Summary
Bu rapor, sülfatlı glikozaminolikanları (GAG) biyolojik örneklerden izole etme ve arındırma tekniklerini ve yaklaşık boyutlarına yönelik bir poliakrilamid jel elektroforez yaklaşımını açıklar. GAG'ler proteinlerle elektrostatik etkileşim yoluyla doku yapısına ve etki sinyalizasyon süreçlerine katkıda bulunur. GAG polimer uzunluğu, konyak ligandları için bağlayıcı yakınlıklarına katkıda bulunur.
Abstract
Heparan sülfat (HS) ve kondroitin sülfat (CS) gibi sülfatlı glikozaminojenler (GAG' ler) canlı organizmalarda her yerde bulunur ve çeşitli temel biyolojik yapılarda ve süreçlerde kritik bir rol oynar. Polimerler olarak, GAG'ler 4000 Da ile 40.000 Da arasında değişebilen polisakkarit zincirleri içeren bir polidisperz karışımı olarak bulunur. Bu zincirlerde, kognate protein ligandlarının pozitif yüklü kalıntılarıyla etkileşimi kolaylaştıran bir negatif yük deseni veren sülfatlama alanları vardır. GAG'lerin sülfatlı etki alanları, bu elektrostatik etkileşimlere izin vermek için yeterli uzunlukta olmalıdır. GAG'lerin biyolojik dokulardaki işlevini anlamak için, araştırmacı GAG'lerin boyutunu izole edebilmeli, arındırabilmeli ve ölçebilmelidir. Bu rapor, çeşitli biyolojik doku tiplerinden izole edilen GAG'ler arasındaki nispeten küçük boyut farklılıklarını çözmek için yararlanılabilen pratik ve çok yönlü poliakrilamid jel elektroforez bazlı bir tekniği açıklar.
Introduction
Glikozaminogllikanlar (GAG'lar), canlı organizmalarda her yerde bulunan ve birçok temel fizyolojik işleme katkıda bulunan doğrusal polisakkaritlerin çeşitli bir ailesidir1. Heparan sülfat (HS) ve kondroitin sülfat (CS) gibi GAG'ler polisakkarit zinciri boyunca farklı konumlarda sülfatlanabilir ve negatif yük coğrafi etki alanları verebilir. Bu GAG'ler, proteoglikanlar olarak bilinen hücre yüzeyi proteinlerine bağlandığında, hücre dışı alana yansıtır ve konyak ligandlarına bağlanır, hem cis- (aynı hücreye bağlı ligand) hem de trans- (komşu hücreye bağlı ligand) sinyal işlemlerinin düzenlenmesine izin verir2. Ayrıca, GAG'ler ayrıca glomerüler bodrum membranı3, vasküler endotel glikokaleks 4 ve pulmoner epitel glikokaleks5 ve kıkırdak6gibi bağdokularında yapısal elemanlar olarak kritik roller üstlenir.
GAG polisakkarit zincirlerinin uzunluğu biyolojik bağlamlarına göre önemli ölçüde değişir ve son derece karmaşık bir enzymatic düzenleyici sistem tarafından dinamik olarak uzatılabilir, bölünebilir ve değiştirilebilir7. Daha da önemlisi, GAG polimer zincirlerinin uzunluğu, ligandlar için bağlayıcı yakınlıklarına ve daha sonra biyolojik işlevlerine önemli ölçüde katkıda bulunur8,9. Bu nedenle, endojen bir GAG işlevinin belirlenmesi, boyutunun takdirini gerektirir. Ne yazık ki, proteinlerin ve nükleik asitlerin aksine, tarihsel olarak bu çeşitli polisakkarit ailesinin biyolojik rolleri hakkında nispeten sınırlı bir araştırma ile sonuçlanan GAG'leri tespit etmek ve ölçmek için çok az sayıda hazır teknik mevcuttur.
Bu makalede, GAG'lerin çoğu biyolojik dokudan nasıl izole ve saflaştırılacağı ve ayrıca izole polimerlerin uzunluğunu adil bir özgüllük derecesiyle değerlendirmek için poliakrilamid jel elektroforezinin (PAGE) nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Diğer, son derece karmaşık (ve genellikle kütle spektrometrisi bazlı) glikonik yaklaşımların aksine, bu yöntem standart laboratuvar ekipmanları ve teknikleri kullanılarak kullanılabilir. Bu nedenle, bu pratik yaklaşım, araştırmacıların yerel GAG'lerin biyolojik rolünü ve bağlamsal olarak önemli ligandlarla etkileşimlerini belirleme yeteneklerini genişletebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde analiz edilen tüm biyolojik örnekler, Colorado Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokoller kapsamında farelerden elde edildi.
1. Heparan sülfat izolasyonu
- Doku örneklerinin delipidasyonu
NOT: Delipidasyon yağ bakımından zengin dokular için isteğe bağlı bir adımdır.- Metanol ve dikloromethane karışımı 1:1 yapın. Numune başına yaklaşık 500 μL hazırlayın; daha büyük doku parçaları 1 mL'ye kadar sürebilir.
- Her doku örneğini, delipidasyon için kapaklı küçük bir cam kaba yerleştirin.
NOT: Örnek kitle, ilgi çekici doku ve deneysel ihtiyaçlara göre değişebilir. 50 mg veya daha az genellikle yeterli GAG verimi için yeterlidir, ancak son kullanıcı tarafından bazı optimizasyon gerekebilir. - Her cam kaba 500 μL metanol:dikloromethane çözeltisi ekleyin ve karıştırın. Tüm katı doku örneklerinin tamamen çözücüye batırıldığından emin olun.
NOT: Metanol/dikloromethane çözeltisini karıştırmak ve işlemek için serolojik pipetler veya plastik konik tüpler kullanın; diğer plastikler çözünebilir. - Numuneleri kimyasal duman kaputuna bir çalkalayıcıya (güvenli rafa) yerleştirin ve 1 saat boyunca hafifçe çalkalayın.
- Numuneleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 17.000 x g'da karıştırmak ve santrifüj etmek için ajite edin.
- Organik çözücü fraksiyonunu (süpernatant) dikkatlice pipetle atın. Bu lipid fraksiyonudur - GAG içermez ve atılabilir.
NOT: Küçük parçalar kaybolabileceği için dokuyu rahatsız etmemeye çalışın. Numune kaybını riske atmak yerine organik tabakanın bir kısmını numune kabında bırakmak tercih edilir. - Cam kabın kapağını açık bırakın ve kaputta gece boyunca buharlaşmasına izin verin. Bu tüpler daha fazla işleme devam etmeyeceği için bir sonraki adım için tüpü değiştirin.
- Solvent karışımı tamamen buharlaştıktan sonra, mekanik parçalanma (artık numune >50 mg ise) veya Actinase E sindirimine (< 50 mg) devam edin.
- Katı dokunun mekanik parçalanması (isteğe bağlı; daha büyük doku örnekleri için)
NOT: Katı dokunun çoğu küçük parçası (yaklaşık 50 mg veya daha az) sindirim adımı sırasında tamamen çözülmelidir. Bununla birlikte, daha büyük numuneler mekanik parçalanma gerektirecektir.- Uygun büyüklükteki polipropilen tüpe yerleştirerek ve kapalı tüpü sıvı nitrojene yerleştirerek ilgi çekici numuneleri flaş dondurun. Numunenin tamamen katı olana kadar donmasına izin verin.
- Temiz bir harç ve pestle kullanarak donmuş numuneleri toz benzeri bir kıvamda öğütün.
- Doğrudan Actinase E sindirimine geçin (Adım 1.4).
- Numune tuzdan arındırma ve konsantrasyon
NOT: Bu isteğe bağlı bir adımdır ve yalnızca seyreltilmiş sıvı doku örnekleri (örneğin, bronko-alveolar lavaj sıvısı (BALF) veya plazma) için gereklidir.- Sıvı numuneleri uygun deneysel gruplar halinde havuzlayın (örneğin, biyolojik çoğaltma veya deneysel grup tarafından)
- Toplam numune hacmini 3.000 Da moleküler ağırlık kesme (MWCO) ile 500 μL santrifüj filtre sütununa yerleştirin.
- Oda sıcaklığında 14.000 x g'da 30 dakika döndürün. İstenen örnek hacmi santrifüj filtre sütununun kapasitesini aşarsa gerektiği gibi yineleyin.
- Her sütunu 3x 400 μL deiyonize, filtrelenmiş su ile yıkayın. Akışı atın.
- Filtreyi ters çevirin ve taze, uygun şekilde etiketlenmiş toplama tüplerinde 2.000 x g'da 1 dakika döndürün. -80 °C'de dondurun veya bir sonraki adıma geçin.
- Actinase E sindirimi
NOT: Bu adım, numunenizdeki protein kirleticileri sindirmek ve sonuçta çıkarmak için gereklidir.- Örnekleri 1:1 rekombinant Actinase E ile 10 mg/mL'lik istenen konsantrasyonda karıştırın. Uygun hacimde 10x sindirim tampon konsantresi ekleyin. İstenen son konsantrasyon: 0.005 M kalsiyum asetat ve 0.01 M sodyum asetat, pH 7.5. Örneğin: 190 μL sıvı numunesi, 190 μL 20 mg/mL Actinase E, 20 μL 0.05 M kalsiyum asetat, 0.1 M sodyum asetat.
- Örnekleri karıştırmak için hafifçe çalkalayın, ardından 55 ° C'de 48-72 saat boyunca sindirin (tüm doku için 7 güne kadar).
- Actinase E'yi inaktive etmek için 15-20 dakika boyunca 80 °C'ye ısıtın.
- Numuneyi -80 °C'de dondurun veya 1,5 adıma devam edin.
- Numune tuzdan arındırma ve konsantrasyon
NOT: Biyolojik numunede ilgi çekici GAG'ın düşük bir kütlesi bekleniyorsa veya sarf malzemesi reaktiflerinin (yani santrifüj filtre sütunlarının) korunması isteniyorsa, numuneler deneysel grup başına tek bir konsantre üretmek için birleştirilebilir (örneğin, biyolojik çoğaltma veya deneysel grup tarafından).- Toplam numune hacmini 3.000 Da MWCO'lu 500 μL santrifüj filtre sütununa yerleştirin.
- Oda sıcaklığında 14.000 x g'da 30 dakika döndürün. İstenen örnek hacmi santrifüj filtre sütununun kapasitesini aşarsa, gerektiği gibi yineleyin.
- Her sütunu 400 μL deiyonize, filtrelenmiş su ile 3x yıkayın. Akışı atın.
- Filtreyi ters çevirin ve taze, uygun şekilde etiketlenmiş toplama tüplerinde 2.000 x g'da 1 dakika döndürün (genellikle santrifüj filtre sütunlarına dahildir). -80 °C'de dondurun veya bir sonraki adıma geçin.
- Tahliye
- 1.5.5. adımdaki çözünmüş numuneleri bir gecede dönüşümlü vakum konsantratörüne yerleştirin veya numuneleri aşağıda ayrıntılı olarak belirtildiği gibi liyofilize edin.
- Numuneleri -80 °C'de gece boyunca veya sıvı nitrojene batırarak iyice dondurun.
- Numune kapaklarını 18 G iğne ile delin ve liyofilzer odasına yerleştirin. Gerektiğinde paketleme için kağıt havlu ekleyin.
- Lyophilizer odasını liyofilzere sabitle ve bir gecede kuru dondur (en az -40 °C, 0.135 Torr)
- Katyon değişimi sütunu
- 400 μL'ye kadar 8 M üre, %2 CHAPS çözeltisi (veya numuneleri birikiyorsa, en fazla (400/n) μL'ye kadar yeniden depolanmış numuneleri yeniden depolar, burada n = istenen havuzdaki numune sayısı. Deterjan çözeltisini mümkün olduğunca az kullanın.
- Katyon değişimi (IEX) sütununu 400 μL 8 M üre, %2 CHAPS çözeltisi ile dengeler. Oda sıcaklığında 2.000 x g'da 5 dakika döndürün.
- IEX sütununa 400 μL numune/havuza numune yükleyin. 2.000 x g'da 5 dakika döndürün.
- 3x'i 400 μL 8 M üre, %2 CHAPS çözeltisi ile yıkayın. Her zaman 2.000 x g'da 5 dakika döndürün.
- 400 μL 0,2 M NaCl ile Elute 3x. Her biri 2.000 x g'da 5 dakika döndürün. Bu düşük benzeşim fraksiyonudur - istenirse kalite kontrol amacıyla tutulabilir.
- 2,7 M (%16) NaCl'nin 400 μL'si ile 3x elute. Her biri 2.000 x g'da 5 dakika döndürün. Bu fraksiyon, ilgi çekici izole glikozaminoglenkanları içerecektir - hepsini saklayın!
- Her bir eluted fraksiyonunu tuzdan arındırmak için, %80 vol'a kadar metanol ekleyin ve bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın. Her numuneyi 2.000 x g'da 5 dakika döndürün. Bu kurutulmuş tuzsuz glikozaminoglenik olduğu için katı kalıntıyı geri kazan.
NOT: Alternatif olarak, bu adımı atlayın ve metanol olmadan eluate tuzdan arındırmak için 1.8 adımına geçin.
- Numune tuzdan arındırma ve konsantrasyon
- Gerekirse, havuz eluted fraksiyonları (1.7.6 itibaren) uygun deneysel gruplara (örneğin, biyolojik çoğaltma veya deneysel grup tarafından).
- Toplam numune hacmini 3.000 Da MWCO'lu 500 μL santrifüj filtre sütununa yerleştirin.
- Oda sıcaklığında 14.000 x g'da 30 dakika döndürün. İstenen örnek hacmi santrifüj filtre sütununun kapasitesini aşarsa, gerektiği gibi yineleyin.
- Her sütunu 400 μL deiyonize, filtrelenmiş su ile 3x yıkayın. Akışı atın. Doğrudan 1.9 adımına geçin.
- Kondroitin sindirimi
NOT: Bu adımın amacı, son kullanıcının ilgisini çekmeyen GAG'leri kaldırmaktır. Bu durumda, kondroitini çıkarmak için kondroitinaz kullanılır. Temsili Sonuçlar (bronko-alveolar lavaj sıvısı ve tüm akciğer) üretmek için kullanılan dokularda, kondroitin sülfatın sindirilmesi heparan sülfatını birincil artık GAG olarak bırakır. Son kullanıcıların deneysel amaçlarına bağlı olarak ek sindirim adımları eklemeleri gerekebilir.- Membrana dokunmadan santrifüj filtre sütununa 350 μL sindirim tamponu (pH 7.0'a ayarlanmış 2 mM kalsiyum klorürlü 50 mM amonyum asetat) yükleyin.
- 5 μL rekombinant kondroitinaz ABC ekleyin.
- Numune tüpünü 37 °C fırına yerleştirin ve 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Sütunu ters çevirin ve uygun şekilde etiketlenmiş toplama tüplerine yerleştirin. 2000 x g'da 1 dakika döndürün.
- Kondroitinaz ABC'yi inaktive etmek için 15-20 dakika boyunca 80 °C'ye ısı örnekleri.
- Numune tuzdan arındırma ve konsantrasyon
- Gerekirse, havuz kondroitin 1.9.5 adımından uygun deneysel gruplara (örneğin, biyolojik çoğaltma veya deneysel grup tarafından) sindirilmiş örnekler
- Toplam numune hacmini 3.000 Da MWCO'lu 500 μL santrifüj filtre sütununa yerleştirin.
- Oda sıcaklığında 14.000 x g'da 30 dakika döndürün. İstenen numune hacmi santrifüj filtre sütununun kapasitesini aşarsa gerektiği gibi yineleyin.
- Her sütunu 400 μL deiyonize, filtrelenmiş su ile 3x yıkayın. Akışı atın.
- Filtreyi ters çevirin ve taze, uygun şekilde etiketlenmiş toplama tüplerinde 2.000 x g'da 1 dakika döndürün. -80 °C'de dondurun veya bir sonraki adıma geçin.
- Tahliye
NOT: Bu adımda, numunelerin mümkün olan en küçük miktarda su ve çalışan tamponda yeniden kullanılabilmesi için kurutma gereklidir.- 1.10.5 adımındaki kondroitin sindirilmiş örnekleri bir gecede doğrudan rotasyonel vakum konsantratörüne yerleştirin veya aşağıdaki gibi liyofilize edin:
- Numuneleri -80 °C'de gece boyunca veya sıvı nitrojene batırarak iyice dondurun.
- Numune kapaklarını 18 G iğne ile delin ve liyofilzer odasına yerleştirin. Gerektiğinde paketleme için kağıt havlu ekleyin.
- Liyofilizör odasını liyofilzere sabitle ve bir gecede kuru dondur (en az 40 °C, 0.135 Torr)
2. İzole edilmiş ve saflaştırılmış glikozaminolikanların poliakrilamid jel elektroforezi
- Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) için gerekli çözümleri önceden hazırlayın (Tablo 1).
NOT: Numunede olması beklenen glikozaminoglisekanların büyüklüğüne bağlı olarak jel çözeltisini çözmenin yüzde akrilamidini seçin. Daha büyük parçaların çözümü için% 15 önerilir (uzunluğu 30'dan fazla disakkarit alt biri); Daha küçük parçalar için %22 (<20 disakkarit alt birikmiş uzunlukta). - PAGE tankına boş kaset yerleştirin. Çözme jelini aşağıdaki gibi dökun: 15 mL'lik tüpte, 10 mL çözelti çözeltisini, 60 μL% 10 amonyum persülfatı (taze hazırlanmış olmalıdır) ve 10 μL TEMED'i karıştırın (en son TEMED ekleyin). Tüpü hafifçe 2-3x ters çevirin. Yukarıdaki 10 mL'lik çözeltiyi kasete hızlı bir şekilde eklemek için pipet kullanın. 2 mL deiyonize, filtrelenmiş su ile kaplama ve çözme jelinin 30 dakika polimerize olmasını sağlar.
NOT: Aşağıdaki PAGE protokolü, toplam hacmi yaklaşık 12mL olan 13,3 x 8,7 cm (genişlik x uzunluk) 1,0 mm kalınlığında döküm kasetler kullanılarak dikey bir PAGE sistemi için optimize edilmiştir. Diğer kaset sistemleri kullanılabilir, ancak son kullanıcı tarafından optimizasyon gerektirebilir. - Çözme jeli tamamen polimerize olduktan sonra, kaplanmış suyu atın ve istifleme jelini aşağıdaki gibi dökin: 15 mL'lik bir tüpte, istifleme jeli çözeltisinin 3 mL'sini, 90 μL% 10 amonyum persülfatını karıştırın (taze hazırlanmış olmalıdır), 3 μL TEMED (en son TEMED ekleyin).
- Tüpü hafifçe 2-3x ters çevirin. İstifleme jeli çözeltisini katılaştırılmış çözümleme jelinin üzerine hızlı bir şekilde eklemek için bir pipet kullanın; kaseti ağzına kadar doldurun. Kurulumla birlikte gelen tarağı tamamen yerleştirin. İstifleme jelinin 30 dakika polimerize olmasını izin verin.
- Jel polimerize olduktan sonra, bant şeridinin kasetin altından çıkarıldığından emin olun ve kaseti PAGE tank tertibatına geri yerleştirin.
- Üst ve alt odaları sırasıyla üst ve alt oda tamponu ile doldurun.
- Kurutulmuş numuneleri adım 1.11.4'ten itibaren gerekli minimum deiyonize, filtrelenmiş su hacminde (PAGE jeldeki kuyuların hacminin en fazla% 50'si) çözün. 1:1'i örnek yükleme tamponu ile karıştırın. Numuneleri ve HS oligosaccharide "merdivenlerini" (bkz. Tablo 1)jel içine yükleyin.
- Jeli 100 V'ta 5 dakika önceden çalıştırın. Daha sonra jeli 20-25 dakika (%15 poliakrilamid çözme jeli için), 40-50 dk (%18 poliakrilamid çözme jeli için), 90-100 dk (%22 poliakrilamid çözme jeli için) için 200 V'de çalıştırın.
NOT: 200 V çalışma süresinin bazı optimizasyonları gerekebilir. Fenol kırmızısı, uzunluğu 2 polimer alt biri olan heparin oligosakkaritlerin önünde göç eder (yani, polimerizasyon derecesi 2 veya dp2); bromophenol mavisi dp10-dp14'ün önüne geçirir. En iyi sonuçlar, voltaj uygulandığında, fenol kırmızı bandı neredeyse, ancak tam olarak değil, jelin dibine göç eder. Çalışma süresini buna göre ayarlayın.
3. Gümüş boyama protokolü
- Gümüş boyama için gerekli tüm çözümleri önceden hazırlayın (Tablo 2).
NOT: PAGE jel lekelenene, geliştirilene ve durdurma çözeltisine yerleştirilene kadar doğrudan dokunmayın. Bunun yerine, temiz plastik veya cam aletler kullanarak jeli manipüle edin. Jelin doğrudan işlenmesi, boyamadan sonra jel üzerinde parmak izi bozulmalarına ve diğer görünür yapıtlara neden olur. - Çalıştırma tamamlandıktan sonra, kaseti sökün ve deiyonize, filtrelenmiş su ile dolu temiz, orta-büyük bir kapta jel çıkarın.
NOT: Jelin doğrudan işlenmesini önlemek için pipet ucu veya başka bir plastik nesne kullanarak jeli suya batırılmış halde kasetten hafifçe uzaklaştırın. Jel kırılgan olabilir - dikkatlice ele alın.- Suyu atın. Jeli Alcian mavisi boyama çözeltisinde 5 dakika lekelenin.
- Alcian mavi lekesi atın. Alcian mavi boyama çözeltisinin çoğu çıkarılana kadar 2-3x'i deiyonize, filtrelenmiş suyla hızlı bir şekilde durulayın/yıkayın.
- Rocker'da bir gecede deiyonize, filtrelenmiş suda lekeyi bırakın. Artık lekelerin jelden bir gecede tamamen yıkanmasını sağlamak için bol miktarda deiyonize, filtrelenmiş su olduğundan emin olun.
- Jeli% 50 metanolde yıkayın (toplam 40 dk, çözeltiyi 2-3x değiştirin).
- Jeli deiyonize, filtrelenmiş suda 30 dakika yıkayın. Suyu atın ve her seferinde suyu değiştirerek toplam 2 saat boyunca 3 kez daha tekrarlayın.
- Taze, temiz bir kapta, jeli gümüş nitrat boyama çözeltisinde 30 dakika lekeleyin.
- Gümüş boyama çözeltisini tamamen çıkarmak için deiyonize, filtrelenmiş suda 2-3x hızlı bir şekilde durulayın/yıkayın.
- Deiyonize, filtrelenmiş suda 30 dakika yıkayın. Suyu atın ve her seferinde su banyoyu değiştirerek toplam 90 dakika boyunca 2x tekrarlayın.
- Suyu atın ve gelişmekte olan çözeltiyi ekleyin.
- Çözelti geliştikten sonra, jeli dikkatlice gözlemleyin ve bantların görünümünü izleyin. Lekenin kalitesine ve yüklenen numunenin kütlesine bağlı olarak, geliştirme birkaç saniyeden birkaç dakikaya kadar sürebilir.
- İstenilen bantlar görünür olur olmaz, gelişen çözeltiyi hemen atın ve durdurma çözeltisi ile kısa bir süre yıkayın.
- Durdurma çözeltisi yıkamayı atın ve yeni durdurma çözeltisi ile değiştirin. Bir rocker veya çalkalayıcı üzerinde 1 saat bekletin.
- Deiyonize, filtrelenmiş suda bir gecede yıkayın (ancak, jel durdurma çözeltisi yıkamadan hemen sonra görüntülenebilir).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alcian mavisi sülfatlı GAG 10'ulekelemede kullanılır; bu sinyal, sonraki gümüş leke 11kullanılarak yükseltilir. Şekil 1, gümüş boyama geliştirme sürecinin görsel bir gösterimini sağlar. Gösterildiği gibi, elektroforez ile ayrılmış GAG'leri temsil eden Alcian mavi sinyali, gelişen ajan poliakrilamid jeline nüfuz ettikçe yükseltilir. Tipik olarak, gelişen süreç gümüş ve Alcian mavi lekeli GAG'leri yoğunluğa bağlı bir şekilde azaltacak, her bandın kenarları ilk önce azaltırken, merkezdeki daha yoğun boyama bölgeleri uzun süre lekelenecektir.
Literatürde, PAGE tabanlı yaklaşımlar kullanılarak GAG'lerin tespit edilmesi için bildirilen sınır 0,5-1 μg12,13arasında değişmektedir. Yaklaşımımızı kullanarak algılama sınırını belirlemek için, farklı polimer uzunluklarındaki heparan sülfat oligosakkaritleri (kırılmamış heparin, dp20, dp10, dp6) % 22 poliakrilamid jel üzerine yüklendi, daha sonra yukarıda açıklandığı gibi çalıştırıldı ve boyandı. Her oligosakkarit iki farklı kütleye iki kez yüklendi: 1.0 μg ve 0.5 μg. Şekil 2, tekniğimizin 0.5 μg saflaştırılmış GAG'ı kolayca tespit edebildiğini göstermektedir. Özellikle, kırılmamış heparin, muhtemelen her bir bandın yoğunluğunu azaltan polimer boyutlarının daha geniş bir dağılımı nedeniyle test edilen dört farklı oligosakkaritten en az kolayca tespit edildi.
Gag saflaştırmasının sıvı biyolojik numunelerden elde edilen verimliliğini değerlendirmek için GAG'ler iki bronkoalveoler lavaj (BAL) örneğinden izole edildi. Şekil 3'tegösterildiği gibi, GAG izolasyonu için kullanılan A olarak işaretlenmiş ilk örnek, intratrakial lipopolisakkaritten (LPS) (3 mg / kg) sonra bir fareden 24 saat hasat edilen 1 mL BAL sıvısıydı, alveoler epitel HS dökülmesini teşvik etmek için uygulandı 5. İzolasyon işlemi sırasında GAG kaybını değerlendirmek için "ani" bir kontrol görevi görmek için doğrudan bu BAL sıvısına 10 μg ticari olarak kullanılabilir DP6 eklendi. B olarak işaretlenmiş ikinci örnek, eksojen GAG çivisi olmadan, 24 saat önce intratrakial LPS (3 mg / kg) verilen 3 fareden birikmiş 10 mL BAL sıvısından oluşuyordu. Her iki örnek de aynı anda GAG yalıtımı için işlendi ve iyon değişim sütunundan elde edilen 3 fraksiyonun tümü, düşük benzeşimlilik ve yıkama fraksiyonlarında herhangi bir GAG olup olmadığını belirlemek için tutuldu ve daha fazla işlendi. 2 μg ticari olarak satın alınan dp20, dp10 ve dp6 heparan sülfat oligosaccharides, bu örneklerin yanı sıra, her bir eluted fraksiyondaki HS GAG'larının boyutunu niteliksel olarak değerlendirmek için bir referans sağlamak için PAGE jelinde çalıştırıldı ve yoğunluğu GAG izolasyonu uygulanan 10 μg "çivi" kontrolüyle karşılaştırmak için bir referans.
Bu tekniğin katı dokuda kullanımını göstermek için heparan sülfat, yukarıda açıklandığı gibi 15 mg'lık donmuş fare akciğerinden izole edildi. İzolasyon ve saflaştırma işlemi sırasında, iyon değişim sütunundan elde edilen düşük benzeşim fraksiyonu (0,2 M NaCl) muhafaza edildi ve yüksek benzeşim (2,7 M NaCl) fraksiyonu ile birlikte işlendi ve jel üzerinde çalıştırıldı (Şekil 4). Ticari olarak satın alınan dp20, dp10 ve dp6 heparan sülfat oligosakkaritlerinin 2 μg'si, boyut için bir referans sağlamak için bu örneklerin yanında çalıştırıldı. Görüldüğü gibi, tüm akciğer homojenatı, en küçük parçaların yaklaşık olarak dp10 boyutuna eşit olduğu bol miktarda izole HS verdi. 2,7 M NaCl fraksiyonunda Alcian mavi/gümüş leke hevesli içerik GAG'larının göreli zenginleştirilmesi, iyon değişim sütunlarına yüksek benzeşimli heparan sülfatın bağlandığını ve sütundan yüksek özgüllükle sıyrılabileceğini göstermektedir. Tüm akciğer homojenatı, en küçük parçaların yaklaşık olarak dp10 boyutuna eşit olduğu geniş miktarda izole heparan sülfat (2,7 M NaCl fraksiyonu) verdi.
Şekil 1: Gümüş leke geliştirme süreci. Elektroforez ile ayrılmış kırılmamış heparin (UFH) veya boyut tanımlı oligosakkaritlerin (dp = polimerizasyon derecesi) alcian mavisi lekelenmesi gümüş boyama ile yükseltilir. Soldan sağa: UFH, dp20, dp10, dp6. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Heparan sülfat tespiti için poliakrilamid jel ve gümüş leke hassasiyeti. Farklı uzunluklarda heparan sülfat oligosakkaritler (kırılmamış heparin aka UFH, dp20, dp10, dp6) % 22 poliakrilamid jel üzerineydi ve koştu ve gümüş lekeli. Her oligosakkarit iki farklı kütleye iki kez yüklendi: 1.0 μg (en sol bantlar) ve 0.5 μg (en sağ bantlar). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sıvı biyolojik numunelerden GAG saflaştırmasının verimliliği. Burada "A" ve "B" olarak etiketlenmiş iki bronkoalveoler lavaj (BAL) örneğinden izole edilen GAG'ler% 22 poliakrilamid jel üzerinde çalıştırıldı ve gümüş lekeli. Örnek A, 3 mg/kg intratrakial lipopolisakkarit (LPS) ile tedavi edildikten sonra 24 saat fareden hasat edilen 1mL BAL sıvısından oluşuyordu. Bu örneğe "ani giriş" kontrolü olarak ek 10 μg dp6 HS eklendi. B örneği, LPS'nin verilmesinden sonra 3 fareden 24 saat toplanan 10 mL havuzlanmış BAL sıvısından oluşuyordu. Her örnek, seyreltici ("yıkama") veya düşük NaCl konsantrasyonları (0,2 M) ile eluted iyon değişim sütunundan kesirlerle birlikte çalıştırıldı. Boyut referansları (en soldaki bantlar) olarak 2 μg ticari olarak satın alınan dp20, dp10 ve dp6 heparan sülfat oligosaccharides kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sağlıklı bir fare akciğerinden izole edilen ve saflaştırılmış heparan sülfatların boyutunun ölçülmesi. Heparin sülfat içeriği izole ve sağlıklı bir fare izole bir akciğer 15 mg dondurulmuş örnek saflaştırılmış ve bir% 22 poliakrilamid jel üzerinde çalıştırılır. Heparan sülfat, nacl'nin düşük konsantrasyonları (0,2 M; düşük benzeşim fraksiyonu) veya yüksek konsantrasyonları (2,7 M, %16 çözelti; yüksek benzeşim fraksiyonu) ile iyon değişim sütunundan elde edildi. Boyut referansları (en soldaki bantlar) olarak 2 μg ticari olarak satın alınan dp20, dp10 ve dp6 heparan sülfat oligosaccharides kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| NOT: Kullanmadan önce tüm çözeltiler filtrelenmelidir (0,22μm). | |||
| Çözüm | Yemek tarifi | Kompozisyon | Yorum |
| Jel/alt bölme çalıştırma tamponunu çözme (2 L veya 4 L) | Borik asit, MW 61.83 | 2L: 12.36 g; 4L: 24,76 g | İstenen konsantrasyon: 0.1 M |
| Tris tabanı, MW 124.14 | 2L: 24,2 g; 4L: | İstenen konsantrasyon: 0.1 M | |
| Disodium EDTA MW 336.21 veya dihidrat, MW 372.36 | 2L: Sırasıyla 6,7 g veya 7,4 g; Sırasıyla 4L 13,4 g veya 14,8 g | İstenen konsantrasyon: 0.01 M | |
| Deiyonize su | 2L veya 4L | Reaktifleri tamamen çözdükten sonra pH'ı 8,3'e ayarlayın | |
| Üst bölme çalışan arabellek (1 L) | Glisin | 93 g | İstenen konsantrasyon: 1 M |
| Tris tabanı, MW 124.14 | 24,2 g | İstenen konsantrasyon: 0.2 M | |
| Deiyonize su | 1 L | ||
| Çözülen jel, %22 toplam akrilamid (500mL) | Akrilamid, MW 71.08 | 100,1 g | İstenen konsantrasyon: 20.02% w /v |
| N,N'-metilen-bis-akrilamid (bis, MW 154.17) | 10 g | İstenen konsantrasyon: 2% w /v | |
| Sakaroz | 75 g | İstenen konsantrasyon: 15% w /v | |
| Jel arabelleği çözümleme | 500 mL | Toplam 500mL hacme getirin; 500mL'den az arabellek toplamı gerektirir | |
| Çözülen jel, %15 toplam akrilamid (400mL) | Akrilamid, MW 71.08 | 56,3 g | İstenen konsantrasyon: 14.08% w /v |
| N,N'-metilen-bis-akrilamid (bis, MW 154.17) | 3,7 g | İstenen konsantrasyon: 2% w /v | |
| Sakaroz | 20,8 g | İstenen konsantrasyon: 15% w /v | |
| Jel arabelleği çözümleme | 400 mL | Toplam 400mL hacme getirin; 400mL'den az arabellek toplamı gerektirir | |
| İstifleme jeli (100 mL) | Akrilamid, MW 71.08 | 4,75 g | İstenen konsantrasyon: 4.75% w /v |
| N,N'-metilen-bis-akrilamid (bis, MW 154.17) | 0,25 g | İstenen konsantrasyon: 0.25% w/v | |
| Jel arabelleği çözümleme | 100 mL | 80mL tampon ve tam çözünmüş reaktifler ekleyin. Daha sonra pH'ı damla yönünde hidroklorik asitle 76,3'e ayarlayın. Daha sonra jel tamponu çözerek toplam 100 mL hacme getirin. | |
| Örnek yükleme tamponu (500 mL) | Sakaroz | 250gr | İstenen konsantrasyon: %50 w/v |
| Fenol kırmızısı | 500mg | İstenen konsantrasyon: 1mg/mL | |
| Bromophenol mavisi | 250mg | İstenen konsantrasyon: 0.5mg/mL | |
| Deiyonize su | 500mL | Toplam 500mL hacme getirin; toplam 500mL'den az su gerektirecektir | |
| Heparin türevi oligosacharide 'merdiven' (her biri 2mL) | dp6 | 0.1mg | NOT: Heparin türevli oligosaccharides 6 polimer alt bira uzunluğunda (aka polimerizasyon derecesi 6 veya dp6) en küçük bant için, dp20 en büyük bant için ve dp10 orta bant için kullanmanızı öneririz. Ancak istenirse başka kombinasyonlar da kullanılabilir. İstenen konsantrasyon: 0.05 mg/mL |
| dp10 | 0.1mg | ||
| dp20 | 0.1mg | ||
| Deiyonize su | 3mL | Her oligosaccharide'i her biri 1mL ile ayrı tüplerde çözün | |
| Örnek yükleme arabelleği | 3mL | Her oligosaccharide çözeltisine 1mL (1:1 karışım) ekleyin | |
Tablo 1: Saflaştırılmış glikozaminolikanların poliakrilamid jel elektroforez için gerekli çözümler. Tüm çözeltiler kullanılmadan önce filtrelenmelidir (0,22 μm).
| NOT: Kullanmadan önce tüm çözeltiler filtrelenmelidir (0,22μm). | |||
| Çözüm | Yemek tarifi | Kompozisyon | Yorum |
| Alcian mavi boyama çözeltisi (500mL) | Alcian mavisi 8GX tozu | 2.5g | İstenen konsantrasyon: 0.5% w /v |
| %2 v/v buzul asetik asit | 500mL | ||
| Gümüş leke (200 mL) | Deiyonize su | 192,7 mL | Leke çözeltisi taze hazırlayın; bir hafta içinde kullanın. |
| 7.6M sodyum hidroksit | 2 mL | Yapmak için, 10 mL suya 3.04 g sodyum hidroksit pelet ekleyin | |
| Amonyum hidroksit | 3,3 mL | ||
| 4M gümüş nitrat çözeltisi | 2 mL | Yapmak için, 5 mL suya 3.397 g gümüş nitrat ekleyin. Yağıştan kaçınmak için karıştırırken damla yönünde ekleyin. | |
| Çözüm geliştirme (501 mL) | Deiyonize su | 500 mL | Gelişen çözelti taze hale getirilmeli ve 24 saat içinde kullanılmalıdır. |
| %2,5 w/v sitrik asit | 1 mL | Yapmak için, 4 mL deiyonize suya 100mg ekleyin. Sitrik asit taze yapılmalıdır. | |
| Formaldehit | 250μL | ||
| Durdurma çözümü (500 mL) | Deiyonize su | 300 mL | |
| Buzul asetik asit | 20 mL | ||
| Metanol | 90 mL | ||
Tablo 2: Poliaklamid jel elektroforezi ile ayrılmış glikozaminogllikanların gümüş boyanma için gerekli çözeltiler. Tüm çözeltiler kullanılmadan önce filtrelenmelidir (0,22 μm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GAG'ler birçok farklı biyolojik proseste merkezi bir rol oynar. Sülfatlı GAG'lerin (HS ve CS gibi) temel işlevlerinden biri, aşağı akış sinyal fonksiyonlarını değiştirebilen ligandlarla etkileşime girmek ve ligandlara bağlanmaktır. Gag bağlama benzeşiminin konyak ligandlarına önemli bir belirleyicisi GAG polimer zincirinin uzunluğu 8,9,14. Bu nedenle, araştırmacıların biyolojik ilgi örneklerinden izole edilen GAG zincirlerinin boyutunu makul bir hassasiyetle tanımlayabilmeleri önemlidir. Pratik olmak için, bu teknik ortak laboratuvar ekipmanları ve reaktifler kullanılarak gerçekleştirilebilir olmalıdır.
Bu protokol, GAG'leri biyolojik örneklerden izole etmek ve arındırmak, PAGE aracılığıyla boyuta göre ayırmak ve Alcian mavisi ve gümüş boyama tekniğini kullanarak görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Glikozaminogliselanı boyuta göre ayırmanın birkaç yolu olsa da, yaklaşımımız bu tekniğin yaşam bilimleri laboratuvarlarında uygulanmasına özgü birkaç güçlülüğe sahiptir. İlk olarak, 0,5 μg algılama sınırı ile, bu teknik ilgi GAG'lerinin algısında oldukça hassastır. Deneyimlerimize göre, nispeten düşük gag konsantrasyonları (yani BAL sıvı örnekleri) içeren örnekler bile bu yöntemi kullanarak algılama için fazlasıyla GAG vermelidir. BAL sıvısının izolasyonu ve saflaştırılmasından elde edilen verim tekniğe ve özel ilgi GAG'ına göre değişirken, 10 mL ham BAL sıvısının bu teknik kullanılarak tespit edilebilen yeterli HS sağladığı deneyimlerimiz olmuştur. Katı organlardan elde edilen verim, hasat edilen dokuya bağlı olarak önemli ölçüde daha yüksektir, ancak 10 mg'luk ilk katı numunenin bu tekniği kullanarak tespit için geniş HS vereceği deneyimimize göredir.
Lekeli PAGE jelinin son görüntülemesinin son kullanıcının kullanabileceği görüntüleme teknolojilerine göre değişeceğini belirtmek önemlidir. Jelin dijital fotoğrafları, mevcut ekipmana ve gerekli algılama hassasiyetine (genellikle jel üzerine yüklenen numune miktarına göre belirlenir) bağlı olarak, piyasada bulunan çok sayıda jel dokümantasyon sistemi veya normal bir ticari kamera da dahil olmak üzere bir dizi farklı sistem kullanılarak alınabilir. Ayrıca, bu jeli dijital olarak görüntülemesi için gereken ışık kaynağının, numunenin yoğunluğuna ve boyama işlemi sırasında gereken geliştirme süresine bağlı olarak değişebileceği belirtilmelidir. Hızla gelişen ve çıplak gözle kolayca görülebilen gümüş lekeli bantlar üreten jeller, ışığın çoğunluğu tepkilenmemiş Alcian mavisi tarafından emileceğinden, en iyi görüntüler için UV transilluminasyon gerektirecektir. Daha uzun gelişim süreleri gerektiren jeller (çok az miktarda numuneye sahip olanlar gibi), gümüş leke tarafından en iyi şekilde emileceğinden, normal tam spektrum ışığı ile epi-aydınlatma veya transilluminasyon gerektirecektir.
Bu tekniğin bir diğer gücü, basit PAGE teknolojisindeki temeli nedeniyle, yaygın olarak bulunan ve ucuza elde edilen ekipman ve reaktifleri kullanarak yaşam bilimleri laboratuvarlarına özellikle uyarlanabilir olmasıdır. İzole GAG polimerlerinin uzunluğunu ölçmek için başka yaklaşımlar olsa da (örneğin, kılcal elektroforez), tipik olarak çoğu yaşam bilimleri laboratuvarında yaygın olarak bulunmayan hem bilgi hem de ekipman gerektirir15,16. Bu yaklaşımın basitliği ve gerekli reaktiflerin nispeten uygun fiyatlı ve kullanılabilir doğası, bu tekniği gag biyolojisini kendi alt alanları bağlamında incelemek isteyen yaşam bilimleri araştırmacıları tarafından kolayca uyarlanabilir hale getirmektedir. Ayrıca, bu teknik biyolojik dokulardaki GAG'leri tespit etmek için kütle spektrometresi tabanlı teknikler için önemli bir tamamlayıcı görevi görür. Kütle spektrometresi tabanlı yaklaşımlar GAG'leri yüksek hassasiyetle tespit edebilir ve karmaşık örneklerden yapıdaki ince farklılıkları ayırt edebilirken17, teknolojinin doğası nedeniyle GAG polimerlerini boyuta göre ayırt edememektedir. Bu nedenle, HS polimerlerinin boyutunun biyolojik ilgi örneklerine bölünmesi için PAGE tabanlı bir yaklaşım gereklidir.
Bu makalede açıklanan tekniklerde birkaç sınırlama olduğunu belirtmek önemlidir. İlk ve en belirgin olanı, Alcian mavi boyama reaksiyonunun merkezinde yer alan şarj-şarj etkileşimi nedeniyle, bu yaklaşımın yüksek oranda sülfatlı GAG'ler için son derece seçici olması ve sadece daha nötr yüklü moietiesleri zayıf bir şekilde lekeleneceğidir (örneğin, hyaluronik asit18). Bu nedenle, bu tekniğin sonuçlarını daha asidik GAG moieties'e doğru önyargılı hale getirmek muhtemeldir. Bu nedenle, deneysel örneklerde bulunan GAG'ların daha eksiksiz bir resmini sağlamak için, ilgi çekici biyolojik örneklerde GAG içeriğini ölçmek için tamamlayıcı yaklaşımlar (örneğin, kütle spektrometresi tabanlı teknikler) yardımcı olarak kullanılmalıdır. Ayrıca, özellikle hyaluronan boyutunu ölçmekle ilgilenen son kullanıcılar için, diğerleri burada açıklanan temel tekniğe uyarlanabilen biyotinillenmiş hyaluronik asit bağlayıcı proteinden (HABP) yararlanan benzer PAGE tabanlı teknikleri tanımlamıştır19.
Özetle, bu makalede sunulan teknik, gag'ları biyolojik örneklerden büyük bir hassasiyet ve özgüllükle izole etmek, arındırmak ve tespit etmek ve bu polisakkarit zincirlerinin doğal uzunluğunu ölçmek için kullanılabilir. Bu bilgiler, gag polimer uzunluğunun konyak ligand bağlayıcı benzeşimi belirlemedeki önemi nedeniyle GAG-ligand etkileşimleri hakkındaki hipotezlerin test edilmesi için kritik olabilir. Bu yaklaşımın, özellikle nispeten basitliği ve yaşam bilimleri araştırma laboratuvarlarına uyarlanabilirliği olmak üzere çeşitli avantajları vardır, ancak olumsuz yüklü GAG moieties'e karşı göreceli önyargısı ile sınırlıdır. Bu dezavantaja rağmen, bu teknik araştırmacıları GAG'lerin organ homeostazındaki ve hastalığındaki rolünü incelemeye teşvik edecek sağlam bir aracı temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL ve EPS) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
- Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
- Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
- Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
- Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
- Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
- Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
- Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
- Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
- Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
- Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
- Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
- Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
- Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
- Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
- Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
- Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).
