我们开发了自动化的计算机视觉软件，用于检测由pH敏感型荧光探针标记的胞吐事件。在此，我们演示如何使用图形用户界面和RStudio来检测融合事件，分析并展示融合事件的时空参数，并将事件分类为不同的融合模式。
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本文内容
摘要
摘要
对连接在囊泡SNARE蛋白上的pH敏感型GFP（pHluorin）进行延时全内反射荧光显微镜（TIRF）成像，是观察细胞培养中单个囊泡胞吐事件的有效方法。为了实现对这类事件的无偏、高效识别与分析，已开发并在MATLAB中实现了一种基于计算机视觉的分析方法。该分析流程包含细胞分割和胞吐事件识别算法。该计算机视觉方法提供了多种单事件参数的分析工具，包括荧光衰减半衰期和峰值ΔF/F，以及全细胞水平上胞吐频率的整体分析。这些及其他融合相关参数被用于分类分析，以区分不同的融合模式。本文介绍了一个新构建的图形用户界面（GUI），可完成从开始到结束的全流程分析。此外，进一步改进的R Studio中Ripley's K函数被用于区分融合事件在空间和时间上的聚集性、弥散性或随机性分布。
引言
VAMP-pHluorin 载体或转铁蛋白受体（TfR）-pHuji 载体是胞吐事件的优良标记物，因为这些对 pH 敏感的荧光蛋白在酸性囊泡腔内处于荧光淬灭状态，而在囊泡与质膜融合孔打开后立即发出荧光1。融合孔打开后，荧光呈指数衰减，其衰减速率存在一定异质性，可反映融合事件的相关信息。本文介绍一种图形用户界面（GUI）应用程序，可自动检测并分析胞吐事件。该程序能够使用户利用 pH 敏感性标记物自动识别胞吐事件2，并从每个事件中提取可用于分类分析的特征参数3（图 1A）。此外，本文还描述了使用 Ripley's K 函数对胞吐事件的空间聚集性进行分析的方法。
最近有研究报道了将胞吐事件自动分类为不同胞吐模式的方法3。此前已描述过两种胞吐模式：全囊泡融合（FVF）和“亲吻-逃逸”融合（KNR）胞吐4,5,6,7。在FVF过程中，融合孔扩张，囊泡完全并入质膜。在KNR过程中，融合孔短暂开放后重新闭合4,5,8,9,10。在发育中的神经元中已鉴定出四种胞吐模式，其中两种与FVF相关，另两种与KNR相关。该研究证明，FVF和KNR均可进一步细分为两类事件：一类是在融合孔开放后立即发生荧光衰减的融合事件（FVFi 和 KNRi），另一类是在融合孔开放后出现延迟，随后才开始荧光衰减的胞吐事件（FVFd 和 KNRd）（图1B）。该分类器可识别每个融合事件的胞吐模式。本文将此分析方法整合为一个图形用户界面（GUI），可在基于Windows和Mac操作系统的MATLAB中安装使用。所有分析文件均可在 https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing 或
https://github.com/GuptonLab 获取。
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方案
注意： 原始的胞吐分析图形用户界面（GUI）使用 Matlab 9.10 版本（2021a）编写并编译。新版本的 MATLAB 需要对 GUI 进行更新，更新版本可从我们的网站下载：https://guptonlab.web.unc.edu/code/
1. 选择数据集和目录
- 选择用于分析的数据集时，点击 查找数据集 按钮（图 2A，红色框 1），进入数据存放的文件夹（例如 RawData 文件夹）。数据文件将自动作为列表填充至“数据文件”区域。文件夹中可包含多个数据集。
- 点击 选择目录 按钮，并选择用于存放分析后文件的目录（例如 Test 目录）（图 2A，红色框 2）。当点击“分析”按钮后，该目录中将生成一组文件夹、已完成的分析文件以及中间临时图像。若未选择目录，则会报错。
2. 设置像素大小和帧率
- 填写图像的适当帧率和像素大小 "帧率" 或 "像素大小" 盒图2A，绿色方框）。如果未提供任何数值（它们将被设置为默认值 "0"），程序将搜索与该文件关联的元数据以获取帧率和像素大小。如果无法找到这些值，程序将默认以每像素作为测量单位，以每帧作为时间点单位。
注意：在提供的示例中，帧率为100，像素大小为0.08。
3. 选择或制作掩膜
- 使用 Mask Maker 按钮，可自动为文件数据集列表中的数据生成细胞掩膜（图 2A，蓝色框）。点击 Mask Maker 按钮后，系统将在所选目录中创建一个名为 MaskFiles 的新文件夹。"运行指示器"在运行期间将变为黄色，完成后恢复为绿色。
注意：将根据数据文件列表中每个文件的图像前 10 帧（或若图像帧数少于 10 帧，则使用全部帧）生成对应的掩膜，并按照正确的命名规则（如下所述）保存至 MaskFiles 文件夹中。 - 确保掩膜文件自动填充至掩膜文件列表中。用户可直接进入分析步骤。
注意：务必目视检查每个掩膜文件，确认其完整覆盖了感兴趣区域。当选中文件时，数据文件的第一帧与对应掩膜文件将在用户界面中显示（图 2B）。在信噪比较低的情况下，Mask Maker 可能产生错误，因此验证掩膜文件的准确性对质量控制至关重要。 - 作为使用 Mask Maker 的替代方案，若图像信噪比不足，可在 ImageJ 中手动创建掩膜。
- 首先，在 ImageJ 中打开原始图像文件（图 3A）。
- 点击 多边形选择 按钮，围绕细胞逐点绘制掩膜区域。绘制完成后，双击最后一个点以闭合多边形。
- 完成后，进入 编辑 | 选择 | 创建掩膜（图 3B），系统将基于所绘制的多边形生成一个新的反相掩膜。将掩膜文件保存至所选目录下的指定 MaskFiles 文件夹中。掩膜文件的命名规则必须与对应的数据文件名一致，并在末尾添加 "_mask_file"。例如，若数据文件名为 "VAMP2_488_WT_1.tif"，则对应的掩膜文件必须命名为 "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif"。
- 使用 查找掩膜文件 按钮，导航至存放自定义掩膜文件的文件夹。掩膜文件将作为列表填充至“掩膜文件”区域。
注意：在运行分析之前，必须确保每个数据文件都有对应的掩膜文件。
4. 分析与特征提取
- 选择目录并填充数据文件列表和掩膜文件列表后，点击分析按钮（图4A）。如果需要对外排事件进行分类，请转至步骤5。
注意：点击分析按钮将执行一系列自动化任务以分析数据。系统将在所选目录中创建独立的文件夹来存储分析后的数据。运行过程中，"运行指示器"将由绿色变为黄色（图4A，红框）。分析完成后，该指示器将恢复为绿色。 - 查找一个DataFiles文件夹（图4B），其中包含完整的分析文件集（以及用于后续分类的特征提取文件），文件按各个数据文件命名（图4C）。
注意：这些分析文件的说明详见下文“代表性结果”部分。
5. 胞吐事件的分类
- 为通过自动检测实现对外排事件的同步分类，在点击分析按钮前，请勾选分类复选框。针对每个外排事件，为每一类别分配一个介于 0 到 1 之间的概率评分。若某类别的概率评分> 0.5，则该外排事件被认定为属于四类中的该类别。
注意：分析完成后，所选目录中将生成一个新的数据文件夹。该文件夹包含与每个图像文件相对应的分析文件。
6. 使用Ripley's K值对胞吐作用进行时空分析
- 创建一个独立的 "神经突" 和 "胞体" 掩膜文件。首先将胞体与神经突进行分割。目前尚无对胞体与神经突进行分割的无偏方法，因此操作者应在对分组条件设盲的情况下，依据最佳判断进行分割；建议采用无明显神经突延伸的椭圆状区域。
- 打开 ImageJ/Fiji。
- 拖放掩膜文件或使用 文件 | 打开 然后选择掩膜文件。
- 使用取色工具，点击掩膜背景中的任意黑色像素，将颜色设置为黑色。
- 使用多边形选择工具或手绘工具在胞体周围绘制轮廓，将其与神经突起分离。此过程需要人工判断。
- 点击 编辑 | 选择 | 创建蒙版将打开一张新图像，其中圈出的细胞体已从图像其余部分分割出来。这将生成一个细胞体掩膜文件。
- 在不移动已绘制区域的情况下，点击原始掩膜文件的标题。
- 点击 编辑 | 填充 填充被圈出的胞体，使掩膜中仅保留神经突。
- 获得独立的神经突和掩膜文件后， 保存 两个掩膜文件。
- 开放 "神经突二维网络" 在 Matlab 中。
- 在 MATLAB 中，导航至包含所有分析数据的目录。
- 更改路径 "掩膜名称" 到神经突掩膜的名称，即 "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_神经突.tif"
- 改变 "csv_file_name" 到 fluorescent_traces.csv 文件所在的位置，即 "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_轴突.csv".
- 点击 运行 对神经突掩膜文件进行骨架化处理。此操作将生成神经突掩膜文件的骨架化版本，并将其以 CSV 文件形式保存至 maskfiles 文件夹中。
- 接下来，为细胞体生成一个 CSV 文件。打开 "CSV_mask_creator.m" 在 Matlab 中。
- 输入路径 "掩模名称" 到胞体掩膜的名称，即 "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
- 改变 "写入矩阵" 要创建的 csv 文件名，即， "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
- 点击 运行这将生成新的 VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv 文件。
- 对每个掩膜文件重复步骤 6.14。
7. RStudio 设置
- 打开 Rstudio，然后打开 ripleys_k_analysis.R 文件。
- 安装软件包 "spatstat" 在 RStudio 中，通过前往 工具 | 安装软件包 并输入 "spatstat" 随后点击 安装.
注意：每个 Rstudio 安装仅需执行一次。 - 每次会话开始时运行 spatstat 程序库。
- 请注意此情况下的两个主要变量： "神经元掩膜" 和 "神经元数据点" 神经元掩膜指向要运行的一组掩膜文件，即胞体掩膜文件。"
注意：所有胞体掩膜文件需一起运行，与 neurite 掩膜文件分开处理，反之亦然。 - 读取待分析的每个神经元的掩膜文件的 .csv 数据。
- 通过复制额外的 neuron_mask_n+1 文件来同时运行多个文件。这将允许使用第 8 节中描述的脚本将 Ripley 分析结果进行汇总。
- 现在检查第二个变量， "神经元数据点".
- 读取。"X_荧光信号.csv" 由分析程序生成的文件（包含所有提取特征的R文件），其中含有胞吐事件的x、y、t位置信息，以及用于二维网络的神经突特异性x、y位置文件。此内容放入 "神经元数据点" 位置。
- 在 RStudio 中 选择代码 | 运行选区 | 全部运行这将生成多个图表，包括分组的Ripley's K值图以及密度图。
- 通过前往保存图表 导出 | 另存图像为 | 选择 合适的图像格式和目录，并输入适当的文件名，然后单击 保存.
注意：热图的绘图函数在脚本中被调用时使用 "plot(密度(soma_data, 0.4))"数量 "0.4" 此处表示密度函数应平滑的程度。可根据用户数据进行有意义的调整，但在不同热图之间进行比较时，该数值必须保持一致。 - 导出 或 保存 来自 Rstudio 的图像。如果热图需要进一步编辑，请选择合适的文件类型（SVG 或 EPS）。
8. 里普利分析
注意：Ripleys_k_analysis.R 文件还会自动生成 Ripley's k 值的图表。运行整个脚本将自动执行下文提到的各个函数，但此处仍详细列出，以便用户需要单独运行脚本的某一部分或对分析过程进行修改。
- 首先，对每个细胞运行包络函数。该函数模拟完全空间随机性（CSR），用于检验胞吐事件点格局的Ripley's K值。
Data_envelope_1 = envelope(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
Data_envelope_2 = envelope(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE) - 接下来，将这些包络合并，并为该组生成一个CSR估计值：
Pool_csr = pool(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
然后，对所有数据点运行Ripley's K函数：
Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, ratio = TRUE)
Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, ratio = TRUE) - 完成后，将Ripley's K值合并，并使用以下命令对其置信区间进行自助法估计：
Data pool = pool(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...) - 使用以下命令进行自助法分析：
Final_Ripleys_K = varblock(fun = Kest, Data_pool) - 绘制数据图形。
- 若需严格的统计学差异检验，可使用spatstat软件包中包含的学生化置换检验来检测点格局组之间的差异：
Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ group, nperm = np)。
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结果
此处使用图形用户界面（GUI）（图2A）分析了在3天体外培养（DIV）时，通过全内反射荧光（TIRF）显微镜观察表达VAMP2-pHluorin的三个神经元的胞吐事件。E15.5期皮层神经元被分离后，按照Winkle等（2016）和Viesselmann等（2011）11,12所述方案转染VAMP2-pHluorin并进行铺板。成像参数的方法学依据Urbina等（2018）2所述进行。简言之，采用TIRF显微镜每100 ms对神经元的基底质膜成像一次，持续2分钟。图2、图3、图4展示了分析胞吐事件的逐步操作指南。首先选择存放神经元图像的文件夹，并指定用于保存最终分析数据文件的目录（图2A
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讨论
使用胞吐检测与分析软件时，请注意该程序仅接受无损压缩的 .tif 文件作为输入。.tif 图像文件可以是 8 位、16 位或 32 位灰度（单通道）图像。其他图像格式必须在输入前转换为上述格式之一。作为参考，本文所用示例为 16 位灰度图像。
在自动检测过程中，时间序列图像集会进行自动背景扣除和光漂白校正处理。对于背景扣除，将掩膜文件中掩膜区域以外的像素在整幅图像的时间序列上取平均值，并从图像集中减去该平均值。对于光漂白校正，则对视频过程中掩膜内像素的平均荧光强度应用单指数衰减拟合，校正后的强度按如下方式调整：
校正后的强度 = （时间 t 时的强度）÷ exp(-k×t)，其中 k = 衰变常数
因此，在输入前无需进行预处理。然而，这些过程在很大程度上依赖图像掩膜来有效分离细胞与背景，因此获得一个准确的细胞掩膜是获得良好结果的必要条件。
自动细胞掩膜生成器需要具有足够信噪比（理想情况下，至少为平均背景信号标准差的2...
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披露
作者声明无任何披露事项。
致谢
感谢Dustin Revell和Reginald Edwards对代码和图形用户界面的测试。本研究由美国国立卫生研究院资助：包括R01NS112326（SLG）、R35GM135160（SLG）和F31NS103586（FLU）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R 核心团队 | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
参考文献
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- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743(2021).
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重印与许可
