Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kapillær elektroforesebaseret hydrogen/deuteriumudveksling til konformationskarakterisering af proteiner med top-down massespektrometri

Published: June 8, 2021 doi: 10.3791/62672
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1, 3, 1
1School of Chemistry and Materials Science, Nanjing Normal University, 2Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, 3Department of Chemistry, University of British Columbia

Summary

Præsenteret her er en protokol for en kapillær elektroforesebaseret hydrogen / deuterium udveksling (HDX) tilgang kombineret med top-down massespektrometri. Denne tilgang karakteriserer forskellen i højere ordens strukturer mellem forskellige proteinarter, herunder proteiner i forskellige tilstande og forskellige proteoformer, ved at udføre samtidig differentiel HDX og elektroforetisk adskillelse.

Abstract

Løsning af konformationel heterogenitet af flere proteintilstande, der sameksisterer i opløsning, forbliver en af de største hindringer i karakteriseringen af proteinterapi og bestemmelsen af de konformationelle overgangsveje, der er kritiske for biologiske funktioner, lige fra molekylær anerkendelse til enzymatisk katalyse. Hydrogen/deuterium udveksling (HDX) reaktion kombineret med top-down massespektrometrisk (MS) analyse giver et middel til at karakterisere protein højere ordens strukturer og dynamik på en konformator-specifik måde. Den konformationelle opløsningskraft af denne teknik er stærkt afhængig af effektiviteten af at adskille proteintilstande på det intakte proteinniveau og minimere det resterende ikke-deutererede protiske indhold under HDX-reaktionerne.

Her beskriver vi en kapillær elektroforese (CE)-baseret variant af HDX MS-tilgangen, der sigter mod at forbedre konformationsopløsningen. I denne tilgang gennemgår proteiner HDX-reaktioner, mens de migrerer gennem en deuteret baggrundselektrolytopløsning (BGE) under kapillær elektroforetisk adskillelse. Forskellige proteintilstande eller proteoformer, der sameksisterer i opløsning, kan adskilles effektivt baseret på deres forskellige ladnings-til-størrelsesforhold. Forskellen i elektroforetisk mobilitet mellem proteiner og protiske opløsningsmiddelmolekyler minimerer det resterende ikke-deutererede opløsningsmiddel, hvilket resulterer i et næsten fuldstændigt deuteringsmiljø under HDX-processen. Den gennemstrømningsmikroviale CE-MS-grænseflade muliggør effektiv elektrosprayionisering af de eluerede proteinarter efter en hurtig blanding med sluknings- og denatureringsmodifikatoropløsningen ved sprøjtens udløb. Online top-down MS-analysen måler det globale deuterationsniveau for de eluerede intakte proteinarter og efterfølgende deuterationen af deres gasfasefragmenter. Dette papir demonstrerer denne tilgang i differentiel HDX for systemer, herunder de naturlige proteinvarianter, der eksisterer sammen i mælk.

Introduction

At skelne proteinarter i forskellige konformations-, bindings- eller modifikationstilstande og karakterisere deres strukturelle forskelle er vigtige for at overvåge overgangsvejene mellem disse arter, der er involveret i biologiske begivenheder, lige fra molekylær genkendelse til enzymatisk katalyse og forstå de mekanismer, der ligger til grund for disse begivenheder. Konventionelle biofysiske teknikker giver ikke en komplet løsning på grund af begrænsningerne såsom utilstrækkelig opløsning og tab af dynamisk information i løsningen. Hydrogen/deuteriumudveksling kombineret med massespektrometri (HDX MS) er en teknik, der mærker de strukturelle og konformationelle træk ved proteiner med deuterium (2H) via udvekslingen mellem labile hydrogenatomer af proteiner og 2H fra den bevidst indførte2H20-opløsning. Protoner, der er involveret i hydrogenbinding, eller som er sekvestreret fra opløsningsmidlet i proteininteriøret, udveksler ikke let1. Da valutakursen på et udskifteligt sted således er stærkt afhængig af dens involvering i højere ordens strukturer, kan proteinstrukturerne afsløres ved høj rumlig opløsning af MS, der undersøger omfanget og hastigheden af 2H-optagelse baseret på de forskellige atommasser mellem 1H og 2H. I løbet af de seneste årtier er HDX MS blevet en enestående succesfuld teknik til at studere proteinkonformationer og dynamik2.

I den klassiske bottom-up-tilgang til HDX MS proteolyseres ensemblet af proteinarter i forskellige konformations-, bindings- eller modifikationstilstande uden adskillelse på det intakte proteinniveau, hvilket gør det umuligt at karakterisere individuelle arter ved at analysere de resulterende proteolytiske fragmenter med indviklet deuteriumindhold. I modsætning hertil giver forskellige proteintilstande eller proteoformer, der har inkorporeret forskellige deuteriumindhold, i top-down-tilgangen anledning til flere fordelinger af intakte proteinmasser i en MS-scanning. Dette gør det muligt at adskille individuelle arter ved masseudvælgelse af ioner svarende til hver massefordeling ved hjælp af et korrekt massefilter (såsom en quadrupol) og karakteriseringen af deres konformationsforskelle i den efterfølgende tandem MS-analyse 3,4,5,6. Effektiviteten af at adskille proteintilstande eller proteoformer i denne strategi er imidlertid begrænset af omfanget af forskellen i deres tilsvarende massefordelinger.

Kapillærelektroforese (CE) giver et middel til at adskille proteinarter baseret på deres forskellige ladninger og hydrodynamiske størrelser i opløsningsfasen med høj effektivitet7. Kombination af CE med HDX giver yderligere adskillelse af proteintilstande eller proteoformer i opløsningsfasen. Derudover tillader det lille volumen af CE-kapillæren udnyttelse af en fuldt deuteret opløsning som baggrundselektrolytopløsningen (BGE), dvs. den løbende buffer, hvilket gør kapillæren til en HDX-reaktor til proteinprøver. På grund af forskellen i elektroforetisk mobilitet mellem proteiner og protiske reagenser i elektroforeseprocessen resulterer udførelse af HDX under CE i et næsten fuldstændigt deuteringsmiljø for proteinanalytterne med minimalt resterende ikke-deuteret indhold, hvilket øger følsomheden af strukturanalysen ved hjælp af HDX-data. Som sådan udviklede vi en CE-baseret differentiel HDX-tilgang kombineret med top-down MS til at karakterisere protein højere ordens strukturer på en tilstands- eller proteoform-specifik måde8.

Dette papir beskriver protokoller for denne tilgang ved at beskrive trinene i materialeforberedelse, eksperimentel procedure og dataanalyse. Faktorer, der kan påvirke metodens ydeevne eller datakvalitet, er angivet i korte noter. De repræsentative resultater, der præsenteres her, omfatter differentielle HDX-data for blandinger af forskellige proteiner og naturlige varianter af kvæg β-lactoglobulin (β-lg), det vigtigste valleprotein, der findes i mælk9. Vi demonstrerer separationseffektivitet, reproducerbarhed og 2H-mærkningsydelse for de to rigelige varianter af β-lg, dvs. A og B10,11 under den CE-baserede HDX og variantspecifik karakterisering af deres konformationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Brug højtydende væskekromatografi (HPLC) kvalitet eller MS-kvalitet reagenser, når det er muligt for at minimere de forurenende stoffer, der kan forstyrre MS-analysen. Rør ikke CE-MS-grænsefladen med bare hænder under målingen for at undgå muligheden for elektrisk stød forårsaget af enten elektroforetisk spænding eller elektrosprayspænding.

1. Forberedelse af materiale

  1. Ændring af smeltet silicakapillær til CE
    1. En opløsning af 5 % hydroxypropylcellulose (HPC) fremstilles ved at opløse HPC-pulver (molekylvægt [MW]: 100 kDa) i vand under kontinuerlig omrøring ved stuetemperatur på en magnetisk omrører i ~12 timer eller indtil fuldstændig forsvinden af faste partikler12. Fjern eventuelle synlige luftbobler med en ultralydsapparat.
    2. Monter en smeltet silicaglaskapillær (indvendig diameter [ID]: 50 μm, udvendig diameter [OD]: 360 μm) på ca. 85 cm længde i et CE-instrument. Skyl kapillæren ved kontinuerligt at infundere et organisk opløsningsmiddel, såsom acetone13, ved hjælp af autosampleren af CE ved et infusionstryk på 40 psi i 10-15 minutter.
    3. Fyld den rensede kapillær med HPC-opløsning ved hjælp af autosampleren ved et infusionstryk på 40 psi (hvilket ofte tager ~ 40 minutter). Tilsæt luft i den HPC-fyldte kapillær ved 40 psi for at sikre fri luftstrøm i kapillæren, indikeret af luftboblerne, der udstødes fra kapillæren ved nedsænkning i vand.
    4. Bag den HPC-belagte kapillær i en temperaturprogrammerbar ovn (ideelt set den temperaturstyrede søjleovn i en temperaturprogrammeret gaskromatograf) med nitrogengas (25 psi), der strømmer gennem kapillæren, efter temperaturprogrammet vist i figur 1.
    5. Afkøl ovnen til stuetemperatur, inden du tager kapillæren ud. Brug denne HPC-modificerede kapillær til CE-separation.

Figure 1
Figur 1: Et anbefalet temperaturprogram til kapillærbagning. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Baggrundselektrolytopløsning (BGE) og modifikatoropløsning8
    1. Der fremstilles 1-10 ml BGE i den ønskede koncentration (f.eks. 10 mM) ved at opløse den passende mængde ammoniumacetat i 2H20. Anbring 200 μL-alikvoter BGE i separate BGE-hætteglas, og forsegl hætteglassene med parafilm for at minimere HDX-reaktionen mellem BGE og vanddamp i luften.
    2. Der fremstilles 10 ml af en modifikatoropløsning med 75 % (v/v) methanol og 25 % (v/v) vand, idet pH justeres til 2,5 under anvendelse af myresyre.
      BEMÆRK: Brug 2H20og deutereret methanol til fremstilling af modifikatoropløsningen, hvis deuteriumatomerne i sidekæderne og ubeskyttede rygradsamiderne skal tilbageholdes til påvisning af MS.
  2. Afsaltning af proteinprøver
    1. Forbered en ammoniumacetatopløsning i ikke-deuteret vand i den ønskede koncentration.
      BEMÆRK: En koncentration på mindre end 100 mM anbefales for at undgå en høj elektrisk strøm under elektroforese og den resulterende Joule-opvarmningseffekt.
    2. Om nødvendigt justeres pH-værdien i ammoniumacetatopløsningen til det ønskede niveau under anvendelse af myresyre (for pH < 6,8) eller ammoniumhydroxid (for pH > 6,8).
    3. De oprindelige buffere i proteinopløsningen er indskiftes med en ammoniumacetatopløsning (fremstillet i ikke-deuteret vand ved den ønskede koncentration; pH justeret til 7,5 med ammoniumhydroxid) gennem mindst fem sekventielle koncentrationer og fortyndingstrin ved 4 °C ved hjælp af et centrifugalfilter med en korrekt MW-afskæring.
      BEMÆRK: De proteinprøver, der skal afsaltes, kan enten være fra tidligere produktionsprocedurer (f.eks. Oprensning eller formulering) eller fremstillet ved at opløse det lyofiliserede proteinpulver. De "salte", der skal fjernes fra prøveopløsningerne i dette trin, henviser generelt til alle små ioner eller molekyler, der ikke er flygtige. Selvom disse arter effektivt kan adskilles fra proteiner under elektroforeseprocessen, anbefales dette trin for at undgå at kompromittere den elektroforetiske opløsning og dermed minimere forureningen af massespektrometeret. Når proteinanalytter skal stabiliseres af specifikke salte eller tilsætningsstoffer, skal du inkludere dem i BGE.
    4. Bestem proteinkoncentrationen ved hjælp af et mikrovolum UV-Vis spektrofotometer.

2. Drift af CE-baseret HDX MS-analyse

BEMÆRK: Massespektrometeret, der anvendes i denne fremgangsmåde, skal være udstyret med en masseanalysator med ultrahøj opløsning, såsom en Fourier-transformioncyklotronresonans (FTICR) eller orbitrap, et massefilter, såsom en quadrupol, der tillader massevalg af forløberioner til fragmentering, og elektronoverførselssociation (ETD) eller elektronfangstsociationsfunktioner (ECD) til at udføre top-down-analyse med pålidelige tandem MS-data (ideelt isotopisk opløste signaler af fragmentioner).

  1. Optimering af CE- og MS-indstillinger
    1. Udfør en pilot-MS-måling ved hjælp af en standard elektrosprayioniseringskilde (ESI) ved at sprøjte enten den forudindlæste prøve fra en metalbelagt borosilikatglaskapillær (det "statiske" nanoESI-skema) eller den kontinuerligt infunderede prøve fra en metaludsender for at optimere MS-indstillingerne til måling af intakte proteiner (MS1) og deres gasfasefragmenter (MS2). Fragmenter proteinarterne af interesse ved masseudvælgelse af ensemblet af dets ioner i en enkelt ladningstilstand efterfulgt af ETD eller ECD af prækursorionerne.
      BEMÆRK: De væsentlige indstillinger omfatter de parametre, der påvirker desolvation, masseudvælgelsen af prækursorioner (for at undgå interferens fra andre arter) og fragmenteringseffektivitet. Både midten og bredden af masseudvælgelsesvinduet bør øges for at matche den resulterende massefordeling af analytionerne efter HDX. Da elueringsvinduet for en proteinart i CE typisk varierer fra 0,5 min til 2 min, skal du vurdere fragmenteringseffektiviteten baseret på MS2-scanninger akkumuleret over et sammenligneligt tidsvindue. De optimale værdier af disse parametre er proteinspecifikke; læsere henvises til tidligere offentliggjorte rapporter for eksemplariske indstillinger 8,14.
    2. Udfør en pilot-CE-måling ved hjælp af et CE-instrument udstyret med en optisk detektor, dvs. en fotodiodearray (PDA) detektor eller en UV-detektor for at optimere CE-indstillingerne for adskillelse af proteinarterne og migrationstiderne, hvilket svarer til HDX-reaktionstiderne.
      BEMÆRK: Dette trin er valgfrit afhængigt af tilgængeligheden af den optiske detektor til CE. I mangel af en optisk detektor kan CE-indstillingerne optimeres ved hjælp af CE-MS, når punkt 2.2 er afsluttet, efter instruktionerne beskrevet i punkt 2.3. De væsentlige indstillinger omfatter parametre, der påvirker separationseffektiviteten, topformer vist i elektroferogrammer og elueringstider.
  2. Forkonditionering af CE-HDX-opsætningen
    1. Rengør den gennemstrømningsmikroviale CE-MS-grænseflade med en blanding af 50% methanol, 49% vand og 1% myresyre (v / v) ved hjælp af ultralydbehandling i mindst 30 minutter ved stuetemperatur.
    2. Ved montering af den HPC-modificerede kapillær på et CE-instrument skylles kapillæren med BGE ved hjælp af autosampleren i 10 minutter og efterlader kapillæren fyldt med BGE.
    3. Der opnås en passende længde af umodificeret smeltet silicakapillærrør (ID: 50 μm, OD: 360 μm) som infusionsrør til modifikatoropløsningen. Tilslut modifikatorslangen til en gastæt glassprøjte med en stump spids ved hjælp af en union og korrekt muffe, og skyl slangen med modifikatoropløsningen ved hjælp af en infusionspumpe i mindst 10 minutter.
    4. Indsæt udløbene på den HPC-belagte CE-kapillær- og modifikatorslange, der er fyldt med tilsvarende opløsninger, i den rensede CE-MS-grænseflade, som illustreret i figur 2.
    5. Fremryk sprøjten til infusionen af modifikatoren enten manuelt eller med infusionspumpen for at sikre, at modifikatoropløsningen når spidsen af grænsefladen. Monter den samlede CE-MS-grænseflade på et nanoESI-kildehus på et massespektrometer.

Figure 2
Figur 2: Skematisk illustration af den CE-baserede HDX MS-opsætning. Dette tal er ændret fra8. Forkortelser: BGE = baggrundselektrolytopløsning; CE = kapillær elektroforese; MS = massespektrometri; HDX = hydrogen/deuterium udveksling; ESI = elektrosprayionisering; FTICR = Fourier-transform ion cyclotron resonans; ETD = elektronoverførselssociation; ECD = elektron-capture dissociation. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Samtidig CE-separation, HDX-reaktion og MS-analyse
    BEMÆRK: Deuteret BGE anbefales at blive brugt inden for 1 dag efter afforsegling.
    1. Påfør en sprøjtespænding på 3-5 kV på CE-MS-grænsefladen.
    2. Begynd at tilføre infusionspumpen modifikatoropløsningen med en strømningshastighed fra 0,1 til 10 μL/min., og sørg for en stabil elektrospray i spidsen af CE-MS-grænsefladen.
    3. Anbring prøvehætteglasset, der indeholder BGE, i autosampleren, og brug det i trin 2.3.4 til at erhverve tomme elektroferogrammer og blindmassespektre.
    4. Prøveopløsningen injiceres ved hjælp af autosampleren ved 2 psi og i en passende varighed for at muliggøre injektion af en ønsket mængde af prøven. Injektionsvolumenet estimeres ved hjælp af forholdet mellem injektionsvolumen og injektionsparametre15 defineret ved ligning (1).
      Equation 1 (1)
      Hvor Vinj er injektionsvolumenet, Δp er injektionstrykket, dc er kapillærens indre diameter, A er kapillærens tværsnit, tinj er injektionsvarigheden, η er væskens viskositet i kapillæren, og L er kapillærens længde.
    5. Start CE-separationen ved at anvende en elektroforetisk spænding på 30 kV og infusionstryk fra 0 til 2 psi, og anskaf elektroferogrammet. I mellemtiden skal du starte indsamlingen af MS-dataene i kromatografisk tilstand, hvor ionstrømsgrafen erhverves som en funktion af tiden, og de tilsvarende MS-scanninger ikke automatisk kombineres til et enkelt spektrum.
      BEMÆRK: Proteiner gennemgår spontan HDX-reaktion ved kontakt med2H20-molekyleri BGE under deres elektroforetiske migration i dette trin. Den optiske detektion til CE kan bruges ud over MS-detektionen. Da detektion på kolonnen kræver fjernelse af en vis længde polyimidbelægning i udløbsenden af den smeltede silicakapillær, skal der træffes yderligere omhu for at undgå kapillærskade under samlingen af CE-MS-grænsefladen.
    6. Gem det tomme elektroferogram og massespektre som referencer.
      BEMÆRK: Tomme data skal bruges til fejlfinding i stedet for baseline subtraktion.
    7. Prøvehætteglassene, der indeholder de ønskede koncentrationer af proteinprøveopløsningerne, anbrings i autosampleren. Elektroferogrammerne og massespektrene for proteinprøverne erhverves ved at følge trin 2.3.4-2.3.5. Indsaml et tilstrækkeligt antal MS-scanninger for at opnå MS1-spektre af de elektroforetisk adskilte og 2H-mærkede proteinarter.
    8. Udføre tandem MS-målinger for de arter, der er af interesse, enten efter at have erhvervet MS1-spektrene inden for samme kørsel eller i en efterfølgende, separat kørsel.
    9. Juster om nødvendigt migrationstiderne/HDX-reaktionstiderne ved at ændre infusionstrykket eller længden af CE-kapillæren. Hvis HDX-reaktionstiden skal være kortere end migrationstiden, skal du anvende den fremgangsmåde, der er beskrevet tidligere8, og som anvender både deuteret og ikke-deuteret BGE i kapillæren under CE-processen.
    10. Skyl CE-kapillæren med BGE ved et tryk på 20 psi i mindst 10 minutter efter hver måling.
    11. Når forsøgene er afsluttet, skal du rengøre CE-MS-grænsefladen og alle slanger til opbevaring.
    12. Der anskaffes et datasæt af HDX-"endepunktsprøven" (som kan fremstilles ved hjælp af tidligere beskrevne 6,16) med MS i direkte infusionstilstand.
      BEMÆRK: Dette trin er kun påkrævet, når der anvendes en deuteret modifikatoropløsning til CE-baseret HDX.

3. Analyse af data

  1. Analyse af CE-data
    1. Brug et af følgende afbildninger som elektroferogram til at bestemme de elektroforetiske egenskaber, herunder antallet af toppe, migrationstider og separationseffektivitet: a) UV-absorbans vs. migrationstid, erhvervet af ce-instrumentets optiske detektor (hvis tilgængelig); b) grafen for den samlede ionstrøm (TIC), som medlemsstaterne har erhvervet c) den af medlemsstaterne erhvervede graf for ekstraheret ionstrøm (EIC/XIC).
      BEMÆRK: EIC/XIC giver det optimale signal/støj-forhold (S/N) generelt blandt de førnævnte formater af elektroferogrammer. Det er bemærkelsesværdigt, at selv i mangel af instrumentelle forstyrrelser, mens UV-absorbans er proportional med massekoncentrationen af protein, er MS-signalet proportionalt med den molære koncentration. Derfor er det rimeligt at observere forskelle i topmønstre mellem CE- og MS-afledte elektroferogrammer.
    2. Brug arealet under kurven (AUC) for de toppe, der er vist i elektroferogrammerne, til halvkvantation. For prøver, der involverer proteinkomplekser, anvendes den tidligere beskrevne fremgangsmåde17 til at udlede massekoncentrationsdata fra TIC/EIC-elektroferogrammerne.
  2. Analyse af MS-data
    1. Opnå MS1- og MS2-spektrene ved at kombinere MS1- og MS2-scanningerne, der er erhvervet inden for de tilsvarende elueringsvinduer, henholdsvis.
    2. Bestem masserne af det intakte protein (M (intakt protein)) og fragmenter ved en af følgende to metoder.
      1. Beregn de gennemsnitlige masser af de ioner, der giver anledning til de isotopisk opløste signalklynger.
      2. Brug midten af de Gaussisk-lignende kurver, der er resultatet af monteringen af de tilsvarende isotopiske konvolutter6.
    3. Brug software som Biopharma Finder, ProSight18 eller MASH Suite19 til at generere masselisten over fragmentionerne og identificere dem.
  3. Analyse af HDX-data
    1. Bestem det samlede deuterationsniveau for en intakt proteinart ved hjælp af ligning (2).
      Equation 2 (2)
      hvor M (2H) eller M (1H) er atomvægte på 2H eller 1H. Stjernen angiver data fra den 2H-mærkede prøve.
    2. Bestem den kumulative beskyttelse eller kumulative deuteration af rygradsamid i et bestemt segment.
      1. For data, der er erhvervet med en deuteret modifikatoropløsning, skal du anvende ligninger (3) og (4) til at bestemme det kumulative beskyttelsesniveau.
        Equation 3 (3)
        Equation 4 (4)
        Hvor P(Sk(N)) er den samlede beskyttelse af det N-terminale segment, der spænder over restkoncentrationer 1 til k, er P(Sm(C)) den samlede beskyttelse af det C-terminale segment, der omfatter m-rester , M (2H) eller M (1H) er atomvægte på 2H eller 1H, og M (ci) eller M (zi) er molekylvægtene af ci eller zi ioner.
        BEMÆRK: Dobbeltstjernen angiver data fra HDX-prøven "slutpunkt".
      2. For data, der er erhvervet med en ikke-deuteret modifikatoropløsning, skal du anvende ligninger (5) og (6) til at bestemme det kumulative deuterationsniveau.
        Equation 5 (5)
        Equation 6 (6)
        Hvor D(Sk(N)) er den kumulative deuteriumoptagelse af det N-terminale segment, der spænder over restkoncentrationer 1 til k D(Sm(C)) er den kumulative deuteriumoptagelse af det C-terminale segment, der omfatter m-restkoncentrationer .
    3. Bestem deuterationsniveauet på en lokal rygradamidgruppe
      1. For data, der er erhvervet med en deuteret modifikatoropløsning, skal du anvende ligninger (7), (8), (9), (10) og (11) til at bestemme det lokale beskyttelsesniveau.
        for data udledt af c-ioner
        Equation 7 (7)
        for data udledt af z-ioner
        Equation 8 (8)
        Hvor P(Ri) er beskyttelsen af et rygradsamid ved rest i, og abonnementet "total" angiver proteinets samlede restantal.
        For restkoncentrationer, hvor efterfølgende fragmentioner manglede, tildeles P(Ri) ved hjælp af ligninger (9) og (10).
        for data udledt af c-ioner
        Equation 9 (9)
        for data udledt af z-ioner
        Equation 10 (10)
        Bestem derefter deuterationsniveauet D (Ri) ved en lokal rygradamidgruppe ved hjælp af ligning (11).
        Equation 11(11)
      2. For data, der er erhvervet med en ikke-deuteret modifikatoropløsning, skal du anvende ligninger (12), (13), (14) og (15) til at bestemme det lokale beskyttelsesniveau.
        for data udledt af c-ioner
        Equation 12(12)
        for data udledt af z-ioner
        Equation 13(13)
        Hvor D(Ri) er beskyttelsen af et rygradsamid ved rest i, og abonnementet "total" angiver proteinets samlede restantal.
        For restkoncentrationer, hvor efterfølgende fragmentioner manglede, tildeles D(Ri) ved hjælp af ligninger (14) og (15).
        for data udledt af c-ioner
        Equation 14 (14)
        for data udledt af z-ioner
        Equation 15 (15)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ændring af infusionstrykket for BGE muliggør justering af både separationseffektivitet og migrationstid, hvilket svarer til HDX-reaktionstiden for de proteiner, der skal adskilles (figur 3). Et lavere infusionstryk resulterer i bedre adskillelse af CE-toppe på bekostning af eksperimentets varighed (figur 3A). En længere migrations-/HDX-reaktionstid resulterer i et højere niveau af deuteration af proteinanalytterne (figur 3B-D). På HDX-tidsskalaen på minutter bør deuterationsforskellen primært afspejle de forskellige udvekslingsomfang på de strukturelt beskyttede lokaliteter i stedet for de hurtigt udskiftelige lokaliteter. Ifølge tendensen i deuterationstidsfunktioner, der vises af begge proteinarter, er det usandsynligt, at migrationstidsforskellen vil være den største bidragyder til deuterationsforskellen. Faktisk viser den tidligere eluterede apo-Mb i differentiel CE-HDX af holo- og apo-myoglobin (Mb)8 et højere deuterationsniveau end holo-Mb, hvilket klart tyder på, at konformationsforskellen er den primære faktor, der bestemmer den målte deuterationsforskel.

Korrektion for deuterationsforskellen, der indføres af migrationstidsforskellen, kan foretages via kurvetilpasning til dataene for deuterationsniveauet vs. HDX-tid (figur 3D). Varianterne A og B af β-lg adskiller sig kun med to aminosyrerester i deres sekvens (D64G og V118A)20. Disse varianter gav anledning til to tilstrækkeligt adskilte toppe i det EIC-afledte elektroferogram (figur 4A). Reproducerbare separationsprofiler blev opnået ved eksperimenter udført af forskellige operatører ved hjælp af forskellige instrumenter på forskellige anlæg (figur 4A). De resulterende særskilte massefordelinger af ioner svarende til den differentielt 2H-mærkede variant (figur 4C) muliggør masseudvælgelse af hver variant ved hjælp af et quadrupolmassefilter til den efterfølgende top-down MS-analyse uden interferens fra kation-adduktionerne af den anden variant.

Tandem MS-spektre af repræsentative fragmentioner er vist i figur 5. Den unikke disulfidbinding og konformation af β-lg begrænser fragmenteringseffektiviteten mellem Cys82 og Cys176, fordi der kræves yderligere fragmenteringsenergi for at spalte disulfidbindingerne, der omslutter denne region14, hvilket resulterer i et lavere antal og relativ overflod af z-ioner (C-terminal) end c-ioner (N-terminal) (figur 5A,B). Dette problem kan løses ved at kombinere med disulfidreduktionsmetoder 21,22,23,24. Mens de fleste fragmentioner produceret af β-lg A og β-lg B udviser en lignende grad af deuteriumoptagelse (figur 5A,B), deutereres større segmenter, der dækker sekvensvariationsstederne (repræsenteret ved ioner som c137) fra β-lg A, i signifikant større omfang end β-lg B (132 vs. 119 2H-atomer; Figur 5C). Disse resultater er i overensstemmelse med CE-profilen og krystallografikarakteriseringsresultaterne for disse varianter. CE-profilen indikerer højere elektroforetisk mobilitet på β-lg B på grund af lavere strukturel fleksibilitet. Krystallografikarakteriseringsresultaterne af disse varianter indikerer, at små ændringer i rygradskonformation finder sted i nærheden af D64G på loop CD (rester 61-67)11.

Figure 3
Figur 3: CE-baseret HDX MS-analyse af en blanding af myoglobin og ubiquitin med forskellige HDX-reaktionstider. (A) Elektroferogrammer (EIC-baserede) af 2H-mærket Mb (rød) og Ub (blå) fra en blanding, erhvervet med forskellige BGE-infusionstryk. (B) Massespektre på 2H-mærket [Mb]16+ (rød) og [Ub]8+ (blå) erhvervet med forskellige HDX-tider. Overlejret på toppen er referencespektre af umærkede [Mb]16+ og [Ub]8+ ioner (grå). C) Migrationstiden for Mb (rød) og Ub (blå) som funktion af BGE-infusionstrykket. (D) Deuterationsniveau for Mb (rød) og Ub (blå) som funktion af HDX-reaktionstiden (svarende til migrationstiden). Data erhvervet med et CESI 8000 plus kapillærelektroforesesystem og et Q Exactive UHMR-massespektrometer. Forkortelser: BGE = baggrundselektrolytopløsning; CE = kapillær elektroforese; MS = massespektrometri; HDX = hydrogen/deuterium udveksling; Mb = myoglobin; Ub = ubiquitin; EIC = ekstraheret ionstrøm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: CE-baseret HDX MS-analyse af en naturlig blanding af β-lg A og β-lg B fra kvægmælk. (A) Elektroferogrammer (EIC-baserede) af 2H-mærkede β-lg A (blå) og β-lg B (rød) fra kvægmælk, erhvervet med forskellige BGE-infusionstryk. Data indsamlet med et CESI 8000 plus CE-system og et Q Exactive UHMR-massespektrometer. Overlejret på toppen er et elektroferogram fra en måling udført på et andet anlæg (gråt) med et PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System og et Orbitrap Fusion Lumos massespektrometer. (B) Massespektre af 2H-mærkede [β-lg A]14+ (blå) og [β-lg B]14+ (rød) erhvervet med BGE-infusionstryk på 1 psi. Overlejret på toppen er referencespektre af umærkede [β-lg A]14+ og [β-lg B]14+ ioner (grå). Forkortelser: BGE = baggrundselektrolytopløsning; CE = kapillær elektroforese; MS = massespektrometri; HDX = hydrogen/deuterium udveksling; Ig = immunoglobulin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Tandem MS-spektre af repræsentative fragmentioner fremstillet af β-lg A (blå) og β-lg B (rød). (A) c10-ioner er rigelige og deutererede i tilsvarende omfang; B) z29-ioner er mindre rigelige og deutererede i tilsvarende omfang C) c137-ioner dækker sekvensvariationsstederne og deutereres i væsentligt forskelligt omfang i β-lg A og B. Placeringen af de tilsvarende segmenter er illustreret som orangefarvede dele af krystalstrukturen i β-lg B (PDB ID: 5IO5). Forkortelser: MS = massespektrometri; Ig = immunoglobulin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Formålet med at belægge CE-kapillærens indre væg omfatter minimering af den elektroosmotiske strøm og proteinabsorption under CE-processen13. Selvom elektroosmotisk strømning er gavnlig for konventionel CE-analyse af små molekyler på grund af dens evne til at køre neutrale eller modsat ladede arter til detektoren, kompromitterer det separationseffektiviteten af proteinarter med lignende størrelser og nettoladninger i opløsning. Belægning af kapillæren med HPC minimerer den elektroosmotiske strøm forårsaget af silanolgrupperne på kapillærens indre væg. Derudover reducerer maskering af disse silanolgrupper deres interaktion med proteiner, idet man undgår langsom migration eller endda fuldstændig tilbageholdelse af proteiner i kapillæren.

Under elektroforesen gennemgår både analytterne og kationerne og anionerne fra BGE elektroforetisk migration. Ved kobling med MS erstattes et reservoir af BGE på den negative spændingsside af CE-kapillæren med en CE-MS-grænseflade med en anden sammensætning. Påføring af et tryk, der kontinuerligt infunderer frisk BGE i kapillæren fra reservoiret ved den positive spændingsside ved en bestemt strømningshastighed, minimerer koncentrationsgradienten af BGE-indholdet i hele kapillæren, hvilket er gavnligt for separationsydelsen.

HDX-reaktionstid er en væsentlig parameter til bestemmelse af valutakursen på et givet sted/segment og karakterisering af dynamikken i højere ordens strukturer af proteiner. I et CE-baseret HDX-skema, når kapillæren er fyldt med deuteret BGE, er HDX-reaktionstiden afhængig af kapillærens indre volumen og analytternes migrationshastighed. Selv om kapillærens indre volumen kan justeres ved at ændre kapillærens længde eller ID, begrænses omfanget af justeringen ved hjælp af denne metode af faktorer såsom den minimale længde, der kræves for at forbinde CE- og MS-instrumenterne, og det ekstra modtryk og risikoen for tilstopning som følge af den nedsatte ID.

I modsætning hertil er ændring af BGE-infusionstrykket en praktisk effektiv måde at justere HDX-reaktionstiden over en bred vifte. Det er dog stadig udfordrende at sænke HDX-tiden til værdier på undermin, fordi en høj strømningshastighed kompromitterer frigørelsen ved ESI-grænsefladen. For at opnå en lavere HDX-tid kan den ønskede mængde ikke-deuteret BGE injiceres i kapillæren, der er blevet fyldt med deuteret BGE før prøveinjektion. Dette vil bidrage til at reducere længden af den deutererede BGE-sektion, som analytproteinerne skal passere igennem og interagere med under deres migration. Denne tilgang gør det muligt at reducere den effektive HDX-tid til den anden skala8.

Simulering af hastighedsfeltet og koncentrationsfordelingen, når analytten konstant infunderes i mikrovialet, afslører, at CE-strømmen effektivt fortyndes af modifikatoropløsningen ved gennemstrømningsmikrovialet, og at analyttens rejsevarighed i dette blandingsområde er på den anden skala i fravær af elektroosmotisk strømning25 . Selvom HDX af de strukturelt beskyttede rygradamidsteder "slukkes" ved blanding med den forsurede modifikator, resulterer et sådant blandingsskema i tab af deuteriumetiketter ved de hurtigt udskiftelige hydrogenatomer (herunder dem ved sidekæderne), når der anvendes en ikke-deuteret modifikator. Derfor bør2H20og deutereret methanol anvendes til at forberede modifikatoren i målinger, der kræver, at deuteriumetiketterne på de hurtigt udskiftelige steder bevares til MS-analyse.

Begrænsningerne i den nuværende ordning for denne CE-baserede HDX MS-tilgang er forbundet med (1) HDX-tidsreguleringen og (2) yderligere hydrogenudveksling mellem proteinanalytterne og modifikatoropløsningen ved gennemstrømningsgrænsefladen. Bestemmelsen af den effektive strømningshastighed er baseret på estimeringen ved hjælp af dens empiriske korrelation med parametre som infusionstryk, kapillærparametre og opløsningsparametre (se trin 2.3.4), På grund af dette, og fordi det ikke er muligt nøjagtigt at måle kapillærens indre volumen (enten modificeret eller uændret, hjemmelavet eller kommerciel), kan HDX-tiden ikke bevidst indstilles med høj nøjagtighed ved at justere driftsparametrene. Den eksperimentelt resulterende HDX-tid kan dog måles nøjagtigt.

Den modifikatoropløsning, der anvendes i denne fremgangsmåde, indbefatter et organisk opløsningsmiddel, som letter tandem MS ved at udfolde proteinerne, og syre for at minimere yderligere udvekslingsreaktioner ved at sænke pH til 2,5. Fordi det ikke er muligt at undgå at bruge protiske opløsningsmidler, sker udveksling mellem proteiner og modifikatoropløsningen ved blanding ved blanding af CE-MS-grænsefladen. Når der anvendes en ikke-deuteret modifikatoropløsning, mister hurtigt udskiftelige steder deres deuteriumetiketter på dette stadium, og kun velbeskyttede steder forbliver mærket, hvilket begrænser følsomheden ved sammenligning af proteiner med mindre konformationsforskelle. Sådanne virkninger kan delvis kalibreres ved at måle det fuldt deutererede protein i en referenceprøve.

Udførelse af HDX i CE giver et middel til at adskille proteinarter i opløsning under HDX for at undgå interferens fra ioner af naboarter i top-down MS-karakterisering af individuelle arter og en tilgang til initialisering af HDX-reaktionen. I denne HDX-reaktion forlader proteinerne, der skal deutereres, fuldstændigt det oprindelige ikke-deutererede miljø på grund af deres forskellige mobiliteter. Dette står i kontrast til den konventionelle fortyndingsoperation, hvor en brøkdel af ikke-deuteret indhold (typisk fra 1% til 10%) bevares. I betragtning af fordelene ved den seneste udvikling af top-down MS-teknikken forventer vi at forbedre denne tilgang yderligere, så den kan indgå i den pålidelige værktøjskasse til differentiel karakterisering af proteinstrukturer af højere orden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

D. D. Y. Chen er en af grundlæggerne af Knowledge for Health Institute for Biomolecules, som kommercialiserer den gennemstrømningsmikroviale CE-MS-grænseflade. Andre forfattere har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). Forfatterne modtog også støtte fra Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, Kina; Jiangsu Collaborative Innovation Center for Biomedicinske Funktionelle Materialer; og Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials ved Nanjing Normal University, Kina.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ammonium acetate Fisher Chemical A/3446/50 ≥99%
CESI 8000 plus capillary electrophoresis system Sciex, USA
centrifuge Eppendorf 5406000097
centrifugal filter Merck UFC201024 10 kDa cutoff
deuterium oxide Energy Chemical E090001 99.9 % D
formic acid Acros Organics  270480250
fused silica glass capillary Polymicro Technologies 1068150017 ID 50μm, OD 360μm
gas chromatography Agilent GC6890N
hydrochloric acid Sigma Aldrich 258148
hydroxypropyl cellulose Aladdin H113415 MW 100000
magnetic stirrers DLAB 8030101212
methanol Fisher Chemical A456-4 MS grade
microvolume UV-Vis spectrophotometer DeNovix 84677JK7731
myoglobin Sigma Aldrich M1882
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer Thermo Fisher Scientific, USA
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System Beckman Coulter, USA
Q Exactive UHMR mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific, Germany
sodium hydroxide Sigma Aldrich S5881
ubiquitin Sigma Aldrich U6253
ultrasonicator SCIENTZ SB-5200
β-lactoglobulin Sigma Aldrich L0130

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).
  2. Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
  3. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
  4. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).
  5. Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
  6. Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
  7. Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
  8. Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
  9. Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
  10. Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).
  11. Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
  12. Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
  13. Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
  14. Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
  15. Sutera, S. P., Skalak, R. The history of Poiseuille's law. Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).
  16. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  17. Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
  18. Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
  19. Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
  20. Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
  21. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  22. Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
  23. Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).
  24. Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
  25. Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).

Tags

Kemi udgave 172
Kapillær elektroforesebaseret hydrogen/deuteriumudveksling til konformationskarakterisering af proteiner med top-down massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chaihu, L., Yao, X., Xu, X., Zhu,… More

Chaihu, L., Yao, X., Xu, X., Zhu, Z., Chen, D. D. Y., Wang, G. Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (172), e62672, doi:10.3791/62672 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter