Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Водородно-дейтериевый обмен на основе капиллярного электрофореза для конформационной характеристики белков с помощью масс-спектрометрии сверху вниз

Published: June 8, 2021 doi: 10.3791/62672
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1, 3, 1
1School of Chemistry and Materials Science, Nanjing Normal University, 2Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, 3Department of Chemistry, University of British Columbia

Summary

Здесь представлен протокол для подхода на основе капиллярного электрофореза на основе водорода / дейтерия (HDX) в сочетании с масс-спектрометрией сверху вниз. Этот подход характеризует различие в структурах более высокого порядка между различными видами белков, включая белки в разных состояниях и различные протеоформы, путем проведения одновременного дифференциального HDX и электрофоретического разделения.

Abstract

Разрешение конформационной гетерогенности множественных белковых состояний, сосуществующих в растворе, остается одним из основных препятствий в характеристике белковой терапии и определении конформационных путей перехода, критически важных для биологических функций, начиная от молекулярного распознавания до ферментативного катализа. Реакция водородно-дейтериевого обмена (HDX) в сочетании с масс-спектрометрическим анализом сверху вниз (MS) обеспечивает средство для характеристики структур и динамики белка более высокого порядка в зависимости от конформера. Конформационная разрешающая способность этого метода в значительной степени зависит от эффективности разделения белковых состояний на уровне интактного белка и минимизации остаточного недейтерированного протического содержания во время реакций HDX.

Здесь мы описываем вариант подхода HDX MS на основе капиллярного электрофореза (CE), который направлен на улучшение конформационного разрешения. При таком подходе белки подвергаются реакциям HDX при миграции через дейтерированный раствор фонового электролита (BGE) во время капиллярного электрофоретического разделения. Различные белковые состояния или протеоформы, которые сосуществуют в растворе, могут быть эффективно разделены на основе их различного соотношения заряда к размеру. Разница в электрофоретической подвижности между белками и молекулами протического растворителя сводит к минимуму остаточный недететерированный растворитель, что приводит к почти полной дейтерирующей среде во время процесса HDX. Проточный микроволичный интерфейс CE-MS обеспечивает эффективную электрораспылительную ионизацию элюированных белковых веществ после быстрого смешивания с раствором модификатора закалки и денатурации на выходе из опрыскивателя. Онлайн-анализ РС сверху вниз измеряет глобальный уровень дейтрации элюированных интактных белковых видов и, следовательно, дейтрацию их фрагментов газовой фазы. В данной работе демонстрируется этот подход в дифференциальном HDX для систем, включая естественные варианты белка, сосуществующие в молоке.

Introduction

Различение белковых видов в различных конформационных, связывающих или модифицирующих состояниях и характеристика их структурных различий важны для мониторинга путей переходов между этими видами, участвующими в биологических событиях, начиная от молекулярного распознавания до ферментативного катализа, и понимания механизмов, лежащих в основе этих событий. Обычные биофизические методы не обеспечивают полного решения из-за таких ограничений, как недостаточное разрешение и потеря динамической информации в растворе. Водородно-дейтериевый обмен в сочетании с масс-спектрометрией (HDX MS) представляет собой метод, который маркирует структурные и конформационные особенности белков дейтерием (2H) посредством обмена между лабильными атомами водорода белков и 2H из преднамеренно введенного раствора 2H2O. Протоны, участвующие в водородной связи или изолированные от растворителя внутри белка, не обмениваются легко1. Таким образом, поскольку обменный курс на обменном участке сильно зависит от его участия в структурах более высокого порядка, белковые структуры могут быть выявлены с высоким пространственным разрешением MS, который исследует степень и скорость поглощения 2H на основе различных атомных масс между 1H и 2H. За последние десятилетия HDX MS стал чрезвычайно успешным методом изучения конформаций и динамики белка2.

В классическом восходящем подходе HDX MS ансамбль белковых видов в различных конформационных, связывающих или модифицирующих состояниях протеолизируется без разделения на интактном белковом уровне, что делает невозможным характеристику отдельных видов путем анализа полученных протеолитических фрагментов с запутанным содержанием дейтерия. Напротив, в нисходящем подходе различные белковые состояния или протеоформы, которые включали различное содержание дейтерия, приводят к множественному распределению неповрежденных белковых масс при сканировании РС. Это позволяет отдельным видам быть разделенными путем массового отбора ионов, соответствующих каждому распределению массы, с использованием надлежащего массового фильтра (такого как квадруполь) и характеристики их конформационных различий в последующем тандемном анализе МС 3,4,5,6. Однако эффективность разделения белковых состояний или протеоформ в этой стратегии ограничена степенью разницы в их соответствующих массовых распределениях.

