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基于毛细管电泳的氢/氘交换结合自上而下质谱法用于蛋白质构象表征

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DOI：

10.3791/62672

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2021年6月8日

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Materials Science, Nanjing Normal University, 2Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, 3Department of Chemistry, University of British Columbia

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于毛细管电泳的氢/氘交换（HDX）方法，并结合自上而下的质谱技术。该方法通过同时进行差异化的HDX反应和电泳分离，表征不同蛋白质种类（包括处于不同状态的蛋白质和不同的蛋白质异构体）在高级结构上的差异。

摘要

解析溶液中共同存在的多种蛋白质状态的构象异质性，仍是表征蛋白质治疗药物以及确定从分子识别到酶催化等生物学功能所依赖的构象转变途径的主要障碍之一。结合自上而下质谱分析（top-down mass spectrometric, MS）的氢/氘交换（HDX）反应为以构象特异性方式表征蛋白质高级结构和动态特性提供了有效手段。该技术的构象分辨能力高度依赖于在完整蛋白质水平上分离蛋白质状态的效率，以及在HDX反应过程中最大限度降低残余非氘代质子含量的能力。

本文描述了一种基于毛细管电泳（CE）的氢氘交换质谱（HDX MS）方法变体，旨在提高构象分辨率。在该方法中，蛋白质在毛细管电泳分离过程中，于氘代背景电解质溶液（BGE）中迁移的同时进行氢氘交换反应。溶液中共同存在的不同蛋白质状态或蛋白质异构体可根据其电荷与尺寸比的差异实现高效分离。蛋白质与质子化溶剂分子之间电泳迁移率的差异，最大限度地减少了残余非氘代溶剂的存在，从而在氢氘交换过程中形成近乎完全的氘代环境。流动式微管CE-MS接口可在喷雾出口处使洗脱的蛋白质组分与淬灭及变性修饰溶液快速混合，进而实现高效的电喷雾离子化。在线自上而下质谱（top-down MS）分析可测定洗脱出的完整蛋白质组分的整体氘代水平，随后测定其气相碎片的氘代程度。本文以共存于乳汁中的天然蛋白质变体体系为例，展示了该方法在差异氢氘交换分析中的应用。

引言

区分蛋白质在不同构象、结合或修饰状态下的种类，并表征其结构差异，对于监测这些种类在生物事件（从分子识别到酶催化）中相互转化的途径以及理解这些事件的潜在机制具有重要意义。传统的生物物理技术由于分辨率不足以及在溶液中丢失动态信息等局限性，无法提供完整的解决方案。氢/氘交换结合质谱技术（HDX MS）是一种通过将蛋白质中可交换的氢原子与人为引入的2H2O溶液中的2H发生交换，从而利用氘（2H）标记蛋白质结构和构象特征的技术。参与氢键或位于蛋白质内部被溶剂隔离的质子不易发生交换1。因此，由于可交换位点的交换速率高度依赖于其在高级结构中的参与程度，质谱可通过探测2H摄取的程度与速率（基于1H与2H原子质量差异）来高空间分辨率地揭示蛋白质结构。在近几十年来，HDX MS已成为研究蛋白质构象与动力学的一项极为成功的技术2。

在HDX MS的经典自下而上方法中，处于不同构象、结合或修饰状态的蛋白质种类集合在完整蛋白质水平未经过分离即进行蛋白酶解，导致无法通过分析具有复杂氘代含量的蛋白酶解片段来表征各个单独的蛋白质种类。相比之下，在自上而下的方法中，掺入了不同氘代水平的蛋白质状态或蛋白异构体在质谱扫描中会产生多个完整蛋白质质量分布。这使得可通过适当的质量过滤器（如四极杆）对对应于每个质量分布的离子进行质荷比选择，从而分离各个蛋白质种类，并在后续的串联质谱分析中表征其构象差异3,4,5,6。然而，该策略中分离蛋白质状态或蛋白异构体的效率受限于其对应质量分布之间差异的程度。

毛细管电泳（CE）能够基于溶液中蛋白质种类所带电荷和流体动力学尺寸的差异，高效地实现其分离7。将CE与氢氘交换（HDX）技术结合，可在溶液相中进一步分离不同的蛋白质状态或蛋白质异构体。此外，毛细管的微小体积允许使用完全氘代的溶液作为背景电解质溶液（BGE），即运行缓冲液，从而使毛细管本身成为蛋白质样品的HDX反应器。由于在电泳过程中蛋白质与质子化试剂的电泳迁移率不同，在CE过程中进行HDX可为蛋白质分析物提供近乎完全的氘代环境，同时残留的非氘代成分极少，从而提高了基于HDX数据进行结构分析的灵敏度。因此，我们开发了一种基于CE的差异性HDX方法，并与自上而下质谱（top-down MS）联用，以实现对蛋白质高级结构在特定状态或特定蛋白质异构体水平上的表征8。

本文通过详细描述材料准备、实验步骤和数据分析等环节，介绍了该方法的实验方案。文中以简要说明的形式列出了可能影响方法性能或数据质量的因素。此处展示的代表性结果包括不同蛋白质混合物以及牛乳中主要乳清蛋白β-乳球蛋白（β-lg）天然变异体的差异氢氘交换（HDX）数据9。我们展示了基于毛细管电泳的氢氘交换实验中β-lg两种高丰度变异体（即A型和B型）10,11的分离效率、重复性以及2H标记性能，并实现了对它们构象的变异体特异性表征。

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方案

注意：尽可能使用高效液相色谱（HPLC）级或质谱级试剂，以最大限度减少可能干扰质谱分析的污染物。在检测过程中切勿用手直接接触毛细管电泳-质谱（CE-MS）接口，以避免因电泳电压或电喷雾电压导致的电击风险。

1. 材料准备

  1. 毛细管电泳用熔融石英毛细管的修饰
    1. 通过将羟丙基纤维素（HPC）粉末（分子量 [MW]：100 kDa）溶于水中，在磁力搅拌器上室温持续搅拌约 12 小时或直至固体颗粒完全消失，配制 5% (w/w) 的羟丙基纤维素（HPC）溶液12。使用超声波清洗器去除任何可见的气泡。
    2. 将一根长约 85 cm 的熔融石英毛细管（内径 [ID]：50 µm，外径 [OD]：360 µm）安装至毛细管电泳仪中。利用毛细管电泳仪的自动进样器，在 40 psi 的灌注压力下持续注入丙酮等有机溶剂，冲洗毛细管 10–15 分钟13。
    3. 使用自动进样器在 40 psi 的灌注压力下将清洗后的毛细管充满 HPC 溶液（通常需要约 40 分钟）。在充满 HPC 溶液的毛细管中以 40 psi 压力注入空气，以确保毛细管内空气流通顺畅；当毛细管浸入水中时，若有气泡排出，则表明空气流通正常。
    4. 将涂覆 HPC 的毛细管置于可编程温控烘箱中（理想情况下使用程序控温气相色谱仪的温控柱箱），在毛细管中通入氮气（25 psi），并按照 图 1 所示的温度程序进行烘烤。
    5. 在取出毛细管前，将烘箱冷却至室温。使用该经 HPC 修饰的毛细管进行毛细管电泳分离。

显示加热阶段温度随时间变化的曲线图，温度从 70°C 升至 140°C，随后趋于稳定。
图 1：毛细管烘烤推荐的温度程序。 请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 背景电解质（BGE）溶液和修饰剂溶液8
    1. 通过将适量的乙酸铵溶解于2H2O中，配制所需浓度（例如10 mM）的BGE溶液1–10 mL。将200 µL的BGE分装至不同的BGE样品瓶中，并用封口膜密封，以尽量减少BGE与空气中水蒸气之间的氢氘交换反应。
    2. 配制10 mL修饰剂溶液，其中含75%（v/v）甲醇和25%（v/v）水，并用甲酸调节pH至2.5。
      注意：若需在质谱检测中保留侧链及未保护主链酰胺上的氘原子，则应使用2H2O和氘代甲醇配制修饰剂溶液。
  2. 蛋白质样品脱盐
    1. 使用非氘代水配制所需浓度的乙酸铵溶液。
      注意：建议浓度低于100 mM，以避免电泳过程中产生过高电流及由此引起的焦耳热效应。
    2. 必要时，使用甲酸（用于pH < 6.8）或氢氧化铵（用于pH > 6.8）将乙酸铵溶液的pH调节至所需水平。
    3. 在4 °C条件下，使用适当截留分子量的离心过滤装置，通过至少五个连续的稀释与浓缩步骤，将蛋白质溶液中原有的缓冲液置换为乙酸铵溶液（使用非氘代水配制至所需浓度，并用氢氧化铵调节pH至7.5）。
      注意：待脱盐的蛋白质样品可来源于前期制备工艺（如纯化或制剂过程），也可通过溶解冻干蛋白粉末获得。本步骤中需去除的“盐”通常指所有非挥发性的小离子或小分子。尽管这些物质可在电泳过程中有效与蛋白质分离，但仍建议进行脱盐以避免影响电泳分辨率，并最大限度减少对质谱仪的污染。若蛋白质分析物需特定盐类或添加剂维持稳定，可将其保留在BGE中。
    4. 使用微体积紫外-可见分光光度计测定蛋白质浓度。

2. 基于毛细管电泳的氢氘交换质谱分析操作

注意：本方法所使用的质谱仪应配备具有超高分辨率的质量分析器，例如傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）或轨道阱（orbitrap）；应具备质量过滤器，例如可实现前体离子选择性碎裂的四极杆；并应具备电子转移解离（ETD）或电子捕获解离（ECD）功能，以进行自上而下的分析，获得可靠的串联质谱数据（理想情况下，碎片离子的同位素峰能够被分辨）。

  1. 毛细管电泳（CE）与质谱（MS）参数的优化
    1. 使用标准电喷雾电离（ESI）源进行初步质谱测量，可通过金属涂层硼硅酸盐玻璃毛细管中预加载样品（“静态”纳米电喷雾电离，nanoESI）或通过金属发射器连续进样样品，以优化完整蛋白质（MS1）及其气相碎片（MS2）的质谱检测参数。通过选择特定电荷态的蛋白离子进行质荷比分离，随后采用电子转移解离（ETD）或电子捕获解离（ECD）对前体离子进行碎裂。
      注意：关键参数包括影响去溶剂化、前体离子质荷比选择（以避免其他物质干扰）以及碎裂效率的设置。由于氢氘交换（HDX）后分析物离子的质量分布发生变化，应相应增加质荷比选择窗口的中心值和宽度。由于蛋白组分在毛细管电泳中的洗脱时间通常为0.5至2分钟，因此应基于在类似时间窗口内累积的MS2扫描结果评估碎裂效率。这些参数的最优值因蛋白而异；读者可参考已发表文献中的示例性参数设置8,14。
    2. 使用配备光学检测器（如光电二极管阵列（PDA）检测器或紫外（UV）检测器）的毛细管电泳仪进行初步毛细管电泳测量，以优化蛋白组分的分离效果及迁移时间（即HDX反应时间）。
      注意：此步骤是否执行取决于毛细管电泳仪是否配备光学检测器。若无光学检测器，可在完成第2.2节后，按照第2.3节所述方法，通过CE-MS联用技术优化毛细管电泳参数。关键参数包括影响分离效率、电泳图谱峰形以及洗脱时间的设置。
  2. CE-HDX系统的预处理
    1. 使用体积比为50%甲醇、49%水和1%甲酸的混合溶液，在室温下对流通式微体积毛细管电泳-质谱（CE-MS）接口进行超声清洗，时间不少于30分钟。
    2. 将HPC修饰毛细管安装至毛细管电泳仪后，使用自动进样器以背景电解质溶液（BGE）冲洗毛细管10分钟，并保持毛细管内充满BGE。
    3. 取适当长度的未修饰熔融石英毛细管（内径：50 µm，外径：360 µm）作为修饰液的进样管路。通过接头和合适的套管将修饰液管路连接至带钝头的气密玻璃注射器，并使用推注泵以修饰液冲洗管路至少10分钟。
    4. 将已装载相应溶液的HPC涂层毛细管和修饰液管路的出口端插入已清洗的CE-MS接口中，如图2所示。
    5. 手动或通过推注泵推动修饰液注射器，确保修饰液到达接口尖端。将组装好的CE-MS接口安装至质谱仪的纳米电喷雾电离（nanoESI）源腔体内。

毛细管电泳-质谱联用示意图，ESI-MS装置，串联质谱检测过程。
图2：基于毛细管电泳的氢氘交换质谱（HDX MS）装置示意图。 本图改编自8。缩写：BGE = 背景电解质溶液；CE = 毛细管电泳；MS = 质谱；HDX = 氢/氘交换；ESI = 电喷雾电离；FTICR = 傅里叶变换离子回旋共振；ETD = 电子转移解离；ECD = 电子捕获解离。 请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 同时进行毛细管电泳分离、氢氘交换反应和质谱分析
    注意：建议去封后1天内使用氘代背景电解质溶液（BGE）。
    1. 在CE-MS接口施加3–5 kV的喷雾电压。
    2. 使用输注泵以0.1至10 µL/min的流速开始输注修饰剂溶液，并确保CE-MS接口尖端形成稳定的电喷雾。
    3. 将含有BGE的样品瓶放入自动进样器，并在步骤2.3.4中使用，以获取空白电泳图和空白质谱图。
    4. 使用自动进样器在2 psi压力下注入样品溶液，并保持适当时间，以实现所需样品量的进样。根据进样体积与进样参数之间的关系（由公式（1）定义）估算进样体积15。
      流体动力学方程：V_inj=Δp×d_c^2×A×t_inj/32ηγL，用于流动分析的公式。 (1)
      其中Vinj为进样体积，Δp为进样压力，dc为毛细管内径，A为毛细管横截面积，tinj为进样时间，η为毛细管中液体的黏度，L为毛细管长度。
    5. 施加30 kV的电泳电压以及0至2 psi的输注压力，开始CE分离，并采集电泳图。同时，在色谱模式下开始采集质谱数据，该模式下离子流图作为时间函数被记录，相应的质谱扫描不会自动合并为单一谱图。
      注意：在此步骤中，蛋白质在电泳迁移过程中与BGE中的2H2O分子接触时会发生自发的氢氘交换反应。除质谱检测外，也可使用毛细管电泳的光学检测。由于柱上检测需要去除熔融石英毛细管出口端一定长度的聚酰亚胺涂层，因此在组装CE-MS接口时应格外小心，避免毛细管损坏。
    6. 将空白电泳图和质谱图保存为参考数据。
      注意：空白数据用于故障排查，而非基线扣除。
    7. 将含有目标浓度蛋白样品溶液的样品瓶放入自动进样器。按照步骤2.3.4–2.3.5采集蛋白样品的电泳图和质谱图。收集足够数量的质谱扫描，以获得经电泳分离并标记2H的蛋白物种的MS1谱图。
    8. 可在同一次运行中获取MS1谱图后，或在后续单独运行中，对目标物种进行串联质谱（MS/MS）测量。
    9. 必要时，可通过调节输注压力或CE毛细管长度来调整迁移时间/氢氘交换反应时间。若氢氘交换反应时间必须短于迁移时间，可采用先前描述的方法8，即在CE过程中在毛细管中同时使用氘代和非氘代BGE。
    10. 每次测量后，以20 psi压力用BGE冲洗CE毛细管至少10分钟。
    11. 实验结束后，清洗CE-MS接口及所有管路以便储存。
    12. 使用直接进样模式的质谱采集氢氘交换“终点”样品的数据集（该样品可采用先前描述的方法制备6,16）。
      ​注意：仅当基于CE的氢氘交换使用氘代修饰剂溶液时，才需要执行此步骤。

3. 数据分析

  1. CE 数据分析
    1. 使用以下图表之一作为电泳图，以确定电泳特性，包括峰的数量、迁移时间及分离效率：(a) 由 CE 仪器的光学检测器获取的紫外吸收（UV 吸收）随迁移时间变化的曲线（如可用）；(b) 质谱（MS）获取的总离子流（TIC）图；(c) 质谱（MS）获取的提取离子流（EIC/XIC）图。
      注：在上述电泳图格式中，EIC/XIC 通常提供最佳的信噪比（S/N）。需注意的是，即使不存在任何仪器偏差，UV 吸收与蛋白质的质量浓度成正比，而 MS 信号则与摩尔浓度成正比。因此，在 CE 和 MS 衍生的电泳图之间观察到峰型差异是合理的。
    2. 利用电泳图中峰的曲线下面积（AUC）进行半定量分析。对于涉及蛋白质复合物的样品，使用先前描述的方法17，从 TIC/EIC 电泳图推导出质量浓度数据。
  2. MS 数据分析
    1. 分别将对应洗脱窗口内采集的 MS1 和 MS2 扫描数据合并，获得 MS1 和 MS2 谱图。
    2. 通过以下两种方法之一确定完整蛋白质（M（完整蛋白质））及其片段的质量。
      1. 计算产生同位素分辨信号簇的离子的平均质量。
      2. 使用对相应同位素包络拟合所得高斯型曲线的中心位置6。
    3. 使用 Biopharma Finder、ProSight18 或 MASH Suite19 等软件生成碎片离子的质量列表并进行鉴定。
  3. HDX 数据分析
    1. 使用公式（2）确定完整蛋白质物种的整体氘代水平。
      蛋白质氘代方程；静态方法；分析图示；生化计算。 （2）
      其中 M（2H）或 M（1H）分别为 2H 或 1H 的原子量。星号表示 2H 标记样品的数据。
    2. 确定特定区段主链酰胺的累积保护程度或累积氘代程度。
      1. 对于使用氘代修饰溶液获得的数据，使用公式（3）和（4）确定累积保护水平。
        质谱分析中同位素分布的方程，显示概率公式。 （3）
        化学分析中表示同位素质量差的平衡方程 Σ。 （4）
        其中 P(Sk(N)) 表示从第 1 至第 k 位残基的 N 末端区段的总保护程度，P(Sm(C)) 表示包含 m 个残基的 C 末端区段的总保护程度，M（2H）或 M（1H）分别为 2H 或 1H 的原子量，M（ci）或 M（zi）分别为 ci 或 zi 离子的分子量。
        ​注：双星号表示 HDX“终点”样品的数据。
      2. 对于使用非氘代修饰溶液获得的数据，使用公式（5）和（6）确定累积氘代水平。
        同位素平衡效应方程；与质谱分析相关的公式。 （5）
        氘转化分析中的同位素标记方程公式；研究方法。 （6）
        其中 D(Sk(N)) 表示从第 1 至第 k 位残基的 N 末端区段的累积氘摄取量；D(Sm(C)) 表示包含 m 个残基的 C 末端区段的累积氘摄取量。
    3. 确定局部主链酰胺基团的氘代水平
      1. 对于使用氘代修饰溶液获得的数据，使用公式（7）、（8）、（9）、（10）和（11）确定局部保护水平。
        由 c-离子推导的数据
        概率公式，\( P(R_i) = P(S_i(N)) - P(S_{i-1}(N)) \)，数学方程分析。 （7）
        由 z-离子推导的数据
        概率模型方程，P(R_i)=P(S_total+1-i(C))-P(S_total-i(C))，用于统计分析。 （8）
        其中 P(Ri) 表示第 i 位残基处主链酰胺的保护程度，下标“total”表示蛋白质的总残基数。
        对于后续碎片离子缺失的残基位点，使用公式（9）和（10）分配 P(Ri)。
        由 c-离子推导的数据
        概率函数方程；说明静态平衡分布的数学公式。 （9）
        由 z-离子推导的数据
        用于数据分析计算的统计概率公式数学方程。 （10）
        然后，使用公式（11）确定局部主链酰胺基团的氘代水平 D(Ri)。
        概率差方程 D(Ri)=1−P(Ri)；用于统计分析的公式。 （11）
      2. 对于使用非氘代修饰溶液获得的数据，使用公式（12）、（13）、（14）和（15）确定局部保护水平。
        由 c-离子推导的数据
        动态计算方程；符号说明；适用于数学建模分析。 （12）
        由 z-离子推导的数据
        数据处理方法的数学方程；D(R,i) 公式；过程分析图。 （13）
        其中 D(Ri) 表示第 i 位残基处主链酰胺的保护程度，下标“total”表示蛋白质的总残基数。
        对于后续碎片离子缺失的残基位点，使用公式（14）和（15）分配 D(Ri)。
        由 c-离子推导的数据
        数学序列中 D(R_i) 系列分析方程；公式表示。 （14）
        由 z-离子推导的数据
        静态平衡；D(Ri)、D(Ri+1) 公式；数学概念；教育用途。 （15）

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结果

调节BGE的进样压力可以同时调整分离效率和迁移时间，后者等同于待分离蛋白质的HDX反应时间（图3）。较低的进样压力虽然延长了实验持续时间，但可实现CE峰更好的分离效果（图3A）。更长的迁移/HDX反应时间会导致蛋白质分析物的氘代水平更高（图3B–D）。在分钟级的HDX时间尺度上，氘代差异主要反映的是结构保护位点之间的交换程度差异，而非快速可交换位点的差异。根据两种蛋白质物种的氘代-时间函数变化趋势，迁移时间差异不太可能是氘代差异的主要来源。事实上，在全肌红蛋白（holo-myoglobin, holo-Mb）与脱辅基肌红蛋白（apo-myoglobin, apo-Mb）的差异CE-HDX实验中8，出峰更早的apo-Mb显示出比holo-Mb更高的氘代水平，这明确表明构象差异是决定所测得氘代差异的主要因素。

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讨论

对毛细管电泳（CE）毛细管内壁进行涂层的主要目的包括在CE过程中最大限度地减少电渗流和蛋白质吸附13。尽管电渗流有利于小分子的传统CE分析（因其可驱动中性或带相反电荷的物质向检测器移动），但在溶液中对大小和净电荷相似的蛋白质进行分离时，电渗流会降低分离效率。使用羟丙基纤维素（HPC）对毛细管进行涂层，可最大限度地减少由毛细管内壁硅醇基团引起的电渗流。此外，屏蔽这些硅醇基团可减少其与蛋白质的相互作用，避免蛋白质在毛细管中迁移减慢甚至完全滞留。

在电泳过程中，分析物以及背景电解质（BGE）中的阳离子和阴离子均发生电泳迁移。当与质谱（MS）联用时，毛细管电泳（CE）毛细管负电压端的BGE储液槽被替换为具有不同组成的CE-MS接口。通过施加压力，使正电压端储液槽中的新鲜BGE以特定流速持续流入毛细管，从而最大限度地减小毛细管内BGE组分的浓度梯度，有利于提高分离性能。

氢氘交换（HDX）反应时间是确定特定位点/区段交换速率以及表征蛋白质高级结构动力学的关键参数。在基于毛细管电泳（CE）的...

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披露

D. D. Y. Chen 是健康知识生物分子研究所的创始人之一，该研究所正在将流通式微管CE-MS接口商业化。其他作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（NSFC 21974069）的资助。作者还获得了中国深圳湾实验室细胞分析研究所、江苏省生物医学功能材料协同创新中心以及南京师范大学江苏省生物医学材料重点实验室的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸铵Fisher ChemicalA/3446/50≥99%
CESI 8000 plus 毛细管电泳系统美国Sciex公司
离心机Eppendorf5406000097
离心过滤器默克UFC20102410 kDa 截留分子量
重水能源化学E09000199.9 % D
甲酸Acros Organics 270480250
熔融石英玻璃毛细管Polymicro Technologies106815001750μm，OD 360μm
气相色谱法安捷伦GC6890N
盐酸Sigma Aldrich258148
羟丙基纤维素AladdinH113415MW 100000
磁力搅拌器DLAB8030101212
甲醇Fisher ChemicalA456-4质谱级
微量紫外-可见分光光度计DeNovix84677JK7731
肌红蛋白Sigma AldrichM1882
Orbitrap Fusion Lumos 质谱仪赛默飞世尔科技公司，美国
PA 800 Plus 药物分析毛细管电泳系统贝克曼库尔特，美国
Q Exactive UHMR 质谱仪赛默飞世尔科技，德国
钠 氢氧化物Sigma AldrichS5881
泛素Sigma AldrichU6253
超声波破碎仪SCIENTZSB-5200
ββ-乳球蛋白Sigma AldrichL0130

参考文献

  1. Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169(2020).
  2. Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
  3. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
  4. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).
  5. Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
  6. Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
  7. Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
  8. Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
  9. Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
  10. Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).
  11. Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
  12. Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
  13. Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
  14. Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
  15. Sutera, S. P., Skalak, R. The history of Poiseuille's law. Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).
  16. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  17. Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
  18. Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
  19. Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
  20. Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
  21. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  22. Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
  23. Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173(2019).
  24. Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
  25. Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).

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