Summary
Questo rapporto descrive le tecniche per isolare e purificare i glicosaminoglicani solfati (GAG) da campioni biologici e un approccio di elettroforesi su gel di poliacrilammide per approssimarne le dimensioni. I GAG contribuiscono alla struttura dei tessuti e influenzano i processi di segnalazione attraverso l'interazione elettrostatica con le proteine. La lunghezza del polimero GAG contribuisce alla loro affinità di legame per i ligandi affini.
Abstract
I glicosaminoglicani solfati (GAG) come l'eparina solfato (HS) e il solfato di condroitina (CS) sono onnipresenti negli organismi viventi e svolgono un ruolo fondamentale in una varietà di strutture e processi biologici di base. Come polimeri, i GAG esistono come una miscela polidispersa contenente catene di polisaccaridi che possono variare da 4000 Da a ben oltre 40.000 Da. All'interno di queste catene esistono domini di solfatazione, che conferiscono un modello di carica negativa che facilita l'interazione con residui caricati positivamente di ligandi proteici affini. I domini solfatati dei GAG devono essere di lunghezza sufficiente per consentire queste interazioni elettrostatiche. Per comprendere la funzione dei GAG nei tessuti biologici, lo sperimentatore deve essere in grado di isolare, purificare e misurare le dimensioni dei GAG. Questo rapporto descrive una tecnica pratica e versatile basata sull'elettroforesi su gel di poliacrilammide che può essere sfruttata per risolvere differenze di dimensioni relativamente piccole tra i GAG isolati da una varietà di tipi di tessuto biologico.
Introduction
I glicosaminoglicani (GAG) sono una famiglia diversificata di polisaccaridi lineari che sono un elemento onnipresente negli organismi viventi e contribuiscono a molti processi fisiologici di base1. GAG come eparina solfato (HS) e condroitin solfato (CS) possono essere solfatati in posizioni distinte lungo la catena dei polisaccaridi, impartendo domini geografici di carica negativa. Questi GAG, quando legati a proteine della superficie cellulare note come proteoglicani, si proiettano nello spazio extracellulare e si legano a ligandi affini, consentendo la regolazione dei processi di segnalazione cis- (ligando attaccato alla stessa cellula) e trans- (ligando attaccato alla cellula vicina)2. Inoltre, i GAG svolgono anche ruoli critici come elementi strutturali in tessuti come la membrana basale glomerulare3,il glicocalyx4 endoteliale vascolare e il glicocalyx epiteliale polmonare5e nei tessuti connettivi come la cartilagine6.
La lunghezza delle catene di polisaccaridi GAG varia sostanzialmente a seconda del suo contesto biologico e può essere dinamicamente allungata, scissa e modificata da un sistema di regolazione enzimatico altamente complesso7. È importante sottolineare che la lunghezza delle catene polimeriche GAG contribuisce in modo sostanziale alla loro affinità di legame per i ligandi e, successivamente, alla loro funzione biologica8,9. Per questo motivo, la determinazione della funzione di un GAG endogeno richiede l'apprezzamento delle sue dimensioni. Sfortunatamente, a differenza delle proteine e degli acidi nucleici, esistono pochissime tecniche prontamente disponibili per rilevare e misurare i GAG, il che ha storicamente portato a un'indagine relativamente limitata sui ruoli biologici di questa diversa famiglia di polisaccaridi.
Questo articolo descrive come isolare e purificare i GAG dalla maggior parte dei tessuti biologici e, inoltre, descrive come utilizzare l'elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) per valutare la lunghezza dei polimeri isolati con un discreto grado di specificità. A differenza di altri approcci glicemici altamente complessi (e spesso basati sulla spettrometria di massa), questo metodo può essere impiegato utilizzando apparecchiature e tecniche di laboratorio standard. Questo approccio pratico può, quindi, espandere la capacità degli investigatori di determinare il ruolo biologico dei GAG nativi e la loro interazione con ligandi contestualmente importanti.
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Protocol
Tutti i campioni biologici analizzati in questo protocollo sono stati ottenuti da topi, secondo protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Colorado.
1. Isolamento del solfato di eparina
- Delipidazione di campioni di tessuto
NOTA: La delipidazione è un passaggio facoltativo per i tessuti ricchi di grasso.- Fare una miscela 1: 1 di metanolo e diclorometano. Preparare circa 500 μL per campione; pezzi di tessuto più grandi possono richiedere fino a 1 ml.
- Posizionare ogni campione di tessuto in un piccolo contenitore di vetro con un coperchio per la delipidazione.
NOTA: La massa del campione può variare in base al tessuto di interesse e alle esigenze sperimentali. 50 mg o meno sono in genere sufficienti per un'adeguata resa GAG, ma una certa ottimizzazione può essere richiesta dall'utente finale. - Aggiungere 500 μL della soluzione di metanolo:diclorometano a ciascun contenitore di vetro e mescolare. Assicurarsi che tutti i campioni di tessuto solido siano completamente immersi nel solvente.
NOTA: utilizzare pipette sierologiche o tubi conici di plastica per miscelare e maneggiare la soluzione di metanolo/diclorometano; altre materie plastiche possono dissolversi. - Posizionare i campioni su uno shaker (in un rack fissato) in una cappa chimica e agitare delicatamente per 1 ora.
