Chemistry

חילופי מימן/דיטריום מבוססי נימי אלקטרופורזה לאפיון קונפורמציה של חלבונים עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה

Published: June 8, 2021 doi: 10.3791/62672

Summary

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור אלקטרופורזה מבוססת אלקטרופורזה נימית מימן / דיוטריום חילופי (HDX) גישה בשילוב עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה. גישה זו מאפיינת את ההבדל במבנים מסדר גבוה יותר בין מיני חלבונים שונים, כולל חלבונים במצבים שונים ופרוטאופורמים שונים, על ידי ביצוע HDX דיפרנציאלי בו זמנית והפרדה אלקטרופורטית.

Abstract

פתרון הטרוגניות קונפורמציה של מצבי חלבון מרובים המתקיימים יחד בתמיסה נותר אחד המכשולים העיקריים באפיון של טיפולי חלבון וקביעת מסלולי המעבר הקונפורמציה הקריטיים לפונקציות ביולוגיות, החל מזיהוי מולקולרי ועד קטליזה אנזימטית. תגובת חילופי מימן/דיטריום (HDX) בשילוב עם ניתוח ספקטרומטרי מסה מלמעלה למטה (MS) מספקים אמצעי לאפיון מבנים ודינמיקה של חלבונים בסדר גבוה יותר באופן ספציפי לקונפורמיסט. כוח פתרון הקונפורמציה של טכניקה זו תלוי מאוד ביעילות של הפרדת מצבי חלבון ברמת החלבון בשלמותה ולמזעור שאריות התוכן הפרוטי שאינו מתויג במהלך תגובות ה-HDX.

כאן אנו מתארים גרסה מבוססת אלקטרופורזה נימית (CE) של גישת HDX MS שמטרתה לשפר את הרזולוציה הקונפורמציה. בגישה זו, חלבונים עוברים תגובות HDX תוך כדי נדידה דרך פתרון אלקטרוליטי רקע deuteated (BGE) במהלך ההפרדה האלקטרופורטית הנימית. מצבי חלבון או פרוטאופורמים שונים הקיימים בתמיסה ניתנים להפרדה יעילה בהתבסס על יחסי הטעינה-לגודל השונים שלהם. ההבדל בניידות אלקטרופורטית בין חלבונים ומולקולות ממס פרוטיות ממזער את הממס השיורי שאינו מוערך, וכתוצאה מכך סביבת deuterating כמעט מלאה במהלך תהליך HDX. ממשק CE-MS המיקרוביאלי המיקרוביאלי מאפשר יינון אלקטרו-ספריי יעיל של מיני החלבון המנופחים לאחר ערבוב מהיר עם תמיסת המכפיל המרווה והדנטורינג בשקע המרסס. ניתוח הטרשת הנפוצה המקוון מלמעלה למטה מודד את רמת ההפחתה העולמית של מיני החלבון השלמים, ולאחר מכן, את ההפחתה של שברי שלב הגז שלהם. מאמר זה מדגים גישה זו ב-HDX דיפרנציאלי למערכות, כולל גרסאות החלבון הטבעיות הקיימות בחלב.

Introduction

הבחנה בין מיני חלבונים במצבים קונפורמצונליים, מחייבים או משתנים שונים ואפיון ההבדלים המבניים שלהם חשובים לניטור מסלולי המעברים בין מינים אלה המעורבים באירועים ביולוגיים, החל מהכרה מולקולרית ועד קטליזה אנזימטית, והבנת המנגנונים העומדים בבסיס אירועים אלה. טכניקות ביופיסיות קונבנציונליות אינן מספקות פתרון מלא בשל מגבלות כגון רזולוציה לא מספקת ואובדן מידע דינמי בפתרון. חילופי מימן/דיאוטריום בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (HDX MS) היא טכניקה המתייגת את התכונות המבניות והקונפורמציה של חלבונים עם דיטריום (²H) באמצעות חילופים בין אטומי מימן שפתיים של חלבונים ו ^-2H מפתרון ²H₂O שהוצג במכוון. פרוטונים המעורבים מליטה מימן או כי הם מבודדים מן הממס בפנים החלבון אינם מחליפים בקלות¹. לפיכך, מכיוון ששער החליפין באתר הניתן להחלפה תלוי מאוד במעורבותו במבנים מסדר גבוה יותר, ניתן לחשוף את מבני החלבון ברזולוציה מרחבית גבוהה על ידי טרשת נפוצה הבוחנת את היקף וקצב ספיגת H ^{של 2}H בהתבסס על המסות האטומיות השונות בין ¹H ל - ²H. במהלך העשורים האחרונים, HDX MS הפך לטכניקה מוצלחת להפליא לחקר קונפורמציות חלבון ודינמיקה².

בגישה הקלאסית מלמטה למעלה של HDX MS, ההרכב של מינים חלבון במצבים קונפורמציה, מחייבים או שינוי שונים הוא proteolyzed ללא הפרדה ברמת החלבון שלם, מה שהופך אותו בלתי אפשרי לאפיין מינים בודדים על ידי ניתוח שברים פרוטאוליטיים וכתוצאה מכך עם תוכן deuterium מפותל. לעומת זאת, בגישה מלמעלה למטה, מצבי חלבון שונים או פרוטאופורמים ששילבו תוכן דיטריום שונה מעוררים הפצות מרובות של גושי חלבון שלמים בסריקת MS. זה מאפשר מינים בודדים להיות מופרדים על ידי בחירה המונית של יונים המתאימים לכל התפלגות מסה באמצעות מסנן מסה מתאים (כגון quadrupole) ואת האפיון של ההבדלים הקונפורמציה שלהם בניתוח MS הדו-מושבי הבא 3,4,5,6. עם זאת, היעילות של הפרדת מצבי חלבון או פרוטאופורמים באסטרטגיה זו מוגבלת על ידי מידת ההבדל בהפצות המסה המתאימות שלהם.

אלקטרופורזה נימית (CE) מספקת אמצעי להפרדת מיני חלבונים בהתבסס על המטענים השונים שלהם וגדלים הידרודינמיים בשלב הפתרון ביעילות גבוהה⁷. שילוב CE עם HDX מציע הפרדה נוספת של מצבי חלבון או פרוטאופורמים בשלב הפתרון. בנוסף, הנפח הקטן של נימי CE מאפשר ניצול של פתרון deuterated לחלוטין כמו פתרון אלקטרוליטים רקע (BGE), כלומר, חיץ פועל, עיבוד הנימים ככור HDX עבור דגימות חלבון. בשל ההבדל בניידות אלקטרופורטית בין חלבונים לבין ריאגנטים פרוטיים בתהליך האלקטרופורזה, ביצוע HDX במהלך CE גורם לסביבת deuterating כמעט מלאה עבור מנתחי חלבון עם תוכן שיורית מינימלית ללא deuteated, ובכך לשפר את הרגישות של הניתוח המבני באמצעות נתוני HDX. ככזה, פיתחנו גישת HDX דיפרנציאלית מבוססת CE בשילוב עם טרשת נפוצה מלמעלה למטה כדי לאפיין מבנים מסוג חלבון בסדר גבוה יותר באופן ספציפי למצב או פרוטאופורם⁸.

מאמר זה מתאר פרוטוקולים לגישה זו על-ידי פירוט שלבי הכנת החומרים, ההליך הניסיוני וניתוח הנתונים. גורמים שעשויים להשפיע על ביצועי השיטה או על איכות הנתונים מפורטים בהערות קצרות. התוצאות הייצוגיות המוצגות כאן כוללות נתוני HDX דיפרנציאליים של תערובות של חלבונים שונים ווריאנטים טבעיים של β-לקטוגלובולין בקר (β-lg), חלבון מי הגבינה העיקרי הנמצא בחלב⁹. אנו מדגימים יעילות הפרדה, רבייה וביצועי תיוג H ^{של 2}גרסאות שופעות של β-lg, כלומר, A ו- B^10,11 במהלך HDX מבוסס CE ואפיון ספציפי לגרסה של הקונפורמציות שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: השתמש ברמת כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בעלת ביצועים גבוהים או ריאגנטים בדרגת MS במידת האפשר כדי למזער את המזהמים שעלולים להפריע לניתוח טרשת נפוצה. אין לגעת בממשק CE-MS בידיים חשופות במהלך המדידה כדי למנוע את האפשרות של הלם חשמלי הנגרם על ידי מתח אלקטרופורטי או מתח electrospray.

1. הכנה חומרית

שינוי של נימי סיליקה מותך עבור CE
1. הכן פתרון של 5% (w/w) הידרוקסיפרופיל תאית (HPC) על ידי המסת אבקת HPC (משקל מולקולרי [MW]: 100 kDa) במים עם ערבוב רציף בטמפרטורת החדר על מערבול מגנטי במשך ~ 12 שעות או עד היעלמות מוחלטת של חלקיקים מוצקים¹². הסר כל בועות אוויר גלויות עם ultrasonicator.
2. הר נימי זכוכית סיליקה מותך (קוטר פנימי [ID]: 50 מיקרומטר, קוטר חיצוני [OD]: 360 מיקרומטר) של כ 85 ס"מ אורך לתוך מכשיר CE. לשטוף את הנימים על ידי החדרה רציפה ממס אורגני, כגון אצטון¹³, באמצעות autosampler של CE בלחץ עירוי של 40 פסאיי במשך 10-15 דקות.
3. מלא את נימי ניקה עם פתרון HPC באמצעות autosampler בלחץ עירוי של 40 פסאיי (אשר לעתים קרובות לוקח ~ 40 דקות). החדירו אוויר לנימים המלאים ב-HPC ב-40 פסאיי כדי להבטיח זרימת אוויר חופשית בנימי, המצוינת על ידי בועות האוויר הנפלטות מהנימילארי עם טבילה במים.
4. אופים את הנימי מצופה HPC בתנור הניתן לתכנות בטמפרטורה (באופן אידיאלי תנור העמודים הנשלט בטמפרטורה של כרומטוגרפיה גז מתוכנת טמפרטורה) עם גז חנקן (25 פסאיי) הזורם דרך הנימים, בהתאם לתוכנית הטמפרטורה המוצגת באיור 1.
5. מצננים את התנור לטמפרטורת החדר לפני הוצאת הנימים. השתמש בנימי זה שעבר שינוי HPC להפרדת CE.

איור 1: תוכנית טמפרטורה מומלצת לאפייה נימית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פתרון אלקטרוליטים ברקע (BGE) ופתרון צירוף⁸
1. הכן 1-10 מ"ל של BGE בריכוז הרצוי (למשל, 10 מ"מ) על ידי המסת הכמות המתאימה של אמוניום אצטט ב ²H₂O. למקם 200 μL-aliquots של BGE בקבוקונים נפרדים BGE ולאטום את הבקבוקונים עם parafilm כדי למזער את תגובת HDX בין BGE אדי מים באוויר.
2. הכינו 10 מ"ל של פתרון מכפיל עם 75% (v/v) מתנול ו-25% (v/v) מים, עם pH מותאם ל-2.5 באמצעות חומצה פורמית.
  הערה: השתמש ²H_{2 2}O ו deuterated מתנול כדי להכין את הפתרון צירוף אם אטומי deuterium בשרשראות הצדדיות ו amides עמוד השדרה לא מוגן צריך להישמר לגילוי על ידי טרשת נפוצה.
התפלת דגימות חלבון
1. הכן פתרון אמוניום אצטט במים שאינם deuteated בריכוז הרצוי.
  הערה: ריכוז של פחות מ-100 מ"מ מומלץ להימנע מזרם חשמלי גבוה במהלך אלקטרופורזה ואפקט חימום ג'אול שנוצר.
2. בעת הצורך, להתאים את ה- pH של פתרון אמוניום אצטט לרמה הרצויה באמצעות חומצה פורמית (עבור pH < 6.8) או אמוניום הידרוקסיד (עבור pH > 6.8).
3. החליפו את המאגרים המקוריים של תמיסת החלבון בתמיסת אמוניום אצטט (שהוכנה במים שאינם מתואמים בריכוז הרצוי; pH מותאם ל-7.5 עם אמוניום הידרוקסיד) באמצעות לפחות חמישה ריכוזים רציפים ושלבי דילול ב-4 מעלות צלזיוס באמצעות מסנן צנטריפוגלי עם ניתוק MW תקין.
  הערה: דגימות החלבון שיש להתפלתן עשויות להיות מהליכי ייצור קודמים (למשל, טיהור או ניסוח) או מוכנות על ידי המסת אבקת החלבון הליופילית. "המלחים" שיש להסיר מפתרונות המדגם בשלב זה מתייחסים באופן כללי לכל היונים הקטנים או המולקולות שאינם נדיפים. למרות מינים אלה ניתן להפריד ביעילות חלבונים במהלך תהליך אלקטרופורזה, צעד זה מומלץ כדי למנוע פגיעה ברזולוציה אלקטרופורטית ובכך למזער את הזיהום של ספקטרומטר המסה. כאשר יש לייצב את ניתוחי החלבון על ידי מלחים או תוספים ספציפיים, כלול אותם ב- BGE.
4. לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis microvolume.

2. תפעול ניתוח HDX MS מבוסס CE

הערה: ספקטרומטר המסה המשמש בגישה זו צריך להיות מצויד במנתח מסות ברזולוציה גבוהה במיוחד, כגון תהודה ציקלוטרון יון פורייה-טרנספורמציה (FTICR) או orbitrap, מסנן מסה, כגון quadrupole המאפשר בחירה המונית של יונים מבשרים לפיצול, ופירוק העברת אלקטרונים (ETD) או דיסוציאציה לכידת אלקטרונים (ECD) פונקציות לביצוע ניתוח מלמעלה למטה עם נתוני MS טנדם אמין (אידיאלי איזוטופי נפתר אותות של יוני שבר).

מיטוב הגדרות CE ו- MS
1. בצע מדידת MS פיילוט באמצעות מקור יינון אלקטרוספריי סטנדרטי (ESI) על-ידי ריסוס הדגימה שנטענה מראש מניב זכוכית בורוסיליקט מצופה מתכת (ערכת nanoESI "סטטית") או מדגם חדורים ברציפות של פולט מתכת כדי לייעל את הגדרות MS למדידת חלבונים שלמים (MS1) ואת שברי שלב הגז שלהם (MS2). לפצל את מיני החלבון של עניין על ידי בחירה המונית של הרכב היונים שלה במצב טעינה אחת, ואחריו ETD או ECD של היונים הקדמה.
  הערה: ההגדרות החיוניות כוללות את הפרמטרים המשפיעים על ההשמדה, את הבחירה ההמונית של יונים מבשרים (כדי למנוע הפרעות ממינים אחרים) ויעילות הפיצול. יש להגדיל הן את המרכז והן את הרוחב של חלון בחירת ההמונים כך שיתאימו להתפלגות ההמונית המתקבלת של יוני האנליטה לאחר HDX. מכיוון שחלון ההמלטה של מין חלבון ב- CE נע בדרך כלל בין 0.5 דקות ל -2 דקות, להעריך את יעילות הפיצול בהתבסס על סריקות MS2 שנצברו על פני חלון זמן דומה. הערכים האופטימליים של פרמטרים אלה הם ספציפיים לחלבון; הקוראים מופנים לדוחות שפורסמו בעבר עבור הגדרות מופתיות ^8,14.
2. בצע מדידת CE פיילוט באמצעות מכשיר CE המצויד בגלאי אופטי, כלומר, גלאי מערך פוטודיודה (PDA) או גלאי UV כדי לייעל את הגדרות CE להפרדת מיני החלבון וזמני הנדידה, המקבילים לזמני התגובה של HDX.
  הערה: שלב זה הוא אופציונלי בהתאם לזמינות של הגלאי האופטי של CE. בהיעדר גלאי אופטי, ניתן למטב את הגדרות CE באמצעות CE-MS עם השלמת סעיף 2.2, בהתאם להוראות המתוארות בסעיף 2.3. ההגדרות החיוניות כוללות פרמטרים המשפיעים על יעילות ההפרדה, צורות שיא המוצגות באלקטרופרוגרמה וזמני ההמלטה.
התניה מוקדמת של התקנת CE-HDX
1. לנקות את ממשק CE-MS המיקרוביאלי דרך זרימה עם תערובת של 50% מתנול, 49% מים, ו 1% חומצה פורמית (v / v) באמצעות ultrasonication לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר.
2. עם הרכבה של נימי HPC שונה על מכשיר CE, לשטוף את הנימים עם BGE באמצעות autosampler במשך 10 דקות ולהשאיר את הנימים מלאים BGE.
3. להשיג אורך מתאים של צינורות נימי סיליקה מותך ללא שינוי (מזהה: 50 מיקרומטר, OD: 360 מיקרומטר) כמו צינורות עירוי עבור פתרון צירוף. חברו את צינורות הצירוף למזרק זכוכית הדוק בגז עם קצה קהה באמצעות איחוד ושרוול מתאים, ושטפו את הצינורות בתמיסת הצירוף באמצעות משאבת אינפוזיה למשך 10 דקות לפחות.
4. הכנס את השקעים של צינורות ה-CE והמשנה מצופים HPC, שנטענו בפתרונות מתאימים, לממשק CE-MS המנוקה, כפי שמודגם באיור 2.
5. לקדם את המזרק עבור עירוי מכפיל או באופן ידני או עם משאבת עירוי כדי להבטיח כי פתרון מכפיל מגיע לקצה הממשק. הר את ממשק CE-MS המורכב על דיור מקור nanoESI של ספקטרומטר מסה.

איור 2: איור סכמטי של הגדרת HDX MS המבוססת על CE. נתון זה שונה מ^{- 8}. קיצורים: BGE = פתרון אלקטרוליטים ברקע; CE = אלקטרופורזה נימית; MS = ספקטרומטריית מסה; HDX = חילופי מימן / דיטריום; ESI = יינון אלקטרוספריי; FTICR = תהודה ציקלוטרון יון טרנספורמציה פורייה; ETD = דיסוציאציה של העברת אלקטרונים; ECD = דיסוציאציה של לכידת אלקטרונים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הפרדת CE בו-זמנית, תגובת HDX וניתוח טרשת נפוצה
הערה: מומלץ להשתמש ב-BGE מתוכם תוך יום אחד לאחר ביטול ההסרה.
1. החל מתח ריסוס של 3-5 kV על ממשק CE-MS.
2. התחל להחדיר את פתרון המכפיל עם משאבת העירוי בקצב זרימה הנע בין 0.1 ל -10 μL / min, ולהבטיח אלקטרוספריי יציב בקצה ממשק CE-MS.
3. מקם את בקבוקון המדגם המכיל את ה- BGE בדגימה האוטומטית, והשתמש בו בשלב 2.3.4 כדי לרכוש אלקטרופרוגרמה ריקה וספקטרת מסה ריקה.
4. הזרקו את הפתרון לדוגמה באמצעות הדגימה האוטומטית ב 2 פסאיי ולמשך זמן מתאים כדי לאפשר הזרקה של כמות רצויה של המדגם. הערכת נפח ההזרקה באמצעות הקשר בין נפח הזרקה ופרמטרי הזרקה¹⁵ המוגדרים על ידי משוואה (1).
  (1)
  כאשר V_inj הוא נפח ההזרקה, Δp הוא הלחץ של הזרקה, d_c הוא הקוטר הפנימי של הנימים, A הוא חתך הרוחב של הנימים, t_inj הוא משך ההזרקה, η הוא צמיגות הנוזל בנימי, ו - L הוא אורך הנימים.
5. התחל את ההפרדה CE על ידי החלת מתח אלקטרופורטי של 30 kV ולחץ עירוי הנע בין 0 ל 2 פסאיי, ולרכוש את electropherogram. בינתיים, התחל את הרכישה של נתוני MS במצב כרומטוגרפי שבו הגרף הנוכחי היון נרכש כפונקציה של זמן, וסריקות MS המתאימות אינן משולבות באופן אוטומטי לספקטרום יחיד.
  הערה: חלבונים עוברים תגובת HDX ספונטנית בנקודת יצירת קשר עם ²מולקולות H₂O ב- BGE במהלך הנדידה האלקטרופורטית שלהם בשלב זה. ניתן להשתמש בזיהוי האופטי עבור CE בנוסף לזיהוי MS. כמו זיהוי בעמודה דורש הסרה של אורך מסוים של ציפוי פולימיד בקצה השקע של נימי סיליקה מותך, יש לנקוט בזהירות נוספת כדי למנוע נזק נימי במהלך ההרכבה של ממשק CE-MS.
6. שמור את האלקטרופרוגרמה הריקה ואת ספקטרום המסה כהפניות.
  הערה: יש להשתמש בנתונים ריקים לפתרון בעיות ולא לחיסור בסיסי.
7. מניחים את הבקבוקונים לדוגמה המכילים את הריכוזים הרצויים של פתרונות דגימת החלבון בדגימה האוטומטית. לרכוש את electropherograms ספקטרום מסה עבור דגימות חלבון הבאים הבאים שלבים 2.3.4-2.3.5. לאסוף מספר הולם של סריקות טרשת נפוצה כדי לקבל ספקטרום MS1 של המופרדים אלקטרופורטית ו ²מינים חלבון שכותרתו H.
8. בצע מדידות MS דו-מושביות עבור מינים של עניין או לאחר רכישת ספקטרום MS1 באותה ריצה או בריצה נפרדת עוקבת.
9. בעת הצורך, להתאים את זמני ההעברה / זמני התגובה HDX על ידי שינוי לחץ עירוי או אורך נימי CE. אם זמן התגובה של HDX חייב להיות קצר יותר מזמן ההעברה, השתמש בגישה שתוארה קודם לכן⁸, אשר מעסיקה הן BGE deuterated והן ללא deuterated בנימי במהלך תהליך CE.
10. לשטוף את נימי CE עם BGE בלחץ של 20 פסאיי לפחות 10 דקות לאחר כל מדידה.
11. עם השלמת הניסויים, נקו את ממשק CE-MS ואת כל הצינורות לאחסון.
12. לרכוש ערכת נתונים של HDX "נקודת קצה" מדגם (אשר ניתן להכין באמצעות גישות שתוארו בעבר ^6,16) עם טרשת נפוצה במצב עירוי ישיר.
  הערה: שלב זה נדרש רק כאשר נעשה שימוש בפתרון צירוף deuterated עבור HDX מבוסס CE.

3. ניתוח נתונים

ניתוח נתוני CE
1. השתמש באחת מהחלקות הבאות כאלקטרופרוגרמה כדי לקבוע את המאפיינים האלקטרו-פורטיים, כולל מספר הפסגות, זמני הנדידה ויעילות ההפרדה: (א) ספיגת UV לעומת זמן הגירה, שנרכש על ידי הגלאי האופטי של מכשיר CE (כאשר זמין); (ב) גרף זרם היון הכולל (TIC) שנרכש על-ידי MS; (ג) גרף זרם היונים שחולץ (EIC/XIC) שנרכש על-ידי MS.
  הערה: EIC/ XIC מספק את יחס האות/רעש האופטימלי (S/N), באופן כללי, בין הפורמטים הנ"ל של אלקטרופרוגרמה. ראוי לציין כי גם בהיעדר הטיות אינסטרומנטליות, בעוד ספיגת UV היא פרופורציונלית לריכוז המסה של חלבון, אות MS הוא פרופורציונלי לריכוז הטוחנת. לפיכך, סביר להבחין בהבדלים בדפוסי השיא בין אלקטרופרוגרמה שמקורה ב- CE ו- MS.
2. השתמש בשטח שמתחת לעקומה (AUC) של הפסגות המוצגות באלקטרופרוגרמה לכמות חלקית. עבור דגימות המערבות קומפלקסים חלבון, להשתמש בגישה שתוארה בעבר¹⁷ כדי להסיק את נתוני ריכוז המסה מן אלקטרופרוגרמה TIC / EIC.
ניתוח נתוני טרשת נפוצה
1. השג את ספקטרום MS1 ו- MS2 על-ידי שילוב סריקות MS1 ו- MS2 שנרכשו בתוך חלונות ההמלטה המתאימים, בהתאמה.
2. קבעו את המסות של החלבון השלם (M (חלבון שלם)) ואת השברים באחת משתי השיטות הבאות.
  1. חשב את המסות הממוצעות של היונים המעוררים את אשכולות האותות שנפתרו באופן איזוטופי.
  2. השתמש במרכז הקימורים דמויי הגאוסים הנובעים מהתאמת המעטפות האיזוטופיות המתאימות⁶.
3. השתמש בתוכנה כגון Biopharma Finder, ProSight¹⁸ או MASH Suite¹⁹ כדי ליצור את הרשימה ההמונית של יוני הקטע ולזהות אותם.
ניתוח נתוני HDX
1. קבע את רמת ההפחתה הכוללת של מין חלבון שלם באמצעות משוואה (2).
  (2)
  כאשר M (²H) או M (¹H) הם משקלים אטומיים של ²H או ¹H. הכוכבית מציינת נתונים של ^{המדגם בעל}התווית H 2.
2. קבע את ההגנה המצטברת או את ההפחתה המצטברת של עמוד השדרה של מקטע מסוים.
  1. עבור נתונים שנרכשו באמצעות פתרון מכפיל deuterated, השתמש במשוואות (3) ו- (4) כדי לקבוע את רמת ההגנה המצטברת.
    (3)
    (4)
    כאשר P(S_k(N)) הוא ההגנה הכוללת של מקטע N-terminal המשתרע על פני שאריות 1 עד k, P(S_m(C)) הוא ההגנה הכוללת של מקטע מסוף C הכולל שאריות m , M (²H) או M (¹H) הם משקלים אטומיים של ²H או ¹H, ו - M (c_i) או M (z_i) הם המשקלים המולקולריים של יונים c_i או z_i .
    הערה: הכוכבית הכפולה מציינת נתונים של דוגמת "נקודת הקצה" של HDX.
  2. עבור נתונים שנרכשו עם פתרון צירוף שאינו מתויג, השתמש במשוואות (5) ו- (6) כדי לקבוע את רמת ההפחתה המצטברת.
    (5)
    (6)
    כאשר D(S_k(N)) הוא ספיגת הדיאוטריום המצטברת של מקטע מסוף N המשתרע על פני שאריות 1 עד k; D(S_m(C)) הוא ספיגת הדיאוטריום המצטברת של מקטע מסוף C הכולל שאריות m .
3. קביעת רמת ההעתקה בקבוצת אמידים מקומית של עמוד השדרה
  1. עבור נתונים שנרכשו באמצעות פתרון מכפיל deuterated, השתמש במשוואות (7), (8), (9), (9) (10) ו- (11) כדי לקבוע את רמת ההגנה המקומית.
    עבור נתונים המופקים מ- c-ions
    (7)
    עבור נתונים המוסיקים מ- z-ions
    (8)
    כאשר P(R_i) הוא ההגנה של עמוד שדרה amide בשאריות i, והתת-כתב התחתי "total" מציין את מספר השאריות הכולל של החלבון.
    עבור אתרי שאריות שבהם היו חסרים יונים של מקטעים הבאים, הקצה P(R_i) באמצעות משוואות (9) ו- (10).
    עבור נתונים המופקים מ- c-ions
    (9)
    עבור נתונים המוסיקים מ- z-ions
    (10)
    לאחר מכן, קבע את רמת ההעתקה D(R_i) בקבוצת אמידים מקומית של עמוד השדרה באמצעות משוואה (11).
    (11)
  2. עבור נתונים שנרכשו עם פתרון צירוף שאינו מוערך, השתמש במשוואות (12), (13), (14) ו- (15) כדי לקבוע את רמת ההגנה המקומית.
    עבור נתונים המופקים מ- c-ions
    (12)
    עבור נתונים המוסיקים מ- z-ions
    (13)
    כאשר D(R_i) הוא ההגנה של עמוד שדרה amide בשאריות i, והתת-כותרת "total" מציינת את מספר השאריות הכולל של החלבון.
    עבור אתרי שאריות שבהם היו חסרים יונים של מקטעים הבאים, הקצה D(R_i) באמצעות משוואות (14) ו- (15).
    עבור נתונים המופקים מ- c-ions
    (14)
    עבור נתונים המוסיקים מ- z-ions
    (15)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שינוי לחץ העירוי של BGE מאפשר התאמה של יעילות ההפרדה וזמן ההגירה, השווה לזמן התגובה של HDX של החלבונים (איור 3). לחץ עירוי נמוך יותר גורם להפרדה טובה יותר של פסגות CE במחיר של משך הניסוי (איור 3A). זמן תגובה ארוך יותר של הגירה/HDX מביא לרמה גבוהה יותר של הפחתת מנתחי החלבון (איור 3B-D). בציר הזמן של HDX של דקות, הפרש deuteration צריך לשקף בעיקר את היקף החליפין השונה באתרים המוגנים מבנית במקום באתרים הניתנים להחלפה מהירה. על פי המגמה של פונקציות זמן deuteration המוצגות על ידי שני מינים חלבון, הפרש זמן הנדידה לא סביר להיות התורם העיקרי להבדל deuteration. ואכן, ב- CE-HDX דיפרנציאלי של הולו- ואפו-מיוגלובין (Mb)⁸, apo-Mb הקודם מהבהב מראה רמת deuteration גבוהה יותר מאשר holo-Mb, מציע בבירור כי ההבדל הקונפורמציה הוא הגורם העיקרי הקובע את ההבדל deuteration נמדד.

ניתן לבצע תיקון להפרש ההפרש בין הזמנים של ההעברה באמצעות התאמת עקומה לנתוני רמת ההפחתה לעומת זמן HDX (איור 3D). הווריאנטים A ו- B של β-lg שונים על ידי רק שתי שאריות חומצות אמינו ברצף שלהם (D64G ו- V118A)²⁰. גרסאות אלה הולידו שתי פסגות מופרדות כראוי באלקטרופרוגרמה שמקורה ב-EIC (איור 4A). פרופילי הפרדה הניתנים לשחזור התקבלו מניסויים שנערכו על ידי מפעילים שונים באמצעות מכשירים שונים במתקנים שונים (איור 4A). התפלגות המסות הייחודית המתקבלת של יונים המתאימים לגרסה הדיפרנציאלית ^{של 2}H עם תווית H (איור 4C) מאפשרת בחירה המונית של כל גרסה באמצעות מסנן מסה מרובע לניתוח טרשת נפוצה מלמעלה למטה, ללא הפרעה מיוני הקטיון-adduct של הגרסה האחרת.

ספקטרום MS דו-מושבי של יוני שבר מייצגים מוצג באיור 5. ההצמדה וההתאמה הייחודיות של β-lg מגבילות את יעילות הפיצול בין Cys82 ל-Cys176 מכיוון שנדרשת אנרגיית פיצול נוספת כדי לבקע את הקשרים הדיסולפידיים המקיפים אזור^{זה 14}, וכתוצאה מכך מספר נמוך יותר ושפע יחסי של z-ions (C-terminal) מאשר c-ions (N-terminal) (איור 5A,B). בעיה זו ניתן לפתור על ידי שילוב עם הפחתת דיסולפיד^מתקרב 21,22,23,24. בעוד שרוב יוני השבר המופקים מ-β-lg A ו-β-lg B מציגים מידה דומה של ספיגת דיאוטריום (איור 5A,B), מקטעים גדולים יותר המכסים את אתרי וריאציית הרצף (המיוצגים על-ידי יונים כגון c137) מ-β-lg A מוזכרים במידה רבה יותר באופן משמעותי מאשר β-lg B (132 לעומת 119 ²אטומי H; איור 5C). תוצאות אלה עולות בקנה אחד עם פרופיל CE ואת תוצאות אפיון קריסטלוגרפיה של וריאנטים אלה. פרופיל CE מציין ניידות אלקטרופורטית גבוהה יותר של β-lg B עקב גמישות מבנית נמוכה יותר. תוצאות אפיון הקריסטלוגרפיה של גרסאות אלה מצביעות על כך ששינויים קטנים בקונפורמציה של עמוד השדרה מתרחשים בקרבת D64G בתקליטור לולאה (שאריות 61-67)¹¹.

