Summary
Dendritische stekels zijn belangrijke cellulaire kenmerken van het zenuwstelsel. Hier worden live beeldvormingsmethoden beschreven voor het beoordelen van de structuur en functie van dendritische stekels in C. elegans. Deze benaderingen ondersteunen de ontwikkeling van mutante schermen voor genen die de dendritische wervelkolomvorm of -functie definiëren.
Abstract
Dendritische stekels zijn gespecialiseerde plaatsen van synaptische innervatie gemoduleerd door activiteit en dienen als substraten voor leren en geheugen. Onlangs zijn dendritische stekels beschreven voor DD GABAerge neuronen als de invoerplaatsen van presynaptische cholinerge neuronen in het motorische circuit van Caenorhabditis elegans. Dit synaptische circuit kan nu dienen als een krachtig nieuw in vivo model van morfogenese en functie van de wervelkolom dat gebruik maakt van de gemakkelijke genetica en gemakkelijke toegankelijkheid van C. elegans naar live-cell imaging.
Dit protocol beschrijft experimentele strategieën voor het beoordelen van de structuur en functie van de DD-wervelkolom. In deze benadering wordt een beeldvormingsstrategie met superresolutie gebruikt om de ingewikkelde vormen van actinerijke dendritische stekels te visualiseren. Om de DD-wervelkolomfunctie te evalueren, stimuleert het lichtgeactiveerde opsine, Chrimson, de presynaptische cholinerge neuronen en de calciumindicator, GCaMP, rapporteert de opgeroepen calciumtransiënten in postsynaptische DD-stekels. Samen omvatten deze methoden krachtige benaderingen voor het identificeren van genetische determinanten van dendritische stekels in C. elegans die ook de morfogenese en functie van de wervelkolom in de hersenen kunnen sturen.
Introduction
Dendritische stekels zijn gespecialiseerde cellulaire structuren die input ontvangen van naburige neuronen voor synaptische transmissie. Activering van neurotransmitterreceptoren verhoogt intracellulaire calcium- en downstream-signaalroutes in deze karakteristieke neuronale uitsteeksels1. Vanwege het fundamentele belang van dendritische stekels voor neurotransmissie en hun misregulatie bij neurologische ontwikkelingsziekten1, is de ontdekking van factoren die de dendritische wervelkolommorfogenese en -functie moduleren van groot belang voor het gebied van de neurowetenschappen.
Onlangs zijn dendritische stekels geïdentificeerd in het C. elegans zenuwstelsel op basis van belangrijke kenmerken die worden gedeeld met zoogdierstekels2. Deze bepaling is cruciaal omdat het de mogelijkheid opent om de voordelen van C. elegans te benutten om de biologie van de wervelkolom te onderzoeken. Dendritische stekels op Dorsale D (DD) motorneuronen ontvangen input van cholinerge neuronen (VA en VB) in het ventrale zenuwkoord (figuur 1A)2,3,4. Hier worden beeldvormingsmethoden gepresenteerd om de structuur van DD-dendritische stekels en hun functie in vivo te onderzoeken in een intact zenuwstelsel dat gemakkelijk toegankelijk is voor live beeldvorming en genetische analyse. Voor het monitoren van de vorm van dendritische stekels, (1) cytosolische fluorescerende eiwitten, die het dendritische proces en de stekels vullen; (2) membraangebonden fluorescerende eiwitten, die de rand van dendritische stekels en dendrieten versieren; of (3) de actinemarkers, LifeAct5 of Utrophin6, die verrijkt zijn met dendritische stekels worden gebruikt, waardoor hun vorm wordt onthuld. Om de functionaliteit van DD-stekels te monitoren, wordt GCaMP-fluorescentie gebruikt om Ca ++ -transiënten te detecteren die worden opgeroepen door activering van de rood verschoven opsine, Chrimson, in presynaptische cholinerge neuronen7. Van beide strategieën wordt verwacht dat ze de studie van DD-dendritische stekels bij wilde en gemuteerde dieren vergemakkelijken.
Protocol
1. Bepaling van de structuur van de DD dendritische stekels
- Maak transgene wormen om DD-stekels te labelen
- Gebruik de flp-13 promotor om een expressievector te bouwen voor het label van belang (bijv. cytoplasmatische mCherry, MYR::mRuby, LifeAct::GFP, GFP::utrofine) (Figuur 1). Zie de volledige lijst van plasmiden in Aanvullend Dossier 1.
- Gebruik gevestigde methoden om een transgene lijn te genereren die DD-stekels 8,9 labelt.
- Bereid de kit voor
- Maak een 1:1 mengsel van op paraffine gebaseerd insluitmedium10 (zie Materiaaltabel).
- Verwarm het medium op 60 °C tot het smelt, vervolgens aliquot in 1,5 ml afgedekte microcentrifugebuizen en houd een verwarmingsblok op 60-70 °C.
OPMERKING: Kit kan 4 weken meegaan in het verwarmingsblok.
- Bereid een verdoving voor.
- Maak voorraadoplossingen in gedistilleerd H2O van 1% Tricaine en 1 M levamisol (zie Materiaaltabel). Bewaren bij -20 °C.
- Bereid een werkoplossing van 0,05% Tricaïne en 15 mM levamisol-anestheticum, zoals beschreven in stap 1.3.3-1.3.511.
- Meng 75 μL van 1% Tricaine en 22,5 μL van 1 M levamisol.
- Voeg de M9-buffer toe aan een eindvolume van 1,5 ml.
- Aliquot 10 μL van 0,05% Tricaine, 15 mM levamisol in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaren bij -20 °C.
OPMERKING: Het verdovingsmengsel is gevoelig voor temperatuur en individuele aliquots van de werkoplossing mogen niet opnieuw worden ingevroren na het ontdooien voor elk experiment. Zie Aanvullend bestand 2 voor een recept voor M9-buffer.
- Afbeeldingen met een hoge resolutie verkrijgen
- Bereid 10% agarose en houd het in het waterbad op 60 °C.
OPMERKING: Zie het rapport van Monica Driscoll in WormBook12. - Monteer 15-20 jongvolwassenen op 10% agarose pads en voeg 3 μL verdovingsmiddel toe (zie stap 3).
- Breng coverslip aan (wormen worden binnen 5 minuten geïmmobiliseerd).
- Sluit de randen van de afdekplaat af met een gesmolten lijmkitmengsel (zie Materiaaltabel).
- Afbeeldingen verkrijgen
- Overname van superresolutie
- Gebruik een laserscanconfiscale microscoop die is uitgerust voor superresolutiemicroscopie met een 63x / 1.40 Plan-Apochromat olieobjectieflens om een kleine pixelgrootte te bereiken (bijvoorbeeld < 50 nm). Koop Z-stacks met behulp van de stapgrootte die wordt aanbevolen door de software van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
- Verzamel een reeks optische secties die het totale volume van het DD-ventrale proces overspannen (bijvoorbeeld 15-20 plakjes met een stapgrootte van 0,19 μm of een dikte van 2- 3 μm). Dien Z-stacks in voor beeldverwerking met behulp van de software van de fabrikant en analyseer afbeeldingen met een score hoger dan 7 (figuur 1B, figuur 2 en figuur 3).
- Overname Nyquist
- Gebruik een laserscan confocale microscoop om de optimale pixelgrootte te selecteren voor de golflengte van het licht en het numerieke diafragma van de gebruikte objectieflens (bijv. 40x/1.4 Plan Fluor olieobjectief).
OPMERKING: De kleinere pixelgrootte onthult de fijne structuur van DD-stekels. - Dien de stack in voor 3D-deconvolutie met behulp van het automatische algoritme (zie materiaaltabel) (figuur 3).
- Gebruik een laserscan confocale microscoop om de optimale pixelgrootte te selecteren voor de golflengte van het licht en het numerieke diafragma van de gebruikte objectieflens (bijv. 40x/1.4 Plan Fluor olieobjectief).
- Gebruik de kleinst mogelijke Z-stap (bijvoorbeeld bepaald door piëzo-fase) omdat oversampling in Z scherpere beelden kan opleveren na 3D-deconvolutie13.
- Overname van superresolutie
- Bereid 10% agarose en houd het in het waterbad op 60 °C.
- Beeldanalyse
- Gebruik geschikte beeldverwerkingssoftware (zie Materiaaltabel) om projecties met maximale intensiteit van de Z-stackste maken 14.
- Tel handmatig de uitsteeksels op de DD-dendriet.
OPMERKING: Uitsteeksels zijn loodrechte uitbreidingen van de hoofdschacht (figuur 1B, pijlpunten). - Bepaal de lengte van de DD-dendriet die is gescoord om de dichtheid van stekels per 10 μm DD-dendriet te berekenen (figuur 1C).
- Classificeer stekels als dun/paddenstoel, filopodiaal, stomp of vertakt (figuur 2A).
OPMERKING: Dunne / paddenstoel stekels vertonen een smalle basis (nek) en een bredere punt (hoofd). Filopodiale stekels vertonen geen vernauwde basis (geen nek) maar hebben een constante breedte. Stompe stekels hebben een brede basis en punt. Vertakte stekels zijn uitsteeksels met meer dan één punt.
2. Beoordeling van de activering van DD dendritische stekels door presynaptische cholinerge signalering
- Maak transgene wormen met behulp van conventionele technieken (bijv. micro-injectie)8,9
- Gebruik de flp-13 promotor om de expressie van de Ca++ sensor, GCaMP6s, in DD neuronen en de unc-4 promotor te stimuleren om de expressie van Chrimson, een rood verschoven kanaalrhodopsine, in presynaptische VA neuronen te stimuleren (Figuur 4A). Zie de lijst met plasmiden in Aanvullend Dossier 1.
- Bereid All-trans Retinal (ATR) en controleplaten voor.
OPMERKING: ATR is een vereiste cofactor voor Chrimson om te functioneren als een optogenetisch geactiveerd ionkanaal.- Bereid 100 mM ATR stockoplossing in ethanol (100%). Bewaren bij -20 °C in aliquots van 1 ml.
- Voeg onder een laminaire stromingskap 300 μL 's nachts OP50 bacteriecultuur en 0,25 μL ATR toe aan elke 60 mm NGM (Nematode Growth Medium) voedingsagarplaat en besmeer met een steriele glazen staaf.
- Voeg voor controles 300 μL OP50-bacteriën en 0,25 μL ethanol (100%) toe aan een afzonderlijke groep NGM-platen.
- Laat platen 24 uur in de motorkap op kamertemperatuur zitten (beschermd tegen omgevingslicht) om bacteriegroei mogelijk te maken.
OPMERKING: Platen kunnen worden gebruikt na de eerste incubatie van 24 uur of op 4 °C worden gehouden om binnen 5 dagen te gebruiken.
- Het experiment opzetten
- Plaats vijf NC3569 L4-stadiumlarven op OP50-gezaaide ATR of controleplaten die GEEN ATR hebben en in het donker groeien bij 23 °C.
- Gebruik drie dagen later een stereo-ontleedmicroscoop om de ontwikkeling van vulva te bevestigen om L4-stadium nakomelingen uit ATR en controleplaten te kiezen voor beeldvorming zoals beschreven in stappen 2.4.1-2.4.3.
- Plaats op een microscoopglaasje 2 μL van 0,05 μm polybeads (2,5% vaste stoffen w/v) (zie Materiaaltabel).
- Gebruik een platinadraad ("worm pick") om een kleine bol superlijm aan de oplossing toe te voegen en draai zachtjes om filamenteuze "strengen" lijm te genereren. Voeg vervolgens 3 μL M9-buffer toe (figuur 4B).
- Plaats ongeveer tien L4-larven in de oplossing en breng een deklip aan.
OPMERKING: Lijmvezels zullen willekeurig contact maken met wormen en ze immobiliseren nadat de coverslip is aangebracht. Wormen die zijn ingebed in grote bolletjes lijm lijken uitgedroogd en mogen niet worden afgebeeld. - Afdichtingsranden van de afdekplaat zoals vermeld in stap 1.4.4.
- Opname van opgeroepen Ca++ transiënten in dendritische stekels.
- Gebruik een draaiende schijf confocale microscoop uitgerust met een gevoelige CCD-camera, een 100x TIRF olie objectieflens en 488 nm en 561 nm laserlijnen (zie Tabel van materialen).
- Pas de microscooptrap aan om DD-stekels in het brandpuntsvlak te plaatsen.
- Stel time-lapse acquisitie in om het monster te verlichten met 488 nm laserlijn elk frame (voor het detecteren van GCaMP6s fluorescentie) en de 561 nm laserlijn met periodieke intervallen (voor Chrimson-excitatie).
OPMERKING: Gebruik bijvoorbeeld 488 nm licht om opeenvolgende snapshots (200 ms) van het GCaMP6s-signaal vast te leggen in combinatie met een 200 ms-puls van 561 nm licht elk 5e frame (figuur 4C-E). Met deze configuratie worden GCaMP-niveaus voor en na elke 561 nm-puls gedetecteerd ~ 1 s uit elkaar (200 ms 488 nm laser om GCaMP te detecteren vóór VA-activering, 200 ms van 561 nm puls om VA te activeren en ~ 600 ms om te schakelen tussen laserlijnen en emissiefilters. Met deze opstelling worden VA-neuronen om de 2,5 s geactiveerd.
- Analyse van in vivo Ca++ beeldvorming
- Gebruik 2D-deconvolutie en beelduitlijning om kleine afwijkingen als gevolg van de wormbeweging tijdens de acquisitie te corrigeren (zie Materiaaltabel).
- Definieer de DD dendritische wervelkolom als de regio van belang (ROI in figuren 4C-D).
- Dupliceer de ROI en verplaats naar een naburig gebied in de worm om achtergrondsignaal (d.w.z. ruis) te verzamelen.
- Gebruik geschikte software (zie Materiaaltabel) om GCaMP6s-intensiteiten te exporteren om uit te blinken voor elk tijdstip. Trek achtergrondfluorescentie af van de ROI-fluorescentie van de wervelkolom.
- Bepaal de verandering in fluorescentie door de GCaMP6s-fluorescentie in het frame onmiddellijk vóór 561 nm excitatie (F0) af te trekken van elk tijdstip na excitatie (ΔF) en vervolgens te delen door F0 om ΔF / F0 te bepalen (figuur 4E).
- Breng de genormaliseerde sporen in kaart (zie materiaaltabel).
- Voer een gepaarde statistische test uit voor elke meting van GCaMP6s fluorescentie voor en na elke puls van 561 nm licht.
OPMERKING: Deze benadering sluit effectief willekeurige fluctuaties in GCaMP6s-fluorescentie uit die anders de statistische kracht verminderen van het vergelijken van het gemiddelde GCaMP6s-signaal van alle metingen voor en na 561 nm excitatie (figuur 4F). - Voor metingen die een normale of Gaussische verdeling laten zien, gebruikt u een gepaarde parametrische ANOVA-test en corrigeert u voor meerdere vergelijkingen voor elk van de twee groepen (ATR vóór versus na, geen ATR vóór versus na). Als alternatief kunt u voor gegevens die normaal niet worden gedistribueerd, een niet-parametrische ANOVA met posthoc-correctie gebruiken voor meerdere tests.
OPMERKING: Wormen gekweekt op platen zonder ATR ("geen ATR") zijn noodzakelijke controles en mogen geen 561 nm-geactiveerde Ca ++ transiënten vertonen omdat ATR vereist is voor de Chrimson-functie.
Representative Results
Metingen met drie onafhankelijke markers (cytosolische mCherry, LifeAct::GFP, MYR::mRuby) leverden een gemiddelde dichtheid op van 3,4 ± 1,03 DD dendritische stekels per 10 μm DD-dendriet bij wildtype jongvolwassenen (figuur 1B,C). Voor deze analyse werden de metingen verkregen met de GFP::Utrofinemarker die een significant lagere wervelkolomdichtheid opleverde, uitgesloten (2,4 ± 0,74, figuur 1) als gevolg van interacties van utrofine met het actinecytoskelet6 dat mogelijk de morfogenese van de wervelkolom aandrijft15. De metingen van de wervelkolomdichtheid in de lichtmicroscoop zijn vergelijkbaar met de waarde van 4,2 stekels/10 μm dendriet verkregen uit de reconstructie van 12 stekels uit elektronenmicrografieën van het DD1-neuron2. De live-cell imaging benadering bevestigde dat de dunne/paddestoelvormige morfologie van de DD-stekels overheerst in de volwassen versus alternatieve wervelkolomvormen (bijv. Filopodiaal, stomp, vertakt) (Figuur 2B), wat ook typisch is voor stekels in het volwassen zenuwstelsel van zoogdieren16.
Een optogenetische strategie werd gebruikt om te vragen of de vermoedelijke dendritische stekels gedetecteerd door hoge resolutie lichtmicroscopie (figuur 1 en figuur 2) reageren op de afgifte van neurotransmitters van presynaptische plaatsen, een kenmerkend kenmerk van dendritische stekels in zoogdierneuronen. Groen licht (561 nm) werd gebruikt om een channelrhodopsine-variant, Chrimson, te activeren in presynaptische cholinerge neuronen en blauw licht (488 nm) om Ca ++-afhankelijke fluorescentie te detecteren die wordt uitgezonden door een cytoplasmatische GCaMP-sonde in postsynaptische DD-dendritische stekels. Dit experiment detecteerde voorbijgaande uitbarstingen van GCaMP-signaal in DD-stekels onmiddellijk na optogenetische activering van Chrimson in presynaptische VA-neuronen (figuur 3). Het succes van dit experiment hangt af van de betrouwbare expressie van Chrimson in alle presynaptische VA-neuronen. In dit geval werd een chromosomaal integrant17 van de Punc-4::Chrimson marker gebruikt om een consistente VA-expressie te garanderen. Dit experiment kan ook worden uitgevoerd met een extrachromosomale array. Chrimson-expressie in een specifiek VA-neuron kan onafhankelijk worden bevestigd, bijvoorbeeld door het Chrimson-transgen te koppelen aan een SL2-getranspliceerde leidersequentie met een downstream nucleair gelokaliseerde GFP als een co-expressiemarker2. Het is essentieel om een controle-experiment uit te voeren in afwezigheid van ATR om te bevestigen dat het gemeten GCaMP-signaal afhankelijk is van optogenetische activering van Chrimson, dat strikt ATR-afhankelijk is (figuur 4D). Ten slotte, omdat opgeroepen Ca ++ -signalen van voorbijgaande aard zijn, is het cruciaal om een beeldvormingsprotocol te gebruiken dat snel schakelen (<1 s) tussen 561 nm excitatie en GCaMP-signaalacquisitie mogelijk maakt met de 488 nm-laser (figuur 4).
Figuur 1: Labeling van DD dendritische stekels. (A) (Top) Zes Dorsale D (DD1-DD6) neuronen in het ventrale zenuwkoord van C. elegans. (Onder) Bij volwassenen nemen ventraal gerichte DD-stekels (pijlpunt) contact op met presynaptische terminals van VentralE A (VA) en VentralE B (VB) motorneuronen (magenta), en DD-commissures strekken zich uit tot het dorsale zenuwkoord om GABAerge output te leveren aan lichaamsspieren (pijl)18. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie2. (B) Fluorescerende micrografieën (Airyscan) van DD-stekels gelabeld met cytosolische mCherry, myristoylated mRuby (MYR::mRuby), LifeAct::GFP en GFP::Utrofine bij jongvolwassen wormen. Grijze pijlpunten wijzen naar stekels. Schaalbalk = 2 μm. (C) Dichtheid (stekels/10 μm) van DD neuron dendritische stekels gelabeld met cytosolische mCherry (3,77 ± 0,9), MYR::mRuby (3,09 ± 0,8), LifeAct::GFP (3,44 ± 1,1) of GFP::Utrofine (2,41 ± 0,8). Alle monsters worden normaal verdeeld. One-Way ANOVA laat zien dat de wervelkolomdichtheden voor cytosolische mCherry, MYR::mRuby en LifeAct::GFP niet significant (NS) verschillen, terwijl de wervelkolomdichtheid wordt verminderd voor GFP::Utrofine vs. cytosolisch gelabeld mCherry (p = 0,0016) en LifeAct::GFP (p = 0,0082). De stippelrode lijn vertegenwoordigt de wervelkolomdichtheid van DD-neuronen beoordeeld op basis van 3D EM-reconstructie (4,2 stekels / 10 μm). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Beeldvorming DD dendritische stekels. (A) (Top) Schematische weergave van wervelkolomvormen. (Onder) Airyscanbeelden van elk type wervelkolom (Schaalbalk = 500 nm) gelabeld met LifeAct::GFP (groen) en 3D-reconstructies door seriële elektronenmicrografieën van een hogedruk bevroren volwassene (blauw). (B) Wervelkolomfrequentie per type, gevisualiseerd met LifeAct::GFP: Thin/Mushroom (55,5 ± 14,5%), Filopodial (10,3 ± 8,70%), Stubby (18,8 ± 10,7%), Branched (15,42 ± 6,01%). Stekels frequentie per type gevisualiseerd met MYR::mRuby: Thin/Mushroom (52,2 ± 16,5%), Filopodial (5,68 ± 7,0%), Stubby (33,1 ± 14,8%), Branched (9,02 ± 9,6%). Ongepaarde T-test, filopodiaal (p = 0,0339); Stubby (p = 0,0009) en vertakte (p = 0,011) stekels gelabeld met de MYR::mRuby marker verschillen aanzienlijk van LifeAct::GFP. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Strategieën voor het verkrijgen van hoge resolutie beelden van DD-stekels. (A-B) (Top) Fluorescerende beelden van DD1-dendrieten gelabeld met een cytosolische marker (mCherry) door (A) Airyscan-detector en (B) Nyquist-acquisitie. (Onder) DD-dendriet (rood) wordt afgebeeld met een beeldanalysesoftware (auto-path-optie van filamenttracer) en DD-stekels (blauw) worden grafisch geïllustreerd met behulp van de semi-geautomatiseerde stekelsdetectiemodule. Pijl wijst naar vertakte wervelkolom vergroot in C en D. Pijlpunten duiden op naburige dunne / paddenstoelstekels vergroot in C en D. Schaalbalk = 2 μm. (C-D) Vergrote voorbeelden van (bovenste) vertakte wervelkolom (pijl) en (onder) twee naburige dunne / paddenstoelstekels (pijlpunten) verkregen met (C) Airyscan-detector of door (D) Nyquist-acquisitie. Schaalbalk = 500 nm. Gegevens gereproduceerd van2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Beoordeling van de functie van DD-stekels. (A) DD-motorneuronen drukken de Ca ++ -indicator GCaMP6s (groen) uit en VA-motorneuronen drukken de channelrhodopsine-variant, Chrimson (magenta)7, uit. (B) Schematische weergavemethode voor het monteren van wormen voor Ca++ metingen. (1) Plaats op een schone microscoopglaas (2) 2 μL 0,05 μm polyparels, (3) gebruik een platinadraad ("wormpick") om een kleine bol superlijm toe te voegen en (4) wervel in de oplossing om filamenteuze strengen lijm te genereren. (5) Voeg 3 μL M9-buffer toe. (6) Plaats ongeveer tien L4-larven in de oplossing(7) breng coverslip aan en sluit randen af met vaseline/was. (C-D) Activering van VA-neuronen correleert met Ca ++ transiënten in DD1-stekels. GCaMP6s fluorescentie afgebeeld (met intervallen van 0,5 s) met periodieke lichtactivering van Chrimson (intervallen van 2,5 s) roept Ca++ transiënten op met (C) +ATR (n = 12) maar niet in (D) controles (-ATR, n = 12). Panelen zijn snapshots in de tijd(en), voor en na puls van 561 nm licht (verticale roze lijn). Schaalbalken = 2 μm. GCaMP6s-signaal wordt verkregen van een ROI (Region of Interest) aan de punt van elke wervelkolom. (E) GCaMP6s fluorescentie tijdens de opnameperiode van 10 s uitgezet voor +ATR (groen) vs -ATR (controle, grijs) (n = 12 video's). Verticale roze balken duiden op 561 nm verlichting (bijv. Chrimson-activering). Elk dier werd 4 keer gestimuleerd met 561 nm licht. Voor en na elke puls van 561 nm licht werden metingen verzameld. (F) Plot van de GCaMP6s fluorescentie voor en na elke puls van 561 nm licht. GCaMP6s fluorescentie werd gemeten 1 s na elke puls van 561 nm licht. Omdat monsters niet normaal worden verdeeld, werd een gepaarde niet-parametrische Friedman-test toegepast om te corrigeren voor meerdere vergelijkingen van GCaMP6s fluorescentie vóór versus. na 561 nm lichtstimulatie voor wormen gekweekt met ATR (+ATR, groen) (*** p = 0,0004, n = 48 metingen) of bij afwezigheid van ATR (-ATR, grijs) (NS, Niet Significant, p = 0,0962, n = 48 metingen). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier 1: Lijst van plasmiden die in het onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 2: Samenstelling en voorbereiding van de M9-buffer. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De Airyscan-detector werd geselecteerd om snapshots van DD-stekels te verkrijgen omdat deze een hogere signaal-ruisverhouding en een betere resolutie biedt dan conventionele confocale microscopen19,20. AiryScan-beeldvorming maakt ook het gebruik van conventionele fluorescerende eiwitten (bijv. GFP, mCherry, enz.), Nu op grote schaal beschikbaar voor C. elegans. Hoewel afbeeldingen met een hogere resolutie kunnen worden verkregen met andere methoden met superresolutie (bijv. STORM, STED, PALM), vereisen deze methoden foto-activeerbare of foto-schakelbare fluorescerende eiwitten21. Als alternatief voor Airyscan worden conventionele confocale microscopen aanbevolen. Beeldvorming met Nyquist-acquisitie (figuur 3) bereikt bijvoorbeeld de pixelgrootte met behulp van een 40x / 1,3-doelstelling van 123,9 nm, voldoende om de morfologische typen van de wervelkolom te onderscheiden (figuur 2).
Voor het bepalen van de wervelkolomdichtheid wordt aanbevolen een cytosolisch fluorescerend eiwit te gebruiken, zoals (1) mCherry of GFP, (2) LifeAct om het actinecytoskelet te labelen, of (3) een gemyristoyleerd fluorescerend eiwit (bijv. MYR::mRuby) om het plasmamembraan te labelen (figuur 1B). Ter vergelijking: het F-actinebindende eiwit Utrofine vermindert de dichtheid van de wervelkolom (figuur 1C), wat wijst op een negatief effect op de morfogenese van de wervelkolom wanneer utrofine te veel tot expressie komt.
De huidige beeldvormingsmethoden moeten helpen bij het identificeren van genetische varianten die de morfologie van de wervelkolom beheersen 1,16. De morfologie van de DD-wervelkolom (d.w.z. dunne/paddenstoel, filopodiale, stompe, vertakte, zie figuur 2) kan worden beoordeeld aan de hand van enkele 2D-projecties van de laterale beelden van het ventrale zenuwkoord, aangezien de meeste DD-stekels een karakteristiek ventraal gerichte oriëntatie aannemen. In deze vergelijkingen is het essentieel om voor elke aandoening dezelfde fluorescerende marker te gebruiken, omdat schijnbare morfologische typen van de wervelkolom lijken te worden beïnvloed door de etiketteringsmethode (bijv. MYR: : mRuby vs. LifeAct::GFP). Bovendien werd opgemerkt dat de wervelkolomvormen dynamisch zijn en waarschijnlijk van vorm veranderen als reactie op de externe signalen 2,16. Het is dus ook essentieel om wervelkolomvormen te vergelijken tussen genotypen in vergelijkbare ontwikkelingsstadia en onder vergelijkbare omstandigheden.
De oriëntatie van het C. elegans ventrale koord is van cruciaal belang voor nauwkeurige beeldacquisitie. Zowel de ventrale als de dorsale koorden aan weerszijden van het dier moeten zichtbaar zijn in hetzelfde Z-vlak, wat aangeeft dat de worm op zijn kant is georiënteerd (figuur 1B). Het is het beste om geen afbeeldingen te verzamelen van wormen die bewegen of in contact komen met andere wormen of bellen in de buurt van het ventrale koord, omdat dit afbeeldingen van stekels kan degraderen.
Voor in vivo calciumbeeldvorming moeten onmiddellijk voor elke verwerving nieuwe dia's worden bereid. Het is het beste om wormen in contact te brengen met alleen dunne lijmvezels versus. "klodders" lijm die de neiging hebben om wormen uit te drogen en het beeld te degraderen (figuur 4B). In het experiment in figuur 4 activeert de puls van 561 nm licht het hele gezichtsveld. Voor het verhogen van de temporele en ruimtelijke resolutie om lokale Ca++ transiënten te detecteren, bijvoorbeeld binnen individuele DD-stekels, kan een galvo miniscanner voor de 561 nm laserlijn worden gebruikt om een kleiner interessegebied te stimuleren17.
Disclosures
Wij verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Beeldvorming en analyse op Imaris werden uitgevoerd in de Vanderbilt Cell Imaging Shared Resource (CIRS) ondersteund door NIH (CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 en EY08126). De LSM 880 wordt ondersteund door subsidie 1S10OD201630. Beeldvorming op een Nikon draaiende schijf werd uitgevoerd in het Nikon Center of Excellence. We bedanken Jenny Schafer, CISR-directeur, en Bryan Millis voor training en inzichtelijke discussies en leden van het Burnette-lab: Dylan Burnette, Aidan Fenix en Nilay Taneja voor advies. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health-subsidies aan DMM (R01NS081259 en R01NS106951) en een American Heart Association-subsidie aan ACC (18PRE33960581).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
| diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
| Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
| ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
| Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
| NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
| NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
| Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
| Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
| SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
| Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
| vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
| Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
| Microscope for super-resolution imaging | |||
| LSM880 | Zeiss | ||
| AiryScan detector | Zeiss | ||
| Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
| Laser lines | |||
| Stage controller | |||
| Microscope for Nyquist image acquisition | |||
| A1R Confocal | Nikon | ||
| Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
| 488 nm, 16mW | |||
| 561 nm, 17mW | |||
| Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
| Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
| Andor DU-897 EMCCD camera | |||
| Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
| 488 nm, 65mW | |||
| 561 nm, 86mW | |||
| 525 nm (+/- 18 nm) | |||
| 605 nm (+/- 35 nm) |
References
- Sala, C., Segal, M. Dendritic Spines: The Locus of Structural and Functional Plasticity. Physiological Reviews. 94 (1), 141-188 (2014).
- Cuentas-Condori, A., et al. C. elegans neurons have functional dendritic spines. Elife. 8, 47918 (2019).
- Philbrook, A., et al. Neurexin directs partner-specific synaptic connectivity in C. Elegans. Elife. 7, 35692 (2018).
- Oliver, D., Alexander, K., Francis, M. M. Molecular Mechanisms Directing Spine Outgrowth and Synaptic Partner Selection in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Neuroscience. 12, 10-13 (2018).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- Ladt, K., Ganguly, A., Roy, S. Axonal actin in action: Imaging actin dynamics in neurons. Methods of Cell Biology. 131, 91-106 (2016).
- Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual color neural activation and behavior control with chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (4), 1029-1034 (2015).
- Mello, C., Kramer, J., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrahcormosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C . elegans Using Microinjection. Journal of Visualized Experiments. (18), e833 (2008).
- Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-specific expression profiling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developemntal Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
- Mccarter, J., Bartlett, B., Dang, T., Schedl, T. Soma - Germ Cell Interactions in Caenorhabditis elegans : Multiple Events of Hermaphrodite Germline Development Require the Somatic Sheath and Spermathecal Lineages. Developemntal Biology. 181 (2), 121-143 (1997).
- Driscoll, M. Mounting animals for observation with Nomarski DIC optics. WormBook. , (2008).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Hotulainen, P., Hoogenraad, C. C. Actin in dendritic spines connecting dynamics to function. Journal of Cell Biology. 189 (4), 619-629 (2010).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are They All the Same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121 (9), 2877-2886 (1995).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Ventral Nerve Cord of Caenorhadbitis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society. 275 (938), 327-348 (1976).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
- Huff, J. The Fast mode for ZEISS LSM 880 with Airyscan high-speed confocal imaging with super-resolution and improved signal-to-noise ratio. Nature Methods. 13, (2016).
- Jacquemet, G., Carisey, A. F., Hamidi, H., Henriques, R., Leterrier, C. The cell biologist's guide to super-resolution microscopy. Journal of Cell Science. 133 (11), 240713 (2020).