- Agitare i campioni per mescolare e centrifugare a 17.000 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Pipettare con cura la frazione organica del solvente (surnatante). Questa è la frazione lipidica - non contiene GAG e può essere scartata.
NOTA: Cerca di non disturbare il tessuto poiché piccoli pezzi potrebbero andare persi. È preferibile lasciare parte dello strato organico nel contenitore del campione, piuttosto che rischiare la perdita del campione. - Lasciare aperto il coperchio del contenitore di vetro e lasciarlo evaporare per una notte nel cofano. Cambia il tubo per il passaggio successivo poiché quei tubi non sopravviveranno a un'ulteriore elaborazione.
- Una volta che la miscela di solvente è completamente evaporata, procedere alla disintegrazione meccanica (se il campione residuo è >50 mg) o alla digestione dell'Actinasi E (< 50 mg).
- Disintegrazione meccanica del tessuto solido (opzionale; per campioni di tessuto più grandi)
NOTA: La maggior parte dei pezzi più piccoli di tessuto solido (circa 50 mg o meno) dovrebbe dissolversi completamente durante la fase di digestione. Tuttavia, campioni più grandi richiederanno la disintegrazione meccanica.- Flash-freeze campioni di interesse posizionandoli in un tubo di polipropilene di dimensioni appropriate e posizionando il tubo chiuso in azoto liquido. Lasciare che il campione si congeli fino a completo solidità.
- Usando un mortaio pulito e un pestello, macinare i campioni congelati in una consistenza simile alla polvere.
- Procedere direttamente alla digestione dell'Actinasi E (Fase 1.4).
- Dissaliziazione e concentrazione del campione
NOTA: questa è una fase facoltativa e richiesta solo per i campioni di tessuto liquido diluito (ad esempio, liquido di lavaggio bronco-alveolare (BALF) o plasma).- Raggruppare campioni liquidi in gruppi sperimentali appropriati (ad esempio, per replica biologica o gruppo sperimentale)
- Posizionare il volume totale del campione in una colonna filtrante centrifuga da 500 μL con un cut-off a peso molecolare (MWCO) di 3.000 Da.
- Girare per 30 minuti a 14.000 x g a temperatura ambiente. Ripetere se necessario se il volume del campione desiderato supera la capacità della colonna del filtro centrifugo.
- Lavare ogni colonna 3 volte con 400 μL di acqua deionizzata e filtrata. Scartare il flusso attraverso.
- Invertire il filtro e ruotare per 1 minuto a 2.000 x g in tubi di raccolta freschi e opportunamente etichettati. Congelare a -80 °C o procedere al passaggio successivo.
- Actinasi E digestione
NOTA: questo passaggio è necessario per digerire e infine rimuovere i contaminanti proteici dal campione.- Mescolare i campioni 1:1 con Actinase E ricombinante alla concentrazione desiderata di 10 mg/ml. Aggiungere il volume appropriato di 10x concentrato tampone di digestione. Concentrazione finale desiderata: 0,005 M acetato di calcio e 0,01 M acetato di sodio, pH 7,5. Ad esempio: 190 μL di campione liquido, 190 μL di Actinasi E da 20 mg/mL, 20 μL da 0,05 M acetato di calcio, 0,1 M acetato di sodio.
- Agitare delicatamente i campioni per mescolare, quindi digerire per 48-72 ore a 55 °C (fino a 7 giorni per il tessuto intero).
- Riscaldare a 80 °C per 15-20 minuti per riscaldare l'inattivazione dell'Actinasi E.
- Congelare il campione a -80 °C o continuare con il punto 1.5.
- Dissaliziazione e concentrazione del campione
NOTA: Se nel campione biologico è prevista una bassa massa del GAG di interesse, o se è auspicabile la conservazione dei reagenti consumabili (cioè colonne di filtro centrifugo), i campioni possono essere raggruppati per produrre un singolo concentrato per gruppo sperimentale (ad esempio, per replica biologica o gruppo sperimentale).- Posizionare il volume totale del campione in una colonna filtrante centrifuga da 500 μL con un MWCO di 3.000 Da.
- Girare per 30 minuti a 14.000 x g a temperatura ambiente. Ripetere se necessario, se il volume di campione desiderato supera la capacità della colonna del filtro centrifugo.
- Lavare ogni colonna 3 volte con 400 μL di acqua deionizzata e filtrata. Scartare il flusso attraverso.
- Invertire il filtro e ruotare per 1 minuto a 2.000 x g in tubi di raccolta freschi e opportunamente etichettati (generalmente inclusi con le colonne del filtro centrifugo). Congelare a -80 °C o procedere al passaggio successivo.
- Essiccazione
- Posizionare i campioni disciolti dal punto 1.5.5 in un concentratore a vuoto rotazionale durante la notte o liofilizzare i campioni come descritto di seguito.
- Congelare accuratamente i campioni durante la notte a -80 °C o immergendo in azoto liquido.
- Forare i coperchi del campione con un ago da 18 G e posizionare nella camera del liofilizzatore. Aggiungere asciugamani di carta per l'imballaggio secondo necessità.