איור 3: ניתוח HDX MS מבוסס CE של תערובת של מיוגלובין ואוביקוויטין עם זמני תגובה שונים של HDX. (A) אלקטרופרוגרמה (מבוססת EIC) של ²Mb (אדום) ו- Ub (כחול) בעלי תווית H מתערובת, שנרכשה עם לחצי עירוי BGE שונים. (B) ספקטרום מסה של ^{2 H}עם תווית [Mb]¹⁶⁺ (אדום) ו-[Ub]⁸⁺ (כחול) שנרכשו עם זמני HDX שונים. למעלה מופיעים ספקטרום התייחסות של יונים ללא תווית [Mb]¹⁶⁺ ו-[Ub]⁸⁺ יונים (אפור). (ג) זמן הגירה של Mb (אדום) ו Ub (כחול) כפונקציה של לחץ עירוי BGE. (D) רמת Deuteration של Mb (אדום) ו- Ub (כחול) כפונקציה של זמן התגובה HDX (שווה ערך לזמן ההעברה). נתונים שנרכשו עם CESI 8000 בתוספת מערכת אלקטרופורזה נימית וספקטרומטר מסה UHMR Q Exactive. קיצורים: BGE = פתרון אלקטרוליטים ברקע; CE = אלקטרופורזה נימית; MS = ספקטרומטריית מסה; HDX = חילופי מימן / דיטריום; Mb = מיוגלובין; Ub = ubiquitin; EIC = זרם יונים שחולץ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ניתוח HDX MS מבוסס CE של תערובת טבעית של β-lg A ו-β-lg B מחלב בקר. (A) אלקטרופרוגרמה (מבוססת EIC) של ²β-lg A (כחול) עם תווית H (כחול) ו-β-lg B (אדום) מחלב בקר, שנרכשו עם לחצי עירוי BGE שונים. נתונים שנרכשו עם CESI 8000 פלוס CE מערכת ספקטרומטר מסה UHMR Q Exactive. מעל הוא אלקטרופרוגרמה ממדידה המבוצעת במתקן אחר (אפור), עם PA 800 פלוס מערכת CE ניתוח פרמצבטי וספקטרומטר מסה אורביטראפ היתוך לומוס. (B) ספקטרום מסה של ²H-labeled [β-lg A]¹⁴⁺ (כחול) ו [β-lg B]¹⁴⁺ (אדום) שנרכש עם לחץ עירוי BGE של 1 פסאיי. למעלה מופיעים ספקטרום ייחוס של β-lg A]¹⁴⁺ ו-[β-lg B]¹⁴⁺ יונים (אפור). קיצורים: BGE = פתרון אלקטרוליטים ברקע; CE = אלקטרופורזה נימית; MS = ספקטרומטריית מסה; HDX = חילופי מימן / דיטריום; Ig = אימונוגלובולין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ספקטרום MS דו-מושבי של יונים ייצוגיים המופקים מ-β-lg A (כחול) ו-β-lg B (אדום). (א) יונים c10 מצויים בשפע ומוכתרים בהיקפים דומים; (ב) יונים z29 הם פחות שופעים ומוכתרים בהיקפים דומים; (ג) יונים c137 מכסים את אתרי וריאציית הרצף ומוכתרים במידה שונה באופן משמעותי β-lg A ו- B. מיקומי המקטעים המתאימים מאוירים כחלקים בצבע כתום של מבנה הגביש של β-lg B (מזהה PDB: 5IO5). קיצורים: טרשת נפוצה = ספקטרומטריית מסה; Ig = אימונוגלובולין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המטרות של ציפוי הקיר הפנימי של נימי CE כוללות את מזעור הזרימה האלקטרו-קוסמוטית וספיגת החלבון במהלך תהליך CE¹³. למרות שזרימה אלקטרוסמוטית מועילה לניתוח CE קונבנציונלי של מולקולות קטנות בשל יכולתה להניע מינים ניטרליים או טעונים הפוך לגלאי, היא פוגעת ביעילות ההפרדה של מינים חלבונים בגדלים דומים וחיובים נטו בתמיסה. ציפוי הנימים עם HPC ממזער את הזרימה האלקטרו-קוסמוטית הנגרמת על ידי קבוצות הסילנול על הקיר הפנימי של הנימים. בנוסף, מיסוך קבוצות סילנול אלה מפחית את האינטראקציה שלהם עם חלבונים, הימנעות הגירה מואטת או אפילו שמירה מלאה של חלבונים בנימה.

במהלך האלקטרופורזה, הן הניתוחים והן הציטוטים והאניונים מה- BGE עוברים הגירה אלקטרופורטית. עם צימוד עם טרשת נפוצה, מאגר של BGE בצד המתח השלילי של נימי CE מוחלף בממשק CE-MS עם הרכב שונה. החלת לחץ המחדיר ברציפות BGE טרי לתוך הנימים מהמאגר בצד המתח החיובי בקצב זרימה מסוים ממזערת את שיפוע הריכוז של תוכן BGE לאורך הנימים, אשר מועיל לביצועי ההפרדה.

זמן התגובה HDX הוא פרמטר חיוני בקביעת שער החליפין באתר / פלח נתון ואפיון הדינמיקה של מבנים מסדר גבוה יותר של חלבונים. בסכימת HDX המבוססת על CE, כאשר הנימים מלאים ב- BGE מוערך, זמן התגובה של HDX תלוי בנפח הפנימי של הנימים ובמהירות הנדידה של הניתוחים. למרות שהנפח הפנימי של הנימי עשוי להיות מותאם על ידי שינוי האורך או המזהה של הנימים, מידת ההתאמה בשיטה זו מוגבלת על ידי גורמים כגון האורך המינימלי הנדרש לחיבור מכשירי CE ו- MS ואת לחץ הגב הנוסף ואת הסיכון של סתימה הנגרמת על ידי מזהה מופחת.

לעומת זאת, שינוי לחץ עירוי BGE היא דרך יעילה כמעט להתאים את זמן התגובה HDX על פני טווח רחב. עם זאת, עדיין מאתגר להוריד את זמן ה-HDX לערכים בתת-המינימום מכיוון שקצב זרימה גבוה מסכן את ההשמדה בממשק ESI. כדי להשיג זמן HDX נמוך יותר, את הכמות הרצויה של BGE שאינו deuterated ניתן להזריק לתוך נימי כי כבר מלא עם BGE deuterated לפני הזרקת מדגם. זה יעזור להפחית את אורך סעיף BGE deuteated כי חלבוני ניתוח צריך לעבור דרך אינטראקציה עם במהלך הנדידה שלהם. גישה זו מאפשרת הפחתת זמן HDX יעיל לסולם השני⁸.

סימולציה של שדה המהירות והתפלגות הריכוז כאשר הניתוח מוחדר כל הזמן לתוך המיקרוביאלי מגלה כי זרימת CE מדוללת ביעילות על ידי פתרון המכפיל במיקרווויאלי הזרימה, וכי משך הנסיעה של האנליט באזור ערבוב זה הוא בקנה המידה השני בהיעדר זרימה אלקטרוזמוטית²⁵ . למרות HDX של אתרי אמיד עמוד השדרה מוגן מבנית הוא "מרווה" על ערבוב עם מכפיל חומצי, ערכת ערבוב כזה גורמת לאובדן תוויות דיטריום על אטומי מימן להחלפה מהירה (כולל אלה בשרשראות הצדדיות) כאשר נעשה שימוש במכפיל שאינו מוערך. בהתאם לכך, ^{יש להשתמש ב- 2}H₂O ובמתנול deuterated כדי להכין את הצירוף במדידות הדורשות את תוויות הדיאוטריום באתרים הניתנים להחלפה מהירה להישמר לניתוח טרשת נפוצה.

המגבלות של הערכה הנוכחית של גישת HDX MS מבוססת CE זו קשורות (1) לוויסות הזמן של HDX ו-(2) חילופי מימן נוספים בין מנתחי החלבון לפתרון המכפיל בממשק הזרימה. הקביעה של קצב הזרימה האפקטיבי מבוססת על ההערכה באמצעות המתאם האמפירי שלה עם פרמטרים כגון לחץ עירוי, פרמטרים נימיים, ופרמטרי פתרון (ראה שלב 2.3.4), בגלל זה ומכיוון שזה לא אפשרי למדוד במדויק את הנפח הפנימי של הנימים (או שונה או לא שונה, תוצרת בית או מסחרי), זמן HDX לא ניתן להגדיר בכוונה עם דיוק גבוה על ידי התאמת הפרמטרים הפעולה. עם זאת, ניתן למדוד במדויק את זמן ה- HDX המתקבל באופן ניסיוני.

פתרון המכפיל המשמש בגישה זו כולל ממס אורגני, המאפשר טרשת נפוצה דו-מושבית על ידי פתיחת החלבונים, וחומצה כדי למזער תגובות חילופיות נוספות על ידי הורדת ה- pH ל -2.5. מכיוון שאין זה אפשרי להימנע משימוש בממסים פרוטיים, החלפה בין חלבונים ופתרון הצירוף מתרחשת עם הערבוב שלהם בממשק CE-MS. כאשר נעשה שימוש בפתרון מכפיל שאינו מוערך, אתרים הניתנים להחלפה מהירה מאבדים בשלב זה את תוויות הדיאוטריום שלהם, ורק אתרים מוגנים היטב נשארים מסומנים בתווית, מה שמגביל את הרגישות בהשוואת חלבונים עם הבדלים קונפורמיים קלים. תופעות כאלה ניתן לכייל חלקית על ידי מדידת החלבון deuteated מלא במדגם התייחסות.

ביצוע HDX ב- CE מספק אמצעי להפרדת מינים של חלבונים בתמיסה במהלך HDX כדי למנוע הפרעות מיונים של מינים שכנים באפיון טרשת נפוצה מלמעלה למטה של מינים בודדים וגישה של אתחול תגובת HDX. בתגובת HDX זו, החלבונים שיש לטפח לחלוטין עוזבים לחלוטין את הסביבה המקורית שאינה מתויגת בשל היכולות השונות שלהם. זאת בניגוד לפעולת הדילול הקונבנציונלית, שבה נשמר שבריר של תוכן שאינו מוערך (בדרך כלל נע בין 1% ל -10%) . בהתחשב ביתרונות ההתפתחויות האחרונות של טכניקת MS מלמעלה למטה, אנו מצפים לשפר גישה זו עוד יותר, כך שניתן יהיה לכלול אותה בארגז הכלים האמין לאפיון דיפרנציאלי של מבנים מסוג חלבון מסדר גבוה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ד.ד. י. חן הוא ממייסדי מכון הידע לבריאות לביומולקולות, הממסחר את ממשק CE-MS המיקרוביאלי השוטף. לסופרים אחרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC 21974069). המחברים קיבלו גם תמיכה מהמכון לניתוח תאים, מעבדת מפרץ שנזן, סין; מרכז החדשנות השיתופית של ג'יאנגסו לחומרים פונקציונליים ביו-רפואיים; והמעבדה העיקרית של ג'יאנגסו לחומרים ביו-רפואיים באוניברסיטת נאנג'ינג נורמל, סין.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ammonium acetate	Fisher Chemical	A/3446/50	≥99%
CESI 8000 plus capillary electrophoresis system	Sciex, USA
centrifuge	Eppendorf	5406000097
centrifugal filter	Merck	UFC201024	10 kDa cutoff
deuterium oxide	Energy Chemical	E090001	99.9 % D
formic acid	Acros Organics	270480250
fused silica glass capillary	Polymicro Technologies	1068150017	ID 50μm, OD 360μm
gas chromatography	Agilent	GC6890N
hydrochloric acid	Sigma Aldrich	258148
hydroxypropyl cellulose	Aladdin	H113415	MW 100000
magnetic stirrers	DLAB	8030101212
methanol	Fisher Chemical	A456-4	MS grade
microvolume UV-Vis spectrophotometer	DeNovix	84677JK7731
myoglobin	Sigma Aldrich	M1882
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific, USA
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System	Beckman Coulter, USA
Q Exactive UHMR mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Germany
sodium hydroxide	Sigma Aldrich	S5881
ubiquitin	Sigma Aldrich	U6253
ultrasonicator	SCIENTZ	SB-5200
β-lactoglobulin	Sigma Aldrich	L0130