Summary
Denne rapport beskriver teknikker til at isolere og rense sulfat glycosaminoglycaner (GAGs) fra biologiske prøver og en polyacrylamidgelelektroforesetilgang for at tilnærme deres størrelse. GAG'er bidrager til vævsstruktur og påvirker signalprocesser via elektrostatisk interaktion med proteiner. GAG polymer længde bidrager til deres bindende affinitet for cognate ligands.
Abstract
Sulfat glycosaminoglycans (GAGs) såsom heparan sulfat (HS) og chondroitin sulfat (CS) er allestedsnærværende i levende organismer og spiller en afgørende rolle i en række grundlæggende biologiske strukturer og processer. Som polymerer findes GAG'er som en polydisperseblanding, der indeholder polysaccharidkæder, der kan variere fra 4000 Da til langt over 40.000 Da. Inden for disse kæder findes områder af sulfatering, hvilket giver et mønster af negativ ladning, der letter interaktionen med positivt ladede rester af cognate protein ligands. Sulfaterede områder af GAG'er skal være af tilstrækkelig længde til at muliggøre disse elektrostatiske interaktioner. For at forstå funktionen af GAGs i biologiske væv, investigator skal være i stand til at isolere, rense, og måle størrelsen af GAGs. Denne rapport beskriver en praktisk og alsidig polyacrylamidgel elektroforese-baseret teknik, der kan udnyttes til at løse relativt små forskelle i størrelse mellem GAGs isoleret fra en række biologiske vævstyper.
Introduction
Glycosaminoglycans (GAGs) er en forskelligartet familie af lineære polysaccharider, der er et allestedsnærværende element i levende organismer og bidrager til mange grundlæggende fysiologiske processer1. GAG'er som heparansulfat (HS) og chondroitin sulfat (CS) kan sulfateres i forskellige positioner langs polysaccharidkæden, der giver geografiske domæner af negativ ladning. Disse GAGs, når tøjret til celle-overflade proteiner kendt som proteoglycaner, projekt i ekstracellulære rum og binde sig til cognate ligands, giver mulighed for regulering af både cis- (ligand knyttet til den samme celle) og trans- (ligand knyttet til nabocelle) signalering processer2. Desuden udfører GAG'er også kritiske roller som strukturelle elementer i væv som den glomerulære kældermembran3, den vaskulære endotelglyks4 og lungeehelleleglyks5og i bindevæv sådan brusk6.
Længden af GAG polysaccharidkæder varierer betydeligt alt efter dens biologiske kontekst og kan forlænges dynamisk, spaltes og ændres af et meget komplekst enzymatisk reguleringssystem7. Det er vigtigt, at længden af GAG-polymerkæder bidrager væsentligt til deres bindende affinitet for ligands og efterfølgende til deres biologiske funktion8,9. Af denne grund kræver bestemmelse af funktionen af en endogen GAG en vurdering af dens størrelse. Desværre findes der i modsætning til proteiner og nukleinsyrer meget få let tilgængelige teknikker til at opdage og måle GAG'er, hvilket historisk har resulteret i relativt begrænset undersøgelse af de biologiske roller i denne forskelligartede polysaccharidfamilie.
Denne artikel beskriver, hvordan man isolerer og renser GAGs fra de fleste biologiske væv, og beskriver også, hvordan man bruger polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) til at vurdere længden af de isolerede polymerer med en rimelig grad af specificitet. I modsætning til andre, meget komplekse (og ofte massespektrometribaserede) glykomiske tilgange kan denne metode anvendes ved hjælp af standard laboratorieudstyr og -teknikker. Denne praktiske tilgang kan derfor udvide efterforskernes evne til at bestemme den biologiske rolle, som indfødte GAG'er spiller, og deres interaktion med kontekstuelt vigtige ligands.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle biologiske prøver analyseret i denne protokol blev fremstillet fra mus, under protokoller godkendt af University of Colorado Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Heparan sulfat isolation
- Delipidation af vævsprøver
BEMÆRK: Delipidation er et valgfrit skridt for fedt-rige væv.- Lav en 1:1 blanding af methanol og dichlormethan. Der fremstilles ca. 500 μL pr. prøve. større stykker væv kan kræve op til 1 mL.
- Placer hver vævsprøve i en lille glasbeholder med låg til delipidation.
BEMÆRK: Prøvemassen kan variere pr. interessevæv og eksperimentelle behov. 50 mg eller mindre er typisk tilstrækkeligt til tilstrækkelig GAG udbytte, men nogle optimering kan være påkrævet af slutbrugeren. - Der tilsættes 500 μL af methanol:dichlormethanopløsningen til hver glasbeholder og blandes. Sørg for, at alle prøver af fast væv er helt nedsænket i opløsningsmiddel.
BEMÆRK: Brug serologiske pipetter eller plastrør til at blande og håndtere methanol-/dichlormethanopløsningen. anden plast kan opløses. - Læg prøverne på en shaker (i sikret rack) i en kemisk røghætte og omrør forsigtigt i 1 time.
- Omrør prøverne til at blande og centrifugere ved 17.000 x g i 5 min ved 4 °C.
- Rør forsigtigt den organiske opløsningsmiddelfraktion (supernatant). Dette er lipidfraktionen - den indeholder ikke GAG'er og kan kasseres.
BEMÆRK: Prøv ikke at forstyrre vævet, da små stykker kan gå tabt. Det er at foretrække at efterlade noget af det organiske lag i prøvebeholderen i stedet for at risikere prøvetabet. - Lad låget af glasbeholderen stå åbent og lad det fordampe natten over i emhætten. Skift røret til det næste skridt, da disse rør ikke vil overleve yderligere behandling.
- Når opløsningsmiddelblandingen er helt fordampet, skal den gå i opløsning (hvis der > > 50 mg) eller Actinase E-fordøjelse (< 50 mg).
- Mekanisk opløsning af fast væv (valgfrit; for større vævsprøver)
BEMÆRK: De fleste mindre stykker fast væv (ca. 50 mg eller mindre) skal opløses helt under fordøjelsestrinnet. Større prøver vil dog kræve mekanisk opløsning.- Flash-fryse prøver af interesse ved at placere dem i en passende størrelse polypropylen rør og placere det lukkede rør i flydende nitrogen. Lad prøven fryse, indtil den er helt fast.
- Brug en ren mørtel og støder, male frosne prøver i en pulver-lignende konsistens.
- Fortsæt direkte til Actinase E fordøjelse (trin 1.4).
- Prøveafsaltning og koncentration
BEMÆRK: Dette er et valgfrit trin og kun nødvendigt for fortyndede flydende vævsprøver (f.eks. broncho-alveolær lavagevæske (BALF) eller plasma).- Pulje af væskeprøver i relevante forsøgsgrupper (f.eks. efter biologisk replikering eller forsøgsgruppe)
- Der anbringes et samlet prøvevolumen i en 500 μL centrifugalfiltersøjle med en molekylvægtsnedskæring (MWCO) på 3.000 Da.
- Spin i 30 min ved 14.000 x g ved stuetemperatur. Gentag efter behov, hvis den ønskede prøvevolumen overstiger centrifugalfilterkolonnens kapacitet.
- Vask hver kolonne 3x med 400 μL deioniseret, filtreret vand. Kassér strømmen igennem.
- Vend filteret og drej i 1 min ved 2.000 x g i friske, korrekt mærkede opsamlingsrør. Frys ved -80 °C, eller fortsæt til næste trin.
- Actinase E fordøjelse
BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for at fordøje og i sidste ende fjerne proteinforurenende stoffer fra din prøve.- Bland prøver 1:1 med rekombinant Actinase E til en ønsket koncentration på 10 mg/mL. Tilsæt passende volumen af 10x fordøjelse buffer koncentrat. Ønsket endelig koncentration: 0,005 M calciumacetat og 0,01 M natriumacetat, pH 7,5. For eksempel: 190 μL flydende prøve, 190 μL på 20 mg/ml Actinase E, 20 μL på 0,05 M calciumacetat, 0,1 M natriumacetat.
- Agiter prøverne forsigtigt for at blande, og fordøjes derefter i 48-72 timer ved 55 °C (op til 7 dage for hele væv).
- Varme til 80 °C i 15-20 min til opvarmning inaktivere Actinase E.
- Prøven fryses ved -80 °C, eller fortsæt til trin 1.5.
- Prøveafsaltning og koncentration
BEMÆRK: Hvis der forventes en lav masse af gag af interesse i den biologiske prøve, eller hvis bevarelse af forbrugsreagenser (dvs. centrifugalfiltersøjler) er ønskelig, kan prøver samles for at producere et enkelt koncentrat pr. forsøgsgruppe (f.eks. efter biologisk replikering eller forsøgsgruppe).- Sæt det samlede prøvevolumen i en 500 μL centrifugalfiltersøjle med en MWCO på 3.000 Da.
- Spin i 30 min ved 14.000 x g ved stuetemperatur. Gentag efter behov, hvis den ønskede prøvevolumen overstiger centrifugalfilterkolonnens kapacitet.
- Vask hver kolonne 3x med 400 μL deioniseret, filtreret vand. Kassér strømmen igennem.
- Inverter filter og spin i 1 min ved 2.000 x g i friske, passende mærkede opsamlingsrør (generelt inkluderet i centrifugalfiltersøjlerne). Frys ved -80 °C, eller fortsæt til næste trin.
- Udtørring
- De opløste prøver placeres enten fra trin 1.5.5 i en rotationsvakuumkoncentrator natten over eller lyophilize prøverne som beskrevet nedenfor.
- Frys prøverne grundigt enten natten over i -80 °C eller ved at dyppe i flydende nitrogen.
- Pierce prøve låg med en 18 G nål og sted i lyophilizer kammer. Tilsæt papirhåndklæder til pakning efter behov.
- Lyophilizer kammer til lyophilizer og fryse tør natten over (mindst -40 °C, 0,135 Torr)
- Kolonnen Cation exchange
- Resuspend udtørrede prøver i op til 400 μL på 8 M urinstof, 2% CHAPS-opløsning (eller, hvis de samler prøver, genanvendes til maks. (400/n) μL, hvor n = antallet af prøver i den ønskede pulje. Brug så lidt af vaskemiddelopløsningen som muligt.
- Ekvilibrere kationsudvekslingskolonnen (IEX) med 400 μL af 8 M urinstof, 2% CHAPS-opløsning. Spin i 5 min ved 2.000 x g ved stuetemperatur.
- Der skal hældes 400 μL prøver/samlede prøver i IEX-kolonnen. Spin i 5 min ved 2.000 x g.
- Vask 3x med 400 μL 8 M urinstof, 2% CHAPS-opløsning. Spin i 5 min ved 2.000 x g hver gang.
- Elute 3x med 400 μL på 0,2 M NaCl. Spin i 5 min ved 2.000 x g hver. Dette er den lave affinitetsfraktion - dette kan bevares til kvalitetskontrolformål, hvis det ønskes.
- Elute 3x med 400 μL på 2,7 M (16%) NaCl. Spin i 5 min ved 2.000 x g hver. Denne fraktion vil indeholde de isolerede glycosaminoglycans af interesse - holde det hele!
- For at afsalte hver eluted brøk tilsættes methanol op til 80 vol% og inkuberes ved 4 °C natten over. Drej hver prøve i 5 min ved 2.000 x g. Genvind den faste rest, da dette tørres afsaltet glycosaminoglycan.
BEMÆRK: Alternativt kan du springe dette trin over og fortsætte til trin 1.8 for at afsalte eluatet uden methanol.
- Prøveafsaltning og koncentration
- Om nødvendigt samlede puljefraktioner (fra 1.7.6) til relevante forsøgsgrupper (f.eks. ved biologisk replikering eller forsøgsgruppe).
- Sæt det samlede prøvevolumen i en 500 μL centrifugalfiltersøjle med en MWCO på 3.000 Da.
- Spin i 30 min ved 14.000 x g ved stuetemperatur. Gentag efter behov, hvis den ønskede prøvevolumen overstiger centrifugalfilterkolonnens kapacitet.
- Vask hver kolonne 3x med 400 μL deioniseret, filtreret vand. Kassér strømmen igennem. Fortsæt direkte til trin 1.9.
- Chondroitin fordøjelse
BEMÆRK: Formålet med dette trin er at fjerne GAG'er, der ikke er af interesse for slutbrugeren. I dette tilfælde bruges chondroitinase til at fjerne chondroitin. I væv, der anvendes til at generere repræsentative resultater (broncho-alveolær lavage væske og hele lunge), fordøje chondroitin sulfat blade heparan sulfat som den primære resterende GAG. Slutbrugere kan være nødvendigt at tilføje yderligere fordøjelse trin afhængigt af deres eksperimentelle mål.- Der skal fyldes 350 μL fordøjelsesbuffer (50 mM ammoniumacetat med 2 mM calciumchlorid justeret til pH 7.0) til centrifugalfilterkolonnen uden at røre membranen.
- Tilsæt 5 μL rekombinant chondroitinase ABC.
- Prøverne sættes i en 37 °C ovn og inkuberes i 1 time.
- Vend kolonnen om og læg den til korrekt mærkede opsamlingsrør. Spin i 1 min ved 2000 x g.
- Varmeprøver til 80 °C i 15-20 min til inaktivere chondroitinase ABC.
- Prøveafsaltning og koncentration
- Om nødvendigt fordøjede pool chondroitin prøver fra trin 1.9.5 til relevante forsøgsgrupper (f.eks. ved biologisk replikering eller forsøgsgruppe)
- Det samlede prøvevolumen anbringes i en 500 μL centrifugalfiltersøjle med en MWCO på 3.000 Da.
- Spin i 30 min ved 14.000 x g ved stuetemperatur. Gentag efter behov, hvis den ønskede prøvevolumen overstiger centrifugalfilterkolonnens kapacitet.
- Vask hver kolonne 3x med 400 μL deioniseret, filtreret vand. Kassér strømmen igennem.
- Inverter filter og spin i 1 min ved 2.000 x g i friske, korrekt mærket indsamling rør. Frys ved -80 °C, eller fortsæt til næste trin.
- Udtørring
BEMÆRK: I dette trin er udtørring nødvendig, så prøverne kan suspenderes igen i den mindst mulige mængde vand og løbebuffer.- Enten placere chondroitin fordøjede prøver fra trin 1.10.5 direkte i en roterende vakuumkoncentrator natten over eller lyophilize som følger:
- Frys prøverne grundigt enten natten over i -80 °C eller ved at dyppe i flydende nitrogen.
- Pierce prøve låg med en 18 G nål og sted i lyophilizer kammer. Tilsæt papirhåndklæder til pakning efter behov.
- Lyophilizer kammer til lyophilizer og fryse tør natten over (mindst 40 °C, 0,135 Torr)
2. Polyacrylamidgelelektroforese af isolerede og rensede glykosaminoglycaner
- Klargør opløsninger, der er nødvendige for polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) på forhånd (tabel 1).
BEMÆRK: Vælg den procentvise acrylamid af opløsning af gelopløsning afhængigt af størrelsen af de glykosaminoglycaner, der forventes at være i prøven. 15% anbefales til løsning af større fragmenter (større end 30 disaccharid underenheder i længden); 22% for mindre fragmenter (<20 disaccharid underenheder i længden). - Placer tom kassette i SIDE-tanken. Støbt den løsende gel som følger: I 15 mL rør blandes 10 mL opløsning gelopløsning, 60 μL på 10% ammoniumpersulfat (skal være frisklavet) og 10 μL TEMED (tilsættes TEMED sidste). Vend røret forsigtigt 2-3x. Brug pipetten til hurtigt at tilføje ovenstående 10 mL-opløsning til kassette. Overlejring med 2 mL deioniseret, filtreret vand og lad den opløsningsgel polymerisere i 30 min.
BEMÆRK: Følgende PAGE-protokol er optimeret til et lodret PAGE-system ved hjælp af 13,3 x 8,7 cm (bredde x længde) 1,0 mm tykke støbekassetter med en samlet volumen på ca. 12 mL. Andre kassettesystemer kan bruges, men kan kræve optimering af slutbrugeren. - Når den opløsningsgel er fuldt polymeriseret, skal du kassere det overlejrede vand og støbe stablingsgelen som følger: I et 15 mL rør blandes 3 mL af stablingsgelopløsningen, 90 μL 10% ammoniumpersulfat (skal være frisklavet), 3 μL TEMED (tilsættes TEMED sidst).
- Vend røret forsigtigt 2-3x. Brug en pipette til hurtigt at tilføje stabling gel opløsning over størknet opløsning gel; fylde kassette til randen. Sæt kammen helt ind, der følger med opsætningen. Lad stablingsgelen polymerisere i 30 min.
- Når gelen er polymeriseret, skal du sørge for, at båndstrimlen fjernes fra bunden af kassetten, og læg kassetten tilbage i SIDE-tankens samling.
- Fyld de øvre og nedre kamre med henholdsvis øvre og nedre kammerbuffer.
- De tørrede prøver opløses fra trin 1.11.4 i det mindste nødvendige volumen af deioniseret, filtreret vand (højst 50% af brøndenes volumen i PAGE gelen). Bland 1:1 med prøveindlæsningsbuffer. Læg prøverne og HS-oligosaccharid "stigerne" (se tabel 1) i gelen.
- Pre-run gelen i 5 min ved 100 V. Kør derefter gelen ved 200 V i 20-25 min (for en 15% polyacrylamidopløsningsgel), 40-50 min (for en 18% polyacrylamidopløsningsgel), 90-100 min (for 22% polyacrylamidopløsning af gel).
BEMÆRK: En vis optimering af 200 V-køretiden kan være nødvendig. Phenol rød migrerer foran heparin oligosaccharider, der er 2 polymer subenheder i længden (dvs. graden af polymerisering 2, eller dp2); bromophenol blå migrerer foran dp10-dp14. De bedste resultater opnås, når spændingen påføres, således at phenolrødbåndet migrerer næsten, men ikke helt, til bunden af gelen. Juster køretiden i overensstemmelse hermed.
3. Sølv farvning protokol
- Forbered alle opløsninger, der er nødvendige for sølvfarvning på forhånd (tabel 2).
BEMÆRK: Rør ikke PAGE-gelen direkte, før den er blevet farvet, udviklet og placeret i stopopløsning. I stedet manipulere gelen ved hjælp af ren plast eller glas værktøjer. Direkte håndtering af gelen vil resultere i finger-print forvrængninger og andre synlige artefakter på gelen efter farvning. - Når kørslen er afsluttet, adskille kassette og udtrække gel i en ren, medium-stor beholder fyldt med deioniseret, filtreret vand.
BEMÆRK: For at undgå direkte håndtering af gelen skal du bruge pipettespidsen eller en anden plastgenstand til forsigtigt at skrælle gelen væk fra kassetten, mens den er nedsænket i vand. Gel kan være skrøbelig - håndtag omhyggeligt.- Kassér vandet. Plet gelen i Alcian blå farvning opløsning i 5 min.
- Kassér Alcian blå plet. Skyl/vask hurtigt 2-3x med deioniseret, filtreret vand, indtil det meste af den alciske blå farvningsopløsning er fjernet.
- Lad det afsmæde i deioniseret, filtreret vand natten over på rocker. Sørg for, at der er rigelig mængde deioniseret, filtreret vand for at sikre, at eventuelle resterende pletter er fuldt vasket af gelen natten over.
- Vask gel i 50% methanol (40 min i alt, ændre opløsning 2-3x).
- Vask gel i deioniseret, filtreret vand i 30 min. Kassér vand og gentag 3 mere tid i alt 2 timer, og udskift vandet hver gang.
- I en frisk, ren beholder skal gelen pletters i 30 minutter i sølvnitratfarvningsopløsning.
- Skyl/vask hurtigt 2-3x i deioniseret, filtreret vand for fuldt ud at fjerne sølvfarvningsopløsningen.
- Vask i 30 min i deioniseret, filtreret vand. Kassér vand og gentag 2x i alt 90 min, og udskift vandbadet hver gang.
- Kassér vand og tilsæt udviklende opløsning.
- Når der er tilsat udvikling af opløsningen, skal du omhyggeligt observere gelen og se efter udseendet af bands. Afhængigt af kvaliteten af pletten og massen af den indlæste prøve kan udviklingen tage alt fra et par sekunder til flere minutter.
- Så snart de ønskede bånd er synlige, skal du straks kassere udviklingsopløsningen og vaske kort med stopopløsning.
- Kassér stopopløsningsvasken, og udskift med frisk stopopløsning. Lad det ligge i blød i 1 time på en rocker eller shaker.
- Vask i deioniseret, filtreret vand natten over (gelen kan dog afbildes umiddelbart efter stopopløsningsvask).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alcian blå bruges til at plette sulfat ggs 10; dette signal forstærkes ved brug af en efterfølgende sølvplet 11. Figur 1 giver en visuel demonstration af udviklingen af sølvfarvningsprocessen. Som det fremgår, forstærkes det Alciske blå signal, der repræsenterer GAG'er adskilt af elektroforese, efterhånden som det udviklende middel trænger ind i polyacrylamidgelen. Typisk vil udviklingsprocessen reducere sølv og Alcian blå-farvede GAGs i en tæthed afhængig måde, med kanterne af hvert bånd reducere først, mens de mere tæt farvning regioner i midten vil plette sidste.
I litteraturen varierer den rapporterede grænse for påvisning af GAG'er ved hjælp af SIDE-baserede tilgange fra 0,5-1 μg12,13. For at bestemme grænsen for detektion ved hjælp af vores tilgang blev heparan sulfat oligosaccharider af forskellige polymerlængder (ufraktioneret heparin, dp20, dp10, dp6) læsset på en 22% polyacrylamidgel, derefter løb og plettet som beskrevet ovenfor. Hver oligosaccharid blev lastet to gange i to forskellige masser: 1,0 μg og 0,5 μg. Figur 2 viser, at vores teknik ganske let kan detektere 0,5 μg renset GAG. Især blev der mindst opdaget ufraktioneret heparin af de fire forskellige oligosaccharider, der blev testet, sandsynligvis på grund af en bredere fordeling af polymerstørrelser, der tilsvarende reducerer tætheden af hvert enkelt bånd.
For at vurdere effektiviteten af GAG-rensning fra flydende biologiske prøver blev GAG'er isoleret fra to bronchoalveolar lavage (BAL) prøver. Som vist i figur 3var den første prøve, der blev markeret som A, der blev anvendt til GAG-isolering, 1 mL BAL-væske, der blev høstet fra en mus 24 timer efter intratracheal lipopolysaccharid (LPS) (3 mg/kg), der blev givet for at fremkalde alveolær epitel HS- 10 μg kommercielt tilgængelige dp6 blev tilføjet direkte til denne BAL væske til at tjene som en "spike i" kontrol til at vurdere tab af GAGs under isolationsprocessen. Den anden prøve, der blev markeret som B, bestod af 10 mL BAL-væske samlet fra 3 mus, som fik intratracheal LPS (3 mg/kg) 24 timer før, uden udefrakommende GAG spike-in. Begge prøver blev behandlet for GAG-isolation samtidigt, og alle 3 fraktioner, der blev udvundet fra ionbytningskolonnen, blev opbevaret og yderligere behandlet for at afgøre, om der var gag'er til stede i lavaffinitets- og vaskefraktionerne. 2 μg kommercielt indkøbte dp20, dp10 og dp6 heparan sulfat oligosaccharider blev kørt i PAGE gel sammen med disse prøver for at give en henvisning til kvalitativt at vurdere størrelsen af HS GAGs i hver eluted fraktion, samt en henvisning til at sammenligne tæthed med 10 μg "spike in" kontrol, der gennemgik GAG isolation.
For at demonstrere brugen af denne teknik på fast væv blev heparan sulfat isoleret fra et 15 mg stykke frossen muselunge som beskrevet ovenfor. Under isolations- og rensningsprocessen blev den lave affinitetsfraktion (0,2 M NaCl) udstukket fra ionbytningskolonnen bevaret og behandlet sammen med den høje affinitet (2,7 M NaCl) brøk og kørt på gelen (figur 4). 2 μg kommercielt indkøbte dp20, dp10 og dp6 heparan sulfat oligosaccharider blev kørt sammen med disse prøver for at give en reference for størrelse. Som det kan ses, gav hele lunge homogenatet en rigelig mængde isoleret HS, med de mindste fragmenter, der omtrent svarede til dp10 i størrelse. Den relative berigelse af Alcian blå / sølv plet ivrig indhold GAGs i 2,7 M NaCl brøk viser, at heparan sulfat binder med høj affinitet til ion udveksling kolonner og kan eluteres fra kolonnen med høj specificitet. Hele lunge homogenatet gav en rigelig mængde isolerede heparan sulfat (2,7 M NaCl fraktion), med de mindste fragmenter omtrent svarende til dp10 i størrelse.
Figur 1: Udviklingsproces for sølvpletter. Alcian blå farvning af ufraktioneret heparin (UFH) eller størrelsesdefinerede oligosaccharider (dp = graden af polymerisering) adskilt af elektroforese forstærkes af sølvfarvning. Fra venstre mod højre: UFH, dp20, dp10, dp6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Følsomheden af polyacrylamidgel og sølvplet til påvisning for heparansulfat. Heparan sulfat oligosaccharider af forskellig længde (ufraktioneret heparin aka UFH, dp20, dp10, dp6) var på en 22% polyacrylamid gel og løb og sølv farves. Hver oligosaccharid blev lastet to gange på to forskellige masser: 1,0 μg (venstre bånd) og 0,5 μg (højre bånd). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Gag-rensningens effektivitet fra flydende biologiske prøver. GAGs isoleret fra to bronchoalveolar lavage (BAL) prøver, mærket her som "A" og "B", blev kørt på en 22% polyacrylamid gel og sølv farves. Prøve A bestod af 1mL BAL væske høstet fra en mus 24 timer efter behandling med 3 mg/kg intratracheal lipopolysaccharid (LPS). Yderligere 10 μg dp6 HS blev tilføjet til denne prøve som en "spike in" kontrol. Prøve B bestod af 10 mL poolet BAL-væske indsamlet fra 3 mus 24 timer efter administration af LPS. Hver prøve blev kørt sammen med fraktioner fra ionbytningskolonnen, der var eluteret med enten fortyndingsstof ("vask") eller lave koncentrationer af NaCl (0,2 M). 2 μg af kommercielt indkøbte dp20, dp10 og dp6 heparan sulfat oligosaccharider blev anvendt som størrelse referencer (venstre bånd). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Måling af størrelsen af heparansulfater isoleret og renset fra en sund muselunge. Heparin sulfatindhold isoleret og renset fra 15 mg frossen prøve af en lunge isoleret fra en sund mus og køre på en 22% polyacrylamid gel. Heparan sulfat blev eluteret fra ionbytningskolonnen med enten lave koncentrationer (0,2 M; lav affinitetsfraktion) eller høje koncentrationer (2,7 M, 16% opløsning; høj affinitetsfraktion) af NaCl. 2 μg af kommercielt indkøbte dp20, dp10 og dp6 heparan sulfat oligosaccharider blev anvendt som størrelse referencer (venstre bånd). Klik her for at se en større version af dette tal.
| BEMÆRK: Alle opløsninger skal filtreres (0,22μm) før brug. | |||
| Opløsning | Opskrift | Sammensætning | Kommentarer |
| Løsning af gel/nedre kammer løbebuffer (2 L eller 4 L) | Borsyre, MW 61,83 | 2L: 12,36 g; 4L: 24,76 g | Ønsket koncentration: 0,1 M |
| Tris base, MW 124,14 | 2L: 24,2 g; 4L: | Ønsket koncentration: 0,1 M | |
| Disodium EDTA MW 336,21 eller dihydrat, MW 372,36 | 2L: henholdsvis 6,7 g eller 7,4 g; 4L 13,4 g eller 14,8 g | Ønsket koncentration: 0,01 M | |
| Deioniseret vand | 2L eller 4L | Juster pH til 8,3 efter fuldstændig opløsning af reagenser | |
| Øvre kammer kører buffer (1 L) | Glycin | 93 g | Ønsket koncentration: 1 M |
| Tris base, MW 124,14 | 24,2 g | Ønsket koncentration: 0,2 M | |
| Deioniseret vand | 1 L | ||
| Opløsning af gel, 22% acrylamid i alt (500mL) | Acrylamid, MW 71,08 | 100,1 g | Ønsket koncentration: 20,02% w/v |
| N,N'-methylen-bis-acrylamid (bis, MW 154,17) | 10 g | Ønsket koncentration: 2% w/v | |
| Saccharose | 75 g | Ønsket koncentration: 15% w/v | |
| Løsning af gelbuffer | 500 mL | Bring til en samlet volumen på 500mL; vil kræve mindre end 500mL buffer i alt | |
| Opløsning af gel, 15% samlet acrylamid (400mL) | Acrylamid, MW 71,08 | 56,3 g | Ønsket koncentration: 14,08% w/v |
| N,N'-methylen-bis-acrylamid (bis, MW 154,17) | 3,7 g | Ønsket koncentration: 2% w/v | |
| Saccharose | 20,8 g | Ønsket koncentration: 15% w/v | |
| Løsning af gelbuffer | 400 mL | Bring til en samlet volumen på 400mL; vil kræve mindre end 400mL buffer i alt | |
| Stabling gel (100 mL) | Acrylamid, MW 71,08 | 4,75 g | Ønsket koncentration: 4,75% w/v |
| N,N'-methylen-bis-acrylamid (bis, MW 154,17) | 0,25 g | Ønsket koncentration: 0,25% w/v | |
| Løsning af gelbuffer | 100 mL | Tilsæt 80mL buffer og fuld opløse reagenser. Juster derefter pH til 76,3 med saltsyre, dråbevis. Derefter bringe til en samlet volumen på 100 mL med opløsning gel buffer. | |
| Prøveindlæsningsbuffer (500 mL) | Saccharose | 250g | Ønsket koncentration: 50% w/v |
| Phenol rød | 500 mg | Ønsket koncentration: 1 mg/mL | |
| Bromophenol blå | 250 mg | Ønsket koncentration: 0,5 mg/mL | |
| Deioniseret vand | 500mL | Bring til en samlet volumen på 500mL; vil kræve mindre end 500mL vand i alt | |
| Heparin afledt oligosacharid 'stigen' (2mL hver) | dp6 | 0,1 mg | BEMÆRK: Anbefal at bruge heparin afledte oligosaccharider 6 polymerunderenheder i længden (aka graden af polymerisering 6 eller dp6) til det mindste bånd, dp20 for det største bånd og dp10 til mellembånd. Andre kombinationer kan dog bruges, hvis det ønskes. Ønsket koncentration: 0,05 mg/mL |
| dp10 | 0,1 mg | ||
| dp20 | 0,1 mg | ||
| Deioniseret vand | 3mL | Opløs hver oligosaccharid i separate rør med 1mL hver | |
| Eksempelbelastningsbuffer | 3mL | Tilsæt 1mL (1:1 blanding) til hver oligosaccharidopløsning | |
Tabel 1: Løsninger, der kræves til polyacrylamidgelelektroforese af rensede glykosaminoglycaner. Alle opløsninger skal filtreres (0,22 μm) før brug.
| BEMÆRK: Alle opløsninger skal filtreres (0,22μm) før brug. | |||
| Opløsning | Opskrift | Sammensætning | Kommentarer |
| Alcian blå farvning opløsning (500mL) | Alcian blå 8GX pulver | 2,5 g | Ønsket koncentration: 0,5% w/v |
| 2% v/v istidseddikesyre | 500mL | ||
| Sølv plet (200 mL) | Deioniseret vand | 192,7 mL | Forbered pletopløsning frisk; inden for en uge. |
| 7,6 M natriumhydroxid | 2 mL | For at gøre, tilsæt 3,04 g natriumhydroxid pellets til 10 ml vand | |
| Ammoniumhydroxid | 3,3 mL | ||
| 4M sølvnitratopløsning | 2 mL | For at gøre, tilsæt 3.397 g sølvnitrat til 5 mL vand. Tilsæt dropwise under omrøring for at undgå nedbør. | |
| Udvikling af opløsning (501 mL) | Deioniseret vand | 500 mL | Udvikling af opløsningen skal laves frisk og anvendes inden for 24 timer. |
| 2,5% m/v citronsyre | 1 mL | For at gøre, tilsæt 100mg til 4 mL deioniseret vand. Citronsyre skal laves frisk. | |
| Formaldehyd | 250μL | ||
| Stopløsning (500 mL) | Deioniseret vand | 300 mL | |
| Eddikesyre i iskold | 20 mL | ||
| Methanol | 90 mL | ||
Tabel 2: Løsninger, der kræves til sølvfarvning af glykosaminoglycaner adskilt af polyacrlamidgelelektroforese. Alle opløsninger skal filtreres (0,22 μm) før brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gag'er spiller en central rolle i mange forskellige biologiske processer. En af de vigtigste funktioner i sulfattede GAG'er (såsom HS og CS) er at interagere med og binde sig til ligands, som kan ændre downstream-signalfunktioner. En vigtig faktor for GAG-bindende affinitet til cognate ligands er længden af GAG polymerkæden 8,9,14. Derfor er det vigtigt for forskere med rimelig præcision at kunne definere størrelsen af GAG-kæder isoleret fra biologiske prøver af interesse. For at være praktisk bør denne teknik være i stand til at blive udført ved hjælp af almindeligt laboratorieudstyr og reagenser.
Denne protokol beskriver en metode til at isolere og rense GAGs fra biologiske prøver, til at adskille dem efter størrelse via PAGE, og at visualisere dem ved hjælp af Alcian blå og sølv farvning teknik. Mens der er flere måder at adskille glycosaminoglycans efter størrelse, vores tilgang har flere styrker specifikke for anvendelsen af denne teknik i life science laboratorier. For det første er denne teknik med en grænse for påvisning af 0,5 μg meget følsom ved påvisning af gag'er af interesse. Det er vores erfaring, at selv prøver, der indeholder relativt lave koncentrationer af GAG'er (dvs. BAL-væskeprøver), bør give mere end nok GAG til påvisning ved hjælp af denne metode. Mens udbyttet fra isolering og rensning af BAL væske vil variere efter teknik og specifikke GAG af interesse, har det været vores erfaring, at 10 mL rå BAL væske giver tilstrækkelig HS til at kunne påvises ved hjælp af denne teknik. Udbyttet fra faste organer er væsentligt højere, afhængigt af det væv høstet, men det er vores erfaring, at en indledende solid prøve på 10 mg vil give rigelig HS til påvisning ved hjælp af denne teknik.
Det er vigtigt at bemærke, at den endelige billeddannelse af den farvede PAGE gel vil variere alt efter de billedbehandling teknologier til rådighed for slutbrugeren. Digitale fotografier af gelen kan tages ved hjælp af en række forskellige systemer, herunder talrige kommercielt tilgængelige gel dokumentationssystemer eller en regelmæssig kommerciel kamera, afhængigt af det tilgængelige udstyr og følsomheden af detektion kræves (typisk dikteret af mængden af prøve lastet på gel). Det skal også bemærkes, at den lyskilde, der kræves for at afbilde denne gel digitalt, kan variere afhængigt af prøvens massefylde og den mængde udviklingstid, der kræves under farvningsprocessen. Geler, der udvikler sig hurtigt og producerer sølvfarvede bånd, der er let synlige for det blotte øje, vil kræve UV-transillumination for de bedste billeder, da størstedelen af lyset vil blive absorberet af ureakt alcisk blå. Geler, der kræver længere udviklingstider (som dem med meget små mængder prøve) vil kræve enten epi-belysning eller transillumination med normalt fuldspektret lys, da dette bedst absorberes af sølvpletten.
En yderligere styrke ved denne teknik er, at den er særligt tilpasningsdygtig til life sciences labs, på grund af sin basis i simpel SIDE-teknologi, ved hjælp af udstyr og reagenser, der er almindeligt tilgængelige og billigt erhvervet. Mens der er andre tilgange til kvantificering af længden af isolerede GAG polymerer (f.eks kapillær elektroforese), de typisk kræver både viden og udstyr, der ikke er almindeligt tilgængelige i de fleste biovidenskabelige laboratorier15,16. Enkelheden i denne tilgang og den relativt overkommelige og tilgængelige karakter af de krævede reagenser gør denne teknik let at tilpasse af biovidenskabelige forskere interesseret i at studere GAG-biologi i forbindelse med deres givne underfelter. Desuden tjener denne teknik som et væsentligt supplement til massespektrometribaserede teknikker til påvisning af GAG'er i biologisk væv. Mens massespektrometri baseret tilgange er i stand til at opdage GAG'er med høj følsomhed og skelne subtile forskelle i struktur fra komplekse prøver17, på grund af arten af den teknologi, det er ikke i stand til at skelne mellem GAG polymerer efter størrelse. Af denne grund er en SIDE-baseret tilgang afgørende for at divining størrelsen af HS polymerer i biologiske prøver af interesse.
Det er vigtigt at bemærke, at der er flere begrænsninger for de teknikker, der er beskrevet i dette papir. Den første og mest iøjnefaldende er, at på grund af den charge-charge interaktion, der er centrale for den alciske blå farvning reaktion, denne tilgang er meget selektiv for meget sulfaterede GAGs og vil kun svagt plette mere neutralt ladede moieties (f.eks hyaluronsyre18). Således vil denne teknik sandsynligvis skævvride sine resultater i retning af mere sure GAG-moietier. Derfor bør der anvendes supplerende metoder til måling af GKG-indhold i biologiske prøver af interesse (f.eks. massespektrometribaserede teknikker) adjunktivt for at give et mere fuldstændigt billede af de GAG'er, der findes i forsøgsprøver. Desuden, for slutbrugere specielt interesseret i at måle størrelsen af hyaluronan, andre har beskrevet lignende SIDE baseret teknikker, der udnytter biotinyleret hyaluronsyre bindende protein (HABP), som kan tilpasses den grundlæggende teknik, der er beskrevet her19.
Sammenfattende kan den teknik, der præsenteres i denne artikel, bruges til at isolere, rense og opdage GAGs fra biologiske prøver med stor følsomhed og specificitet samt til at måle den oprindelige længde af disse polysaccharidkæder. Disse oplysninger kan være afgørende for at teste hypoteser om GAG-ligand interaktioner på grund af betydningen af GAG polymer længde i fastsættelsen af cognate ligand bindende affinitet. Denne tilgang har flere fordele, især dens relative enkelhed og tilpasningsevne til biovidenskabelige forskningslaboratorier, selv om den er begrænset af sin relative bias i retning af negativt ladede GAG-moieties. På trods af denne ulempe repræsenterer denne teknik et robust værktøj, der vil tilskynde efterforskere til at studere GAG'ernes rolle i organ homøostase og sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL og EPS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
- Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
- Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
- Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
- Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
- Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
- Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
- Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
- Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
- Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
- Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
- Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
- Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
- Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
- Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
- Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
- Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).
