我们开发了自动化的计算机视觉软件，用于检测由pH敏感型荧光探针标记的胞吐事件。在此，我们演示如何使用图形用户界面和RStudio来检测融合事件，分析并展示融合事件的时空参数，并将事件分类为不同的融合模式。
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本文内容
摘要
摘要
对连接在囊泡SNARE蛋白上的pH敏感型GFP（pHluorin）进行延时全内反射荧光显微镜（TIRF）成像，是观察细胞培养中单个囊泡胞吐事件的有效方法。为了实现对这类事件的无偏、高效识别与分析，已开发并在MATLAB中实现了一种基于计算机视觉的分析方法。该分析流程包含细胞分割和胞吐事件识别算法。该计算机视觉方法提供了多种单事件参数的分析工具，包括荧光衰减半衰期和峰值ΔF/F，以及全细胞水平上胞吐频率的整体分析。这些及其他融合相关参数被用于分类分析，以区分不同的融合模式。本文介绍了一个新构建的图形用户界面（GUI），可完成从开始到结束的全流程分析。此外，进一步改进的R Studio中Ripley's K函数被用于区分融合事件在空间和时间上的聚集性、弥散性或随机性分布。
引言
VAMP-pHluorin 载体或转铁蛋白受体（TfR）-pHuji 载体是胞吐事件的优良标记物，因为这些对 pH 敏感的荧光蛋白在酸性囊泡腔内处于荧光淬灭状态，而在囊泡与质膜融合孔打开后立即发出荧光1。融合孔打开后，荧光呈指数衰减，其衰减速率存在一定异质性，可反映融合事件的相关信息。本文介绍一种图形用户界面（GUI）应用程序，可自动检测并分析胞吐事件。该程序能够使用户利用 pH 敏感性标记物自动识别胞吐事件2，并从每个事件中提取可用于分类分析的特征参数3（图 1A）。此外，本文还描述了使用 Ripley's K 函数对胞吐事件的空间聚集性进行分析的方法。
最近有研究报道了将胞吐事件自动分类为不同胞吐模式的方法3。此前已描述过两种胞吐模式：全囊泡融合（FVF）和“亲吻-逃逸”融合（KNR）胞吐4,5,6,7。在FVF过程中，融合孔扩张，囊泡完全并入质膜。在KNR过程中，融合孔....
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方案
注意： 原始的胞吐分析图形用户界面（GUI）使用 Matlab 9.10 版本（2021a）编写并编译。新版本的 MATLAB 需要对 GUI 进行更新，更新版本可从我们的网站下载：https://guptonlab.web.unc.edu/code/
1. 选择数据集和目录
- 选择用于分析的数据集时，点击 查找数据集 按钮（图 2A，红色框 1），进入数据存放的文件夹（例如 RawData 文件夹）。数据文件将自动作为列表填充至“数据文件”区域。文件夹中可包含多个数据集。
- 点击 选择目录 按钮，并选择用于存放分析后文件的目录（例如 Test 目录）（图 2A，红色框 2）。当点击“分析”按钮后，该目录中将生成一组文件夹、已完成的分析文件以及中间临时图像。若未选择目录，则会报错。
2. 设置像素大小和帧率
- 填写图像的适当帧率和像素大小 "帧率" 或 "像素大小" 盒图2A，绿....
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结果
此处使用图形用户界面（GUI）（图2A）分析了在3天体外培养（DIV）时，通过全内反射荧光（TIRF）显微镜观察表达VAMP2-pHluorin的三个神经元的胞吐事件。E15.5期皮层神经元被分离后，按照Winkle等（2016）和Viesselmann等（2011）11,12所述方案转染VAMP2-pHluorin并进行铺板。成像参数的方法学依据Urbina等（2018）2所述进行。简言之，采用TIRF显微镜每100 ms对神经元的基底质膜成像一次，持续2分钟。图2、图3、图4展示了分析胞吐事件的逐步操作指南。首先选择存放神经元图像的文件夹，并指定用于保存最终分析数据文件的目录（图2A
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讨论
使用胞吐检测与分析软件时，请注意该程序仅接受无损压缩的 .tif 文件作为输入。.tif 图像文件可以是 8 位、16 位或 32 位灰度（单通道）图像。其他图像格式必须在输入前转换为上述格式之一。作为参考，本文所用示例为 16 位灰度图像。
在自动检测过程中，时间序列图像集会进行自动背景扣除和光漂白校正处理。对于背景扣除，将掩膜文件中掩膜区域以外的像素在整幅图像的时间序列上取平均值，并从图像集中减去该平均值。对于光漂白校正，则对视频过程中掩膜内像素的平均荧光强度应用单指数衰减拟合，校正后的强度按如下方式调整：
校正后的强度 = （时间 t 时的强度）÷ exp(-k×t)，其中 k = 衰变常数
因此，在输入前无需进行预处理。然而，这些过程在很大程度上依赖图像掩膜来有效分离细胞与背景，因此获得一个准确的细胞掩膜是获得良好结果的必要条件。
自动细胞掩膜生成器需要具有足够信噪比（理想情况下，至少为平均背景信号标准差的2.......
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披露
作者声明无任何披露事项。
致谢
感谢Dustin Revell和Reginald Edwards对代码和图形用户界面的测试。本研究由美国国立卫生研究院资助：包括R01NS112326（SLG）、R35GM135160（SLG）和F31NS103586（FLU）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R 核心团队 | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
参考文献
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal orga....
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重印与许可
