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Biochemistry

ग्रेनोबल में ईएमबीएल एचएचएक्स सुविधा में स्वचालित क्रिस्टलोग्राफी पाइपलाइन

Published: June 5, 2021 doi: 10.3791/62491
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3, 1, 1, 1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2
1European Molecular Biology Laboratory, 2ALPX S.A.S., 3Institut de Biologie Structurale

Summary

यहां, हम बताते हैं कि प्रोटीन-टू-स्ट्रक्चर, रैपिड लिगांड-प्रोटीन जटिल विश्लेषण और बड़े पैमाने पर खंड स्क्रीनिंग के लिए स्वचालित मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलोग्राफी पाइपलाइनों का उपयोग ईएमबीएल ग्रेनोबल में एचटीएक्स प्रयोगशाला में क्रिस्टलडायरेक्ट तकनीक पर आधारित कैसे किया जाए।

Abstract

ईएमबीएल ग्रेनोबल उच्च थ्रूपुट क्रिस्टलाइजेशन लेबोरेटरी (एचएचएक्स लैब) का संचालन करता है, जो दुनिया भर में उपयोगकर्ताओं को उच्च थ्रूपुट क्रिस्टलोग्राफी सेवाएं प्रदान करने वाली एक बड़े पैमाने पर उपयोगकर्ता सुविधा है। एचटीएक्स लैब में मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलोग्राफी में नए तरीकों के विकास में मजबूत फोकस है । एक उच्च थ्रूपुट क्रिस्टलाइजेशन प्लेटफॉर्म के संयोजन के माध्यम से, पूरी तरह से स्वचालित क्रिस्टल माउंटिंग और क्रायोकूलिंग के लिए क्रिस्टलडायरेक्ट तकनीक और क्रिम्स सॉफ्टवेयर हमने मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलोग्राफी के लिए पूरी तरह से स्वचालित पाइपलाइन विकसित की है जिसे इंटरनेट पर दूर से संचालित किया जा सकता है। इनमें नई संरचनाओं के निर्धारण के लिए प्रोटीन-टू-स्ट्रक्चर पाइपलाइन, औषधीय रसायन विज्ञान के समर्थन में प्रोटीन-लिगांड परिसरों के तेजी से लक्षण वर्णन के लिए एक पाइपलाइन, और एक बड़े पैमाने पर, स्वचालित खंड स्क्रीनिंग पाइपलाइन शामिल है जो १००० से अधिक टुकड़ों के पुस्तकालयों के मूल्यांकन को सक्षम करती है । यहां हम इन संसाधनों का उपयोग और उपयोग करने का वर्णन करते हैं।

Introduction

ऑटोमेशन को 10, 11, 12, 12, 12, 12, 12, 12, 12, 12, 12के नमूने के लिएकई प्रौद्योगिकियों सहित क्रिस्टलीकरण से लेकर विवर्तन डेटा संग्रह और प्रसंस्करण 1,2,3,4,6,7,8, 9,मैक्रोमॉलिकेकुलर क्रिस्टलोग्राफी प्रायोगिक प्रक्रिया के सभी चरणों में पेश किया गया है। ,13,14,15,16,17. इससे न केवल उस गति में तेजी आई है जिस पर क्रिस्टलीय संरचनाएं प्राप्त की जाती हैं बल्कि उन्होंने संरचना निर्देशित दवा डिजाइन 18 ,19, 20 ,21,22,23,24जैसे अनुप्रयोगों को सुव्यवस्थित करने में योगदान दिया है । इस पांडुलिपि में हम ग्रेनोबल में एचटीएक्स लैब में उपलब्ध स्वचालित क्रिस्टलोग्राफी पाइपलाइनों के कुछ पहलुओं के साथ-साथ अंतर्निहित प्रौद्योगिकियों का वर्णन करते हैं।

EMBL ग्रेनोबल में एचटीएक्स लैब यूरोप में क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग के लिए सबसे बड़ी अकादमिक सुविधाओं में से एक है । यह यूरोपीय फोटॉन और न्यूट्रॉन (ईपीएन) परिसर में यूरोपीय सिंक्रोट्रॉन विकिरण सुविधा (ईएसआरएफ) के साथ सह-स्थित है, जो दुनिया के कुछ सबसे शानदार एक्स-रे बीम और इंस्टीटयूट लॉई लैंगवेइन (ILL) का उत्पादन करता है, जो उच्च प्रवाह न्यूट्रॉन बीम प्रदान करता है। 2003 में संचालन की शुरुआत के बाद से एचटीएक्स प्रयोगशाला ने प्रति वर्ष 1000 से अधिक नमूनों और प्रक्रियाओं को 800 से अधिक वैज्ञानिकों और प्रक्रियाओं को सेवाएं प्रदान की हैं। एचटीएक्स लैब में मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलोग्राफी में नए तरीकों के विकास में मजबूत ध्यान दिया गया है, जिसमें नमूना मूल्यांकन और गुणवत्ता नियंत्रण25,26 और क्रिस्टलडायरेक्ट तकनीक के तरीके शामिल हैं, जिससे पूरी तरह से स्वचालित क्रिस्टल बढ़ते और प्रसंस्करण15,16,17को सक्षम किया जा सके। एचटीएक्स लैब ने क्रिस्टलोग्राफिक इंफॉर्मेशन मैनेजमेंट सिस्टम (CRIMS) भी विकसित किया है, जो एक वेब-आधारित प्रयोगशाला सूचना प्रणाली है जो क्रिस्टलीकरण और सिंक्रोट्रॉन डेटा संग्रह सुविधाओं के बीच स्वचालित संचार प्रदान करता है, जिससे शुद्ध प्रोटीन से विवर्तन डेटा तक पूरे नमूना चक्र पर निर्बाध सूचना प्रवाह सक्षम होता है। एचटीएक्स सुविधा, क्रिस्टलडायरेक्ट तकनीक और क्रिम्स सॉफ्टवेयर की क्षमताओं के संयोजन के माध्यम से, हमने क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग, क्रिस्टल अनुकूलन, स्वचालित क्रिस्टल हार्वेस्टिंग प्रोसेसिंग प्रोसेसिंग और क्रायोकूलिंग और एक्स-रे डेटा संग्रह को एक एकल और निरंतर कार्यप्रवाह में एकीकृत करने वाली पूरी तरह से स्वचालित प्रोटीन-टू-स्ट्रक्चर पाइपलाइन विकसित की है जिसे एक वेब ब्राउज़र के माध्यम से दूर से संचालित किया जा सकता है। इन पाइपलाइनों को नई संरचनाओं के तेजी से निर्धारण, प्रोटीन-लिगांड परिसरों के लक्षण वर्णन और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के माध्यम से बड़े पैमाने पर यौगिक और टुकड़ा स्क्रीनिंग का समर्थन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

एचटीएक्स प्रयोगशाला एक गैर-व्यवसीय क्रिस्टलीकरण रोबोट (एक एलसीपी मॉड्यूल सहित जो घुलनशील और झिल्ली प्रोटीन दोनों के क्रिस्टलीकरण को सक्षम बनाता है), क्रिस्टल फार्म (5 डिग्री सेल्सियस और 20 डिग्री सेल्सियस पर), क्रिस्टलीकरण स्क्रीन तैयार करने के लिए दो रोबोट लिक्विड हैंडलिंग स्टेशन, और दो स्वचालित क्रिस्टलडायरेक्ट क्रिस्टल हार्वेस्टर से लैस है, जो प्रति परिचालन चक्र 400 जमे हुए नमूना पिन ों को उत्पादन और स्टोर करने की क्षमता रखता है। वैज्ञानिक अपने नमूनों को एक्सप्रेस कूरियर द्वारा सुविधा के लिए भेजते हैं, जो तब एचएचएक्स लैब में समर्पित तकनीशियनों द्वारा संसाधित किए जाते हैं । वैज्ञानिक CRIMS प्रणाली द्वारा प्रदान किए गए वेब इंटरफेस के माध्यम से क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग और अनुकूलन प्रयोगों को दूरस्थ रूप से डिजाइन कर सकते हैं। इस इंटरफ़ेस के माध्यम से, वे अपनी विशिष्ट नमूना आवश्यकताओं को फिट करने के लिए सुविधा पर उपलब्ध मापदंडों और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की एक विस्तृत श्रृंखला में से चुन सकते हैं। सभी प्रयोगात्मक मापदंडों के साथ परिणाम क्रिम्स के माध्यम से वास्तविक समय में उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध कराए जाते हैं। प्राप्त सभी नमूनों को एक विशेष रूप से विकसित विधि के माध्यम से परख दिया जाता है जो नमूने25 , 26,27के क्रिस्टलीकरण की संभावना का अनुमान लगाने में सक्षम बनाता है । इस परख के परिणामों के आधार पर इष्टतम इनक्यूबेशन तापमान और संभावित नमूना अनुकूलन प्रयोगों से संबंधित उपयोगकर्ताओं के लिए विशिष्ट सिफारिशें की जाती हैं। एक बार क्रिस्टलीकरण प्रयोग स्थापित होने के बाद, वैज्ञानिक वेब के माध्यम से विभिन्न समय बिंदुओं पर एकत्र क्रिस्टलीकरण छवियों को देखकर परिणामों का मूल्यांकन कर सकते हैं। जब एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए उपयुक्त क्रिस्टल की पहचान की जाती है, तो वैज्ञानिक एक क्रिस्टल माउंटिंग प्लान स्थापित करने के लिए एक समर्पित इंटरफ़ेस का उपयोग कर सकते हैं जिसे क्रिस्टलडायरेक्ट रोबोट द्वारा निष्पादित किया जाएगा।

क्रिस्टलडायरेक्ट तकनीक एक संशोधित वाष्प प्रसार क्रिस्टलीकरण माइक्रोप्लेट के उपयोग और एक लेजर बीम पर आधारित है जो क्रिस्टलीकरण और डेटा संग्रह 15 ,16,17के बीच मौजूद स्वचालन अंतर को बंद करने का समर्थन करता है । संक्षेप में, क्रिस्टल एक संशोधित वाष्प प्रसार प्लेट, क्रिस्टलडायरेक्ट माइक्रोप्लेट में उगाए जाते हैं। एक बार क्रिस्टल दिखाई देते हैं क्रिस्टलडायरेक्ट हार्वेस्टिंग रोबोट स्वचालित रूप से क्रिस्टल युक्त फिल्म के टुकड़े को उत्पादित करने के लिए एक लेजर बीम लागू करता है, इसे एक मानक विवर्तन डेटा संग्रह पिन से जोड़ता है, और इसे नाइट्रोजन गैस स्ट्रीम में क्रायो-कूल करता है (जैंडर एट अल 2016 और https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 देखें)। इस तकनीक में मैनुअल या अर्ध-स्वचालित क्रिस्टल बढ़ते प्रोटोकॉल पर कई अतिरिक्त फायदे हैं। उदाहरण के लिए, क्रिस्टल का आकार और आकार एक मुद्दा नहीं है, जिससे बड़े क्रिस्टल या माइक्रोक्रिस्टल फसल करना समान रूप से आसान हो जाता है, अक्सर क्रायो-प्रोटैंट्स के उपयोग से बचना संभव होता है, विशेष तरीके से जिसमें प्रौद्योगिकी संचालित होती है (संदर्भ 17, जैंडर एट अल देखें), एक्स-रे विवर्तन विश्लेषण को बहुत अधिक सरल बनाती है। लेजर-बीम का उपयोग एक शल्य चिकित्सा उपकरण के रूप में भी किया जा सकता है ताकि नमूने के सर्वोत्तम हिस्सों का चयन किया जा सके जब क्रिस्टल समूहों पर बढ़ते हैं या उदाहरण के लिए एपीटैक्सियल विकास दिखाते हैं। क्रिस्टलडायरेक्ट तकनीक का उपयोग स्वचालित भिगोने वाले प्रयोगों के लिए भी किया जा सकता है17. छोटे अणुओं या क्रिस्टल के लिए अन्य रसायनों के साथ समाधान का वितरण। इस प्रकार यह पूरी तरह से स्वचालित, बड़े पैमाने पर यौगिक और खंड स्क्रीनिंग का समर्थन करने में सक्षम बनाता है। एक बार क्रिस्टल को क्रिस्टलडायरेक्ट रोबोट द्वारा काटा और क्रायोकल किया जाता है, उन्हें या तो स्पाइन या यूनिपक पक में स्थानांतरित कर दिया जाता है जो दुनिया भर में सबसे सिंक्रोनी मैक्रोमॉलिक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी बीमलाइन के साथ संगत होते हैं। यह प्रणाली पूरी तरह से स्वायत्त तरीके से 400 पिन (क्रायोजेनिक भंडारण देवर की क्षमता) तक फसल कर सकती है। CRIMS प्रक्रिया के दौरान हार्वेस्टर रोबोट के साथ संचार करता है और क्रिस्टल नमूनों (पक और पिन) की स्वचालित ट्रैकिंग प्रदान करता है। पक को बारकोड और आरएफआईडी टैग दोनों के साथ चिह्नित किया जाता है ताकि नमूना प्रबंधन21,28को सुविधाजनकबनाया जासके ।

CRIMS यूरोप और दुनिया29में कई सिंक्रोट्रॉन पर एक्स-रे डेटा संग्रह प्रबंधन और प्रसंस्करण का समर्थन करने वाले आईएसपीईबी सिस्टम के साथ स्वचालित संचार का समर्थन करने वाला एक एप्लिकेशन प्रोग्राम इंटरफेस (एपीआई) प्रदान करता है। स्वचालित क्रिस्टल हार्वेस्टिंग पूरा होने के बाद, वैज्ञानिक क्रिस्टल नमूनों (पक) का चयन कर सकते हैं और ईएसआरएफ (ग्रेनोबल, फ्रांस)7,8,9 या पेट्रा III सिंक्रोट्रॉन (हैम्बर्ग, जर्मनी)18,19में मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलोग्राफी बीमलाइन के लिए नमूना लदान बना सकते हैं। CRIMS पूर्व-चयनित डेटा संग्रह मापदंडों के साथ सिंक्रोट्रॉन सूचना प्रणाली में चयनित बीमलाइन नमूनों के अनुरूप डेटा स्थानांतरित करते हैं। एक बार नमूने चयनित सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन पर पहुंचते हैं, तो एक्स-रे डेटा संग्रह या तो मैन्युअल रूप से, रिमोट बीमलाइन ऑपरेशन के माध्यम से या पूरी तरह से स्वचालित तरीके से किया जाता है (यानी, संयुक्त ईएमएल ईएसआरएफ ज्वाइंट स्ट्रक्चरल बायोलॉजी ग्रुप (जेएसबीजी) द्वारा संचालित ईएसआरएफ8 के मासिफ-1 बीमलाइन पर। डेटा संग्रह के बाद CRIMS सिंक्रोट्रॉन डेटा प्रोसेसिंग सिस्टम द्वारा किए गए प्रारंभिक डेटा प्रोसेसिंग परिणामों के साथ डेटा संग्रह के परिणामों के बारे में स्वचालित रूप से जानकारी प्राप्त करता है और इसे एक सुविधाजनक उपयोगकर्ता इंटरफेस के माध्यम से वैज्ञानिक को प्रस्तुत करता है।

एचटीएक्स लैब तीन अलग-अलग अनुप्रयोगों, नई संरचनाओं के तेजी से निर्धारण, प्रोटीन-लिगांड परिसरों के तेजी से लक्षण वर्णन और बड़े पैमाने पर यौगिक और टुकड़ा स्क्रीनिंग का समर्थन करने के लिए इन स्वचालित पाइपलाइनों को लागू करती है। नीचे हम उनका उपयोग करने और संचालित करने के तरीके का वर्णन करते हैं।

Protocol

नोट: दुनिया भर में वैज्ञानिकों के लिए इन पाइपलाइनों के लिए वित्त पोषित उपयोग धन कार्यक्रमों की एक श्रृंखला के माध्यम से समर्थित है । उपयोग के लिए इस पांडुलिपि अनुप्रयोगों को लिखने के समय या तो iNEXT डिस्कवरी कार्यक्रम (https://inext-discovery.eu), एक यूरोपीय सुविधा नेटवर्क के माध्यम से स्वीकार किए जाते है अनुवाद संरचनात्मक जीव विज्ञान 20 यूरोपीय आयोग या निर्देश के क्षितिज२०२० कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित प्रोत्साहित करने के लिए या https://instruct-eric.eu/ एरिक (https://instruct-eric.eu/) । किसी विशेष समय पर वित्त पोषित पहुंच के लिए वर्तमान तौर-तरीकों और मार्गों के लिए संबंधित लेखक से संपर्क करें। यह प्रोटोकॉल प्रोटीन-टू-स्ट्रक्चर पाइपलाइन के संचालन का वर्णन करता है और इसमें हमारी सभी पाइपलाइनों के लिए आम कदम शामिल हैं जबकि अन्य दो पाइपलाइनों के लिए विशिष्टताओं पर निम्नलिखित खंड में चर्चा की जाती है । यहां निर्देश CRIMS V4.0 को देखें ।

1. हाई थ्रूपुट क्रिस्टलाइजेशन लेबोरेटरी

  1. शुरू करने से पहले क्रिम्स सिस्टम के जरिए एचटीएक्स लैब में रजिस्ट्रेशन के लिए https://htxlab.embl.fr/#/। उपयोगकर्ता साख सभी प्रयोगात्मक डिजाइन और मूल्यांकन इंटरफेस के लिए दूरस्थ पहुंच प्रदान करते हैं।
    1. एक वेब नेविगेटर (फ़ायरफ़ॉक्स, क्रोम और सफारी समर्थित हैं) के माध्यम से CRIMS में लॉग इन करें। CRIMs वेब सर्वर डेटा तक पहुंचने से तीसरे पक्ष को रोकने के लिए एन्क्रिप्टेड है, जबकि यह वेब के माध्यम से यात्रा करता है । एक बार CRIMS में, स्क्रीनिंग के बाईं ओर मेनू की एक श्रृंखला नमूने का प्रबंधन और निर्माण करने में मदद करती है, क्रिस्टलीकरण प्रयोगों का अनुरोध करती है, प्लेटों का प्रबंधन और कल्पना करती है, आदि। वीडियो ट्यूटोरियल की एक श्रृंखला https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d पर उपलब्ध हैं।
      नोट: कूरियर द्वारा नमूने भेजने वाले उपयोगकर्ताओं को नमूने भेजने से पहले CRIMS के माध्यम से नमूने और अनुरोध क्रिस्टलीकरण प्रयोगों को पंजीकृत करने की आवश्यकता होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि आगमन पर देरी के बिना उन्हें संसाधित किया जा सकता है। कृपया शिपमेंट विवरण htx@embl.fr को भेजें।
  2. एक वेब ब्राउज़र के साथ CRIMS (https://htxlab.embl.fr) में लॉग इन करें और नमूने मेनूपर क्लिक करें । इससे प्रोजेक्ट और सैंपल मैनेजमेंट टूल्स के साथ इंटरफेस खुलेगा।
  3. नए नमूना बटन पर क्लिक करें और अनुरोध की गई जानकारी प्रदान करें। CRIMS विभिन्न परियोजनाओं, लक्ष्यों और निर्माणों के तहत नमूनों को व्यवस्थित करने की अनुमति देता है। मौजूदा लोगों को नमूना असाइन करें या इस बिंदु पर नए बनाएं।
  4. एक बार अनुरोधित जानकारी सेव एंड मेक रिक्वेस्टपर क्लिक करें दर्ज हो जाने के बाद । क्रिस्टलीकरण प्रोटोकॉल, क्रिस्टलीकरण स्क्रीन का उपयोग करने के लिए, इनक्यूबेशन तापमान और प्रयोगों के लिए वांछित तिथि का चयन करें।
    1. HTX लैब ऑपरेटरों को जानने के लिए महत्वपूर्ण नमूनों के बारे में संकेत प्रदान करने के लिए टिप्पणी क्षेत्रों का उपयोग करें। कस्टम स्क्रीन का भी चयन किया जा सकता है (नीचे देखें)। क्रिस्टलीकरण अनुरोध प्रस्तुत करने के बाद इसे एचएचएक्स लैब टीम द्वारा मान्य किया जाएगा और प्रयोगों के शेड्यूलिंग के बारे में पुष्टि ई-मेल के माध्यम से भेजी जाएगी। नमूना शिपमेंट के लिए आवश्यक समय के साथ संगत हैं कि प्रयोग तिथियों का चयन करने के लिए सुनिश्चित करें।
  5. एक बार नमूने एचएचएक्स लैब में सुविधा ऑपरेटरों में आने के बाद अनुरोध के अनुसार प्रयोग करेंगे । एक बार क्रिस्टलीकरण प्रयोग स्थापित होने के बाद, पुष्टि ई-मेल के माध्यम से भेजी जाएगी और क्रिस्टलीकरण ट्रे स्वचालित इमेजर्स को स्थानांतरित कर दी जाएगी। CRIMS सभी प्रयोगात्मक मापदंडों तक पहुंच प्रदान करता है और स्वचालित रूप से नए इमेजिंग सत्रों को ट्रैक करेगा। नई इमेज उपलब्ध होने पर ई-मेल नोटिफिकेशन अपने आप भेज दिया जाएगा। सुविधा25, 26पर विकसित प्रोटोकॉल के आधार पर एक थर्मोफ्लोर आधारित30 नमूना गुणवत्ता मूल्यांकन प्रयोग इस बिंदु पर हर नमूने के साथ कियाजाता है और CRIMS के माध्यम से उपलब्ध होगा ।
  6. नमूना गुणवत्ता मूल्यांकन के परिणामों के साथ क्रिस्टलीकरण प्रयोगों की छवियां क्रिस्टलीकरण ट्रे स्थापित होने के कुछ ही समय बाद CRIMS में उपलब्ध होंगी। थर्मोफ्लोर मेनू पर क्लिक करें और नमूना गुणवत्ता मूल्यांकन प्रयोग के परिणामों को देखने के लिए नमूने पर नेविगेट करें।
    1. क्रिस्टलीकरण प्लेटों से छवियों को देखने के लिए प्लेट्स मेनू पर क्लिक करें। नमूने पर नेविगेट करें और या तो पिछले इमेजिंग सत्र को देखने के लिए देखें पर क्लिक करें या एक अलग इमेजिंग सत्र का चयन करने के लिए + (विस्तार) प्रतीक पर। उपकरणों की एक श्रृंखला नमूनों के माध्यम से आसानी से खोजने और नेविगेट करने में मदद करता है। उदाहरण के लिए, स्क्रीन के शीर्ष पर एक परियोजना बॉक्स में क्लिक करना उस परियोजना के लिए नमूनों को फ़िल्टर करता है और अधिकांश टेबल कॉलम के लिए खोज फ़ंक्शन उपलब्ध हैं।
  7. क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के परिणामों का मूल्यांकन करने और स्कोर करने में मदद करने के लिए प्लेट व्यू इंटरफ़ेस का उपयोग करें। यह क्रिस्टलीकरण प्लेटों के विभिन्न कुओं के माध्यम से नेविगेशन की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए छवि प्रकार (यानी, विस, यूवी), चुनिंदा छवि संकल्प या रिकॉर्ड स्कोर का चयन करता है। यह इंटरफ़ेस क्रिस्टलीकरण समाधानों की संरचना सहित क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी प्रयोगात्मक मापदंड भी प्रदान करता है।
  8. प्रारंभिक स्क्रीनिंग के माध्यम से पहचानकी गई प्राथमिक हिट स्थितियों के आधार पर क्रिस्टल अनुकूलन स्क्रीन डिजाइन करने के लिए शोधन मेनू पर क्लिक करें। रसायन और स्टॉक समाधान उपमेनस एक पंजीकरण और क्रिस्टलीकरण स्टॉक समाधान का प्रबंधन करने के लिए अनुमति देते हैं । स्क्रीन सबमेन्यू अपने स्वयं के अनुकूलन या कस्टम स्क्रीन को डिजाइन करने के लिए एक इंटरफ़ेस तक पहुंच प्रदान करता है।
    1. प्लेट प्रकार, स्टॉक समाधान या ढाल विन्यास का चयन करें जो प्रयोगात्मक डिजाइन को सबसे अच्छा फिट करते हैं। क्रिम्स को फॉर्मेक्टर रोबोट (फॉर्मूलाट्रिक्स) के साथ सीधे संगत फ़ाइल को आउटपुट करने के लिए पूछना संभव है ताकि स्क्रीन को प्लेट में स्वचालित रूप से पिपेट किया जा सके या मैनुअल ऑपरेशन के लिए वॉल्यूम के साथ प्रिंट करने योग्य दस्तावेज़ आउटपुट किया जा सके।
  9. क्रिस्टल अनुकूलन प्रयोगों को पूरा करने के लिए चरण 1.2-1.8 के माध्यम से पुन: निर्धारित करें।
  10. एक बार एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए उपयुक्त क्रिस्टल की पहचान कर रहे हैं, प्लेट व्यू इंटरफेस के लिए नेविगेट और सही क्रिस्टलीकरण ड्रॉप के अनुरूप छवि का चयन करें । प्री-स्टोर किए गए स्कोर आपको आसानी से ऐसा करने में मदद करेंगे।
    1. क्रिस्टलडायरेक्ट हार्वेस्टर रोबोट के लिए एक स्वचालित क्रिस्टल हार्वेस्टिंग योजना रिकॉर्ड करने के लिए क्रिस्टल हार्वेस्टिंग पर या पारंपरिक मैनुअल क्रिस्टल माउंटिंग के लिए मैनुअल हार्वेस्टिंग पर क्लिक करें, यदि क्रिस्टलडायरेक्ट से सुसज्जित नहीं है, तो CRIMS का उपयोग करते हुए। दोनों इंटरफेस क्रिस्टल हार्वेस्टिंग प्रक्रिया के माध्यम से उपयोगकर्ता का मार्गदर्शन करेंगे। CRIMS स्वचालित रूप से रिकॉर्ड और काटा क्रिस्टल के स्थान या तो रीढ़ या Unipucks21में स्टोर करेगा ।
  11. CRIMS में क्रिस्टल प्रबंधक मेनू का चयन करें। जमे हुए नमूनों का निरीक्षण करने के लिए काटा क्रिस्टल उपमेनू पर क्लिक करें । क्रिस्टलडायरेक्ट हार्वेस्टर का उपयोग करते समय, कटाई प्रक्रिया की छवियां प्रस्तुत की जाती हैं, जिसमें काटे गए क्रिस्टल के साथ पिनों की छवियां शामिल हैं।
  12. ईएसआरएफ या पेट्रा III सिंक्रोट्रॉन से जुड़ने और एक्स-रे विवर्तन विश्लेषण के लिए नमूना शिपमेंट्स बनाने के लिए शिपमेंट्स मेनू का चयन करें। क्रिएट शिपमेंट बटन पर क्लिक करें और उस सिंक्रोट्रॉन का चयन करें जिसे आप इस्तेमाल करना चाहते हैं और बैग नंबर (सिंक्रोट्रॉन पर बैग पासवर्ड यहां आवश्यक है)। इंटरफ़ेस की अगली श्रृंखला का उपयोग शिपमेंट में शामिल होने के लिए पीयूकेएस का चयन करने के लिए किया जाता है। सिस्टम डेटा संग्रह का समर्थन करने और मासिफ-1 जैसे स्वचालित बीमलाइन के लिए डेटा संग्रह मापदंडों का निर्धारण करने के लिए टिप्पणियां प्रदान करना संभव बनाता है।
  13. यदि ईएसआरएफ या पेट्रा III एचएचएक्स लैब में डेटा संग्रह किया जा रहा है, तो ऑपरेटर नमूनों को बीमलाइन में स्थानांतरित कर देंगे, अन्य सिंक्रोट्रॉन पर डेटा संग्रह उपयोगकर्ता के अपने खर्च पर किया जाएगा। रिमोट बीमलाइन ऑपरेशन के माध्यम से या मासिफ-1 पर सिंक्रोट्रॉन की यात्रा करके डेटा एकत्र करना संभव है। बाद के मामले में, डेटा संग्रह प्रक्रिया पूरी तरह से स्वचालित है। सिंक्रोट्रॉन में, आईएसपीईबी29 में विशिष्ट इंटरफेस उपयोगकर्ताओं को CRIMS द्वारा भेजी गई जानकारी को ठीक करने और नमूना पक को संबद्ध करने की अनुमति देते हैं ताकि डेटा संग्रह के परिणाम स्वचालित रूप से ट्रैक किए जा सकें। यहां वर्णित प्रयोगों के लिए, सिंक्रोट्रॉन में डेटा संग्रह आमतौर पर एमएक्सक्यूब31 सॉफ्टवेयर के साथ किया जाता था, जबकि डेटा प्रोसेसिंग और संरचना शोधन अटुओप्रोसी32,स्टारनिंसो33, बस्टर33,पिप्रीम32,33 औरकूट 35के साथ किया गया था।
  14. एक बार डेटा संग्रह प्रयोग किए जाने के बाद CRIMS आईएसपीबी29 सिस्टम से सिंक्रोट्रॉन में प्रारंभिक डेटा प्रसंस्करण के परिणामों के साथ सारांश जानकारी प्राप्त करता है। CRIMS क्रिस्टल प्रबंधक मेनू पर जाएं और क्रिस्टल विवर्तन डेटा सब मेनू पर क्लिक करें। विवर्तन डेटा संग्रह के संबंध में सभी जानकारी और मेटाडेटा उपलब्ध है। सिंक्रोट्रॉन के साथ-साथ कच्चे विवर्तन छवियों से प्रोसेस्ड डेटा डाउनलोड करना भी संभव है। कई डेटा संग्रह देखें या विशिष्ट डेटासेट चुनें। नमूना प्रबंधन उपकरण विशिष्ट परियोजनाओं के निर्माण के लिए नमूनों को नेविगेट और चयन करना संभव बनाते हैं।
    नोट: यह पाइपलाइन शुद्ध प्रोटीन से एक्स-रे विवर्तन परिणामों के लिए इंटरनेट पर पूरी तरह से स्वचालित संचालन प्रदान करती है और एक ही समय में एक या कई नमूनों के साथ संचालित किया जा सकता है। यह संरचनात्मक जीव विज्ञान में विभिन्न संदर्भ और परियोजना प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है।

Representative Results

ऊपर वर्णित स्वचालित क्रिस्टलोग्राफी पाइपलाइन को उल्लेखनीय सफलता के साथ बड़ी संख्या में आंतरिक और बाहरी परियोजनाओं का समर्थन करने के लिए लागू किया गया है। कुछ हाइलाइट्स में Djinović-Carugo से परियोजना और मैक्स पेरुर्ट्ज प्रयोगशालाओं (वियना) से सह-कार्यकर्ता शामिल हैं जो एक जीवाणु रोगजनक के विकास के लिए आवश्यक एक डिपप्टिडिल पेप्टिडास के संरचनात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करते हैं। क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग, विवर्तन मूल्यांकन, क्रिस्टल अनुकूलन और एक्स-रे डेटा संग्रह चक्र (इस परियोजना के लिए 8 पुनरावृत्तियों तक) का तेजी से उत्तराधिकार कुछ ही हफ्तों में प्रोटीन के तीन अलग-अलग अनुरूप राज्यों के लिए संरचनात्मक मॉडल प्राप्त करने में सक्षम था, जिसने प्रोटीन36 के इस वर्ग के कार्य पर महत्वपूर्ण मशीनी समझ प्रदान की (चित्रा 1देखें)।

एक अन्य उदाहरण बायोमेडिकल रिसर्च संस्थान (आईआरबी, बार्सिलोना) से मैकियस और सह-कार्यकर्ताओं से है जो सेल भाग्य विनियमन में शामिल SMAD3 और SMAD4 प्रतिलेखन कारकों के लिए नए डीएनए बाध्यकारी रूपांकनों की पहचान करने के लिए जैव सूचना उपकरण और संरचनात्मक दृष्टिकोण को संयुक्त करता है। इस कार्य ने विभिन्न डीएनए बाध्यकारी रूपांकनों३७,३८ के साथ परिसर में SMAD3 और 4 की 6 उच्च संकल्प संरचनाओं का उत्पादन कियाहै,जो डीएनए दृश्यों की विविध सरणी को पहचानने और उसके लिए बाध्य करने के लिए इन प्रतिलेखन कारकों की अब तक पहले से न सोचा हुआ क्षमता का खुलासा करता है, जो विभिन्न जैविक संदर्भों में उनके कार्य की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है । इन प्रौद्योगिकियों को फार्मा और बायोटेक कंपनियों में अनुसंधान समूहों से दवा डिजाइन परियोजनाओं के संदर्भ में मालिकाना अनुसंधान का समर्थन करने के लिए भी लागू किया गया है । उदाहरण के लिए, इन पाइपलाइनों द्वारा योगदान की गई तेजी के लिए धन्यवाद, कई लिगांड-लक्ष्य परिसरों का संरचनात्मक विश्लेषण दिनों के भीतर प्राप्त किया जा सकता है, जो दवा विकास के संदर्भ में लगातार दौर औषधीय रसायन अनुकूलन का समर्थन करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। अंत में हमने बड़े पैमाने पर एक्स-रे आधारित खंड स्क्रीनिंग39के लिए इस बुनियादी ढांचे को भी लागू किया है।

Figure 1
चित्रा 1:स्वचालित क्रिस्टलोग्राफी पाइपलाइन। क्रिस्टलडायरेक्ट तकनीक और ईएसआरएफ में मासिफ-1 बीमलाइन के साथ CRIMS सॉफ्टवेयर सहित ईएमबीएल एचटीएक्स लैब का एकीकृत संचालन और CRIMS और ISPyB सॉफ्टवेयर के बीच स्वचालित संचार पूरी तरह से स्वचालित, रिमोट नियंत्रित प्रोटीन-टू-स्ट्रक्चर पाइपलाइन को क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग और अनुकूलन, स्वचालित क्रिस्टल हार्वेस्टिंग और क्रायो-कूलिंग और स्वचालित डेटा संग्रह और प्रसंस्करण को एकीकृत करने में सक्षम बनाता है। संरचनात्मक मॉडल इन पाइपलाइन36को लागू करके रिकॉर्ड समय में पहचाने गए रोगजनक जीवाणु से प्रोटीज की तीन अलग - अलग संरचनाओं के अनुरूप होते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां वर्णित स्वचालित क्रिस्टलोग्राफी पाइपलाइनों विभिन्न धन कार्यक्रमों के माध्यम से दुनिया भर में शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध हैं । वर्तमान में, क्रिस्टलीकरण प्रयोगों और क्रिस्टलडायरेक्ट तकनीक के लिए वित्त पोषित पहुंच को iNEXT डिस्कवरी कार्यक्रम और निर्देश-एरिक पर लागू करके प्राप्त किया जा सकता है, जबकि ईएसआरएफ में मैक्रोमॉलिक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी बीमलाइन तक पहुंच ईएसआरएफ उपयोगकर्ता पहुंच कार्यक्रम के माध्यम से समर्थित है। यह दृष्टिकोण क्रिस्टल विकास और माप के बीच देरी को कम करता है, बहुत चुनौतीपूर्ण परियोजनाओं की प्रगति को तेज करता है जिसके लिए प्रोटीन उत्पादन और क्रिस्टलीकरण स्थितियों के विवर्तन-आधारित अनुकूलन की आवश्यकता होती है और वैज्ञानिकों को क्रिस्टलीकरण, क्रिस्टल हैंडलिंग और बीमलाइन ऑपरेशन से जुड़े जटिल संचालन से मुक्त करता है, क्रिस्टलोग्राफी को गैर-विशेषज्ञ समूहों के लिए अधिक सुलभ प्रदान करता है। इसका उपयोग क्रिस्टलीकरण योजक, चरणबद्ध एजेंटों या सह-क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के माध्यम से यौगिक स्क्रीनिंग के लिए तेजी से अन्वेषण के लिए भी किया जा सकता है। जबकि अधिकांश क्रिस्टलोग्राफी परियोजनाओं को संभवतः इस दृष्टिकोण से लाभ हो सकता है, कुछ नमूनों को विशेष प्रोटोकॉल की आवश्यकता हो सकती है जो स्वचालन या यहां प्रस्तुत पाइपलाइनों के लिए उत्तरदायी नहीं हैं, उदाहरण के लिए माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम या अत्यधिक विशिष्ट क्रिस्टलीकरण उपकरणों या नमूनों की आवश्यकता होती है जो बेहद प्रयोगशाला हैं और शिपमेंट बर्दाश्त नहीं करेंगे।

क्रिस्टलडायरेक्ट तकनीक छोटे अणु-लक्ष्य परिसरों के लक्षण वर्णन के लिए स्वचालित क्रिस्टल भिगोने17 को भी सक्षम बनाती है। इसके लिए, कटाई प्रक्रिया से पहले लेजर के साथ एक छोटा सा एपर्चर बनाया जाता है और वांछित रसायनों (यानी, चरणबद्ध एजेंटों या संभावित लिगामेंट्स) वाले समाधान की एक बूंद शीर्ष पर जोड़ी जाती है, ताकि यह संपर्क में प्रवेश करे, और क्रिस्टलीकरण समाधान में अंततः क्रिस्टलीकरण तक पहुंचने में फैलता है। पानी, डीएमएसओ या अन्य ऑर्गेनिक सॉल्वैंट्स में केमिकल सॉल्यूशंस तैयार किए जा सकते हैं। एक निश्चित इनक्यूबेशन समय के बाद क्रिस्टल काटा जा सकता है और ऊपर वर्णित के रूप में विवर्तन द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । यह दृष्टिकोण संरचना आधारित दवा डिजाइन के साथ-साथ बड़े पैमाने पर यौगिक और खंड स्क्रीनिंग के संदर्भ में लिगांड-प्रोटीन परिसरों के तेजी से लक्षण वर्णन के लिए लागू किया गया है। बाद के मामले में एक हजार से अधिक टुकड़ों के लिए सैकड़ों के साथ टुकड़ा पुस्तकालयों तेजी से विश्लेषण किया जा सकता है । यहां प्रस्तुत नहीं किए गए विशिष्ट क्रिम्स इंटरफेस क्रिस्टल भिगोने के प्रयोगों के डिजाइन और स्वचालित ट्रैकिंग की सुविधा प्रदान करते हैं, जबकि ग्लोबल फेसिंग लिमिटेड (यूके) द्वारा विकसित CRIMS सॉफ्टवेयर और पाइपड्रीम सॉफ्टवेयर सुइट के बीच एकीकरण समानांतर में सैकड़ों डेटासेट पर स्वचालित डेटा प्रसंस्करण, चरणबद्ध, लिगांड पहचान और संरचना शोधन को सक्षम करता है, डेटा विश्लेषण और व्याख्या को व्यवस्थित करताहै 32,33 . उदाहरण के लिए, इस पाइपलाइन को हाल ही में सक्रिय साइट और ट्राइपानोसोमा ब्रूसी फारनेसिल पायरोफोस्फेट सिंथेस के कई एलोस्टेरिक साइटों दोनों के लिए बाध्यकारी टुकड़ों की पहचान के लिए लागू किया गया था, जो परजीवी के एक प्रमुख एंजाइम मानव अफ्रीकी ट्राइपानोसोमियासिस का कारण बनते हैं।

यहां प्रस्तुत पाइपलाइनों संरचनात्मक जीव विज्ञान में खोज की गति में तेजी लाने और मैक्रोमॉलिक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी अनुसंधान समूहों की एक बड़ी संख्या के लिए और अधिक सुलभ बनाने के लिए योगदान कर सकते हैं । इसके अलावा, बड़े पैमाने पर यौगिक और खंड स्क्रीनिंग की सुविधा के द्वारा वे अनुवाद अनुसंधान को बढ़ावा देने और दवा की खोज की प्रक्रिया में तेजी लाने में योगदान कर सकते हैं, लक्ष्यों की एक बड़ी संख्या के खिलाफ बेहतर और सुरक्षित दवाओं के विकास को सुविधाजनक बनाने में योगदान ।

Disclosures

जाम क्रिस्टलडायरेक्ट सिस्टम पर एक पेटेंट के सह-लेखक हैं

Acknowledgments

हम ईएसआरएफ मैक्रोमॉलिक्यूलर बीमलाइंस के उपयोग और संचालन में समर्थन के लिए संयुक्त ईएमबीएल-ईएसआरएफ स्ट्रक्चरल बायोलॉजी ग्रुप (जेएसबीजी) को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम ईएसआरएफ और थॉमस श्नाइडर के मासिफ-1 बीमलाइन में डेटा संग्रह के साथ समर्थन के लिए मैथ्यू गेंदबाज के आभारी हैं और पेट्राआईआई सिंक्रोट्रॉन (DESY, हैम्बर्ग, जर्मनी) के P14 में डेटा संग्रह के साथ उत्कृष्ट समर्थन के लिए ईएमबीएल हैम्बर्ग टीम। क्रिस्टलडायरेक्ट हार्वेस्टर को ईएमबीएल ग्रेनोबल में इंस्ट्रूमेंटेशन टीम के सहयोग से विकसित किया गया है। इस परियोजना को बूस्टर कार्यक्रम के माध्यम से परियोजनाओं iNEXT (अनुदान संख्या 653706) और iNEXT डिस्कवरी (ग्रांट नो 871037) के साथ-साथ रेजियन ऑवरगेन-रोन-आल्प्स के तहत यूरोपीय कम्युनिटीएच 2020 कार्यक्रम से वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CrystalDirect harvester Arinax Automated crystal mounting and cryocooling
CrystalDirect Crystallization plate Mitegen SKU: M-XDIR-96-2 96-well crytsallization microplate
Formulator 16 Formulatrix For the autoamted preparation of crystallization screens
Mosquito crystallization Robot SPT Labtech For the preparation of crystallization experiments
Tecan Evo Liquid handling station Tecan For the preparation of crystallization solutions
Spine Pucks Mitegen SKU: M-SP-SC3-1 SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers
UniPucks Mitegen SKU: M-CP-111-021 Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 172
ग्रेनोबल में ईएमबीएल एचएचएक्स सुविधा में स्वचालित क्रिस्टलोग्राफी पाइपलाइन
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Cornaciu, I., Bourgeas, R.,… More

Cornaciu, I., Bourgeas, R., Hoffmann, G., Dupeux, F., Humm, A. S., Mariaule, V., Pica, A., Clavel, D., Seroul, G., Murphy, P., Márquez, J. A. The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble. J. Vis. Exp. (172), e62491, doi:10.3791/62491 (2021).

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