- Fissare la camera del liofilizzatore al liofilizzatore e liofilizzatore durante la notte (almeno -40 °C, 0,135 Torr)
- Colonna di scambio cationico
- Campioni essiccati in soluzione essiccata fino a 400 μL di urea 8 M, soluzione CHAPS al 2% (o, se si accumulano campioni, riconsegregati fino a un massimo di (400/n) μL, dove n = il numero di campioni nel pool desiderato. Utilizzare il minor numero possibile di soluzione detergente.
- Equilibrare la colonna di scambio cationico (IEX) con 400 μL di urea 8 M, soluzione CHAPS al 2%. Girare per 5 minuti a 2.000 x g a temperatura ambiente.
- Caricare 400 μL di campioni/campioni raggruppati nella colonna IEX. Girare per 5 minuti a 2.000 x g.
- Lavare 3x con 400 μL di 8 M di urea, soluzione CHAPS al 2%. Gira per 5 minuti a 2.000 x g ogni volta.
- Elute 3x con 400 μL di 0,2 M NaCl. Girare per 5 minuti a 2.000 x g ciascuno. Questa è la frazione a bassa affinità - questa può essere conservata per scopi di controllo qualità, se lo si desidera.
- Elute 3x con 400 μL di 2,7 M (16%) NaCl. Girare per 5 minuti a 2.000 x g ciascuno. Questa frazione conterrà i glicosaminoglicani isolati di interesse - tienilo tutto!
- Per dissalare ogni frazione eluita, aggiungere metanolo fino all'80 vol% e incubare a 4 °C durante la notte. Ruotare ogni campione per 5 minuti a 2.000 x g. Recuperare il residuo solido in quanto questo viene essiccato glicosaminoglicano disasato.
NOTA: in alternativa, saltare questo passaggio e procedere al passaggio 1.8 per disacrosare l'eluato senza metanolo.
- Dissaliziazione e concentrazione del campione
- Se necessario, raggruppare le frazioni eluite (da 1.7.6) in gruppi sperimentali appropriati (ad esempio, per replica biologica o gruppo sperimentale).
- Posizionare il volume totale del campione in una colonna filtrante centrifuga da 500 μL con un MWCO di 3.000 Da.
- Girare per 30 minuti a 14.000 x g a temperatura ambiente. Ripetere se necessario, se il volume di campione desiderato supera la capacità della colonna del filtro centrifugo.
- Lavare ogni colonna 3 volte con 400 μL di acqua deionizzata e filtrata. Scartare il flusso attraverso. Procedere direttamente al passaggio 1.9.
- Digestione della condroitina
NOTA: lo scopo di questo passaggio è rimuovere i GAG non di interesse per l'utente finale. In questo caso, la condroitinasi viene utilizzata per rimuovere la condroitina. Nei tessuti utilizzati per generare risultati rappresentativi (liquido di lavaggio bronco-alveolare e polmone intero), la digestione del solfato di condroitina lascia eparina solfato come gag residuo primario. Gli utenti finali potrebbero dover aggiungere ulteriori fasi di digestione a seconda dei loro obiettivi sperimentali.- Caricare 350 μL di tampone di digestione (50 mM di acetato di ammonio con 2 mM di cloruro di calcio regolato a pH 7,0) sulla colonna del filtro centrifugo senza toccare la membrana.
- Aggiungere 5 μL di condroitinasi ABC ricombinante.
- Posizionare la provetta dei campioni in un forno a 37 °C e incubare per 1 ora.
- Capovolgere la colonna e posizionare in tubi di raccolta opportunamente etichettati. Girare per 1 min a 2000 x g.
- Riscaldare i campioni a 80 °C per 15-20 minuti per inattivare la condroitinasi ABC.
- Dissaliziazione e concentrazione del campione
- Se necessario, raggruppare i campioni di condroitina digeriti dal passo 1.9.5 in gruppi sperimentali appropriati (ad esempio, per replica biologica o gruppo sperimentale)
- Posizionare il volume totale del campione in una colonna filtrante centrifuga da 500 μL con un MWCO di 3.000 Da.
- Girare per 30 minuti a 14.000 x g a temperatura ambiente. Ripetere se necessario se il volume del campione desiderato supera la capacità della colonna del filtro centrifugo.
- Lavare ogni colonna 3 volte con 400 μL di acqua deionizzata e filtrata. Scartare il flusso attraverso.
- Invertire il filtro e ruotare per 1 minuto a 2.000 x g in tubi di raccolta freschi e opportunamente etichettati. Congelare a -80 °C o procedere al passaggio successivo.
- Essiccazione
NOTA: in questa fase, l'essiccazione è necessaria in modo che i campioni possano essere risuscisi nella minor quantità possibile di acqua e tampone corrente.- Posizionare i campioni digeriti di condroitina dal punto 1.10.5 direttamente in un concentratore di vuoto rotazionale durante la notte o liofilizzare come segue:
- Congelare accuratamente i campioni durante la notte a -80 °C o immergendo in azoto liquido.
- Forare i coperchi del campione con un ago da 18 G e posizionare nella camera del liofilizzatore. Aggiungere asciugamani di carta per l'imballaggio secondo necessità.
- Fissare la camera del liofilizzatore al liofilizzatore e liofilizzatore durante la notte (almeno 40 °C, 0,135 Torr)
2. Elettroforesi su gel di poliacrilammide di glicosaminoglicani isolati e purificati
- Preparare in anticipo le soluzioni necessarie per l'elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) (Tabella 1).
