Summary
Мы разработали автоматизированное программное обеспечение для компьютерного зрения для обнаружения экзоцитарных событий, отмеченных pH-чувствительными флуоресцентными зондами. Здесь мы демонстрируем использование графического пользовательского интерфейса и RStudio для обнаружения событий слияния, анализа и отображения пространственно-временных параметров слияния и классификации событий в различные режимы слияния.
Abstract
Замедленная TIRF-микроскопия pH-чувствительного GFP (pHluorin), прикрепленного к белкам SNARE везикул, является эффективным методом визуализации одиночных экзоцитарных событий в клеточной культуре. Для проведения непредвзятой, эффективной идентификации и анализа таких событий в MATLAB был разработан и внедрен подход, основанный на компьютерном зрении. Конвейер анализа состоит из алгоритма сегментации клеток и идентификации экзоцитарных событий. Подход компьютерного зрения включает в себя инструменты для исследования множественных параметров единичных событий, включая период полураспада флуоресценции и пик ΔF/F, а также общеклеточный анализ частоты экзоцитоза. Эти и другие параметры синтеза используются в классификационном подходе для различения различных режимов синтеза. Здесь недавно созданный графический интерфейс выполняет конвейер анализа от начала до конца. Дальнейшая адаптация K-функции Рипли в R Studio используется для различения кластеризованным, рассеянным или случайным возникновением событий слияния как в пространстве, так и во времени.
Introduction
Конструкции VAMP-pHluorin или конструкции рецептора трансферрина (TfR)-pHuji являются отличными маркерами экзоцитарных событий, поскольку эти pH-чувствительные флуорофоры гасятся в просвете кислых езикул и флуоресцируют сразу после открытия пор слияния между везикулой и плазматической мембраной1. После открытия пор синтеза флуоресценция распадается экспоненциально, с некоторой неоднородностью, которая раскрывает информацию о событии синтеза. Здесь описано приложение графического интерфейса пользователя (GUI), которое автоматически обнаруживает и анализирует экзоцитарные события. Это приложение позволяет пользователю автоматически обнаруживать экзоцитарные события, выявленные чувствительными к pH маркерами2, и генерировать признаки из каждого события, которые могут быть использованы для целей классификации3 (рисунок 1A). Кроме того, описан анализ кластеризации экзоцитарных событий с использованием K-функции Рипли.
Автоматизированная классификация экзоцитарных событий в различные экзоцитарные режимы была недавно сообщена3. Два режима экзоцитоза, полное везикулярное слияние (FVF) и слияние поцелуев (KNR), ранее были описаны4,5,6,7. Во время FVF пора слияния расширяется, и везикула включается в плазматическую мембрану. Во время KNR пора плавления временно открывается, а затем повторно засовывает4,5,8,9,10. Четыре режима экзоцитоза были идентифицированы в развивающихся нейронах, два из которых связаны с FVF и два связаны с KNR. Эта работа демонстрирует, что как FVF, так и KNR могут быть дополнительно подразделены на события синтеза, которые немедленно переходят к флуоресцентному распаду (FVFi и KNRi) после открытия пор синтеза или экзоцитарным событиям, которые проявляют задержку после открытия пор синтеза до начала распада флуоресценции (FVFd и KNRd)(рисунок 1B). Классификатор определяет режим экзоцитоза для каждого события слияния. Здесь этот анализ был включен в графический интерфейс, который может быть установлен в MATLAB в операционных системах windows и Mac. Все файлы анализа можно найти по адресу https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing или
https://github.com/GuptonLab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выберите наборы данных и каталог
- Чтобы выбрать наборы данных для анализа, нажмите кнопку Find Datasets (рисунок 2A,красное поле 1),чтобы перейти в папку, в которую депонируются данные (например, папка RawData). Файлы данных автоматически заполняют файлы данных в виде списка. В папке может быть несколько наборов данных.
- Нажмите кнопку Выбрать каталог и выберите каталог (например, Test), в который будут депонироваться анализируемые файлы(рисунок 2A,красное поле 2). Набор папок и готовых файлов анализа, а также промежуточные временные образы будут созданы в этом каталоге при нажатии кнопки Анализ. Ошибки будут вытекать, если каталог не выбран.
2. Установите размер пикселя и частоту кадров
- Заполните соответствующую частоту кадров и размер пикселя изображений в соответствующем поле «Частота кадров» или «Размер пикселя»(рисунок 2A,зеленое поле). Если значения не указаны (они установлены на «0» по умолчанию), то программа будет искать метаданные, связанные с файлом, на частоту кадров и размер пикселя. Если эти значения не могут быть найдены, программа по умолчанию будет использовать попиксель для измерения и для кадра для точек времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенном примере частота кадров составляет 100, а размер пикселя — 0,08.
3. Выберите или сделайте маски
- Используйте кнопку Mask Maker для автоматического создания масок ячеек для данных в списке наборов данных файлов(рисунок 2A,синий лист). При использовании кнопки Mask Maker будет создана новая папка в выбранном каталоге с именем MaskFiles. Индикатор «Пробежать» станет желтым во время бега и вернется к зеленому цвету после завершения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Маска для каждого файла в списке Файлы данных будет создана из первых 10 кадров файла изображения (или из всех кадров, если в файле изображения менее 10) и депонирована в папку MaskFiles с использованием правильной схемы именования (описанной ниже). - Убедитесь, что маски автоматически заполняют список Файлы масок. Пользователь может перейти непосредственно к анализу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда визуально проверяйте файлы масок и подтверждайте, что они захватывают всю интересуемую область. Первый кадр файла данных и файл маски отображаются в пользовательском интерфейсе при выборе. (Рисунок 2B). Mask Maker может выдавать ошибки в случае низкого уровня шума, поэтому проверка того, что файлы масок соответствуют, имеет решающее значение для контроля качества. - В качестве альтернативы использованию Mask Maker, если сигнал к шуму изображений недостаточен, создайте маски вручную в ImageJ.
- Сначала откройте файл необработанного изображения в ImageJ(рисунок 3A).
- Нажмите кнопку «Выделение полигонов» и нажмите, чтобы нарисовать маску вокруг ячейки. После завершения дважды щелкните последнюю точку, чтобы завершить полигон.
- После завершения перейдите в раздел Изменить | | выбора Создать маску (рисунок 3B). Новая перевернутая маска будет создана на основе полигональной чертежи. Сохраняйте маски в указанной папке MaskFiles в выбранном каталоге. Схема именования файлов маски должна соответствовать соответствующим отдельным файлам данных, за которыми следует «_mask_file». Например, если файл данных называется «VAMP2_488_WT_1.tif», соответствующий файл маски должен называться «VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif».
- Используйте кнопку Найти файлы масок для перехода к выбранной папке депонированных пользовательских файлов масок. Маски будут заполнять файлы масок в виде списка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно иметь маску для каждого файла данных перед запуском анализа.
4. Анализ и извлечение признаков
- После того, как каталог выбран и список файлов данных и список файлов mask заполнены, нажмите кнопку Analysis (рисунок 4A). Если требуется классификация экзоцитарных событий, перейдите к шагу 5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нажатие кнопки Анализ выполнит ряд автоматизированных задач по анализу данных. Он создаст отдельные папки в выбранном каталоге для депонирования проанализированных данных. Во время бега индикатор «пробега» изменится с зеленого на желтый(рисунок 4А,красное поле). После завершения анализа он изменится обратно на зеленый. - Найдите папку DataFiles(рисунок 4B)с полным набором файлов анализа (а также файлов извлечения объектов, которые будут использоваться в классификации позже), названных в соответствии с каждым файлом данных(рисунок 4C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Описание этих аналитических файлов приведено ниже в разделе «Репрезентативные результаты».
5. Классификация экзоцитарных событий
- Чтобы выполнить одновременную классификацию экзоцитарных событий с автоматическим обнаружением, установите флажок Классификация перед нажатием кнопки Анализ. Для каждого экзоцитического события присвойте оценке вероятности от 0 до 1 для каждого класса. Экзоцитическое событие считается классифицированным как один из четырех классов, если оценка вероятности для этого класса составляет > 0,5.
ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения анализа в выбранном каталоге появится новая папка с файлами данных. Папка будет содержать файлы анализа, соответствующие каждому файлу изображения.
6. Пространственно-временный анализ экзоцитоза с использованием значений K Рипли
- Создайте отдельный файл маски «нейрит» и «сома». Во-первых, сегментируйте сому от нейрита. Не существует непредвзятого метода сегментации сомы от нейритов, поэтому пользователь должен быть ослеплен экспериментом по обусловливаниям и использовать наилучшее суждение; предлагается эллипсоид без явных расширений нейритов.
- Открыть ImageJ/Фиджи.
- Перетащите файл маски или используйте | Откройте и выберите файл маски.
- Используйте инструмент палитры цветов и нажмите на любой из черных пикселей на фоне маски, чтобы установить черный цвет.
- Используйте инструмент выделения полигонов или от руки, чтобы нарисовать контур вокруг сомы, отделив ее от нейритов. Это требует ручного принятия решений.
- Нажмите Изменить | | выбора Сделать маску. Откроется новое изображение с обведенным сомой, сегментированной от остальной части изображения. Это создаст файл маски soma.
- Не перемещая нарисованную область, щелкните заголовок исходного файла маски.
- Нажмите Изменить | Заполните, чтобы заполнить обведенные сомы так, чтобы маской оставались только нейриты.
- После получения отдельных файлов нейритов и масок сохраните оба файла маски.
- Откройте «neurite_2D_network» в Матлабе.
- В MATLAB перейдите в каталог со всеми данными анализа.
- Измените путь "имя маски" на имя нейритной маски, т.е. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"
- Измените "csv_file_name" на "fluorescent_traces.csv файл", т.е. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".
- Нажмите кнопку Выполнить, чтобы скелетировать файл маски нейрита. При этом создается скелетонизированная версия файла маски нейрита и он депонируется как CSV-файл в папку maskfiles.
- Затем создайте CSV-файл для soma. Откройте «CSV_mask_creator.m» в Матлабе.
- Вставьте путь для "имени маски" к имени маски сомы, т.е. "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif
- Измените "writematrix" на csv имя создаваемого файла, т.е. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"
- Нажмите кнопку Выполнить. При этом будет создастся новый файл VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv.
- Повторите 6.14 для каждого файла маски.
7. Настройка RStudio
- Откройте Rstudio и откройте ripleys_k_analysis. R файл.
- Установите пакет "spatstat" в RStudio, перейдя в Tools | Установите пакеты и введите "spatstat" с последующим нажатием кнопки Установить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо выполнить только один раз для установки Rstudio. - Запускаем библиотеку spatstat в начале каждого сеанса.
- Обратите внимание на две основные переменные в этом случае: «neuron_mask» и «neuron_datapoints». Neuron Mask указывает на набор файлов масок для запуска, то есть файлы масок soma».
ПРИМЕЧАНИЕ: Запустите все файлы масок soma вместе, отдельно от файлов маски Neurite, и наоборот. - Прочитайте в .csv файлов масок для каждого из анализируемых нейронов.
- Запускайте несколько файлов одновременно, копируя дополнительные neuron_mask_n+1. Это позволит агрегировать анализ Рипли вместе, используя скрипт, описанный в разделе 8.
- Теперь проверьте вторую переменную, "neuron_datapoints".
- Читайте в». X_fluorescent_traces.csv" файл, сгенерированный программой анализа (по функциям всех extracted_R файл) с позициями x,y,t экзоцитических событий, а также нейрит-специфическим файлом позиций x,y для 2D-сети. Это идет в позиции «neuron_datapoints».
- В RStudio выберите код | | региона запуска Запустите все. Это генерирует несколько графиков, включая сгруппированные значения K Рипли, а также графики плотности.
- Сохраните участки, перейдя в Экспорт | Сохранить изображение как | Выберите соответствующий формат изображения и каталог, а затем введите соответствующее имя файла, затем нажмите кнопку Сохранить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Функция построения тепловых карт вызывается в скрипте с использованием "plot(density(soma_data,0.4))". Число «0,4» здесь показывает, насколько сглаженной должна быть функция плотности. Его можно изменить, чтобы он соответствовал пользовательским данным значимым образом, но если сравнение должно выполняться между различными тепловыми картами, число должно быть одинаковым между ними. - Экспорт или сохранение изображения из Rstudio. Если тепловая карта требует дальнейшего редактирования, выберите соответствующий тип файла (SVG или EPS).
8. Анализ Рипли
ПРИМЕЧАНИЕ: Ripleys_k_analysis. Файл R также автоматически генерировал графики k значений Рипли. Запуск всего скрипта автоматически запустит функции, упомянутые ниже, но он включен в детали, если кто-то хочет запустить каждую часть скрипта отдельно или внести изменения в анализ.
- Сначала запустите функцию оболочки для каждой ячейки. Эта функция имитировала полную пространственную случайность (CSR) для проверки значения K Рипли экзоцитарной точки события.
Data_envelope_1 = конверт (soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)
Data_envelope_2 = envelope(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE) - Затем объедините эти конверты вместе и создайте одну оценку КСО для группы:
Pool_csr = pool(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...)
Затем запустите функцию K Рипли для всех точек данных.
Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, ratio = TRUE)
Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, ratio = TRUE) - После завершения объедините значения K Рипли вместе и загрузите их доверительные интервалы с помощью следующей команды:
Data pool = pool(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...) - Начальная загрузка с помощью следующей команды:
Final_Ripleys_K = varblock(fun = Kest, Data_pool) - Построение данных.
- Если требуется жесткая статистическая разница, Studentised Permutation Test включается в пакет spatstat для проверки разницы между группами точечных паттернов:
Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ group, nperm = np).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь графический интерфейс(рисунок 2A)использовался для анализа экзоцитарных событий из трех VAMP2-pHluorin,экспрессирующих нейроны при 3 DIV с использованием микроскопии TIRF (полная флуоресценция внутреннего отражения). Корковые нейроны E15.5 были выделены с последующей трансфекцией VAMP2-pHluorin и покрытием с использованием протоколов, изложенных в Winkle et al., 2016 и Viesselmann et al., 201111,12. Методология параметров визуализации изложена в Urbina et al., 20182. Вкратце, микроскопия TIRF использовалась для изображения базальной плазматической мембраны нейронов каждые 100 мс в течение 2 мин. Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4 показывают пошаговое руководство по анализу экзоцитарных событий. Выбирается папка, в которой расположены изображения нейронов, и выбирается каталог для депонирований файлов данных окончательного анализа(рисунок 2A). С помощью функции MaskMaker для нейронов генерируется маска, которая проверяется в графическом интерфейсе(рисунок 2B). В этом случае клеточная маска хорошего качества, и анализ может продолжаться. Если маска недостаточна, маска может быть создана в ImageJ(рисунок 3). После использования функции MaskMaker или создания маски в ImageJ и выбора каталога, в котором расположены файлы маски, выполняется анализ(рисунок 4A). Результаты генерируются в папке DataFiles после завершения анализа (желтый индикатор меняется обратно на зеленый)(рисунок 4B).
Файлы данных автоматически создаются и именуются в соответствии с предоставленными файлами необработанных данных.
Предполагая, что файл данных называется X:
X_tracking: Этот файл включает в себя положение x, y и номер кадра каждого события, а также ограничителю, которые можно использовать для рисования полей вокруг каждого события. Возраст указывает на количество кадров после первоначального обнаружения, где событие является отдельной гауссовой пунктой. Если классификация проверена, в этом файле появятся результаты классификации, которые указывают на вероятность экзоцитарного события, принадлежащего к одному из четырех классов. Если вероятность больше 0,5 и больше других вероятностей, то был выбран экзоцитический класс.
X_fluorescent следы: Этот файл содержит положение x,y и номер кадра каждого события. Кроме того, он включает измерения интенсивности флуоресцентной лампы в интересующей области вокруг каждого события за 2 секунды до и 10 секунд после пика ΔF / F для каждого события (обозначено столбцами Timepoint).
X_cell_statistics: Этот файл включает в себя площадь ячейки, общее время изображения и автоматически вычисляемую частоту экзоцитарных событий для каждой клетки (в событиях / мм2/ минута).
Файлы извлечения компонентов включают в себя:
X_contrast: Контраст. Мера контраста интенсивности между пикселем и его соседом по всему изображению.
X_correlation: Корреляция. Мера того, насколько коррелирует пиксель со своим соседом по всему изображению.
X_energy Общая энергия. Определяется как квадратная сумма интенсивности пикселей.
X_homogeneity измеряет близость распределения элементов в ROI к диагонали ROI.
X_ring_fluorescence: средняя флуоресценция пограничных пикселей.
X_SD: Стандартное отклонение. Это определяется как стандартное отклонение ROI.
Примеры следов средней флуоресценции ± SEM из каждого экзоцитарного класса были построены из файла X_fluorescent следов(рисунок 5A). Используя файл Cell_statistics, частота экзоцитоза для каждого класса была построена для каждого нейрона(рисунок 5B). При нажатии флажка Классификация программа назначает каждое экзоцитическое событие классу, построенное на рисунке 5C. Следуя классификации, код анализа K Рипли был использован для определения того, являются ли экзоцитарные события случайными, сгруппированными или рассеянными в пространстве и времени. Сгенерированы тепловые карты плотности локализации экзоцитарных событий(рисунок 5D). Они показывают ожидаемые кластеризованные «горячие точки» в отдельных областях нейрона. Затем был выполнен K-анализ Рипли для сомы, нейрита и кластеризации с течениемвремени (рисунок 5E). Значение K Рипли и SEM (черная линия и синяя затененная область соответственно) поднимаются выше линии полной пространственной случайности (красная пунктирная линия), что предполагает статистически значимую кластеризацию.
Рисунок 1:Представление экзоцитарного анализа и классификации. (A) Схема конвейера анализа для графического интерфейса. Клетки сегментируются от фона до того, как экзоцитарные события идентифицируются и отслеживаются. Такие параметры, как пик ΔF/F и t1/2, рассчитываются на основе флуоресцентных следов экзоцитоза в ROI вокруг события до и после синтеза. (B)иллюстрация четырех режимов экзоцитоза и примеры монтажей изображений. После слияния события могут мгновенно переходить в FVF или KNR (FVFi и KNRi), или задержка может присутствовать до наступления судьбы слияния fvf или KNR (FVFd и KNRd). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Пошаговый пример анализа. (A) Сначала выбираются наборы данных (1., красное поле), и выбирается каталог для размещения файлов анализа (2., красное поле). Далее указываются частота кадров и размер пикселя (3., зеленое поле). Здесь использовался размер пикселя 0,08 мкм и частота кадров 100 мс. Затем нажимается функциональная кнопка MaskMaker (4., синяя рамка). Папка под названием "MaskFiles" автоматически создается в выбранном каталоге, содержащем файл маски для каждого файла изображения в наборе данных. (B) При загрузке наборов данных при выборе файла данных и/или файла маски будет отображаться первый кадр изображений для удобства сравнения (зеленое поле). Файлы масок могут быть не совсем правильными; этот файл маски может быть исправлен для ошибок, или новый файл маски может быть сделан вручную Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Создание файла маски вручную в ImageJ. (A) Сначала откройте файл для создания маски. Кнопка "Выбор полигона" выделена красным цветом. Щелкнув по краю ячейки, создается контур полигона. (B) Как создать маску из контура многоугольника. Выбрав Изменить | | выбора Create Mask, черно-белая маска будет создана из многоугольника (правое изображение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Анализ экзоцитарных событий. (A) Демонстрация кнопки анализа (оранжевая коробка) и запущенный анализ. Обратите внимание, что индикатор запуска становится желтым во время выполнения анализа. (B) Примеры файлов анализа, которые создаются в выбранном каталоге после завершения анализа. DataFiles содержат все файлы анализа экзоцитического события. (C) Файлы анализа, созданные в папке DataFiles. Цветные поля представляют открытые файлы на последующих изображениях. (D)Три открытых файла: «X_fluorescent_traces.csv» (красный) и «X_Cell_statistics» (зеленый) и «X_tracking» (синий). Флуоресцентные следы содержат положение x, y и номер кадра каждого события, а также интенсивность флуоресценции при каждой рентабельности инвестиций. Cell_statistics содержит сводную информацию о экзоцитарной статистике целых клеток, такую как частота экзоцитоза. X_tracking содержит информацию о положении и времени для каждого экзоцитарного события, а также вероятность каждого класса экзоцитоза для каждого события, представленную в виде числа от 0 до 1 (>0,5 указывает на то, что событие принадлежит к определенному классу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Репрезентативные результаты. (A) Средние следы флуоресценции +/- SEM из каждого экзоцитарного класса. (B) Частота событий, построенная для трех мышиных корковых нейронов для каждого экзоцитарного класса. Эти значения данных были построены из "X_Cell_statistics" с использованием классов, назначенных в "X_tracking". (C)Распределение классов экзоцитоза для тех же трех клеток, которые используются в А). Здесь строится соотношение каждого режима. (D)График плотности, на котором происходят экзоцитарные события, как сгенерировано в части протокола, в которой происходит K-анализ Рипли. Это можно интерпретировать как «тепловую карту» пространственной вероятности того, где происходят события. (E)K-анализ Рипли трех клеток, используемых для A) и B). Красная линия указывает, какое значение будет совершенно пространственно случайное распределение экзоцитарных событий. Черная линия указывает совокупное значение K Рипли для трех ячеек в этом примере, а синяя затененная область представляет доверительный интервал. Здесь затененная область заметно выходит за линию полной пространственной случайности между ~ 0,25-1 мкм, предполагая, что экзоцитарные события сгруппированы на этих расстояниях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При использовании программного обеспечения для обнаружения и анализа экзоцитов, пожалуйста, учитывайте, что программа принимает только сжатие без потерь .tif файлы в качестве входных данных. Файлы изображений .tif могут быть 8-битными, 16-битными или 32-битными изображениями в градациях серого (одноканальные). Другие форматы изображений должны быть преобразованы в один из этих типов перед вводом. Для справки здесь используются примеры 16-битных изображений в градациях серого.
Присущие автоматизированному процессу обнаружения наборы изображений таймлапса обрабатываются для автоматического вычитания фона и коррекции фотоотбеливания. Для вычитания фона пиксели за пределами маскируемой области файла маски усредняются за время спада всего изображения, а среднее значение вычитается из набора изображений. Для коррекции фотоотбеливания к средней флуоресценции пикселей в маске в течение видео применяется моноконциненциальная затухание с коррекцией интенсивности следующим образом:
Скорректированная интенсивность = (Интенсивность в момент времени t) ÷ exp-k×t, где k = константа распада
Поэтому предварительная обработка перед вводом не требуется. Эти процессы, однако, критически полагаются на маску изображения, чтобы эффективно отделить клетку от фона, и, таким образом, правильная маска клетки необходима для хороших результатов.
Для хорошей работы автоматизированному создателю маски ячейки требуется однородный сигнал с достаточным отношением сигнал/шум (в идеале, по крайней мере, в 2 раза больше стандартного отклонения среднего фонового сигнала). Эмпирически коробка CAAX, помеченная флуоресцентным белком, который вставляется в плазматическую мембрану при пренилировании, работает хорошо. Нет требования, чтобы сигнал мог поддерживаться на протяжении всего таймлапса визуализации экзоцитоза, так как подходящая маска может быть создана из высокого сигнала в первые 10 кадров последовательности. Однако, если морфология клеток значительно меняется во время парадигмы визуализации, следует проявлять осторожность.
При использовании программного обеспечения автоматического обнаружения включите частоту кадров и размер пикселя для точного временного и пространственного вывода. Если частота кадров или размер пикселя не объявлены, выходные данные будут на пиксель и на кадр. Как правило, диаметры везикул в развивающихся нейронах находятся в масштабе ~ 100 нм13,и, таким образом, автоматическое обнаружение событий может работать для везикул, похожих по размеру. В настоящее время нет жесткого ограничения на размер везикул, которые могут быть обнаружены (по площади пикселей), поскольку автоматическое обнаружение зависит от интенсивности гауссовой формы в большом диапазоне ширин Гаусса. Слияние везикул, меньших ширины пикселя, может быть точно обнаружено, если интенсивность события соответствует критерию сигнал-шум в 2 раза стандартному отклонению среднего фонового сигнала, поскольку флуоресцентная дифракция расширяется на несколько пикселей.
Эта программа была разработана для обнаружения экзоцитарных событий в развивающихся нейронах. Тем не менее, программное обеспечение было использовано для успешного обнаружения экзоцитарных событий в других клеточных линиях2,что указывает на надежность алгоритма обнаружения. Хотя мы использовали программное обеспечение для обнаружения экзоцитарных событий в ненейрональных типах клеток, различия в режиме экзоцитарных событий между типами клеток14 указывают на то, что алгоритм классификации может не подходить для других типов клеток. Экзоцитарные события в развивающихся нейронах были первоначально классифицированы с использованием трех различных методов: иерархической кластеризации, динамической деформации времени и анализа главных компонентов (PCA), выявляя четыре различных класса3. Здесь все три классификатора используются в графическом интерфейсе для классификации экзоцитических событий в один из этих установленных четырех классов. Для каждого экзоцитарного события для каждого из четырех возможных классов присваивается оценка вероятности от 0 до 1. Любой класс с оценкой вероятности > 0,5 считается классом этого класса. Эта классификация использовалась только в разработке нейронов до настоящего времени. Существуют ли эти классы в других типах клеток или в более поздних точках развития нейронов, неизвестно. Большое количество событий с оценками вероятности <0,5 для любого из классов предполагает, что процедура классификации может не подходить для оцениваемых в настоящее время экзоцитарных событий. Если низкие оценки вероятности присваиваются экзоцитарным событиям различных типов клеток, это говорит о том, что классификация de novo необходима, поскольку могут существовать новые или альтернативные режимы экзоцитоза. Те же методы классификации, которые используются здесь, должны быть применены к автоматически обнаруженным экзоцитарным событиям.
Для исследования пространственной и временной кластеризации экзоцитарных событий используется K-анализ15 Рипли. Анализ кластеризации нейронов включает в себя три отдельных анализа: один для сомы, один для нейритов и один для времени. Причина расщепления сомы и нейритов заключается в том, чтобы учесть крайнюю морфологию нейритов, которые часто достаточно тонкие, чтобы их можно было рассматривать как 2D-сеть и применять 2D-вариант K-анализа Рипли. Для временной кластеризации реализован 1D-анализ K Рипли. K-анализ Рипли является надежным методом обнаружения кластеризации точечных процессов и колокализации. График K Рипли можно интерпретировать так: значение K Рипли + доверительный интервал имеет 5% шанс выпасть за линию полной пространственной случайности в любой точке, аналогично p-значению 0,05. Если значение выходит за пределы линии полной пространственной случайности, экзоцитарные события группируются (выше CSR) или разделяются через равные промежутки времени (ниже CSR) на этих расстояниях (ось X).
Создание файла маски зависит от высокого начального сигнала-шума ячейки. Чувствительные к pH маркеры не всегда могут хорошо работать при освещении клетки, в зависимости от того, к какому белку прикреплен зонд. Другим вариантом создания файлов масок, если сигнал к шуму экзоцитарного маркера недостаточно выделяет границу ячейки, является использование второго флуоресцентного канала / изображения для создания маски. При использовании другого флуоресцентного маркера (tagRFP-CAAX, например) для создания масок, при выборе набора данных сначала перейдите в папку с изображениями, из которых можно сделать маски (например, папку, содержащую изображения tagRFP-CAAX). Используйте кнопку «Создатель масок» здесь. Важно отметить, что не забудьте переименовать файлы масок, чтобы они соответствовали анализируемым файлам экзоцитарных данных с помощью приведенной выше схемы именования (следуя приведенному выше примеру, файлы маски с именем «CAAX_1_mask_file.tif» необходимо будет переименовать в «VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif», чтобы соответствовать набору изображений VAMP2 для анализа). После присвоения файлам маски соответствующего имени вернитесь к кнопке Выбрать набор данных еще раз, чтобы перейти к файлам экзоцитарных наборов данных для анализа.
Обнаружение экзоцитоза удивительно чувствительно, и экзоцитарные события были точно обнаружены при соотношении сигнал/шум до ΔF/F 0,01. Чувствительность обнаружения частично зависит от дисперсии фоновой флуоресценции, и события менее 4 стандартных отклонений выше фонового сигнала не будут обнаружены.
Обнаружение экзоцитарных событий зависит от их преходящей природы. В качестве функции анализа переходных событий наш код обнаружения исследует 20-секундное окно вокруг экзоцитарного события. В некоторых типах клеток экзоцитоз поцелуев и поцелуев может «оставаться» в течение гораздо более длительного временного окна, чем в развивающихся нейронах, и автоматическое обнаружение может не надежно захватывать эти менее переходные события. Эта функция является легко изменяемой переменной для тех, кто чувствует себя комфортно с MATLAB. Подобно ограничению 20-секундной рентабельности инвестиций, экзоцитарные события, которые появляются, но не исчезают до последнего таймфрейма видео, могут не считаться истинным экзоцитозом, который может влиять на частоту, которая рассчитывается на основе всей длины временного ряда.
Включенный производитель масок автоматизирован по дизайну и хорошо работает при сегментировании сложных форм с фона; однако полностью автоматизированная конструкция ограничивает диапазон сигнал-шум и тип сигнала, которые могут быть использованы для автоматического создания маски. Если пользователь не может включить маркер флуоресцентной ячейки, который является однородным и имеет значительное отношение сигнал/шум, маску ячейки необходимо будет нарисовать вручную.
Пользовательский анализ экзоцитоза является трудоемким процессом и подвержен личной предвзятости, поскольку события не всегда четко отделены от других флуоресценций. Использование автоматизированной программы анализа для правильного выявления и анализа экзоцитарных событий непредвзятым образом повышает эффективность анализа и улучшает воспроизводимость и строгость.
Это обнаружение экзоцитарных событий работает не только для точного захвата чувствительной к рН флуоресценции в развивающихся нейронах, но и в других типах клеток (Urbina et al., 2018). Потребуется определить, работает ли классификация для других типов клеток. Будущие применения этого метода могут быть полезны при синапсах, в ненейрональных типах клеток или с новыми маркерами стыковки и слияния экзоцитарных везикул, такими как недавно описанный pHmScarlet16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что не раскрывают.
Acknowledgments
Мы благодарим Дастина Ревелла и Реджинальда Эдвардса за тестирование кода и графического интерфейса. Финансирование было предоставлено Национальными институтами здравоохранения, поддержали это исследование: в том числе R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) и F31NS103586 (FLU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
References
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L.
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).