Капиллярный электрофорез (СЕ) обеспечивает средство для разделения белковых видов на основе их различных зарядов и гидродинамических размеров в фазе раствора с высокой эффективностью7. Сочетание CE с HDX обеспечивает дополнительное разделение белковых состояний или протеоформ в фазе раствора. Кроме того, небольшой объем капилляра CE позволяет использовать полностью дейтерированный раствор в качестве фонового раствора электролита (BGE), т. е. работающего буфера, превращая капилляр в реактор HDX для образцов белка. Из-за разницы в электрофоретической подвижности между белками и протическими реагентами в процессе электрофореза, проведение HDX во время CE приводит к почти полной дейтерирующей среде для белковых аналитов с минимальным остаточным недететерированным содержимым, тем самым повышая чувствительность структурного анализа с использованием данных HDX. Таким образом, мы разработали дифференциальный подход HDX на основе CE в сочетании с нисходящим MS для характеристики белковых структур более высокого порядка специфическим для состояния или протеоформа способом8.

В этом документе описываются протоколы для этого подхода путем подробного описания этапов подготовки материала, экспериментальной процедуры и анализа данных. Факторы, которые могут повлиять на производительность метода или качество данных, перечислены в кратких примечаниях. Репрезентативные результаты, представленные здесь, включают дифференциальные данные HDX смесей различных белков и природных вариантов бычьего β-лактоглобулина (β-lg), основного сывороточного белка, присутствующего в молоке9. Мы демонстрируем эффективность разделения, воспроизводимость и производительность 2H-маркировки двух распространенных вариантов β-lg, т.е. A и B10,11 во время HDX на основе CE и характеризацию их конформаций для конкретных вариантов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности используйте высокоэффективные реагенты для жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или РС, чтобы свести к минимуму загрязняющие вещества, которые могут мешать анализу РС. Не прикасайтесь к интерфейсу CE-MS голыми руками во время измерения, чтобы избежать возможности поражения электрическим током, вызванного электрофоретическим напряжением или напряжением электрораспыления.

1. Подготовка материала

  1. Модификация плавленого капилляра кремнезема для CE
    1. Готовят 5% (мас./мас.) раствор гидроксипропилцеллюлозы (HPC) путем растворения порошка HPC (молекулярная масса [MW]: 100 кДа) в воде с непрерывным перемешиванием при комнатной температуре на магнитной мешалке в течение ~12 ч или до полного исчезновения твердых частиц12. Удалите все видимые пузырьки воздуха с помощью ультразвукового аппарата.
    2. Смонтируйте в прибор CE расплавленный капилляр из кремнеземистого стекла (внутренний диаметр [ID]: 50 мкм, наружный диаметр [OD]: 360 мкм) длиной приблизительно 85 см. Промыть капилляр путем непрерывного настаивания органического растворителя, такого как ацетон13, используя автосамплер CE при давлении инфузии 40 фунтов на квадратный дюйм в течение 10-15 мин.
    3. Заполните очищенный капилляр раствором HPC с помощью автопробоотборника при давлении инфузии 40 фунтов на квадратный дюйм (что часто занимает ~ 40 минут). Вливайте воздух в заполненный HPC капилляр со скоростью 40 фунтов на квадратный дюйм, чтобы обеспечить свободный воздушный поток в капилляре, о чем свидетельствуют пузырьки воздуха, выбрасываемые из капилляра при погружении в воду.
    4. Выпекать капилляр с покрытием HPC в температурно-программируемой печи (в идеале колонной печи с контролируемой температурой газового хроматографа) с газообразным азотом (25 фунтов на кв. дюйм), протекающим через капилляр, следуя температурной программе, показанной на рисунке 1.
    5. Охладите духовку до комнатной температуры, прежде чем вынуть капилляр. Используйте этот капилляр, модифицированный HPC, для разделения CE.

Figure 1
Рисунок 1: Рекомендуемая температурная программа для капиллярной выпечки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Раствор фонового электролита (БГЭ) и раствор модификатора8
    1. Готовят 1-10 мл БГЭ в желаемой концентрации (например, 10 мМ), растворяя соответствующее количество ацетата аммония в 2 Ч2О. Поместите 200мкл-аликвот БГЭ в отдельные флаконы БГЭ и запечатайте флаконы парапленкой, чтобы свести к минимуму реакцию HDX между БГЭ и водяным паром в воздухе.
    2. Готовят 10 мл раствора модификатора с 75% (v/v) метанолом и 25% (v/v) воды, с рН, скорректированным до 2,5 с использованием муравьиной кислоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 2H2Oи дейтерированный метанол для приготовления раствора модификатора, если атомы дейтерия в боковых цепях и незащищенные амиды позвоночника должны быть сохранены для обнаружения РС.
  2. Обессоливание белковых образцов
    1. Готовят раствор ацетата аммония в недетерированной воде в нужной концентрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать концентрацию менее 100 мМ, чтобы избежать сильного электрического тока во время электрофореза и возникающего в результате эффекта нагрева Джоуля.
    2. При необходимости отрегулируйте рН раствора ацетата аммония до нужного уровня с помощью муравьиной кислоты (для рН < 6,8) или гидроксида аммония (для рН > 6,8).
    3. Заменить исходные буферы белкового раствора раствором ацетата аммония (приготовленным в недететерированной воде в желаемой концентрации; рН, скорректированным до 7,5 с гидроксидом аммония) через по меньшей мере пять последовательных концентраций и стадий разбавления при 4 °C с использованием центробежного фильтра с надлежащим отключением MW.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы белка, подлежащие обессоливанию, могут быть либо получены в результате предыдущих производственных процедур (например, очистки или состава), либо получены путем растворения лиофилизированного порошка белка. «Соли», подлежащие удалению из растворов образцов на этом этапе, относятся в целом ко всем малым ионам или молекулам, которые являются нелетучими. Хотя эти виды могут быть эффективно отделены от белков в процессе электрофореза, этот этап рекомендуется, чтобы избежать компрометации электрофоретического разрешения и, таким образом, свести к минимуму загрязнение масс-спектрометра. Когда белковые аналиты должны быть стабилизированы специфическими солями или добавками, включите их в состав БГЭ.
    4. Определить концентрацию белка можно с помощью микрообъемного спектрофотометра UV-Vis.

2. Работа анализа HDX MS на основе CE

ПРИМЕЧАНИЕ: Масс-спектрометр, используемый в этом подходе, должен быть оснащен анализатором массы со сверхвысоким разрешением, таким как циклотронный резонанс с преобразованием Фурье (FTICR) или орбитрап, массовым фильтром, таким как квадруполь, который позволяет выбирать массу ионов-предшественников для фрагментации, и функциями диссоциации переноса электронов (ETD) или диссоциации захвата электронов (ECD) для выполнения нисходящего анализа с надежными тандемными данными MS (в идеале изотопно разрешенные сигналы фрагментов ионов).

  1. Оптимизация настроек CE и MS
    1. Выполните пилотное измерение MS с использованием стандартного источника электрораспылительной ионизации (ESI) путем распыления либо предварительно загруженного образца из боросиликатного стеклянного капилляра с металлическим покрытием («статическая» схема nanoESI), либо непрерывно вводимого образца из металлического излучателя для оптимизации настроек MS для измерения неповрежденных белков (MS1) и их газофазных фрагментов (MS2). Фрагментировать интересующие белковые виды путем массового отбора ансамбля его ионов в однозарядном состоянии с последующим ETD или ECD ионов-предшественников.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основные настройки включают параметры, влияющие на дезинсервацию, массовый отбор ионов-предшественников (во избежание вмешательства со стороны других видов) и эффективность фрагментации. Как центр, так и ширина окна выбора массы должны быть увеличены, чтобы соответствовать результирующему массовому распределению ионов анализируемого вещества после HDX. Поскольку окно элюирования вида белка в CE обычно колеблется от 0,5 мин до 2 мин, оцените эффективность фрагментации на основе сканирования MS2, накопленного за сопоставимое временное окно. Оптимальные значения этих параметров являются белково-специфическими; читатели ссылаются на ранее опубликованные отчеты по примерным настройкам 8,14.
    2. Выполните пилотное измерение CE с помощью прибора CE, оснащенного оптическим детектором, то есть детектором фотодиодной решетки (PDA) или УФ-детектором для оптимизации настроек CE для разделения белковых видов и времени миграции, что эквивалентно времени реакции HDX.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным в зависимости от наличия оптического детектора CE. При отсутствии оптического детектора настройки CE могут быть оптимизированы с использованием CE-MS после завершения раздела 2.2, следуя инструкциям, описанным в разделе 2.3. Основные настройки включают параметры, которые влияют на эффективность разделения, пиковые формы, показанные на электроферограммах, и время элюирования.
  2. Предварительное кондиционирование установки CE-HDX
    1. Очистите проточный микровизионный интерфейс CE-MS смесью 50% метанола, 49% воды и 1% муравьиной кислоты (v/v) с использованием ультразвука в течение не менее 30 мин при комнатной температуре.
    2. После установки HPC-модифицированного капилляра на инструмент CE промойте капилляр с помощью автопробоотборника в течение 10 минут и оставьте капилляр заполненным BGE.
    3. Получить надлежащую длину немодифицированной плавленой капиллярной трубки кремнезема (ID: 50 мкм, OD: 360 мкм) в качестве инфузионной трубки для раствора модификатора. Соедините трубку-модификатор с газонепроницаемым стеклянным шприцем с тупым наконечником с помощью соединения и соответствующей втулки и промойте трубку раствором модификатора с помощью инфузионного насоса в течение не менее 10 мин.
    4. Вставьте выпускные отверстия капиллярной и модификаторной трубки CE с покрытием HPC, которые были загружены соответствующими решениями, в очищенный интерфейс CE-MS, как показано на рисунке 2.
    5. Выдвигайте шприц для инфузии модификатора либо вручную, либо с помощью инфузионного насоса, чтобы убедиться, что раствор модификатора достигает кончика интерфейса. Установите собранный интерфейс CE-MS на корпус источника nanoESI масс-спектрометра.

Figure 2
Рисунок 2: Схематическая иллюстрация установки HDX MS на основе CE. Эта цифра была изменена с8. Сокращения: BGE = раствор фонового электролита; CE = капиллярный электрофорез; MS = масс-спектрометрия; HDX = водородно-дейтериевый обмен; ESI = электрораспылительная ионизация; FTICR = циклотронный резонанс ионов с преобразованием Фурье; ETD = диссоциация переноса электронов; ECD = диссоциация захвата электронов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Одновременное разделение CE, реакция HDX и анализ MS
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дейтерированный БГЭ рекомендуется использовать в течение 1 дня после вскрытия.
    1. Приложите напряжение распыления 3-5 кВ к интерфейсу CE-MS.
    2. Начните вливание раствора модификатора с инфузионным насосом со скоростью потока от 0,1 до 10 мкл/мин и обеспечьте стабильное электрораспыление на кончике интерфейса CE-MS.
    3. Поместите флакон с образцом, содержащий BGE, в автопробоотборник и используйте его на этапе 2.3.4 для получения пустых электроферограмм и пустых масс-спектров.
    4. Вводите раствор образца с помощью автопробоотборника при 2 фунтах на квадратный дюйм и в течение надлежащего периода времени, чтобы обеспечить инъекцию желаемого количества образца. Оцените объем впрыска, используя соотношение между объемом впрыска и параметрамивпрыска 15 , определенным уравнением (1).
      Equation 1 (1)
      Где Vinj - объем инъекции, Δp - давление инъекции, dc - внутренний диаметр капилляра, A - поперечное сечение капилляра, tinj - продолжительность инъекции, η - вязкость жидкости в капилляре, а L - длина капилляра.
    5. Начните разделение СЕ, применив электрофоретическое напряжение 30 кВ и давление инфузии в диапазоне от 0 до 2 фунтов на квадратный дюйм, и получите электроферограмму. Между тем, начать сбор данных МС в хроматографическом режиме, где график ионного тока получается в зависимости от времени, а соответствующие МС-сканы автоматически не объединяются в единый спектр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Белки подвергаются спонтанной реакции HDX в точке контакта молекул 2H2O в BGE во время их электрофоретической миграции на этом этапе. Оптическое обнаружение для CE может использоваться в дополнение к обнаружению MS. Поскольку обнаружение на колонне требует удаления определенной длины полиимидного покрытия на выходном конце расплавленного капилляра кремнезема, следует проявлять дополнительную осторожность, чтобы избежать повреждения капилляров во время сборки интерфейса CE-MS.
    6. Сохраните пустую электроферограмму и масс-спектры в качестве ссылок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пустые данные должны использоваться для устранения неполадок, а не для базового вычитания.
    7. Поместите флаконы с образцом, содержащие желаемые концентрации растворов образца белка, в автопробоотборник. Получите электроферограммы и масс-спектры для образцов белка, выполнив шаги 2.3.4-2.3.5. Соберите достаточное количество ms-сканирований для получения спектров MS1 электрофоретически разделенных и 2H-меченых белковых форм.
    8. Выполняйте тандемные измерения MS для интересующих видов либо после получения спектров MS1 в рамках того же пробега, либо в последующем, отдельном прогоне.
    9. При необходимости отрегулируйте время миграции/время реакции HDX, изменив давление инфузии или длину капилляра CE. Если время реакции HDX должно быть короче, чем время миграции, используйте подход, описанный ранее8, который использует как дейтерированный, так и невейтерированный BGE в капилляре во время процесса CE.
    10. Промывайте капилляр CE BGE при давлении 20 фунтов на квадратный дюйм в течение не менее 10 минут после каждого измерения.
    11. По завершении экспериментов очистите интерфейс CE-MS и все трубки для хранения.
    12. Получить набор данных образца «конечной точки» HDX (который может быть подготовлен с использованием подходов, описанных ранее 6,16) с MS в режиме прямой инфузии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг требуется только в том случае, если для HDX на основе CE используется дейтерированное модификаторное решение.

3. Анализ данных

  1. Анализ данных CE
    1. Используйте один из следующих графиков в качестве электроферограммы для определения электрофоретических характеристик, включая количество пиков, время миграции и эффективность разделения: (a) поглощение УФ-излучения против времени миграции, полученное оптическим детектором прибора CE (при наличии); b) график общего ионного тока (ТИЦ), полученный MS; c) график извлечь ионного тока (EIC/XIC), полученный MS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: EIC/XIC обеспечивает оптимальное соотношение сигнал/шум (S/N), в целом, среди вышеупомянутых форматов электроферограмм. Примечательно, что даже при отсутствии каких-либо инструментальных смещений, в то время как поглощение УФ-излучения пропорционально массовой концентрации белка, сигнал РС пропорционален молярной концентрации. Следовательно, разумно наблюдать различия в пиковых паттернах между электроферограммами, полученными из CE и MS.
    2. Используйте площадь под кривой (AUC) пиков, показанных в электроферограммах, для полуквантования. Для образцов, включающих белковые комплексы, используйте подход, описанный ранее17 , для вывода данных о концентрации массы из электроферограмм TIC/EIC.
  2. Анализ данных MS
    1. Получите спектры MS1 и MS2, объединив сканы MS1 и MS2, полученные в соответствующих окнах элюирования соответственно.
    2. Определите массы интактного белка (M (интактный белок)) и фрагментов одним из следующих двух методов.
      1. Рассчитайте средние массы ионов, дающих начало изотопно разрешенным сигнальным кластерам.
      2. Используйте центр гауссовских кривых, возникающих в результате подгонки соответствующих изотопных оболочек6.
    3. Используйте программное обеспечение, такое как Biopharma Finder, ProSight18 или MASH Suite19 , для создания массового списка фрагментов ионов и их идентификации.
  3. Анализ данных HDX
    1. Определите общий уровень дейтрации интактного вида белка с помощью уравнения (2).
      Equation 2 (2)
      где M (2H) или M (1H) — атомные веса 2H или 1H. Звездочкой обозначены данные образца с маркировкой 2H.
    2. Определите кумулятивную защиту или кумулятивную дейтрацию магистральных амидов определенного сегмента.
      1. Для данных, полученных с помощью дейтерированного модификатора, используйте уравнения (3) и (4) для определения кумулятивного уровня защиты.
        Equation 3 (3)
        Equation 4 (4)
        Где P(Sk(N)) - полная защита N-концевого сегмента, охватывающего остатки от 1 до k, P(Sm(C)) - полная защита C-концевого сегмента, содержащего m остатков, M (2H) или M (1H) - атомные массы 2H или 1H, а M (ci) или M (zi) - молекулярные массы ионов ci или zi .
        ПРИМЕЧАНИЕ: Двойная звездочка указывает на данные образца "конечной точки" HDX.
      2. Для данных, полученных с помощью невыполненного решения модификатора, используйте уравнения (5) и (6) для определения кумулятивного уровня дейтерации.
        Equation 5 (5)
        Equation 6 (6)
        Где D(Sk(N)) - кумулятивное поглощение дейтерия N-концевым сегментом, охватывающим остатки от 1 до k; D(Sm(C)) - кумулятивное поглощение дейтерия С-концевым сегментом, содержащим м-остатки .
    3. Определение уровня дейтрации в локальной амидной группе позвоночника
      1. Для данных, полученных с помощью дейтерированного модификаторного решения, используйте уравнения (7), (8), (9), (10) и (11) для определения локального уровня защиты.
        для данных, полученных из с-ионов
        Equation 7 (7)
        для данных, полученных из z-ионов
        Equation 8 (8)
        Где P(Ri) — защита основного амида при остатке i, а подстрочный индекс «total» обозначает общее остаточное число белка.
        Для участков остатков, где последующие фрагменты ионов отсутствовали, назначьте P(Ri), используя уравнения (9) и (10).
        для данных, полученных из с-ионов
        Equation 9 (9)
        для данных, полученных из z-ионов
        Equation 10 (10)
        Затем определите уровень дейтрации D(Ri) в локальной амидной группе позвоночника с помощью уравнения (11).
        Equation 11(11)
      2. Для данных, полученных с помощью невыполненного решения модификатора, используйте уравнения (12), (13), (14) и (15) для определения локального уровня защиты.
        для данных, полученных из с-ионов
        Equation 12(12)
        для данных, полученных из z-ионов
        Equation 13(13)
        Где D(Ri) — защита амида позвоночника при остатке i, а подстрочный индекс «всего» обозначает общее остаточное число белка.
        Для участков остатков, где последующие фрагменты ионов отсутствовали, назначьте D(Ri), используя уравнения (14) и (15).
        для данных, полученных из с-ионов
        Equation 14 (14)
        для данных, полученных из z-ионов
        Equation 15 (15)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Изменение давления инфузии BGE позволяет регулировать как эффективность разделения, так и время миграции, что эквивалентно времени реакции HDX разделяемых белков (рисунок 3). Более низкое давление инфузии приводит к лучшему разделению пиков CE за счет продолжительности эксперимента (рисунок 3A). Более длительное время реакции миграции/HDX приводит к более высокому уровню дейтрации белковых аналитов (рисунок 3B-D). При временной шкале HDX в минутах разница в дейтерации должна в первую очередь отражать различные протяженности обмена на структурно защищенных участках, а не на быстрозаменяемых участках. В соответствии с тенденцией функций времени дейтрации, показанной любым из видов белка, разница во времени миграции вряд ли будет основным фактором разницы в дейтерации. Действительно, в дифференциальном CE-HDX голо- и апо-миоглобина (Mb)8 более ранний элюированный apo-Mb показывает более высокий уровень дейтрации, чем голо-Mb, что ясно указывает на то, что конформационная разница является основным фактором, определяющим измеренную разницу дейтрации.

Коррекция разницы дейтрации, введенной разницей во времени миграции, может быть выполнена с помощью подгонки кривой для данных уровня дейтрации по сравнению со временем HDX (рисунок 3D). Варианты A и B β-lg отличаются только двумя аминокислотными остатками в своей последовательности (D64G и V118A)20. Эти варианты привели к появлению двух адекватно разделенных пиков в электроферограмме, полученной из KIK (рисунок 4A). Воспроизводимые профили разделения были получены из экспериментов, проведенных различными операторами с использованием различных приборов на разных объектах (рисунок 4А). Полученные в результате различные массовые распределения ионов, соответствующие дифференциально 2Н-меченому варианту (рис. 4С), позволяют выбирать массу каждого варианта с помощью квадрупольного массового фильтра для последующего нисходящего анализа МС без помех со стороны катион-аддукционных ионов другого варианта.

Тандемные MS-спектры репрезентативных фрагментов ионов показаны на рисунке 5. Уникальная дисульфидная связь и конформация β-lg ограничивают эффективность фрагментации между Cys82 и Cys176, поскольку для расщепления дисульфидных связей, которые охватывают эту область14, требуется дополнительная энергия фрагментации, что приводит к меньшему числу и относительному количеству z-ионов (C-концевых), чем c-ионов (N-концевой) (рисунок 5A, B). Эта проблема может быть решена путем объединения с дисульфидным восстановлением подходов 21,22,23,24. В то время как большинство фрагментов ионов, полученных из β-lg A и β-lg B, демонстрируют одинаковую степень поглощения дейтерия (рисунок 5A, B), более крупные сегменты, которые покрывают участки вариации последовательности (представленные ионами, такими как c137) из β-lg A, дейтерируются в значительно большей степени, чем β-lg B (132 против 119 атомовH; Рисунок 5С). Эти результаты согласуются с профилем CE и результатами кристаллографической характеристики этих вариантов. Профиль CE указывает на более высокую электрофоретическую подвижность β-lg B из-за более низкой структурной гибкости. Результаты кристаллографической характеристики этих вариантов указывают на то, что небольшие изменения в конформации магистрали происходят в непосредственной близости от D64G на петлевом CD (остатки 61-67)11.

Figure 3
Рисунок 3: Анализ HDX MS на основе CE смеси миоглобина и убиквитина с различным временем реакции HDX. (A) Электроферограммы (на основе EIC) 2H-меченых Mb (красный) и Ub (синий) из смеси, полученные с различными давлениями инфузии BGE. (B) Масс-спектры 2H-меченых [Mb]16+ (красный) и [Ub]8+ (синий), полученные с различным временем HDX. Сверху накладываются эталонные спектры немаркированных ионов [Mb]16+ и [Ub]8+ (серый). (C) Время миграции Mb (красный) и Ub (синий) в зависимости от давления инфузии BGE. (D) Уровень дейтрации Mb (красный) и Ub (синий) в зависимости от времени реакции HDX (эквивалентно времени миграции). Данные, полученные с помощью системы капиллярного электрофореза CESI 8000 plus и масс-спектрометра Q Exactive UHMR. Сокращения: BGE = раствор фонового электролита; CE = капиллярный электрофорез; MS = масс-спектрометрия; HDX = водородно-дейтериевый обмен; Mb = миоглобин; Ub = убиквитин; EIC = извлечь ионный ток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Анализ HDX MS на основе CE природной смеси β-lg A и β-lg B из коровьего молока. (A) Электроферограммы (на основе EIC) 2H-меченых β-lg A (синий) и β-lg B (красный) из коровьего молока, полученные при различных давлениях инфузии BGE. Данные, полученные с помощью системы CESI 8000 plus CE и масс-спектрометра Q Exactive UHMR. Сверху накладывается электроферограмма из измерения, выполненного на другом объекте (серый), с системой фармацевтического анализа PA 800 Plus CE и масс-спектрометром Orbitrap Fusion Lumos. (B) Масс-спектры 2H-меченых [β-lg A]14+ (синий) и [β-lg B]14+ (красный), полученные при давлении инфузии BGE 1 psi. Сверху накладываются эталонные спектры немаркированных ионов [β-lg A]14+ и [β-lg B]14+ (серый). Сокращения: BGE = раствор фонового электролита; CE = капиллярный электрофорез; MS = масс-спектрометрия; HDX = водородно-дейтериевый обмен; Ig = иммуноглобулин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Тандемные MS-спектры репрезентативных фрагментов ионов, полученных из β-lg A (синий) и β-lg B (красный). (A) ионы c10 обильны и дейтерированы в аналогичной степени; (B) ионы z29 менее распространены и дейтерированы в аналогичной степени; (C) ионы c137 покрывают участки вариации последовательности и дейтерируются в значительно различной степени в β-lg A и B. Расположение соответствующих сегментов проиллюстрировано в виде оранжевых участков кристаллической структуры β-lg B (PDB ID: 5IO5). Сокращения: MS = масс-спектрометрия; Ig = иммуноглобулин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Цели покрытия внутренней стенки капилляра CE включают минимизацию электроосмотического потока и поглощения белка во время процессаCE 13. Хотя электроосмотический поток полезен для обычного анализа СЕ малых молекул из-за его способности направлять нейтральные или противоположно заряженные виды к детектору, он ставит под угрозу эффективность разделения белковых видов с аналогичными размерами и чистыми зарядами в растворе. Покрытие капилляра высокопроизводительными вычислениями минимизирует электроосмотический поток, вызванный силаноловыми группами на внутренней стенке капилляра. Кроме того, маскировка этих силаноловых групп снижает их взаимодействие с белками, избегая замедленной миграции или даже полного удержания белков в капиллярах.

Во время электрофореза как аналиты, так и катионы и анионы из БГЭ подвергаются электрофоретической миграции. При соединении с MS резервуар BGE на стороне отрицательного напряжения капилляра CE заменяется интерфейсом CE-MS с другим составом. Применение давления, которое непрерывно вливает свежий BGE в капилляр из резервуара на стороне положительного напряжения при определенной скорости потока, минимизирует градиент концентрации содержания BGE по всему капилляру, что полезно для производительности разделения.

Время реакции HDX является важным параметром при определении обменного курса на данном участке/сегменте и характеристике динамики структур белков более высокого порядка. В схеме HDX на основе CE, когда капилляр заполнен дейтерированным BGE, время реакции HDX зависит от внутреннего объема капилляра и скорости миграции аналитов. Хотя внутренний объем капилляра может быть отрегулирован путем изменения длины или идентификатора капилляра, степень регулировки с использованием этого метода ограничена такими факторами, как минимальная длина, необходимая для подключения инструментов CE и MS, а также дополнительное противодавление и риск засорения, вызванные снижением ID.

Напротив, изменение давления инфузии BGE является практически эффективным способом регулировки времени реакции HDX в широком диапазоне. Тем не менее, по-прежнему сложно снизить время HDX до значений на субминуте, потому что высокая скорость потока ставит под угрозу дезинсервацию на интерфейсе ESI. Для достижения более низкого времени HDX желаемое количество недететерированного BGE может быть введено в капилляр, который был заполнен дейтерированным BGE перед инъекцией образца. Это поможет уменьшить длину дейтерированного участка БГЭ, через который должны проходить анализируемые белки и взаимодействовать с ними во время их миграции. Такой подход позволяет сократить эффективное время HDX до второй шкалы8.

Моделирование поля скоростей и распределения концентрации при постоянном введении анализируемого вещества в микроволиальность показывает, что CE-поток эффективно разбавляется раствором модификатора на проточной микроволии и что продолжительность перемещения анализируемого вещества в этой области перемешивания находится на второй шкале при отсутствии электроосмотического потока25 . Хотя HDX структурно защищенных амидных участков магистрали «гасится» при смешивании с подкисленным модификатором, такая схема смешивания приводит к потере меток дейтерия на быстрообменяемых атомах водорода (в том числе на боковых цепях) при использовании недететерированного модификатора. Соответственно, 2H2Oи дейтерированный метанол следует использовать для подготовки модификатора в измерениях, требующих сохранения дейтериевых этикеток на быстросменных участках для анализа РС.