NOTA: Selezionare la percentuale di acrilammide della soluzione di gel risolutivo in base alle dimensioni dei glicosaminoglicani che si prevede siano nel campione. Il 15% è raccomandato per la risoluzione di frammenti più grandi (più di 30 subunità disaccaridi in lunghezza); 22% per frammenti più piccoli (<20 subunità di disaccaridi in lunghezza). - Inserire la cassetta vuota nel serbatoio PAGE. Gettare il gel risolutivo come segue: In un tubo da 15 mL, mescolare 10 mL di soluzione di gel risolutivo, 60 μL di persolfato di ammonio al 10% (deve essere preparato al momento) e 10 μL di TEMED (aggiungere TEMED per ultimo). Capovolgere delicatamente il tubo 2-3x. Utilizzare la pipetta per aggiungere rapidamente la soluzione di 10 ml di cui sopra alla cassetta. Sovrapporre con 2 ml di acqua deionizzata e filtrata e lasciare polimerizzare il gel risolutivo per 30 min.
NOTA: il seguente protocollo PAGE è stato ottimizzato per un sistema PAGE verticale che utilizza cassette di fusione spesse 13,3 x 8,7 cm (larghezza x lunghezza) 1,0 mm con un volume totale di circa 12 ml. Altri sistemi di cassette possono essere utilizzati, ma possono richiedere l'ottimizzazione da parte dell'utente finale. - Dopo che il gel risolutivo si è completamente polimerizzato, scartare l'acqua sovrapposta e gettare il gel impilante come segue: in un tubo da 15 ml, mescolare 3 mL della soluzione di gel impilante, 90 μL di persolfato di ammonio al 10% (deve essere preparato al momento), 3 μL di TEMED (aggiungere TEMED per ultimo).
- Capovolgere delicatamente il tubo 2-3x. Utilizzare una pipetta per aggiungere rapidamente la soluzione di gel impilabile sul gel risolutivo solidificato; riempire la cassetta fino all'orlo. Pettine completamente inserito incluso con il set-up. Lasciare polimerizzare il gel impilante per 30 minuti.
- Una volta che il gel si è polimerizzato, assicurarsi che la striscia di nastro venga rimossa dal fondo della cassetta e riporre la cassetta nel gruppo del serbatoio PAGE.
- Riempire le camere superiore e inferiore con il buffer della camera superiore e inferiore, rispettivamente.
- Sciogliere i campioni essiccati dal punto 1.11.4 nel volume minimo necessario di acqua deionizzata e filtrata (al massimo, il 50% del volume dei pozzi nel gel PAGE). Mescolare 1:1 con il buffer di caricamento del campione. Caricare i campioni e le "scale" oligosaccaridiche HS (vedi Tabella 1) nel gel.
- Pre-eseguire il gel per 5 minuti a 100 V. Quindi eseguire il gel a 200 V per 20-25 minuti (per un gel risolutivo poliacrilammide al 15%), 40-50 minuti (per un gel risolutivo poliacrilammide al 18%), 90-100 minuti (per gel risolutivo poliacrilammide al 22%).
NOTA: potrebbe essere necessaria una certa ottimizzazione del tempo di esecuzione di 200 V. Il rosso fenolo migra davanti agli oligosaccaridi dell'eparina che sono 2 subunità polimeriche di lunghezza (cioè grado di polimerizzazione 2 o dp2); bromophenol blue migra davanti a dp10-dp14. I migliori risultati si ottengono quando la tensione viene applicata in modo tale che la banda rossa fenole migri quasi, ma non del tutto, sul fondo del gel. Regola il tempo di esecuzione di conseguenza.
3. Protocollo di colorazione dell'argento
- Preparare in anticipo tutte le soluzioni necessarie per la colorazione dell'argento (Tabella 2).
NOTA: non toccare direttamente il gel PAGE fino a quando non è stato macchiato, sviluppato e posto in soluzione di arresto. Invece, manipola il gel usando strumenti di plastica o vetro puliti. Maneggiare direttamente il gel comporterà distorsioni dell'impronta digitale e altri artefatti visibili sul gel dopo la colorazione. - Una volta completata la corsa, smontare la cassetta ed estrarre il gel in un contenitore pulito, medio-grande, riempito con acqua deionizzata e filtrata.
NOTA: per evitare di maneggiare direttamente il gel, utilizzare la punta della pipetta o altro oggetto di plastica per staccare delicatamente il gel dalla cassetta mentre è immerso in acqua. Il gel può essere fragile - maneggiare con attenzione.- Scartare l'acqua. Macchiare il gel in soluzione di colorazione blu Alcian per 5 minuti.
- Scartare la macchia blu alcian. Risciacquare/lavare rapidamente 2-3 volte con acqua deionizzata e filtrata fino a quando la maggior parte della soluzione colorante blu Alcian non è stata rimossa.
- Lasciare smacchiare in acqua deionizzata e filtrata per una notte sul bilanciere. Assicurarsi che vi sia un ampio volume di acqua deionizzata e filtrata per garantire che qualsiasi macchia residua venga completamente lavata via dal gel durante la notte.
- Gel di lavaggio in metanolo al 50% (40 min totali, cambio soluzione 2-3x).
- Lavare il gel in acqua deionizzata e filtrata per 30 min. Scartare l'acqua e ripetere altre 3 volte per un totale di 2 ore, sostituendo l'acqua ogni volta.
- In un contenitore fresco e pulito, macchiare il gel per 30 minuti in soluzione colorante di nitrato d'argento.
- Risciacquare / lavare rapidamente 2-3 volte in acqua deionizzata e filtrata per rimuovere completamente la soluzione colorante all'argento.
- Lavare per 30 minuti in acqua deionizzata e filtrata. Scartare l'acqua e ripetere 2 volte per un totale di 90 minuti, sostituendo ogni volta il bagno d'acqua.
- Scartare l'acqua e aggiungere la soluzione in via di sviluppo.
- Una volta aggiunta la soluzione di sviluppo, osservare attentamente il gel e osservare l'aspetto delle fasce. A seconda della qualità della macchia e della massa del campione caricato, lo sviluppo può richiedere da pochi secondi a diversi minuti.
- Non appena le bande desiderate sono visibili, scartare immediatamente la soluzione di sviluppo e lavare brevemente con la soluzione di arresto.
- Scartare la soluzione di arresto lavare e sostituirla con una soluzione di arresto fresco. Lasciare in ammollo per 1 ora su un bilanciere o shaker.
- Lavare in acqua deionizzata e filtrata durante la notte (tuttavia, il gel può essere ripreso immediatamente dopo aver interrotto il lavaggio con soluzione).
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Representative Results
Il blu alciano è usato per macchiare i GAG solfati 10; questo segnale è amplificato dall'uso di una successiva macchia d'argento 11. La Figura 1 fornisce una dimostrazione visiva del processo di sviluppo della colorazione dell'argento. Come dimostrato, il segnale blu di Alcian che rappresenta i GAG separati dall'elettroforesi viene amplificato quando l'agente in via di sviluppo penetra nel gel di poliacrilammide. In genere, il processo di sviluppo ridurrà l'argento e i GAG macchiati di blu Alcian in modo dipendente dalla densità, con i bordi di ciascuna banda che si riducono per primi mentre le regioni più densamente macchiate al centro si macchiano per ultime.
In letteratura, il limite riportato di rilevazione dei GAG utilizzando approcci basati su PAGE varia da 0,5-1 μg12,13. Per determinare il limite di rilevazione utilizzando il nostro approccio, gli oligosaccaridi di epatano solfato di diverse lunghezze polimeriche (eparina non sezionata, dp20, dp10, dp6) sono stati caricati su un gel di poliacrilammide al 22%, quindi eseguiti e colorati come descritto sopra. Ogni oligosaccaride è stato caricato due volte a due masse diverse: 1,0 μg e 0,5 μg. La Figura 2 dimostra che la nostra tecnica può rilevare abbastanza facilmente 0,5 μg di GAG purificato. In particolare, l'eparina non sezionata è stata rilevata meno facilmente dei quattro diversi oligosaccaridi testati, probabilmente a causa di una più ampia distribuzione delle dimensioni del polimero che riduce di conseguenza la densità di ogni singola banda.
Per valutare l'efficienza della purificazione GAG da campioni biologici liquidi, i GAG sono stati isolati da due campioni di lavaggio broncoalveolare (BAL). Come mostrato nella Figura 3,il primo campione contrassegnato come A utilizzato per l'isolamento GAG è stato 1 mL di liquido BAL raccolto da un topo 24 ore dopo il lipopolisaccaride intratracheale (LPS) (3 mg/kg), somministrato per indurre lo spargimento di HS epiteliale alveolare 5. 10 μg di dp6 disponibile in commercio sono stati aggiunti direttamente a questo fluido BAL per fungere da controllo "spike in" per valutare la perdita di GAG durante il processo di isolamento. Il secondo campione contrassegnato come B consisteva in 10 ml di liquido BAL raccolto da 3 topi a cui è stato somministrato LPS intratracheale (3 mg / kg) 24 ore prima, senza spike-in GAG esogeno. Entrambi i campioni sono stati elaborati per l'isolamento GAG contemporaneamente e tutte e 3 le frazioni eluite dalla colonna a scambio ionico sono state trattenute e ulteriormente elaborate al fine di determinare se fossero presenti GAG nelle frazioni a bassa affinità e di lavaggio. 2 μg di oligosaccaridi di eparano solfato dp20, dp10 e dp6 acquistati in commercio sono stati eseguiti nel gel PAGE insieme a questi campioni per fornire un riferimento con cui valutare qualitativamente la dimensione dei GAG HS in ciascuna frazione eluita, nonché un riferimento per confrontare la densità con il controllo "spike in" di 10 μg sottoposto all'isolamento GAG.
Per dimostrare l'uso di questa tecnica sul tessuto solido, l'eparina solfato è stato isolato da un pezzo da 15 mg di polmone di topo congelato come descritto sopra. Durante il processo di isolamento e purificazione, la frazione a bassa affinità (0,2 M NaCl) eluita dalla colonna a scambio ionico è stata trattenuta ed elaborata insieme alla frazione ad alta affinità (2,7 M NaCl) e eseguita sul gel (Figura 4). 2 μg di oligosaccaridi di eparano solfato dp20, dp10 e dp6 acquistati commercialmente sono stati eseguiti insieme a questi campioni per fornire un riferimento per le dimensioni. Come si può vedere, l'intero omogeneizzato polmonare ha prodotto un'ampia quantità di HS isolato, con i frammenti più piccoli approssimativamente uguali a dp10 di dimensioni. Il relativo arricchimento del contenuto avido di macchia blu/argento di Alcian nella frazione naCl di 2,7 M dimostra che il solfato di eparina si lega con elevata affinità alle colonne di scambio ionico e può essere eluito dalla colonna con elevata specificità. L'intero omogeneizzato polmonare ha prodotto un'ampia quantità di eparano solfato isolato (frazione NaCl 2,7 M), con i frammenti più piccoli approssimativamente uguali a dp10 di dimensioni.
Figura 1: Processo di sviluppo della macchia d'argento. La colorazione blu alciana di eparina non sezionata (UFH) o oligosaccaridi definiti in termini di dimensioni (dp = grado di polimerizzazione) separati dall'elettroforesi è amplificata dalla colorazione dell'argento. Da sinistra a destra: UFH, dp20, dp10, dp6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Sensibilità del gel di poliacrilammide e della macchia d'argento per il rilevamento dell'eparina solfato. Gli oligosaccaridi di epatano solfato di diverse lunghezze (eparina non sezionata aka UFH, dp20, dp10, dp6) erano su un gel di poliacrilammide al 22% e correvano e macchiati d'argento. Ogni oligosaccaride è stato caricato due volte a due masse diverse: 1,0 μg (bande più a sinistra) e 0,5 μg (bande più a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Efficienza della purificazione GAG da campioni biologici liquidi. I GAG isolati da due campioni di lavaggio broncoalveolare (BAL), etichettati qui come "A" e "B", sono stati eseguiti su un gel di poliacrilammide al 22% e macchiati d'argento. Il campione A consisteva in 1 ml di liquido BAL raccolto da un topo 24 ore dopo il trattamento con 3 mg/kg di lipopolisaccaride intratracheale (LPS). Altri 10 μg di dp6 HS sono stati aggiunti a questo campione come controllo "spike in". Il campione B consisteva in 10 ml di liquido BAL in pool raccolto da 3 topi 24 ore dopo la somministrazione di LPS. Ogni campione è stato eseguito insieme a frazioni della colonna di scambio ionico eluite con diluente ("lavaggio") o basse concentrazioni di NaCl (0,2 M). 2 μg di oligosaccaridi di solfato di eparina dp20, dp10 e dp6 acquistati commercialmente sono stati utilizzati come riferimenti dimensionali (bande più a sinistra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Misurazione delle dimensioni dei solfati di eparina isolati e purificati da un polmone di topo sano. Contenuto di eparina solfato isolato e purificato da un campione congelato di 15 mg di un polmone isolato da un topo sano e eseguito su un gel di poliacrilammide al 22%. Il solfato di epatano è stato eluito dalla colonna di scambio ionico con basse concentrazioni (0,2 M; frazione a bassa affinità) o alte concentrazioni (2,7 M, soluzione al 16%; frazione ad alta affinità) di NaCl. 2 μg di oligosaccaridi di solfato di eparina dp20, dp10 e dp6 acquistati commercialmente sono stati utilizzati come riferimenti dimensionali (bande più a sinistra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| NOTA: tutte le soluzioni devono essere filtrate (0,22 μm) prima dell'uso. | |||
| Soluzione | Ricetta | Composizione | Commenti |
| Liquido di risoluzione del tampone di funzionamento del gel/camera inferiore (2 L o 4 L) | Acido borico, MW 61.83 | 2L: 12,36 g; 4L: 24,76 g | Concentrazione desiderata: 0.1 M |
| Base Tris, MW 124,14 | 2L: 24,2 g; 4L: | Concentrazione desiderata: 0.1 M | |
| EDTA disodico MW 336.21 o diidrato, MW 372.36 | 2L: 6,7 g o 7,4 g, rispettivamente; 4L 13,4 g o 14,8 g, rispettivamente | Concentrazione desiderata: 0.01 M | |
| Acqua deionizzata | 2L o 4L | Regolare il pH a 8,3 dopo aver completamente sciolto i reagenti | |
| Buffer di funzionamento della camera superiore (1 L) | Glicina | 93 g | Concentrazione desiderata: 1 M |
| Base Tris, MW 124,14 | 24,2 g | Concentrazione desiderata: 0,2 M | |
| Acqua deionizzata | 1 L | ||
| Gel risolutivo, 22% acrilammide totale (500mL) | Acrilammide, MW 71,08 | 100,1 g | Concentrazione desiderata: 20,02% p/v |
| N,N'-metilene-bis-acrilammide (bis, MW 154.17) | 10 g | Concentrazione desiderata: 2% p/v | |
| Saccarosio | 75 grammi | Concentrazione desiderata: 15% p/v | |
| Risoluzione del tampone gel | 500 ml | Portare ad un volume totale di 500mL; richiederà meno di 500 ml di buffer totale | |
| Gel risolutivo, 15% acrilammide totale (400mL) | Acrilammide, MW 71,08 | 56,3 g | Concentrazione desiderata: 14,08% p/v |
| N,N'-metilene-bis-acrilammide (bis, MW 154.17) | 3,7 g | Concentrazione desiderata: 2% p/v | |
| Saccarosio | 20,8 g | Concentrazione desiderata: 15% p/v | |
| Risoluzione del tampone gel | 400 ml | Portare ad un volume totale di 400mL; richiederà meno di 400 ml di buffer totale | |
| Gel impilante (100 mL) | Acrilammide, MW 71,08 | 4,75 g | Concentrazione desiderata: 4,75% p/v |
| N,N'-metilene-bis-acrilammide (bis, MW 154.17) | 0,25 g | Concentrazione desiderata: 0,25% p/v | |
| Risoluzione del tampone gel | 100 ml | Aggiungere un tampone da 80 ml e i reagenti a piena dissoluzione. Quindi regolare il pH a 76,3 con acido cloridrico, a goccia. Quindi portare a un volume totale di 100 ml con tampone gel risolutivo. | |
| Buffer di carico del campione (500 mL) | Saccarosio | 250g | Concentrazione desiderata: 50% p/v |
| Rosso fenolo | 500mg | Concentrazione desiderata: 1mg/mL | |
| Bromofenolo blu | 250mg | Concentrazione desiderata: 0.5mg/mL | |
| Acqua deionizzata | 500mL | Portare ad un volume totale di 500mL; richiederà meno di 500 ml di acqua totale | |
| "Scala" oligosaccaride derivata dall'eparina (2 ml ciascuna) | DP6 | 0,1mg | NOTA: Consigliare l'uso di oligosaccaridi derivati dall'eparina 6 subunità polimeriche in lunghezza (ovvero grado di polimerizzazione 6 o dp6) per la banda più piccola, dp20 per la banda più grande e dp10 per la banda centrale. Tuttavia, se lo si desidera, è possibile utilizzare altre combinazioni. Concentrazione desiderata: 0,05 mg/mL |
| dp10 | 0,1mg | ||
| dp20 | 0,1mg | ||
| Acqua deionizzata | 3mL | Sciogliere ogni oligosaccaride in tubi separati con 1mL ciascuno | |
| Buffer di caricamento del campione | 3mL | Aggiungere 1mL (miscela 1:1) a ciascuna soluzione di oligosaccaridi | |
Tabella 1: Soluzioni necessarie per l'elettroforesi su gel di poliacrilammide di glicosaminoglicani purificati. Tutte le soluzioni devono essere filtrate (0,22 μm) prima dell'uso.
| NOTA: tutte le soluzioni devono essere filtrate (0,22 μm) prima dell'uso. | |||
| Soluzione | Ricetta | Composizione | Commenti |
| Soluzione di colorazione blu alciana (500mL) | Alcian blu 8GX polvere | 2,5 g | Concentrazione desiderata: 0,5% p/v |
| Acido acetico glaciale 2% v/v | 500mL | ||
| Macchia argento (200 mL) | Acqua deionizzata | 192,7 ml | Preparare la soluzione di macchia fresca; utilizzare entro una settimana. |
| 7.6M idrossido di sodio | 2 ml | Per fare, aggiungere 3,04 g di pellet di idrossido di sodio a 10 ml di acqua | |
| Idrossido di ammonio | 3,3 ml | ||
| Soluzione di nitrato d'argento 4M | 2 ml | Per fare, aggiungere 3.397 g di nitrato d'argento a 5 ml di acqua. Aggiungere goccia mentre si mescola per evitare precipitazioni. | |
| Soluzione di sviluppo (501 mL) | Acqua deionizzata | 500 ml | La soluzione di sviluppo deve essere resa fresca e utilizzata entro 24 ore. |
| 2,5% p/v di acido citrico | 1 ml | Per fare, aggiungere 100mg a 4 ml di acqua deionizzata. L'acido citrico deve essere reso fresco. | |
| Formaldeide | 250μL | ||
| Soluzione di arresto (500 mL) | Acqua deionizzata | 300 ml | |
| Acido acetico glaciale | 20 ml | ||
| Metanolo | 90 ml | ||
Tabella 2: Soluzioni necessarie per la colorazione dell'argento di glicosaminoglicani separati mediante elettroforesi su gel di poliacrlamide. Tutte le soluzioni devono essere filtrate (0,22 μm) prima dell'uso.
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Discussion
I GAG svolgono un ruolo centrale in molti processi biologici diversi. Una delle funzioni principali dei GAG solfati (come HS e CS) è quella di interagire e legarsi ai ligandi, che possono alterare le funzioni di segnalazione a valle. Un importante determinante dell'affinità di legame GAG ai ligandi affini è la lunghezza della catena polimerica GAG 8,9,14. Per questo motivo, è importante che i ricercatori siano in grado di definire con ragionevole precisione le dimensioni delle catene GAG isolate da campioni biologici di interesse. Per essere pratici, questa tecnica dovrebbe poter essere eseguita utilizzando apparecchiature e reagenti di laboratorio comuni.
Questo protocollo descrive un metodo per isolare e purificare i GAG dai campioni biologici, per separarli per dimensione tramite PAGE e per visualizzarli utilizzando la tecnica di colorazione blu e argento di Alcian. Mentre ci sono diversi modi per separare i glicosaminoglicani per dimensione, il nostro approccio ha diversi punti di forza specifici per l'applicazione di questa tecnica nei laboratori di scienze della vita. In primo luogo, con un limite di rilevazione di 0,5 μg, questa tecnica è altamente sensibile nel rilevamento di GAG di interesse. Nella nostra esperienza, anche i campioni che contengono concentrazioni relativamente basse di GAG (cioè campioni di fluido BAL) dovrebbero produrre GAG più che sufficienti per il rilevamento utilizzando questo metodo. Mentre la resa derivante dall'isolamento e dalla purificazione del fluido BAL varierà in base alla tecnica e al GAG specifico di interesse, è stata la nostra esperienza che 10 ml di fluido BAL grezzo producono HS sufficiente per essere rilevabili utilizzando questa tecnica. La resa degli organi solidi è sostanzialmente più alta, a seconda del tessuto prelevato, ma è nostra esperienza che un campione solido iniziale di 10 mg produrrà un ampio HS per il rilevamento utilizzando questa tecnica.
È importante notare che l'imaging finale del gel PAGE colorato varierà in base alle tecnologie di imaging disponibili per l'utente finale. Le fotografie digitali del gel possono essere scattate utilizzando una serie di sistemi diversi, tra cui numerosi sistemi di documentazione del gel disponibili in commercio o una normale fotocamera commerciale, a seconda dell'attrezzatura disponibile e della sensibilità di rilevamento richiesta (in genere dettata dalla quantità di campione caricato sul gel). Va anche notato che la sorgente luminosa necessaria per l'immagine digitale di questo gel può variare a seconda della densità del campione e della quantità di tempo di sviluppo richiesto durante il processo di colorazione. I gel che si sviluppano rapidamente e producono bande macchiate d'argento facilmente visibili ad occhio nudo richiederanno la transilluminazione UV per le migliori immagini, poiché la maggior parte della luce sarà assorbita dal blu Alcian non reazionato. I gel che richiedono tempi di sviluppo più lunghi (come quelli con quantità molto piccole di campione) richiederanno un'epi-illuminazione o una transilluminazione con la normale luce a spettro completo, poiché questa sarà meglio assorbita dalla macchia d'argento.
Un ulteriore punto di forza di questa tecnica è che è particolarmente adattabile ai laboratori di scienze della vita, grazie alla sua base nella semplice tecnologia PAGE, utilizzando apparecchiature e reagenti comunemente disponibili e acquistati a basso costo. Mentre ci sono altri approcci per quantificare la lunghezza dei polimeri GAG isolati (ad esempio, elettroforesi capillare), in genere richiedono sia conoscenze che attrezzature che non sono comunemente disponibili nella maggior parte dei laboratori di scienze della vita15,16. La semplicità di questo approccio e la natura relativamente economica e disponibile dei reagenti richiesti rende questa tecnica facilmente adattabile dai ricercatori delle scienze della vita interessati a studiare la biologia GAG nel contesto dei loro sottocampi dati. Inoltre, questa tecnica funge da complemento essenziale alle tecniche basate sulla spettrometria di massa per rilevare i GAG nei tessuti biologici. Mentre gli approcci basati sulla spettrometria di massa sono in grado di rilevare GAG con elevata sensibilità e di discernere sottili differenze nella struttura da campioni complessi17, a causa della natura della tecnologia non è in grado di distinguere tra polimeri GAG per dimensione. Per questo motivo, un approccio basato su PAGE è essenziale per divinare le dimensioni dei polimeri HS nei campioni biologici di interesse.
È importante notare che esistono diverse limitazioni alle tecniche descritte in questo documento. Il primo e più saliente è che a causa dell'interazione carica-carica che è centrale per la reazione di colorazione blu alciana, questo approccio è altamente selettivo per i GAG altamente solfati e macchierà solo debolmente parti più cariche neutre (ad esempio, acido ialuronico18). Pertanto, è probabile che questa tecnica incida sui suoi risultati verso gag più acide. Per questo motivo, approcci complementari per misurare il contenuto di GAG in campioni biologici di interesse (ad esempio, tecniche basate sulla spettrometria di massa) dovrebbero essere utilizzati in aggiunta per fornire un quadro più completo dei GAG presenti nei campioni sperimentali. Inoltre, per gli utenti finali specificamente interessati a misurare le dimensioni dello ialuvano, altri hanno descritto tecniche simili basate su PAGE che sfruttano la proteina legante l'acido ialuronico biotinilato (HABP) che può essere adattabile alla tecnica di base descritta qui19.
In sintesi, la tecnica presentata in questo articolo può essere utilizzata per isolare, purificare e rilevare GAG da campioni biologici con una grande sensibilità e specificità, nonché per misurare la lunghezza nativa di queste catene di polisaccaridi. Queste informazioni possono essere fondamentali per testare ipotesi sulle interazioni GAG-ligando a causa dell'importanza della lunghezza del polimero GAG nel determinare l'affinità di legame del ligando affine. Questo approccio presenta diversi vantaggi, in particolare la sua relativa semplicità e adattabilità ai laboratori di ricerca delle scienze della vita, sebbene sia limitato dalla sua relativa propensione verso le dimensioni GAG caricate negativamente. Nonostante questo inconveniente, questa tecnica rappresenta uno strumento robusto che incoraggerebbe i ricercatori a studiare il ruolo dei GAG nell'omeostasi degli organi e nelle malattie.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL ed EPS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
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