外分泌物的自动检测和分析

VAMP-普鲁林构造或转移素受体（TfR）-pHuji构造是外延事件的优秀标志，因为这些pH敏感荧光在囊泡和等离子膜¹之间的融合孔隙打开后立即在酸囊性流明和荧光中淬火。聚变孔打开后，荧光呈指数级衰变，具有一些异质性，揭示了有关聚变事件的信息。在此处，描述了一个图形用户界面 （GUI） 应用程序，该应用程序可自动检测和分析外显事件。此应用程序允许用户自动检测 pH 敏感标记² 显示的外阴事件，并从可用于分类目的^3（ 图1A）的每个事件生成功能。此外，还描述了使用Ripley的K函数分析外阴事件聚类。

最近有报道说，将外阴事件自动分类为不同的外阴模式^。两种外分泌模式，全囊融合（FVF）和吻跑融合（KNR）外血症（KNR）以前曾被描述为^{4，5，6，7。}在 FVF 期间，聚变孔扩张，囊泡被整合到等离子体膜中。在KNR期间，融合孔短暂打开，然后重新密封4，5，8，9，10。在发育中的神经元中发现了四种外血病模式，其中两种与FVF有关，两种与KNR有关。这项工作表明，FVF和KNR可以进一步细分为融合事件，在聚变孔打开后立即进入荧光衰变（FVFi和KNRi），或在荧光衰变开始前发生融合孔打开后出现延迟的外阴事件（FVFd和KNRd）（图1B）。分类器识别每个融合事件的外血病模式。在此处，此分析已整合到可安装在基于 Windows 和 Mac 的操作系统中的 MATLAB 中的 GUI 中。所有分析文件都可以在 https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing 或
https://github.com/GuptonLab

1. 选择数据集和目录

1. 要选择数据集进行分析，请单击 "查找数据集 "按钮（图 2A，红色框 1），以导航到存放数据的文件夹（例如 RawData 文件夹）。数据文件将自动将数据文件填充为列表。文件夹中可以有多个数据集。
2. 单击 "选择目录 "按钮并选择将分析文件存入的目录（例如测试）（图 2A，红色框 2）。当按下分析按钮时，将在该目录中创建一组文件夹和完成的分析文件以及中间临时图像。如果不选择目录，将产生错误。

2. 设置像素大小和帧速率

1. 在适当的"帧速率"或"像素大小"框（图 2A，绿色框）中填写图像的适当帧速率和像素大小。如果没有提供值（它们被设置为默认的"0"），则程序将搜索与文件相关的元数据，以查找帧速率和像素大小。如果找不到这些值，程序将默认为每像素用于测量，并且按帧默认用于时间点。
   注:在提供的示例中，帧速率为 100，像素大小为 0.08。

3. 选择或制作口罩

1. 使用 "掩码器制造者 "按钮自动创建文件数据集列表中数据的单元格掩码（图 2A，蓝色框）。使用 "面具制造商 "按钮后，将创建选定目录中的新文件夹，称为"面具文件"。"运行指示器"在运行时会变黄，完成后返回绿色。
   注:数据文件列表中每个文件的掩码将从图像文件的前 10 帧（如果图像文件中少于 10 帧，则从所有帧创建），并使用正确的命名方案（如下所述）沉积在掩码文件夹中。
2. 确保掩码文件自动填充掩码文件列表。用户可以直接进行分析。
   注:始终目视检查掩码文件，并确认它们捕获了整个感兴趣区域。数据文件的第一帧和掩码文件在选择时显示在 UI 上。（图2B）。在信号到噪声低的情况下，掩码制造商可能会产生错误，因此验证掩码文件是否合适对于质量控制至关重要。
3. 作为使用掩码制造商的替代方案，如果图像噪声信号不足，则在 ImageJ 中手动创建掩码。
   1. 首先，打开图像J中的原始图像文件（图3A）。
   2. 单击 Polygon 选择 按钮，然后单击以在单元格周围绘制一个面罩。完成后，双击最后一点完成多边形。
   3. 完成后，导航到 编辑|选择|创建掩码 （图3B）。将根据多边形绘图创建新的倒置面罩。在选定的目录中将掩码保存在指定的掩码文件夹中。掩码文件命名方案必须匹配相应的个人数据文件，然后是"_mask_file"。例如，如果数据文件被命名为"VAMP2_488_WT_1.tif"，则相应的掩码文件必须命名为"VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif"。
   4. 使用 "查找掩码文件" 按钮导航到已存入的自定义掩码文件夹。面具将填充面具文件作为列表。
      注:在运行分析之前，为每个数据文件提供一个掩码非常重要。

4. 分析和功能提取

1. 选择目录和数据文件列表和掩码文件列表填充后，单击 分析 按钮（图 4A）。如果需要对外阴事件进行分类，则移到第 5 步。
   注: 分析 按钮单击将执行一系列自动任务来分析数据。它将创建选定目录中的单个文件夹以沉积分析的数据。运行时，"运行指示器"将从绿色变为黄色（图4A，红色框）。分析完成后，这将变回绿色。
2. 查找一个数据文件夹 （图 4B）， 其中包含一套完整的分析文件 （以及功能提取文件， 稍后将用于分类）， 根据每个数据文件 （图 4C）命名。
   注:以下部分包括这些分析文件的描述。

5. 外阴事件分类

1. 要通过自动检测同时对外阴事件进行分类，请在单击分析按钮之前检查分类复选框。对于每个外阴事件，为每个类分配 0-1 之间的概率分数。如果该类的概率分数为 0.5 >，则外阴事件被视为四个类之一。
   注:分析完成后，选定目录内将出现新的数据文件夹。文件夹将包含与每个图像文件对应的分析文件。

6. 使用里普利的 K 值对外分泌体的痉挛性分析

1. 创建单独的"神经质"和"索玛"面罩文件。首先，将索马从神经质中分割。没有公正的方法将索马从神经中分割，因此用户应该对调理实验视而不见，并使用最佳判断:建议一种没有明显神经延长的椭圆形。
2. 打开图像J/斐济。
3. 拖放掩码文件或使用 文件|打开 然后选择掩码文件。
4. 使用选色工具，单击面膜背景中的任何黑色像素，将颜色设置为黑色。
5. 使用多边形选择工具或徒手在索马周围绘制轮廓，将其与神经分离。这需要人工决策。
6. 单击 "编辑|选择|制作面具。新图像将打开，从图像的其余部分分割成圆形的索马。这将创建一个索马面具文件。
7. 无需移动绘制区域，请单击原始掩码文件的头。
8. 单击 "编辑|填充 填充圆索玛，以便只有神经保持面罩。
9. 获得单独的神经和掩码文件后， 保存 两个掩码文件。
10. 在马特拉布打开"neurite_2D_network"。
11. 在 MATLAB 中，使用所有分析数据导航到目录。
12. 将路径"面具名称"更改为新面具的名称，即"面具文件/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
13. 将"csv_file_name"更改为文件fluorescent_traces.csv位置，即"掩码文件/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv"。
14. 单击 "运行 "以将神经质掩码文件骨干化。这将创建一个骨架化版本的神经面膜文件，并将其作为 CSV 文件在掩蔽文件夹下沉积。
15. 接下来，生成一个CSV文件为索马。在马特拉布打开"CSV_mask_creator.m"。
16. 将"面具名称"放在索马面具名称的路径中，即"面具文件/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
17. 将"写字矩阵"更改为 csv 文件名以创建，即"掩码文件/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
18. 单击 "运行"。这将创建新的VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv文件。
19. 每个掩码文件重复 6.14。

7. 斯图迪奥设置

1. 打开 Rstudio 并打开ripleys_k_analysis。R 文件。
2. 通过转到工具|，在 RStudio 中安装包 "spatstat"安装包 和键入"spatstat"，然后单击 安装。
   注:此仅需要执行一次每个 Rstudio 安装。
3. 在每个会话开始时运行库吐口水。
4. 注意本例中的两个主要变量:"neuron_mask"和"neuron_datapoints"。神经元掩码指向要运行的一组掩码文件，即索马掩码文件。
   注:运行所有索马面具文件在一起，分开从Neurite面具文件，反之亦然。
5. 阅读要分析的每个神经元的掩码文件.csv。
6. 通过复制附加的 neuron_mask_n+1 同时运行多个文件。这将允许使用第 8 节中描述的脚本将 Ripley 的分析聚合在一起。
7. 现在检查第二个变量"neuron_datapoints"。
8. 阅读中。分析程序生成的X_fluorescent_traces.csv"文件（按所有extracted_R文件）与外阴事件的 x、y、t 位置以及 x、y 位置的神经特异性文件一起生成。这属于"neuron_datapoints"位置。
9. 在 RStudio 中选择代码|运行区域|全部运行。这将生成多个绘图，包括分组 Ripley 的 K 值以及密度图。
10. 通过出口|保存地块 将图像保存为|选择 适当的图像格式和目录，并输入适当的文件名称，然后单击 保存。
    注:热图的绘图功能在脚本中使用"绘图（密度（soma_data，0.4）"来调用。此处的数字"0.4"表示密度函数应如何平滑。它可以更改以以有意义的方式适合用户数据，但如果要在不同的热图之间进行比较，则它们之间的数字必须相同。
11. 从 Rstudio导出或保存图像。如果热图需要进一步编辑，请选择合适的文件类型 （SVG 或 EPS）。

8. 里普利的分析

注:Ripleys_k_analysis。R 文件还自动生成 Ripley 的 k 值图。运行整个脚本将自动运行下面提到的功能，但如果一个人希望单独运行脚本的每个部分或对分析进行更改，则详细包含该功能。

1. 首先，为每个单元格运行信封功能。此功能模拟完整的空间随机性 （CSR），以测试 Ripley 的外延事件点模式的 K 值。
   Data_envelope_1 = 信封 （soma_data_1， 凯斯特， 尼西姆 = 19， 保存芬斯 = 真实）
   Data_envelope_2 = 信封 （soma_data_2， 凯斯特， 尼西姆 = 19， 保存funs = 真实）
2. 接下来，将这些信封集中在一起，为团队创建一个 CSR 估计值:
   Pool_csr = 游泳池（Data_envelope_1，Data_envelop_2,...）
   接下来，运行所有数据点的 Ripley K 功能。
   Data_ripleys_k_1 = 凯斯特 （soma_data_1， 比率 = 真实）
   Data_ripleys_k_2 = 凯斯特 （soma_data_2， 比率 = 真实）
3. 完成后，将 Ripley 的 K 值汇集在一起，并根据以下命令引导其置信区间:
   数据池 + 池（Data_ripleys_k_1，Data_ripleys_k_2,...）
4. 具有以下命令的引导:
   Final_Ripleys_K = 瓦布洛克 （有趣 = 凯斯特， Data_pool）
5. 绘制数据。
6. 如果需要硬统计差异，则将学生化排列测试包含在口水统计包中，以测试点模式组之间的差异:
   Test_difference = 螺柱测试 （all_points_to_test， exocytic_events = 组， nperm = np） 。

在这里，利用TIRF（总内部反射荧光）显微镜分析三个VAMP2-pHluorin在3DIV下表达神经元的外细胞事件。E15.5皮质神经元被分离，随后与VAMP2-普鲁林和电镀使用温克尔等人概述的协议，2016年和维塞尔曼等人，2011年11月，12日。成像参数的方法如乌尔比纳等人所概述的，2018年2月2日。简言之，TIRF显微镜用于每100ms对神经元的基底血浆膜进行成像，每2分钟。图2，图3，图4显示一个分步指南，分析外显子事件。选择神经元图像所在的文件夹，并选择存放最终分析数据文件的目录（图2A）。使用面罩制造函数，为神经元生成一个面膜，在GUI中检查（图2B）。在这种情况下，细胞面膜质量良好，可以进行分析。如果面膜不足，可以在 ImageJ 中创建一个面膜（图 3）。在使用"掩码制造"功能或在 ImageJ 中创建掩码并选择掩码文件所在的目录后，执行分析（图 4A）。分析完成后，数据文件夹中会生成结果（黄色指示器变回绿色）（图 4B）。

数据文件根据所提供的原始数据文件自动生成和命名。

假设数据文件被命名为 X:

X_tracking: 此文件包括每个事件的 x、y 位置和帧数，以及可用于绘制每个事件周围的框的边界框。年龄表示超过初始检测的帧数，其中事件是一个明显的高斯穿刺。如果检查分类，分类结果将显示在此文件中，该文件表示属于四个类别之一的外阴事件的概率。如果概率大于 .5，并且大于其他概率，则选择了外细胞类。

X_fluorescent痕迹: 此文件包括每个事件的 x、y 位置和帧数。此外，它还包括每个事件前 2 秒和每个事件峰值后 10 秒（由时间点列指示）周围感兴趣区域的荧光强度测量。

X_cell_statistics: 此文件包括细胞区域、总图像时间以及自动计算每个单元格事件的频率（事件/毫米2/分钟）。

功能提取文件包括:

X_contrast: 反差。衡量像素与其邻居在整个图像上的强度对比度。

X_correlation: 相关。衡量像素与邻居在整个图像中的关联程度。

X_energy 总能量。定义为像素强度的平方总和。

X_homogeneity 衡量投资回报率中元素分布与投资回报率对角线的接近程度。

X_ring_fluorescence: 边框像素的平均荧光。

X_SD: 标准差。这被定义为投资回报率的标准偏差。

从X_fluorescent痕迹文件（图5A）中绘制了每个外细胞类的平均荧光痕迹±SEM示例。使用Cell_statistics文件，为每个神经元绘制了每个类的外分泌频率（图5B）。单击分类复选框后，程序将每个外阴事件分配给一个类，绘制在图 5C 中。分类后，Ripley 的 K 分析代码用于确定外阴事件是随机的、聚类的还是在空间和时间内分散的。产生了外阴事件本地化的密度热图（图5D）。这些揭示了神经元不同区域的预期聚类"热点"。接下来，Ripley 的 K 分析针对索马、神经质和聚类进行了长期分析（图5E）。Ripley 的 K 值和 SEM（分别为黑线和蓝色阴影区域）高于完整的空间随机度线（红色虚线），这表明具有统计学意义的聚类。

图1:外阴分析与分类的表述。 （A） GUI分析管道大纲。在识别和跟踪外阴事件之前，细胞从背景中分割出来。诸如峰值 +F/F 和 t1/2 等参数是根据融合前后事件周围活动投资回报率的荧光外源痕迹计算得出的。（B） 外分泌和示例图像蒙太奇的四种模式的说明。融合后，事件可能会立即进行到 FVF 或 KNR （FVFI 和 KNRi），或在融合命运开始前可能会出现延迟到 FVF 或 KNR （FVFd 和 KNRd）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:分步示例分析。（A）首先，选择数据集（1.，红框），选择目录放置分析文件（2.，红色框）。接下来，指定帧速率和像素大小（3.，绿色框）。在这里，使用了 0.08 μm 像素大小和 100 ms 帧速率。然后按下"面具制造者"功能按钮（4.，蓝色框）。在选定的目录中自动创建一个名为"掩码文件"的文件夹，其中包含数据集中每个图像文件的掩码文件。（B） 当数据集加载时，选择数据文件和/或掩码文件将显示图像的第一帧，以便于比较（绿色框）。掩蔽文件可能不完全正确;此掩码文件可以更正错误，或新的掩码文件可以手动制作请单击此处查看此图的较大版本。

图3:在 ImageJ（A）中手动创建一个掩码文件。首先，打开文件制作掩码。"多边形选择"按钮以红色轮廓。通过单击细胞边缘，创建多边形轮廓。（B） 如何从多边形轮廓创建面罩。通过选择编辑|选择|创建面膜，黑白面膜将从多边形（右图）创建。请单击此处查看此图的较大版本。

图4:外阴事件分析。（A）分析按钮（橙色框）的演示和运行分析。请注意，在进行分析时，运行指示器变黄。（B） 分析完成后在选定目录中创建的示例分析文件。数据文件包含外泄事件的所有分析文件。（C） 数据文件夹中生成的分析文件。颜色框表示后续图像中的打开文件。（D） 三个打开的文件，"X_fluorescent_traces.csv"（红色）和"X_Cell_statistics"（绿色）和"X_tracking"（蓝色）。荧光痕迹包含每个事件的 x、y 位置和帧数，以及每个 ROI 的荧光强度。Cell_statistics包含全细胞外细胞统计的摘要信息，如外分泌频率。X_tracking包含每个外显子事件的位置和时间信息，以及每个事件的每个外分泌类别的概率，表示为 0-1 之间的数字（>0.5 表示事件属于特定类别）。请单击此处查看此图的较大版本。

图5: 代表结果。 （A） 平均荧光痕迹 [/- SEM 从每个外细胞类。（B） 每个外细胞类绘制三个穆林皮质神经元的事件频率。这些数据值是从"X_Cell_statistics"中绘制的，使用"X_tracking"中分配的类。（C） A 中使用的同一三个细胞的外分泌类别的分布。在此处绘制了每个模式的比例。（D） 在协议的里普利 K 分析部分生成的外阴事件发生地点的密度图。这可以解释为事件发生空间可能性的"热图"。（E） 里普利对用于A）和B的三个细胞的K分析。红线表示外阴事件在空间上完全随机分布的价值。黑线表示本示例中三个单元格的 Ripley K 值，蓝色阴影区域表示置信区间。在这里，阴影区域明显位于 +0.25-1 μm 之间的完整空间随机性线之外，这表明外显子事件聚集在这些距离。 请单击此处查看此图的较大版本。

作者声明不透露任何情况。