Summary
Ce rapport décrit des techniques pour isoler et purifier les glycosaminoglycanes sulfatés (GAN) à partir d’échantillons biologiques et une approche d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide pour approximer leur taille. Les GG contribuent à la structure des tissus et influencent les processus de signalisation via l’interaction électrostatique avec les protéines. La longueur du polymère GAG contribue à leur affinité de liaison pour les ligands apparentés.
Abstract
Les glycosaminoglycanes sulfatés (GAG) tels que le sulfate d’héparane (HS) et le sulfate de chondroïtine (CS) sont omniprésents dans les organismes vivants et jouent un rôle essentiel dans une variété de structures et de processus biologiques de base. En tant que polymères, les GAG existent sous la forme d’un mélange polydispersé contenant des chaînes de polysaccharides pouvant aller de 4000 Da à plus de 40 000 Da. Au sein de ces chaînes existent des domaines de sulfatation, conférant un modèle de charge négative qui facilite l’interaction avec les résidus chargés positivement de ligands protéiques apparentés. Les domaines sulfatés des GAG doivent être d’une longueur suffisante pour permettre ces interactions électrostatiques. Pour comprendre la fonction des GG dans les tissus biologiques, l’investigateur doit être en mesure d’isoler, de purifier et de mesurer la taille des GG. Ce rapport décrit une technique pratique et polyvalente basée sur l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide qui peut être exploitée pour résoudre des différences de taille relativement faibles entre les GAN isolés à partir d’une variété de types de tissus biologiques.
Introduction
Les glycosaminoglycanes (GAG) sont une famille diversifiée de polysaccharides linéaires qui sont un élément omniprésent dans les organismes vivants et contribuent à de nombreux processus physiologiques de base1. Les GIG tels que le sulfate d’héparane (HS) et le sulfate de chondroïtine (CS) peuvent être sulfatés à des positions distinctes le long de la chaîne polysaccharidique, conférant des domaines géographiques de charge négative. Ces GAG, lorsqu’ils sont attachés à des protéines de surface cellulaire connues sous le nom de protéoglycanes, se projettent dans l’espace extracellulaire et se lient à des ligands apparentés, permettant la régulation des processus de signalisation cis- (ligand attaché à la même cellule) et trans- (ligand attaché à la cellule voisine)2. En outre, les GGA jouent également un rôle essentiel en tant qu’éléments structurels dans des tissus tels que la membrane basale glomérulaire3,le glycocalyx endothélial vasculaire4 et le glycocalyx épithélial pulmonaire5,et dans les tissus conjonctifs tels que le cartilage6.
La longueur des chaînes polysaccharidiques GAG varie considérablement en fonction de son contexte biologique et peut être allongée dynamiquement, clivée et modifiée par un système de régulation enzymatique très complexe7. Il est important de savoir que la longueur des chaînes polymères GAG contribue de manière substantielle à leur affinité de liaison pour les ligands et, par la suite, à leur fonction biologique8,9. Pour cette raison, la détermination de la fonction d’un GAG endogène nécessite une appréciation de sa taille. Malheureusement, contrairement aux protéines et aux acides nucléiques, il existe très peu de techniques facilement disponibles pour détecter et mesurer les GAG, ce qui a historiquement donné lieu à des recherches relativement limitées sur les rôles biologiques de cette famille diversifiée de polysaccharides.
Cet article décrit comment isoler et purifier les GG de la plupart des tissus biologiques et, également, décrit comment utiliser l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) pour évaluer la longueur des polymères isolés avec un certain degré de spécificité. Contrairement à d’autres approches glycomiques très complexes (et souvent basées sur la spectrométrie de masse), cette méthode peut être utilisée à l’aide d’équipements et de techniques de laboratoire standard. Cette approche pratique peut donc élargir la capacité des chercheurs à déterminer le rôle biologique des GG natifs et leur interaction avec des ligands contextuellement importants.
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Protocol
Tous les échantillons biologiques analysés dans le cadre de ce protocole ont été obtenus sur des souris, selon des protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Colorado.
1. Isolement du sulfate d’héparane
- Délipidation d’échantillons de tissus
REMARQUE: La délipidation est une étape facultative pour les tissus riches en graisse.- Faire un mélange 1:1 de méthanol et de dichlorométhane. Préparer environ 500 μL par échantillon; de plus gros morceaux de tissu peuvent nécessiter jusqu’à 1 mL.
- Placez chaque échantillon de tissu dans un petit récipient en verre avec un couvercle pour la délipidation.
REMARQUE : La masse de l’échantillon peut varier selon les tissus d’intérêt et les besoins expérimentaux. 50 mg ou moins sont généralement suffisants pour un rendement GAG adéquat, mais une certaine optimisation peut être requise par l’utilisateur final. - Ajouter 500 μL de la solution méthanol:dichlorométhane dans chaque récipient en verre et mélanger. Assurez-vous que tous les échantillons de tissus solides sont complètement immergés dans le solvant.
REMARQUE: Utilisez des pipettes sérologiques ou des tubes coniques en plastique pour mélanger et manipuler la solution de méthanol / dichlorométhane; d’autres plastiques peuvent se dissoudre. - Placer les échantillons sur un agitateur (dans une grille sécurisée) dans une hotte à fumée chimique et agiter doucement pendant 1 h.
- Agiter les échantillons pour les mélanger et centrifuger à 17 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Pipettez soigneusement la fraction de solvant organique (surnageant). C’est la fraction lipidique - elle ne contient pas de GAG et peut être jetée.
REMARQUE: Essayez de ne pas déranger le tissu car de petits morceaux pourraient être perdus. Il est préférable de laisser une partie de la couche organique dans le récipient de l’échantillon, plutôt que de risquer la perte de l’échantillon. - Laissez le couvercle du récipient en verre ouvert et laissez-le s’évaporer pendant la nuit dans la hotte. Changez le tube pour l’étape suivante car ces tubes ne survivront pas à un traitement ultérieur.
- Une fois que le mélange de solvants s’est complètement évaporé, procéder à la désintégration mécanique (si l’échantillon résiduel est >50 mg) ou à la digestion de l’actinase E (< 50 mg).
- Désintégration mécanique des tissus solides (facultatif; pour les échantillons de tissus plus grands)
REMARQUE: La plupart des petits morceaux de tissu solide (environ 50 mg ou moins) devraient se dissoudre complètement pendant l’étape de digestion. Cependant, les échantillons plus grands nécessiteront une désintégration mécanique.- Congeler les échantillons d’intérêt en les plaçant dans un tube en polypropylène de taille appropriée et en plaçant le tube fermé dans de l’azote liquide. Laissez l’échantillon geler jusqu’à ce qu’il soit complètement solide.
- À l’aide d’un mortier et d’un pilon propres, broyer les échantillons congelés en une consistance semblable à de la poudre.
- Passez directement à la digestion de l’Actinase E (étape 1.4).
- Dessalage et concentration des échantillons
REMARQUE: Il s’agit d’une étape facultative et requise uniquement pour les échantillons de tissu liquide dilué (par exemple, le liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF) ou le plasma).- Regrouper les échantillons liquides en groupes expérimentaux appropriés (p. ex., par réplique biologique ou groupe expérimental)
- Placer le volume total de l’échantillon dans une colonne filtrante centrifuge de 500 μL avec un seuil de poids moléculaire (MWCO) de 3 000 Da.
- Tourner pendant 30 min à 14 000 x g à température ambiante. Répétez l’opération au besoin si le volume d’échantillon souhaité dépasse la capacité de la colonne de filtre centrifuge.
- Lavez chaque colonne 3x avec 400 μL d’eau déionisée et filtrée. Jetez le flux à travers.
- Inverser le filtre et tourner pendant 1 min à 2 000 x g dans des tubes de collecte frais et correctement étiquetés. Congelez à -80 °C ou passez à l’étape suivante.
- Digestion de l’actinase E
REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour digérer et finalement éliminer les contaminants protéiques de votre échantillon.- Mélanger les échantillons 1:1 avec l’Actinase E recombinante à une concentration souhaitée de 10 mg/mL. Ajouter le volume approprié de concentré tampon de digestion 10x. Concentration finale souhaitée : 0,005 M d’acétate de calcium et 0,01 M d’acétate de sodium, pH 7,5. Par exemple : 190 μL d’échantillon liquide, 190 μL de 20 mg/mL d’actinase E, 20 μL d’acétate de calcium de 0,05 M, 0,1 M d’acétate de sodium.
- Agiter doucement les échantillons pour les mélanger, puis les digérer pendant 48 à 72 h à 55 °C (jusqu’à 7 jours pour les tissus entiers).
- Chauffer à 80 °C pendant 15-20 min pour inactiver l’Actinase E.
- Congeler l’échantillon à -80 °C ou continuer à l’étape 1.5.
- Dessalage et concentration des échantillons
REMARQUE : Si l’échantillon biologique prévoit une faible masse du GAG d’intérêt ou si la conservation de réactifs consommables (c.-à-d. colonnes filtrantes centrifuges) est souhaitable, les échantillons peuvent être regroupés pour produire un seul concentré par groupe expérimental (p. ex., par réplique biologique ou groupe expérimental).- Placer le volume total de l’échantillon dans une colonne filtrante centrifuge de 500 μL avec un MWCO de 3 000 Da.
- Tourner pendant 30 min à 14 000 x g à température ambiante. Répétez l’opération si nécessaire si le volume d’échantillon souhaité dépasse la capacité de la colonne de filtre centrifuge.
- Lavez chaque colonne 3x avec 400 μL d’eau désionisée et filtrée. Jetez le flux à travers.
- Inverser le filtre et filer pendant 1 min à 2 000 x g dans des tubes de collecte frais et correctement étiquetés (généralement inclus avec les colonnes filtrantes centrifuges). Congelez à -80 °C ou passez à l’étape suivante.
- Dessiccation
- Placez les échantillons dissous de l’étape 1.5.5 dans un concentrateur à vide rotatif pendant la nuit ou lyophilisez les échantillons comme indiqué ci-dessous.
- Congeler soigneusement les échantillons pendant la nuit à -80 °C ou en trempant dans de l’azote liquide.
- Percer les couvercles d’échantillon avec une aiguille de 18 G et placer dans la chambre de lyophilisation. Ajoutez des serviettes en papier pour l’emballage au besoin.
- Fixer la chambre du lyophilisateur au lyophilisateur et lyophiliser pendant la nuit (au moins -40 °C, 0,135 Torr)
- Colonne d’échange de cations
- Remise en caisse des échantillons desséchés jusqu’à 400 μL d’urée 8 M, solution CHAPS à 2 % (ou, si l’on remettez en commun les échantillons, remettez en caisse jusqu’à un maximum de (400/n) μL, où n = le nombre d’échantillons dans le pool souhaité. Utilisez le moins possible de la solution détergente.
- Équilibrer la colonne d’échange cationiques (IEX) avec 400 μL d’urée 8 M, solution CHAPS à 2%. Tourner pendant 5 min à 2 000 x g à température ambiante.
- Chargez 400 μL d’échantillons/échantillons groupés dans la colonne IEX. Tourner pendant 5 min à 2 000 x g.
- Laver 3x avec 400 μL d’urée 8 M, solution CHAPS à 2%. Tourner pendant 5 min à 2 000 x g à chaque fois.
- Elute 3x avec 400 μL de 0,2 M NaCl. Tourner pendant 5 min à 2 000 x g chacun. Il s’agit de la fraction de faible affinité - elle peut être conservée à des fins de contrôle de la qualité si vous le souhaitez.
- Elute 3x avec 400 μL de 2,7 M (16%) NaCl. Tourner pendant 5 min à 2 000 x g chacun. Cette fraction contiendra les glycosaminoglycanes isolés d’intérêt - gardez-le tous!
- Pour dessaler chaque fraction éluée, ajouter du méthanol jusqu’à 80 % vol. et incuber à 4 °C pendant la nuit. Faire tourner chaque échantillon pendant 5 min à 2 000 x g. Récupérez le résidu solide car il s’agit de glycosaminoglycane desséché et desserré.
REMARQUE: Vous pouvez également sauter cette étape et passer à l’étape 1.8 pour déstenter l’éluat sans méthanol.
- Dessalage et concentration des échantillons
- Si nécessaire, regrouper les fractions (à partir du point 1.7.6) en groupes expérimentaux appropriés (p. ex., par réplique biologique ou groupe expérimental).
- Placer le volume total de l’échantillon dans une colonne filtrante centrifuge de 500 μL avec un MWCO de 3 000 Da.
- Tourner pendant 30 min à 14 000 x g à température ambiante. Répétez l’opération si nécessaire si le volume d’échantillon souhaité dépasse la capacité de la colonne de filtre centrifuge.
- Lavez chaque colonne 3x avec 400 μL d’eau désionisée et filtrée. Jetez le flux à travers. Passez directement à l’étape 1.9.
- Digestion de la chondroïtine
REMARQUE: Le but de cette étape est de supprimer les GG qui n’intéressent pas l’utilisateur final. Dans ce cas, la chondroïtine est utilisée pour éliminer la chondroïtine. Dans les tissus utilisés pour générer des résultats représentatifs (liquide de lavage broncho-alvéolaire et poumon entier), la digestion du sulfate de chondroïtine laisse le sulfate d’héparane comme principal GAG résiduel. Les utilisateurs finaux peuvent avoir besoin d’ajouter des étapes de digestion supplémentaires en fonction de leurs objectifs expérimentaux.- Chargez 350 μL de tampon de digestion (acétate d’ammonium de 50 mM avec 2 mM de chlorure de calcium ajusté à un pH de 7,0) dans la colonne filtrante centrifuge sans toucher la membrane.
- Ajouter 5 μL de chondroïinase ABC recombinante.
- Placer le tube d’échantillonnage dans un four à 37 °C et incuber pendant 1 h.
- Retournez la colonne et placez-la dans des tubes de collecte étiquetés de manière appropriée. Tourner pendant 1 min à 2000 x g.
- Chauffer les échantillons à 80 °C pendant 15-20 min pour inactiver la chondroïtinase ABC.
- Dessalage et concentration des échantillons
- Si nécessaire, regrouper les échantillons de chondroïtine de l’étape 1.9.5 en groupes expérimentaux appropriés (p. ex., par réplique biologique ou groupe expérimental).
- Placer le volume total de l’échantillon dans une colonne filtrante centrifuge de 500 μL avec un MWCO de 3 000 Da.
- Tourner pendant 30 min à 14 000 x g à température ambiante. Répétez l’opération au besoin si le volume d’échantillon souhaité dépasse la capacité de la colonne de filtre centrifuge.
- Lavez chaque colonne 3x avec 400 μL d’eau désionisée et filtrée. Jetez le flux à travers.
- Inverser le filtre et tourner pendant 1 min à 2 000 x g dans des tubes de collecte frais et correctement étiquetés. Congelez à -80 °C ou passez à l’étape suivante.
- Dessiccation
REMARQUE: Dans cette étape, la dessiccation est nécessaire afin que les échantillons puissent être remises en caisse dans la plus petite quantité possible d’eau et de tampon courant.- Placez les échantillons digérés de chondroïtine de l’étape 1.10.5 directement dans un concentrateur à vide rotatif pendant la nuit ou lyophilisez comme suit:
- Congeler soigneusement les échantillons pendant la nuit à -80 °C ou en trempant dans de l’azote liquide.
- Percer les couvercles d’échantillon avec une aiguille de 18 G et placer dans la chambre de lyophilisation. Ajoutez des serviettes en papier pour l’emballage au besoin.
- Fixer la chambre du lyophilisateur au lyophilisateur et lyophilisation pendant la nuit (au moins 40 °C, 0,135 Torr)
2. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide de glycosaminoglycanes isolés et purifiés
- Préparer à l’avance les solutions nécessaires à l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) (Tableau 1).
REMARQUE: Sélectionnez le pourcentage d’acrylamide de la solution de gel résolvant en fonction de la taille des glycosaminoglycanes attendus dans l’échantillon. 15% est recommandé pour résoudre des fragments plus gros (plus de 30 sous-unités de disaccharides de longueur); 22 % pour les fragments plus petits (<20 sous-unités de disaccharides de longueur). - Placez la cassette vide dans le réservoir PAGE. Couler le gel résolvant comme suit : Dans un tube de 15 mL, mélanger 10 mL de solution de gel résolvant, 60 μL de persulfate d’ammonium à 10 % (doit être fraîchement préparé) et 10 μL de TEMED (ajouter TEMED en dernier). Inverser doucement le tube 2-3x. Utilisez une pipette pour ajouter rapidement la solution supérieure à 10 mL à la cassette. Superposer avec 2 mL d’eau déionisée et filtrée et laisser le gel de résolution polymériser pendant 30 min.
REMARQUE: Le protocole PAGE suivant a été optimisé pour un système PAGE vertical utilisant des cassettes de coulée de 13,3 x 8,7 cm (largeur x longueur) de 1,0 mm d’épaisseur avec un volume total d’environ 12 mL. D’autres systèmes de cassettes peuvent être utilisés, mais peuvent nécessiter une optimisation par l’utilisateur final. - Une fois que le gel de résolution a complètement polymérisé, jeter l’eau superposée et couler le gel empilable comme suit: dans un tube de 15 mL, mélanger 3 mL de la solution de gel empilable, 90 μL de persulfate d’ammonium à 10% (doit être fraîchement préparé), 3 μL de TEMED (ajouter TEMED en dernier).
- Inverser doucement le tube 2-3x. Utilisez une pipette pour ajouter rapidement la solution de gel empilable sur le gel de résolution solidifié; remplir la cassette à ras bord. Insérez entièrement le peigne inclus avec la configuration. Laisser le gel empilable polymériser pendant 30 min.
- Une fois le gel polymérisé, assurez-vous que la bande de bande est retirée du fond de la cassette et replacez la cassette dans l’ensemble du réservoir PAGE.
- Remplissez les chambres supérieure et inférieure avec un tampon de chambre supérieure et inférieure, respectivement.
- Dissoudre les échantillons séchés de l’étape 1.11.4 dans le volume minimum nécessaire d’eau désionisée et filtrée (au maximum, 50% du volume des puits dans le gel PAGE). Mélanger 1:1 avec le tampon de chargement de l’échantillon. Charger les échantillons et les « échelles » d’oligosaccharides HS (voir tableau 1)dans le gel.
- Pré-exécuter le gel pendant 5 min à 100 V. Ensuite, faites fonctionner le gel à 200 V pendant 20-25 min (pour un gel résolvant de polyacrylamide à 15%), 40-50 min (pour un gel de résolution de polyacrylamide à 18%), 90-100 min (pour un gel de résolution de polyacrylamide à 22%).
REMARQUE: Une certaine optimisation de la durée d’exécution de 200 V peut être nécessaire. Le rouge de phénol migre devant les oligosaccharides d’héparine qui sont 2 sous-unités polymères de longueur (c.-à-d. degré de polymérisation 2, ou dp2); le bleu de bromophénol migre avant dp10-dp14. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque la tension est appliquée de telle sorte que la bande rouge phénol migre presque, mais pas tout à fait, vers le fond du gel. Ajustez le temps d’exécution en conséquence.
3. Protocole de coloration à l’argent
- Préparer à l’avance toutes les solutions nécessaires à la coloration à l’argent (Tableau 2).
REMARQUE: Ne touchez pas directement le gel PAGE tant qu’il n’a pas été taché, développé et placé dans une solution d’arrêt. Au lieu de cela, manipulez le gel à l’aide d’outils en plastique ou en verre propres. La manipulation directe du gel entraînera des distorsions d’empreinte digitale et d’autres artefacts visibles sur le gel après la coloration. - Une fois la course terminée, démontez la cassette et extrayez le gel dans un récipient propre de taille moyenne à grande rempli d’eau déionisée et filtrée.
REMARQUE: Pour éviter de manipuler directement le gel, utilisez la pointe de la pipette ou un autre objet en plastique pour décoller doucement le gel de la cassette lorsqu’il est immergé dans l’eau. Le gel peut être fragile - manipulez-le avec précaution.- Jetez l’eau. Tacher le gel dans une solution de coloration bleu Alcian pendant 5 min.
- Jetez la tache bleue d’Alcian. Rincez / lavez rapidement 2-3x avec de l’eau filtrée désionisée jusqu’à ce que la majeure partie de la solution de coloration bleu Alcian ait été enlevée.
- Laisser dé-tacher dans de l’eau déionisée et filtrée pendant la nuit sur la bascule. Assurez-vous qu’il y a un volume suffisant d’eau déionisée et filtrée pour vous assurer que toute tache résiduelle est complètement lavée du gel pendant la nuit.
- Gel de lavage dans du méthanol à 50% (40 min au total, changer de solution 2-3x).
- Gel de lavage à l’eau désionisée et filtrée pendant 30 min. Jetez l’eau et répétez 3 fois de plus pendant un total de 2 h, en remplaçant l’eau à chaque fois.
- Dans un récipient frais et propre, tacher le gel pendant 30 min dans une solution de coloration au nitrate d’argent.
- Rincez / lavez rapidement 2-3x dans de l’eau filtrée désionisée pour éliminer complètement la solution de coloration à l’argent.
- Laver pendant 30 min à l’eau déionisée et filtrée. Jetez l’eau et répétez 2x pendant un total de 90 min, en remplaçant le bain-marie à chaque fois.
- Jetez l’eau et ajoutez une solution de développement.
- Une fois la solution en développement ajoutée, observez attentivement le gel et surveillez l’apparition des bandes. Selon la qualité de la tache et la masse de l’échantillon chargé, le développement peut prendre de quelques secondes à plusieurs minutes.
- Dès que les bandes souhaitées sont visibles, jetez immédiatement la solution en développement et lavez-la brièvement avec la solution d’arrêt.
- Jetez le lavage de la solution d’arrêt et remplacez-le par une solution d’arrêt fraîche. Laisser tremper pendant 1 h sur une bascule ou un shaker.
- Laver à l’eau désionisée et filtrée pendant la nuit (cependant, le gel peut être imagé immédiatement après l’arrêt du lavage de la solution).
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Representative Results
Le bleu Alcian est utilisé pour colorer les GAG sulfatés 10; ce signal est amplifié par l’utilisation d’une tache d’argent ultérieure 11. La figure 1 présente une démonstration visuelle du processus de développement de la coloration à l’argent. Comme démontré, le signal bleu Alcian représentant les GAN séparés par électrophorèse est amplifié lorsque l’agent en développement pénètre dans le gel de polyacrylamide. En règle générale, le processus de développement réduira les GAG colorés en argent et en bleu Alcian en fonction de la densité, les bords de chaque bande se réduisant en premier tandis que les régions de coloration plus denses au centre se tacheront en dernier.
Dans la littérature, la limite rapportée de détection des GAG à l’aide d’approches basées sur PAGE varie de 0,5 à 1 μg12,13. Pour déterminer la limite de détection à l’aide de notre approche, des oligosaccharides de sulfate d’héparane de différentes longueurs de polymère (héparine non fractionnée, dp20, dp10, dp6) ont été chargés sur un gel de polyacrylamide à 22%, puis exécutés et colorés comme décrit ci-dessus. Chaque oligosaccharide a été chargé deux fois à deux masses différentes : 1,0 μg et 0,5 μg. La figure 2 démontre que notre technique permet de détecter assez facilement 0,5 μg de GAG purifié. Notamment, l’héparine non fractionnée a été la moins facilement détectée des quatre oligosaccharides différents testés, probablement en raison d’une distribution plus large des tailles de polymères qui réduit en conséquence la densité de chaque bande individuelle.
Pour évaluer l’efficacité de la purification du GAG à partir d’échantillons biologiques liquides, des GAG ont été isolés à partir de deux échantillons de lavage broncho-alvéolaire (BAL). Comme le montre la figure 3,le premier échantillon marqué comme A utilisé pour l’isolement GAG était de 1 mL de liquide BAL prélevé sur une souris 24 h après le lipopolysaccharide intratrachéal (LPS) (3 mg/kg), administré pour induire une perte de SH épithéliale alvéolaire 5. 10 μg de dp6 disponible dans le commerce ont été ajoutés directement à ce fluide BAL pour servir de contrôle de « pointe » afin d’évaluer la perte de GAG pendant le processus d’isolement. Le deuxième échantillon marqué comme B consistait en 10 mL de liquide BAL regroupés à partir de 3 souris ayant reçu du LPS intratrachéal (3 mg/kg) 24 h auparavant, sans pic de GAG exogène. Les deux échantillons ont été traités simultanément pour l’isolement GAG, et les 3 fractions éluées de la colonne d’échange d’ions ont été conservées et traitées ultérieurement afin de déterminer si des GAG étaient présents dans les fractions de faible affinité et de lavage. 2 μg d’oligosaccharides d’héparane sulfate de dp20, dp10 et dp6 achetés dans le commerce ont été exécutés dans le gel PAGE à côté de ces échantillons pour fournir une référence permettant d’évaluer qualitativement la taille des GAG HS dans chaque fraction éluée, ainsi qu’une référence pour comparer la densité avec le contrôle de 10 μg de « pic in » qui a subi un isolement GAG.
Pour démontrer l’utilisation de cette technique sur des tissus solides, le sulfate d’héparane a été isolé à partir d’un morceau de poumon de souris congelé de 15 mg comme décrit ci-dessus. Au cours du processus d’isolement et de purification, la fraction de faible affinité (0,2 M NaCl) éluée de la colonne d’échange d’ions a été conservée et traitée avec la fraction à haute affinité (2,7 M NaCl) et exécutée sur le gel(Figure 4). 2 μg d’oligosaccharides d’héparane sulfate dp20, dp10 et dp6 achetés dans le commerce ont été exécutés à côté de ces échantillons pour fournir une référence pour la taille. Comme on peut le voir, l’homogénat pulmonaire entier a produit une grande quantité de SH isolé, les plus petits fragments étant approximativement égaux à dp10. L’enrichissement relatif des GAG à teneur avide de taches bleu/argent Alcian dans la fraction NaCl de 2,7 M démontre que le sulfate d’héparane se lie avec une grande affinité aux colonnes d’échange d’ions et peut être élué de la colonne avec une grande spécificité. L’homogénat pulmonaire entier a produit une grande quantité de sulfate d’héparane isolé (fraction NaCl de 2,7 M), les plus petits fragments étant approximativement égaux à dp10.
Figure 1: Processus de développement des taches d’argent. La coloration en bleu alcien de l’héparine non fractionnée (UFH) ou des oligosaccharides de taille définie (dp = degré de polymérisation) séparés par électrophorèse est amplifiée par coloration à l’argent. De gauche à droite : UFH, dp20, dp10, dp6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Sensibilité du gel de polyacrylamide et de la tache d’argent pour la détection du sulfate d’héparane. Les oligosaccharides de sulfate d’héparane de différentes longueurs (héparine non fractionné aka UFH, dp20, dp10, dp6) étaient sur un gel de polyacrylamide à 22% et ran et colorés à l’argent. Chaque oligosaccharide a été chargé deux fois à deux masses différentes : 1,0 μg (bandes les plus à gauche) et 0,5 μg (bandes les plus à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Efficacité de la purification du GAG à partir d’échantillons biologiques liquides. Les GRAG isolés à partir de deux échantillons de lavage broncho-alvéolaire (BAL), étiquetés ici comme « A » et « B », ont été exécutés sur un gel de polyacrylamide à 22% et de l’argent coloré. L’échantillon A consistait en 1 mL de liquide BAL prélevé sur une souris 24 heures après le traitement avec 3 mg/kg de lipopolysaccharide intratrachéal (LPS). 10 μg supplémentaires de dp6 HS ont été ajoutés à cet échantillon en tant que témoin de « pic ». L’échantillon B consistait en 10 mL de liquide BAL regroupé prélevé sur 3 souris 24 h après l’administration de LPS. Chaque échantillon a été traité avec des fractions de la colonne d’échange d’ions éluées avec soit un diluant (« lavage »), soit de faibles concentrations de NaCl (0,2 M). 2 μg d’oligosaccharides dp20, dp10 et dp6 de sulfate d’héparane achetés dans le commerce ont été utilisés comme références de taille (bandes les plus à gauche). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Mesure de la taille des sulfates d’héparane isolés et purifiés à partir d’un poumon de souris sain. Teneur en sulfate d’héparine isolée et purifiée à partir d’un échantillon congelé de 15 mg d’un poumon isolé d’une souris en bonne santé et exécuté sur un gel de polyacrylamide à 22%. Le sulfate d’héparane a été élué de la colonne d’échange d’ions avec de faibles concentrations (0,2 M; fraction de faible affinité) ou des concentrations élevées (2,7 M, solution à 16%; fraction de haute affinité) de NaCl. 2 μg d’oligosaccharides dp20, dp10 et dp6 de sulfate d’héparane achetés dans le commerce ont été utilisés comme références de taille (bandes les plus à gauche). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| REMARQUE: Toutes les solutions doivent être filtrées (0,22 μm) avant utilisation. | |||
| Solution | Recette | Composition | Commentaires |
| Gel de résolution/tampon de fonctionnement de la chambre inférieure (2 L ou 4 L) | Acide borique, MW 61,83 | 2L : 12,36 g ; 4L : 24,76 g | Concentration souhaitée : 0,1 M |
| Base Tris, MW 124,14 | 2L: 24,2 g; 4L : | Concentration souhaitée : 0,1 M | |
| EDTA disodique MW 336,21 ou dihydraté, MW 372,36 | 2L: 6,7 g ou 7,4 g, respectivement; 4L 13,4 g ou 14,8 g, respectivement | Concentration souhaitée : 0,01 M | |
| Désionisée | 2L ou 4L | Ajuster le pH à 8,3 après dissolution complète des réactifs | |
| Tampon de fonctionnement de la chambre supérieure (1 L) | Glycine | 93 g | Concentration souhaitée : 1 M |
| Base Tris, MW 124,14 | 24,2 g | Concentration souhaitée : 0,2 M | |
| Désionisée | 1 L | ||
| Gel résolvant, 22% d’acrylamide total (500mL) | Acrylamide, MW 71,08 | 100,1 g | Concentration souhaitée : 20,02 % p/v |
| N,N'-méthylène-bis-acrylamide (bis, MW 154,17) | 10 g | Concentration souhaitée : 2 % p/v | |
| Saccharose | 75 g | Concentration souhaitée : 15 % p/v | |
| Tampon de gel de résolution | 500 mL | Porter à un volume total de 500mL; nécessitera moins de 500 mL de tampon total | |
| Gel résolvant, 15% d’acrylamide total (400mL) | Acrylamide, MW 71,08 | 56,3 g | Concentration souhaitée : 14,08 % p/v |
| N,N'-méthylène-bis-acrylamide (bis, MW 154,17) | 3,7 g | Concentration souhaitée : 2 % p/v | |
| Saccharose | 20,8 g | Concentration souhaitée : 15 % p/v | |
| Tampon de gel de résolution | 400 mL | Porter à un volume total de 400mL; nécessitera moins de 400 mL de tampon total | |
| Gel empilable (100 mL) | Acrylamide, MW 71,08 | 4,75 g | Concentration souhaitée : 4,75 % p/v |
| N,N'-méthylène-bis-acrylamide (bis, MW 154,17) | 0,25 g | Concentration souhaitée : 0,25 % p/v | |
| Tampon de gel de résolution | 100 mL | Ajouter un tampon de 80 mL et dissoudre complètement les réactifs. Ajustez ensuite le pH à 76,3 avec de l’acide chlorhydrique, goutte à goutte. Porter ensuite à un volume total de 100 mL avec un tampon de gel résolvant. | |
| Tampon de chargement d’échantillon (500 mL) | Saccharose | 250g | Concentration souhaitée : 50 % p/v |
| Phénol rouge | 500mg | Concentration souhaitée : 1 mg/mL | |
| Bleu de bromophénol | 250 mg | Concentration souhaitée : 0,5 mg/mL | |
| Désionisée | 500 mL | Porter à un volume total de 500mL; nécessitera moins de 500 mL d’eau au total | |
| Oligosacharide dérivé de l’héparine « échelle » (2 mL chacun) | dp6 | 0,1 mg | REMARQUE: Recommander d’utiliser des oligosaccharides dérivés de l’héparine 6 sous-unités de polymère en longueur (alias degré de polymérisation 6, ou dp6) pour la plus petite bande, dp20 pour la plus grande bande et dp10 pour la bande moyenne. Cependant, d’autres combinaisons peuvent être utilisées si vous le souhaitez. Concentration souhaitée : 0,05 mg/mL |
| dp10 | 0,1 mg | ||
| dp20 | 0,1 mg | ||
| Désionisée | 3 mL | Dissoudre chaque oligosaccharide dans des tubes séparés de 1 mL chacun | |
| Exemple de tampon de chargement | 3 mL | Ajouter 1 mL (mélange 1:1) à chaque solution d’oligosaccharide | |
Tableau 1 : Solutions requises pour l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide de glycosaminoglycanes purifiés. Toutes les solutions doivent être filtrées (0,22 μm) avant utilisation.
| REMARQUE: Toutes les solutions doivent être filtrées (0,22 μm) avant utilisation. | |||
| Solution | Recette | Composition | Commentaires |
| Solution de coloration bleu Alcian (500mL) | Alcian bleu 8GX poudre | 2,5 g | Concentration souhaitée : 0,5 % p/v |
| 2% v/v d’acide acétique glacial | 500 mL | ||
| Tache d’argent (200 mL) | Désionisée | 192,7 mL | Préparer la solution de teinture fraîche; utiliser dans un délai d’une semaine. |
| 7,6 M d’hydroxyde de sodium | 2 mL | Pour faire, ajouter 3,04 g de granulés d’hydroxyde de sodium à 10 mL d’eau | |
| Hydroxyde d’ammonium | 3,3 mL | ||
| Solution de nitrate d’argent 4M | 2 mL | Pour faire, ajouter 3,397 g de nitrate d’argent à 5 mL d’eau. Ajouter goutte à goutte en remuant pour éviter les précipitations. | |
| Solution de développement (501 mL) | Désionisée | 500 mL | La solution de développement doit être rendue fraîche et utilisée dans les 24 heures. |
| 2,5 % p/v d’acide citrique | 1 mL | Pour faire, ajoutez 100mg à 4 mL d’eau désionisée. L’acide citrique doit être rendu frais. | |
| Formaldéhyde | 250μL | ||
| Solution d’arrêt (500 mL) | Désionisée | 300 mL | |
| Acide acétique glacial | 20 mL | ||
| Méthanol | 90 mL | ||
Tableau 2 : Solutions nécessaires à la coloration à l’argent des glycosaminoglycanes séparés par électrophorèse sur gel de polyacrlamide. Toutes les solutions doivent être filtrées (0,22 μm) avant utilisation.
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Discussion
Les GG jouent un rôle central dans de nombreux processus biologiques divers. L’une des principales fonctions des GAN sulfatés (tels que HS et CS) est d’interagir avec les ligands et de s’y lier, ce qui peut modifier les fonctions de signalisation en aval. Un déterminant important de l’affinité de liaison GAG aux ligands apparentés est la longueur de la chaîne polymère GAG 8,9,14. Pour cette raison, il est important que les chercheurs soient en mesure de définir avec une précision raisonnable la taille des chaînes GAG isolées à partir d’échantillons biologiques d’intérêt. Pour être pratique, cette technique doit pouvoir être réalisée à l’aide d’équipements de laboratoire et de réactifs courants.
Ce protocole décrit une méthode pour isoler et purifier les GAG des échantillons biologiques, pour les séparer par taille via PAGE, et pour les visualiser en utilisant la technique de coloration bleu et argent Alcian. Bien qu’il existe plusieurs façons de séparer les glycosaminoglycanes par taille, notre approche a plusieurs points forts spécifiques à l’application de cette technique dans les laboratoires de sciences de la vie. Tout d’abord, avec une limite de détection de 0,5 μg, cette technique est très sensible dans la détection des GAG d’intérêt. D’après notre expérience, même les échantillons qui contiennent des concentrations relativement faibles de GAG (c.-à-d. des échantillons de liquide BAL) devraient produire plus que suffisamment de GAG pour la détection à l’aide de cette méthode. Bien que le rendement de l’isolement et de la purification du fluide BAL varie selon la technique et le GAG spécifique d’intérêt, nous avons l’expérience que 10 mL de liquide BAL brut produisent suffisamment de SH pour être détectables à l’aide de cette technique. Le rendement des organes solides est considérablement plus élevé, en fonction du tissu prélevé, mais d’après notre expérience, un échantillon solide initial de 10 mg produira suffisamment d’HS pour la détection à l’aide de cette technique.
Il est important de noter que l’imagerie finale du gel PAGE coloré variera en fonction des technologies d’imagerie disponibles pour l’utilisateur final. Des photographies numériques du gel peuvent être prises à l’aide d’un certain nombre de systèmes différents, y compris de nombreux systèmes de documentation sur le gel disponibles dans le commerce ou un appareil photo commercial ordinaire, en fonction de l’équipement disponible et de la sensibilité de détection requise (généralement dictée par la quantité d’échantillon chargée sur le gel). Il convient également de noter que la source lumineuse nécessaire pour imager numériquement ce gel peut varier en fonction de la densité de l’échantillon et du temps de développement requis pendant le processus de coloration. Les gels qui se développent rapidement et produisent des bandes tachées d’argent facilement visibles à l’œil nu nécessiteront une transillumination UV pour obtenir les meilleures images, car la majorité de la lumière sera absorbée par le bleu Alcian non réagi. Les gels qui nécessitent des temps de développement plus longs (comme ceux avec de très petites quantités d’échantillon) nécessiteront soit un épi-éclairage, soit une transillumination avec une lumière normale à spectre complet, car celle-ci sera mieux absorbée par la tache d’argent.
Une autre force de cette technique est qu’elle est particulièrement adaptable aux laboratoires des sciences de la vie, en raison de sa base dans la technologie PAGE simple, en utilisant des équipements et des réactifs qui sont couramment disponibles et acquis à moindre coût. Bien qu’il existe d’autres approches pour quantifier la longueur des polymères GAG isolés (p. ex., électrophorèse capillaire), elles nécessitent généralement à la fois des connaissances et de l’équipement qui ne sont généralement pas disponibles dans la plupart des laboratoires des sciences de la vie15,16. La simplicité de cette approche et la nature relativement abordable et disponible des réactifs requis rendent cette technique facilement adaptable par les chercheurs en sciences de la vie intéressés à étudier la biologie GAG dans le contexte de leurs sous-domaines donnés. En outre, cette technique sert de complément essentiel aux techniques basées sur la spectrométrie de masse pour détecter les GAG dans les tissus biologiques. Alors que les approches basées sur la spectrométrie de masse sont capables de détecter les GAG avec une sensibilité élevée et de discerner des différences subtiles de structure à partir d’échantillons complexes17, en raison de la nature de la technologie, il n’est pas en mesure de distinguer les polymères GAG par taille. Pour cette raison, une approche basée sur PAGE est essentielle pour deviner la taille des polymères HS dans les échantillons biologiques d’intérêt.
Il est important de noter qu’il existe plusieurs limites aux techniques décrites dans ce document. La première et la plus saillante est qu’en raison de l’interaction charge-charge qui est au cœur de la réaction de coloration du bleu d’Alcian, cette approche est très sélective pour les GAN hautement sulfatés et ne tachera que faiblement les fractions plus neutres (par exemple, l’acide hyaluronique18). Ainsi, cette technique est susceptible de biaiser ses résultats vers des fractions GAG plus acides. Pour cette raison, des approches complémentaires pour mesurer la teneur en GAG dans les échantillons biologiques d’intérêt (p. ex., les techniques basées sur la spectrométrie de masse) devraient être utilisées de manière complémentaire pour fournir une image plus complète des GAG présents dans les échantillons expérimentaux. En outre, pour les utilisateurs finaux spécifiquement intéressés par la mesure de la taille de l’hyaluronane, d’autres ont décrit des techniques similaires basées sur PAGE qui exploitent la protéine de liaison à l’acide hyaluronique biotinylé (HABP) qui peut être adaptable à la technique de base décrite ici19.
En résumé, la technique présentée dans cet article peut être utilisée pour isoler, purifier et détecter les GAG à partir d’échantillons biologiques avec beaucoup de sensibilité et de spécificité ainsi que pour mesurer la longueur native de ces chaînes polysaccharidiques. Cette information peut être essentielle pour tester des hypothèses sur les interactions GAG-ligand en raison de l’importance de la longueur du polymère GAG dans la détermination de l’affinité de liaison au ligand apparenté. Cette approche présente plusieurs avantages, notamment sa relative simplicité et son adaptabilité aux laboratoires de recherche en sciences de la vie, bien qu’elle soit limitée par son biais relatif en faveur des fractions GAG chargées négativement. Malgré cet inconvénient, cette technique représente un outil robuste qui encouragerait les chercheurs à étudier le rôle des GGG dans l’homéostasie des organes et la maladie.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL et EPS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
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