Ограничения текущей схемы этого подхода HDX MS на основе CE связаны с (1) регулированием времени HDX и (2) дальнейшим водородным обменом между белковыми аналитами и раствором модификатора на проточном интерфейсе. Определение эффективного расхода основано на оценке с использованием его эмпирической корреляции с такими параметрами, как давление инфузии, капиллярные параметры и параметры раствора (см. шаг 2.3.4), Из-за этого и из-за невозможности точного измерения внутреннего объема капилляра (модифицированного или немодифицированного, самодельного или коммерческого), время HDX не может быть преднамеренно установлено с высокой точностью путем корректировки рабочих параметров. Тем не менее, экспериментально полученное время HDX может быть точно измерено.

Раствор модификатора, используемый в этом подходе, включает органический растворитель, который облегчает тандем МС путем развертывания белков, и кислоту для минимизации дальнейших обменных реакций путем снижения рН до 2,5. Поскольку невозможно избежать использования протических растворителей, обмен между белками и раствором модификатора происходит при их смешивании на границе CE-MS. Когда используется недейтерированный раствор модификатора, быстрообменные сайты теряют свои дейтериевые метки на этой стадии, и только хорошо защищенные участки остаются помеченными, ограничивая чувствительность при сравнении белков с незначительными конформационными различиями. Такие эффекты могут быть частично откалиброваны путем измерения полностью дейтерированного белка в эталонном образце.

Выполнение HDX в CE обеспечивает средство для разделения белковых видов в растворе во время HDX, чтобы избежать вмешательства ионов соседних видов в нисходящую характеристику MS отдельных видов и подход инициализации реакции HDX. В этой реакции HDX белки, подлежащие дейтерации, полностью покидают исходную недететерированную среду из-за их различной мобильности. Это контрастирует с обычной операцией разбавления, где сохраняется часть недететерированного содержимого (обычно в диапазоне от 1% до 10%). Учитывая преимущества последних разработок нисходящей техники РС, мы ожидаем дальнейшего совершенствования этого подхода, чтобы его можно было включить в надежный набор инструментов для дифференциальной характеристики белковых структур высшего порядка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

D. D. Y. Chen является одним из основателей Института биомолекул Knowledge for Health, который коммерциализирует проточный микровизионный интерфейс CE-MS. Другим авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (NSFC 21974069). Авторы также получили поддержку от Института клеточного анализа, Шэньчжэньская лаборатория залива, Китай; Цзянсуский коллаборативный инновационный центр биомедицинских функциональных материалов; и Ключевая лаборатория биомедицинских материалов Цзянсу в Нанкинском педагогическом университете, Китай.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ammonium acetate Fisher Chemical A/3446/50 ≥99%
CESI 8000 plus capillary electrophoresis system Sciex, USA
centrifuge Eppendorf 5406000097
centrifugal filter Merck UFC201024 10 kDa cutoff
deuterium oxide Energy Chemical E090001 99.9 % D
formic acid Acros Organics  270480250
fused silica glass capillary Polymicro Technologies 1068150017 ID 50μm, OD 360μm
gas chromatography Agilent GC6890N
hydrochloric acid Sigma Aldrich 258148
hydroxypropyl cellulose Aladdin H113415 MW 100000
magnetic stirrers DLAB 8030101212
methanol Fisher Chemical A456-4 MS grade
microvolume UV-Vis spectrophotometer DeNovix 84677JK7731
myoglobin Sigma Aldrich M1882
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer Thermo Fisher Scientific, USA
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System Beckman Coulter, USA
Q Exactive UHMR mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific, Germany
sodium hydroxide Sigma Aldrich S5881
ubiquitin Sigma Aldrich U6253
ultrasonicator SCIENTZ SB-5200
β-lactoglobulin Sigma Aldrich L0130

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).
  2. Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
  3. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
  4. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).
  5. Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
  6. Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
  7. Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
  8. Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
  9. Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
  10. Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).
  11. Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
  12. Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
  13. Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
  14. Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
  15. Sutera, S. P., Skalak, R. The history of Poiseuille's law. Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).
  16. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  17. Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
  18. Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
  19. Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
  20. Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
  21. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  22. Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
  23. Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).
  24. Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
  25. Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).

Tags

Химия выпуск 172
Водородно-дейтериевый обмен на основе капиллярного электрофореза для конформационной характеристики белков с помощью масс-спектрометрии сверху вниз
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chaihu, L., Yao, X., Xu, X., Zhu,… More

Chaihu, L., Yao, X., Xu, X., Zhu, Z., Chen, D. D. Y., Wang, G. Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (172), e62672, doi:10.3791/62672 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter