dermed fremhæve succes omprogrammering til induceret pluripotency.

Den ovenfor beskrevne metode har fungeret effektivt i omprogrammering dermal fibroblaster og mesenkymale celler stammer fra forskellige kilder i vores laboratorium (data fra andre linjer ikke vist). Det er vores erfaring, at følgende trin er afgørende for omprogrammeringseksperimentets succes:

a) Kvaliteten af plasmidforberedelse: gamle præparater giver ikke iPSC'er.
b) Kvaliteten af celler, der anvendes til transinfektioner: spredte celler er afgørende for iPSC-generering. 0,5 til 1 million celler pr. transfektion gav en reproducerbar omprogrammeringseffektivitet.
c) Nykonstituerede nucleofector reagenser: rekonstituerede nucleofector reagenser opbevaret i over en måned gav ikke iPSCs.
d) Vedligeholdelse af mastercellebanken ved mekanisk subkultur i iPSC'erne gav stabile linjer. Enzymatisk dissociation blev brugt som pr eksperiment krav.

Laboratoriets fremtidige mål er at etablere et panel af kromosomalt unormale iPSCs til downstream-udvikling, funktionel og sygdomsmodellering ved hjælp af denne effektive metode. Føtal aneuploidies forårsage graviditet tab og organ misdannelser i levende fødsler. Aneuploid iPSCs stammer fra væv af spontane abortuses er en værdifuld ressource til at modellere og studere mislykkede embryonale udviklingshændelser. In vitro 2D og 3D-kultursystemer, herunder embryonale organer og vævsspecifikke organoider22, vil gøre det muligt for forskere at forstå molekylære og cellulære uregelmæssigheder såsom afvigende cellespredning og celledød i slægtsspecifikke celler, der kan manifestere sig som udviklingsanomalier og graviditetsfejl forbundet med aneuploidy syndromer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Økonomisk støtte til ovennævnte forskning blev ydet af Manipal Academy of Higher Education. Karakterisering af linjen blev udført delvist i laboratoriet af M.M. Panicker på NCBS. Vi takker Anand Diagnostic Laboratory for hjælp til karyotyping.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.15% trypsin Thermo Fisher Scientific 27250018 G Banding
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023 Pluripotency and Embryoid body medium
4', 6 diamidino-2-phenylindole Sigma Aldrich D8417 Immunocytochemistry
Activin A Sigma Aldrich SRP3003 Differentiation assays
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353 AP staining
AMAXA Nucleofector II Lonza - Nucleofection
AmnioMAX II complete media Thermo Fisher Scientific, Gibco 11269016 Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures
Ampicillin HiMedia TC021 Plasmid purification
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Invitrogen A11059 Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Invitrogen A11034 Immunocytochemistry
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 Invitrogen A11035 Immunocytochemistry
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific, Gibco 15240096 Contamination control
Anti-E-Cadherin BD Biosciences 610181 Immunocytochemistry
Anti-Nanog BD Biosciences 560109 Immunocytochemistry
Anti-OCT3/4 BD Biosciences 611202 Immunocytochemistry
Anti-SOX17 BD Biosciences 561590 Immunocytochemistry
Anti-SOX2 BD Biosciences 561469 Immunocytochemistry
Anti-SSEA4 BD Biosciences 560073 Immunocytochemistry
Anti-TRA 1-81 Millipore MAB4381 Immunocytochemistry
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2] Sigma Aldrich F0291 Pluripotency medium
Bone Morphogenetic Factor 4 Sigma Aldrich SRP3016 Differentiation assays
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059 Blocking
Collagen Human Type IV BD Biosciences 354245 Differentiation assays
Collagenase blend Sigma Aldrich C8051 Digestion of foetal chorionic villi
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902 Differentiation assays
DMEM F12 Thermo Fisher Scientific 11320033 Differentiation assays
FastDigest EcoR1 Thermo Scientific FD0274 Restriction digestion
Fibronectin Sigma Aldrich F2518 Differentiation assays
Giemsa Stain HiMedia S011 G Banding
Glacial Acetic Acid HiMedia AS001 Fixative for karyotyping
Glucose Sigma Aldrich G7528 Differentiation assays
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Pluripotency and Embryoid body medium
Heparin sodium Sigma Aldrich H3149 Differentiation assays
Insulin solution human Sigma Aldrich I9278 Differentiation assays
Insulin Transferrin Selenite Sigma Aldrich I1884 Differentiation assays
KAPA HiFi PCR kit Kapa Biosystems KR0368 OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid Thermo Fisher Scientific 15210040 Mitotic arrest for karyotyping
KnockOut DMEM Thermo Fisher Scientific 10829018 Pluripotency and Embryoid body medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Pluripotency and Embryoid body medium
Luria Bertani agar HiMedia M1151F Plasmid purification
Matrigel BD Biosciences 356234 Differentiation assays
MEM Non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140035 Pluripotency and Embryoid body medium
Methanol HiMedia MB113 Fixative for karyotyping
Myosin ventricular heavy chain α/β Millipore MAB1552 Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector Kit Lonza VAPD-1001 Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148 Fixing cells
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F Addgene 27077 Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hSK Addgene 27078 Episomal reprogramming Plasmid
pCXLE-hUL Addgene 27080 Episomal reprogramming Plasmid
Penicillin Streptomycin   Thermo Fisher Scientific,  15070063 Pluripotency and Embryoid body medium
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma Aldrich P1951 Immunocytochemistry
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving
Storage: Room temperature.
PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS.
Storage: Room temperature.
Plasmid purification Kit- Midi prep QIAGEN 12143 Plasmid purification
Potassium Chloride Solution HiMedia MB043 Hypotonic solution for karyotyping
QIAamp DNA Blood Kit Qiagen 51104 Genomic DNA isolation
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875093 Hepatocyte differentiation medium
Sodium Citrate HiMedia RM255 Hypotonic solution for karyotyping
Triton X-100 HiMedia MB031 Permeabilisation
Trypsin-EDTA (0.05%) Thermo Fisher Scientific, Gibco 25300054 Subculture of  foetal chorionic villi fibroblasts
Tween 20 HiMedia MB067 Preparation of PBST
β III tubulin Sigma Aldrich T8578 Immunocytochemistry
Y-27632 dihydrochloride Sigma Aldrich Y0503 Differentiation assays

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verlinsky, Y., et al. Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).
  2. Eiges, R., et al. Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos. Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).
  3. Biancotti, J. -C., et al. Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes. STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).
  4. Li, W., et al. Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes. Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).
  5. Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. Turner syndrome: mechanisms and management. Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).
  6. Luo, Y., et al. Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Discovery. 1, 15022 (2015).
  7. Luo, Y., et al. Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism. Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).
  8. Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion. Stem Cell Research. 19, (2017).
  9. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  10. Soldner, F., et al. Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors. Cell. 136, 964-977 (2009).
  11. Somers, A., et al. Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).
  12. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  13. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
  14. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).
  15. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  16. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  17. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  18. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).
  20. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
  21. Ambartsumyan, G., Clark, A. T. Aneuploidy and early human embryo development. Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).
  22. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).

Tags

Udviklingsbiologi Udgave 178 Omprogrammering Human induceret pluripotente stamceller Aneuploidies Medfødte misdannelser spontan fosterdød Turner Syndrom Neurologiske Underskud
Generering af inducerede pluripotente stamceller fra Turner Syndrom (45XO) Fosterceller til downstream modellering af neurologiske underskud forbundet med syndromet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Veerasubramanian, N., Karthikeyan,… More

Veerasubramanian, N., Karthikeyan, V., Hegde, S., Dhanushkodi, A., Parveen, S. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome. J. Vis. Exp. (178), e62240, doi:10.3791/62240 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter