基于毛细管电泳的氢/氘交换结合自上而下质谱法用于蛋白质构象表征

摘要

本文介绍了一种基于毛细管电泳的氢/氘交换（HDX）方法，并结合自上而下的质谱技术。该方法通过同时进行差异化的HDX反应和电泳分离，表征不同蛋白质种类（包括处于不同状态的蛋白质和不同的蛋白质异构体）在高级结构上的差异。

摘要

解析溶液中共同存在的多种蛋白质状态的构象异质性，仍是表征蛋白质治疗药物以及确定从分子识别到酶催化等生物学功能所依赖的构象转变途径的主要障碍之一。结合自上而下质谱分析（top-down mass spectrometric, MS）的氢/氘交换（HDX）反应为以构象特异性方式表征蛋白质高级结构和动态特性提供了有效手段。该技术的构象分辨能力高度依赖于在完整蛋白质水平上分离蛋白质状态的效率，以及在HDX反应过程中最大限度降低残余非氘代质子含量的能力。

本文描述了一种基于毛细管电泳（CE）的氢氘交换质谱（HDX MS）方法变体，旨在提高构象分辨率。在该方法中，蛋白质在毛细管电泳分离过程中，于氘代背景电解质溶液（BGE）中迁移的同时进行氢氘交换反应。溶液中共同存在的不同蛋白质状态或蛋白质异构体可根据其电荷与尺寸比的差异实现高效分离。蛋白质与质子化溶剂分子之间电泳迁移率的差异，最大限度地减少了残余非氘代溶剂的存在，从而在氢氘交换过程中形成近乎完全的氘代环境。流动式微管CE-MS接口可在喷雾出口处使洗脱的蛋白质组分与淬灭及变性修饰溶液快速混合，进而实现高效的电喷雾离子化。在线自上而下质谱（top-down MS）分析可测定洗脱出的完整蛋白质组分的整体氘代水平，随后测定其气相碎片的氘代程度。本文以共存于乳汁中的天然蛋白质变体体系为例，展示了该方法在差异氢氘交换分析中的应用。

引言

区分蛋白质在不同构象、结合或修饰状态下的种类，并表征其结构差异，对于监测这些种类在生物事件（从分子识别到酶催化）中相互转化的途径以及理解这些事件的潜在机制具有重要意义。传统的生物物理技术由于分辨率不足以及在溶液中丢失动态信息等局限性，无法提供完整的解决方案。氢/氘交换结合质谱技术（HDX MS）是一种通过将蛋白质中可交换的氢原子与人为引入的²H₂O溶液中的²H发生交换，从而利用氘（²H）标记蛋白质结构和构象特征的技术。参与氢键或位于蛋白质内部被溶剂隔离的质子不易发生交换¹。因此，由于可交换位点的交换速率高度依赖于其在高级结构中的参与程度，质谱可通过探测²H摄取的程度与速率（基于¹H与²H原子质量差异）来高空间分辨率地揭示蛋白质结构。在近几十年来，HDX MS已成为研究蛋白质构象与动力学的一项极为成功的技术²。

在HDX MS的经典自下而上方法中，处于不同构象、结合或修饰状态的蛋白质种类集合在完整蛋白质水平未经过分离即进行蛋白酶解，导致无法通过分析具有复杂氘代含量的蛋白酶解片段来表征各个单独的蛋白质种类。相比之下，在自上而下的方法中，掺入了不同氘代水平的蛋白质状态或蛋白异构体在质谱扫描中会产生多个完整蛋白质质量分布。这使得可通过适当....

方案

注意：尽可能使用高效液相色谱（HPLC）级或质谱级试剂，以最大限度减少可能干扰质谱分析的污染物。在检测过程中切勿用手直接接触毛细管电泳-质谱（CE-MS）接口，以避免因电泳电压或电喷雾电压导致的电击风险。

1. 材料准备

1. 毛细管电泳用熔融石英毛细管的修饰
   1. 通过将羟丙基纤维素（HPC）粉末（分子量 [MW]：100 kDa）溶于水中，在磁力搅拌器上室温持续搅拌约 12 小时或直至固体颗粒完全消失，配制 5% (w/w) 的羟丙基纤维素（HPC）溶液¹²。使用超声波清洗器去除任何可见的气泡。
   2. 将一根长约 85 cm 的熔融石英毛细管（内径 [ID]：50 µm，外径 [OD]：360 µm）安装至毛细管电泳仪中。利用毛细管电泳仪的自动进样器，在 40 psi 的灌注压力下持续注入丙酮等有机溶剂，冲洗毛细管 10–15 分钟¹³。
   3. 使用自动进样器在 40 psi 的灌注压力下将清洗后的毛细管充满 HPC 溶液（通常需要约 40 分钟）。在充满 HPC 溶液的毛细管中以 40 psi 压力注入空气，以确保毛细管内空气流通顺畅；当毛细管浸入水中时，若有气泡排出，则表明空气流通正常。
   4. 将涂覆 HPC 的毛细管置于可编程温控烘箱中（理想情况下使用程序控温气相色谱仪的温控柱箱），在毛细....

结果

调节BGE的进样压力可以同时调整分离效率和迁移时间，后者等同于待分离蛋白质的HDX反应时间（图3）。较低的进样压力虽然延长了实验持续时间，但可实现CE峰更好的分离效果（图3A）。更长的迁移/HDX反应时间会导致蛋白质分析物的氘代水平更高（图3B–D）。在分钟级的HDX时间尺度上，氘代差异主要反映的是结构保护位点之间的交换程度差异，而非快速可交换位点的差异。根据两种蛋白质物种的氘代-时间函数变化趋势，迁移时间差异不太可能是氘代差异的主要来源。事实上，在全肌红蛋白（holo-myoglobin, holo-Mb）与脱辅基肌红蛋白（apo-myoglobin, apo-Mb）的差异CE-HDX实验中⁸，出峰更早的apo-Mb显示出比holo-Mb更高的氘代水平，这明确表明构象差异是决定所测得氘代差异的主要因素。

讨论

对毛细管电泳（CE）毛细管内壁进行涂层的主要目的包括在CE过程中最大限度地减少电渗流和蛋白质吸附¹³。尽管电渗流有利于小分子的传统CE分析（因其可驱动中性或带相反电荷的物质向检测器移动），但在溶液中对大小和净电荷相似的蛋白质进行分离时，电渗流会降低分离效率。使用羟丙基纤维素（HPC）对毛细管进行涂层，可最大限度地减少由毛细管内壁硅醇基团引起的电渗流。此外，屏蔽这些硅醇基团可减少其与蛋白质的相互作用，避免蛋白质在毛细管中迁移减慢甚至完全滞留。

在电泳过程中，分析物以及背景电解质（BGE）中的阳离子和阴离子均发生电泳迁移。当与质谱（MS）联用时，毛细管电泳（CE）毛细管负电压端的BGE储液槽被替换为具有不同组成的CE-MS接口。通过施加压力，使正电压端储液槽中的新鲜BGE以特定流速持续流入毛细管，从而最大限度地减小毛细管内BGE组分的浓度梯度，有利于提高分离性能。

氢氘交换（HDX）反应时间是确定特定位点/区段交换速率以及表征蛋白质高级结构动力学的关键参数。在基于毛细管电泳（CE）的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸铵	Fisher Chemical	A/3446/50	≥99%
CESI 8000 plus 毛细管电泳系统	美国Sciex公司
离心机	Eppendorf	5406000097
离心过滤器	默克	UFC201024	10 kDa 截留分子量
重水	能源化学	E090001	99.9 % D
甲酸	Acros Organics	270480250
熔融石英玻璃毛细管	Polymicro Technologies	1068150017	50μm，OD 360μm
气相色谱法	安捷伦	GC6890N
盐酸	Sigma Aldrich	258148
羟丙基纤维素	Aladdin	H113415	MW 100000
磁力搅拌器	DLAB	8030101212
甲醇	Fisher Chemical	A456-4	质谱级
微量紫外-可见分光光度计	DeNovix	84677JK7731
肌红蛋白	Sigma Aldrich	M1882
Orbitrap Fusion Lumos 质谱仪	赛默飞世尔科技公司，美国
PA 800 Plus 药物分析毛细管电泳系统	贝克曼库尔特，美国
Q Exactive UHMR 质谱仪	赛默飞世尔科技，德国
钠 氢氧化物	Sigma Aldrich	S5881
泛素	Sigma Aldrich	U6253
超声波破碎仪	SCIENTZ	SB-5200
ββ-乳球蛋白	Sigma Aldrich	L0130