Summary
العمود الفقري التغصني هي السمات الخلوية الهامة للجهاز العصبي. هنا يتم وصف طرق التصوير الحية لتقييم بنية ووظيفة العمود الفقري الشجيري في C. elegans. تدعم هذه الأساليب تطوير شاشات متحولة للجينات التي تحدد شكل العمود الفقري الشجيري أو وظيفته.
Abstract
العمود الفقري الشجيري هي مواقع متخصصة للتعصيب المشبكي المعدل حسب النشاط وتعمل كركائز للتعلم والذاكرة. في الآونة الأخيرة ، تم وصف العمود الفقري التغصني للخلايا العصبية DD GABAergic كمواقع إدخال من الخلايا العصبية الكولينية قبل المشبكية في الدائرة الحركية ل Caenorhabditis elegans. يمكن أن تعمل هذه الدائرة المشبكية الآن كنموذج جديد قوي في الجسم الحي لتشكل العمود الفقري ووظيفته التي تستغل علم الوراثة السهل وسهولة الوصول إلى C. elegans لتصوير الخلايا الحية.
يصف هذا البروتوكول الاستراتيجيات التجريبية لتقييم بنية العمود الفقري DD ووظيفته. في هذا النهج ، يتم استخدام استراتيجية تصوير فائقة الدقة لتصور الأشكال المعقدة للأشواك المتغصنة الغنية بالأكتين. لتقييم وظيفة العمود الفقري DD ، يحفز الأوبسين المنشط بالضوء ، Chrimson ، الخلايا العصبية الكولينية قبل المشبكية ، ومؤشر الكالسيوم ، GCaMP ، يبلغ عن عابري الكالسيوم المثار في أشواك DD بعد المشبكي. تشتمل هذه الطرق معا على مناهج قوية لتحديد المحددات الجينية للأشواك المتغصنة في C. elegans والتي يمكن أن توجه أيضا تكوين العمود الفقري ووظيفته في الدماغ.
Introduction
العمود الفقري الشجيري هو تراكيب خلوية متخصصة تتلقى مدخلات من الخلايا العصبية المجاورة للانتقال المشبكي. يؤدي تنشيط مستقبلات الناقل العصبي إلى رفع الكالسيوم داخل الخلايا ومسارات الإشارات النهائية في هذه النتوءات العصبية المميزة1. نظرا للأهمية الأساسية للأشواك المتغصنة في النقل العصبي وسوء تنظيمها في أمراض النمو العصبي1 ، فإن اكتشاف العوامل التي تعدل تشكل العمود الفقري التغصني ووظيفته له أهمية كبيرة في مجال علم الأعصاب.
في الآونة الأخيرة ، تم تحديد العمود الفقري التغصني في الجهاز العصبي C. elegans بناء على الخصائص الرئيسية المشتركة مع أشواك الثدييات2. هذا التحديد أمر بالغ الأهمية لأنه يفتح إمكانية استغلال مزايا C. elegans للتحقيق في بيولوجيا العمود الفقري. تتلقى الأشواك المتغصنة على الخلايا العصبية الحركية الظهرية D (DD) مدخلات من الخلايا العصبية الكولينية (VA و VB) في الحبل العصبي البطني (الشكل 1 أ) 2،3،4. هنا ، يتم تقديم طرق التصوير لاستكشاف بنية العمود الفقري التغصني DD ووظيفتها في الجسم الحي في نظام عصبي سليم يمكن الوصول إليه بسهولة للتصوير الحي والتحليل الجيني. لمراقبة شكل العمود الفقري التغصني ، (1) بروتينات الفلورسنت الخلوية ، التي تملأ العملية المتغصنة والعمود الفقري ؛ (2) بروتينات الفلورسنت المرتبطة بالغشاء ، والتي تزين حدود العمود الفقري التغصني والتشعبات ؛ أو (3) يتم استخدام علامات الأكتين ، LifeAct5 أو Utrophin6 ، والتي يتم تخصيبها في العمود الفقري التغصني ، وبالتالي الكشف عن شكلها. لمراقبة وظائف العمود الفقري DD ، يتم استخدام مضان GCaMP للكشف عن عابرات Ca++ التي أثارها تنشيط الأوبسين الأحمر ، Chrimson ، في الخلايا العصبية الكولينية قبل المشبكية7. من المتوقع أن تسهل كلتا الاستراتيجيتين دراسة العمود الفقري التغصني DD في الحيوانات البرية والمتحولة.
Protocol
1. تحديد هيكل العمود الفقري التغصني DD
- إنشاء ديدان معدلة وراثيا لتسمية أشواك DD
- استخدم مروج flp-13 لبناء متجه تعبير لتسمية الاهتمام (على سبيل المثال ، mCherry السيتوبلازمي ، MYR::mRuby ، LifeAct::GFP ، GFP::utrophin) (الشكل 1). انظر القائمة الكاملة للبلازميدات في الملف التكميلي 1.
- استخدم الأساليب المعمول بها لإنشاء خط معدل وراثيا يصنف أشواك DD 8,9.
- تحضير مانع التسرب
- اصنع مزيجا بنسبة 1: 1 من وسيط التضمين القائم على البارافين10 (انظر جدول المواد).
- سخني الوسط عند 60 درجة مئوية حتى يذوب ، ثم القسمة في أنابيب طرد مركزي دقيقة مغطاة بسعة 1.5 مل وحافظ على كتلة تسخين عند 60-70 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن أن يستمر مانع التسرب لمدة 4 أسابيع في كتلة التسخين.
- تحضير مخدر.
- اصنع محاليل مخزون في H2O المقطر من 1٪ Tricaine و 1 M levamisole (انظر جدول المواد). يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
- قم بإعداد محلول عملي من 0.05٪ Tricaine و 15 mM مخدر ليفاميزول ، كما هو موضح في الخطوات 1.3.3-1.3.511.
- مزيج 75 ميكرولتر من 1٪ مخزون تريكايين و 22.5 ميكرولتر من 1 م ليفاميزول.
- أضف المخزن المؤقت M9 إلى الحجم النهائي 1.5 مل.
- حصة 10 ميكرولتر من 0.05٪ تريكايين ، 15 مللي مول ليفاميزول في أنابيب طرد مركزي دقيقة 0.5 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: خليط التخدير حساس لدرجة الحرارة ، ولا ينبغي إعادة تجميد القسمة الفردية لمحلول العمل بعد الذوبان لكل تجربة. انظر الملف التكميلي 2 للحصول على وصفة للمخزن المؤقت M9.
- الحصول على صور عالية الدقة
- تحضير 10٪ agarose والحفاظ عليه في حمام مائي عند 60 درجة مئوية.
ملاحظة: راجع تقرير مونيكا دريسكول في WormBook12. - قم بتركيب 15-20 شابا على ضمادات أغاروز بنسبة 10٪ وأضف 3 ميكرولتر من المخدر (انظر الخطوة 3).
- ضع غطاء الغطاء (يتم تجميد الديدان في غضون 5 دقائق).
- أغلق حواف غطاء الغطاء بخليط مانع التسرب اللاصق المذاب (انظر جدول المواد).
- الحصول على الصور
- اكتساب فائقة الدقة
- استخدم مجهرا متحد البؤر للمسح بالليزر ومزودا للفحص المجهري فائق الدقة بعدسة موضوعية لزيت Plan Apochromat 63x / 1.40 لتحقيق حجم بكسل صغير (على سبيل المثال ، < 50 نانومتر). احصل على مكدسات Z باستخدام حجم الخطوة الموصى به من قبل برنامج الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- اجمع سلسلة من المقاطع البصرية التي تغطي الحجم الكلي للعملية البطنية DD (على سبيل المثال ، 15-20 شريحة بحجم خطوة 0.19 ميكرومتر أو سمك 2-3 ميكرومتر). أرسل Z-stacks لمعالجة الصور باستخدام برنامج الشركة المصنعة وقم بتحليل الصور بدرجة أعلى من 7 (الشكل 1B والشكل 2 والشكل 3).
- اقتناء نيكويست
- استخدم مجهر المسح الضوئي متحد البؤر لتحديد حجم البكسل الأمثل لطول موجة الضوء والفتحة العددية للعدسة الشيئية المستخدمة (على سبيل المثال ، 40x / 1.4 Plan Fluor oil objective).
ملاحظة: سيكشف حجم البكسل الأصغر عن البنية الدقيقة لأشواك DD. - أرسل مكدسا لفك الالتفاف ثلاثي الأبعاد باستخدام خوارزمية تلقائية (انظر جدول المواد) (الشكل 3).
- استخدم مجهر المسح الضوئي متحد البؤر لتحديد حجم البكسل الأمثل لطول موجة الضوء والفتحة العددية للعدسة الشيئية المستخدمة (على سبيل المثال ، 40x / 1.4 Plan Fluor oil objective).
- استخدم أصغر خطوة Z ممكنة (على سبيل المثال ، تحددها مرحلة بيزو) لأن الإفراط في أخذ العينات في Z يمكن أن ينتج عنه صور أكثر وضوحا بعد فك الالتفاف ثلاثي الأبعاد13.
- اكتساب فائقة الدقة
- تحضير 10٪ agarose والحفاظ عليه في حمام مائي عند 60 درجة مئوية.
- تحليل الصور
- استخدم برنامج معالجة الصور المناسب (انظر جدول المواد) لإنشاء إسقاطات كثافة قصوى ل Z-stacks14.
- عد يدويا النتوءات على تغصنات DD.
ملاحظة: النتوءات عبارة عن امتدادات عمودية من العمود الرئيسي (الشكل 1B ، رؤوس الأسهم). - أوجد طول التغصنات DD المسجلة لحساب كثافة الأشواك لكل 10 ميكرومتر من تغصنات DD (الشكل 1C).
- صنف الأشواك على أنها رقيقة / فطر أو خيطية أو قصيرة أو متفرعة (الشكل 2 أ).
ملاحظة: تظهر الأشواك الرقيقة / الفطر قاعدة ضيقة (رقبة) وطرف أوسع (رأس). لا تظهر الأشواك الخيطية قاعدة ضيقة (بدون رقبة) ولكن لها عرض ثابت. العمود الفقري القصير له قاعدة واسعة وطرف. العمود الفقري المتفرع عبارة عن نتوءات بأكثر من طرف واحد.
2. تقييم تنشيط العمود الفقري التغصني DD عن طريق الإشارات الكولينية قبل المشبكية
- إنشاء ديدان معدلة وراثيا باستخدام التقنيات التقليدية (مثل الحقن المجهري)8,9
- استخدم مروج flp-13 لدفع التعبير عن مستشعر Ca++ ، GCaMP6s ، في الخلايا العصبية DD ومروج unc-4 لدفع التعبير عن Chrimson ، قناة حمراء التحول رودوبسين ، في الخلايا العصبية VA قبل المشبكية (الشكل 4 أ). انظر قائمة البلازميدات في الملف التكميلي 1.
- تحضير الشبكية العابرة بالكامل (ATR) ولوحات التحكم.
ملاحظة: ATR هو عامل مساعد مطلوب ل Chrimson ليعمل كقناة أيونية منشطة بصريا.- تحضير محلول مخزون ATR 100 mM في الإيثانول (100٪). يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية في 1 مل من القسمة الأصلة.
- تحت غطاء التدفق الصفحي ، أضف 300 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية OP50 طوال الليل و 0.25 ميكرولتر من ATR إلى كل صفيحة أجار مغذية NGM (وسط نمو الديدان الخيطية) 60 مم وانتشر بقضيب زجاجي معقم.
- بالنسبة للضوابط ، أضف 300 ميكرولتر من بكتيريا OP50 و 0.25 ميكرولتر من الإيثانول (100٪) إلى مجموعة منفصلة من ألواح NGM.
- دع الألواح تجلس في غطاء المحرك في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة (محمية من الضوء المحيط) للسماح بنمو البكتيريا.
ملاحظة: يمكن استخدام الألواح بعد الحضانة الأولية لمدة 24 ساعة أو الحفاظ عليها عند 4 درجات مئوية لاستخدامها في غضون 5 أيام.
- إعداد التجربة
- ضع خمس يرقات من المرحلة NC3569 L4 على ATR المصنف OP50 أو لوحات التحكم التي تفتقر إلى ATR وتنمو في الظلام عند 23 درجة مئوية.
- بعد ثلاثة أيام ، استخدم مجهر تشريح ستيريو لتأكيد تطور الفرج لاختيار ذرية المرحلة L4 من ATR ولوحات التحكم للتصوير كما هو موضح في الخطوات 2.4.1-2.4.3.
- على شريحة مجهرية ، ضع 2 ميكرولتر من 0.05 ميكرومتر بوليبيدات (2.5٪ مواد صلبة وزن / حجم) (انظر جدول المواد).
- استخدم سلكا بلاتينيا ("معول الدودة") لإضافة كرية صغيرة من الغراء الفائق إلى المحلول وقم بالدوران برفق لتوليد "خيوط" خيطية من الغراء. ثم أضف 3 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 (الشكل 4 ب).
- ضع ما يقرب من عشرة يرقات L4 في المحلول وقم بتطبيق غطاء غطاء.
ملاحظة: سوف تتصل ألياف الغراء بشكل عشوائي بالديدان وتشل حركتها بعد تطبيق غطاء الغطاء. تظهر الديدان المضمنة في كريات كبيرة من الغراء مجففة ويجب عدم تصويرها. - قم بختم حواف غطاء الغطاء كما هو مذكور في الخطوة 1.4.4.
- تسجيل عابري Ca++ المثار في العمود الفقري التغصني.
- استخدم مجهرا متحد البؤر للقرص الدوار مزودا بكاميرا CCD حساسة ، وعدسة موضوعية زيتية TIRF 100x ، وخطوط ليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر (انظر جدول المواد).
- اضبط مرحلة المجهر لوضع أشواك DD في المستوى البؤري.
- قم بإعداد الحصول على الفاصل الزمني لإلقاء الضوء على العينة بخط ليزر 488 نانومتر لكل إطار (للكشف عن مضان GCaMP6s) وخط الليزر 561 نانومتر على فترات دورية (لإثارة Chrimson).
ملاحظة: على سبيل المثال ، استخدم ضوء 488 نانومتر لالتقاط لقطات متتالية (200 مللي ثانية) لإشارة GCaMP6s مقترنة بنبضة 200 مللي ثانية من ضوء 561 نانومتر كل إطار خامس (الشكل 4C-E). باستخدام هذا التكوين ، يتم اكتشاف مستويات GCaMP قبل وبعد كل نبضة 561 نانومتر ~ 1 ثانية متباعدة (200 مللي ثانية من ليزر 488 نانومتر لاكتشاف GCaMP قبل تنشيط VA ، 200 مللي ثانية من نبضة 561 نانومتر لتنشيط VA و ~ 600 مللي ثانية للتبديل بين خطوط الليزر ومرشحات الانبعاثات. مع هذا الإعداد ، يتم تنشيط الخلايا العصبية VA كل 2.5 ثانية.
- تحليل التصوير في الجسم الحي Ca++
- استخدم 2D-deconvolution ومحاذاة الصورة لتصحيح الانحرافات الطفيفة الناشئة عن حركة الدودة أثناء الاكتساب (انظر جدول المواد).
- حدد العمود الفقري الشجيري DD على أنه منطقة الاهتمام (عائد الاستثمار في الأشكال 4C-D).
- قم بتكرار عائد الاستثمار والانتقال إلى منطقة مجاورة داخل الدودة لجمع إشارة الخلفية (أي الضوضاء).
- استخدم البرامج المناسبة (انظر جدول المواد) لتصدير كثافة GCaMP6s للتفوق لكل نقطة زمنية. اطرح مضان الخلفية من مضان عائد الاستثمار في العمود الفقري.
- حدد التغير في التألق عن طريق طرح مضان GCaMP6s في الإطار مباشرة قبل إثارة 561 نانومتر (F0) من كل نقطة زمنية بعد الإثارة (ΔF) ، ثم القسمة على F0 لتحديد ΔF / F0 (الشكل 4E).
- رسم بياني للآثار الطبيعية (انظر جدول المواد).
- قم بإجراء اختبار إحصائي مزدوج لكل قياس لمضان GCaMP6s قبل وبعد كل نبضة من ضوء 561 نانومتر.
ملاحظة: يستبعد هذا النهج بشكل فعال التقلبات العشوائية في مضان GCaMP6s التي تقلل من القوة الإحصائية لمقارنة متوسط إشارة GCaMP6s من جميع القياسات قبل وبعد إثارة 561 نانومتر (الشكل 4F). - بالنسبة للقياسات التي تظهر توزيعا طبيعيا أو غاوسيا ، استخدم اختبار ANOVA بارامتري مقترن وصحح للمقارنات المتعددة لكل من المجموعتين (ATR قبل مقابل بعد ، لا ATR قبل مقابل بعد). بدلا من ذلك ، بالنسبة للبيانات التي لا يتم توزيعها عادة ، استخدم ANOVA غير معلمي مع تصحيح لاحق للاختبارات المتعددة.
ملاحظة: الديدان التي تنمو على لوحات تفتقر إلى ATR ("لا ATR") هي عناصر تحكم ضرورية ويجب ألا تظهر 561 نانومتر متحرك Ca++ لأن ATR مطلوب لوظيفة Chrimson.
Representative Results
أسفرت القياسات باستخدام ثلاث علامات مستقلة (mCherry الخلوي ، LifeAct::GFP ، MYR::mRuby) عن متوسط كثافة 3.4 ± 1.03 DD من العمود الفقري التغصني لكل 10 ميكرومتر من تغصنات DD في الشباب من النوع البري (الشكل 1B ، C). بالنسبة لهذا التحليل ، تم استبعاد القياسات التي تم الحصول عليها باستخدام GFP::Utrophin marker التي أسفرت عن كثافة عمود فقري أقل بكثير (2.4 ± 0.74 ، الشكل 1) بسبب تفاعلات Utrophin مع الهيكل الخلوي الأكتين6 الذي يحتمل أن يدفع تكوين العمود الفقري15. قياسات كثافة العمود الفقري في المجهر الضوئي قابلة للمقارنة مع قيمة 4.2 العمود الفقري / 10 ميكرومتر من التغصنات التي تم الحصول عليها من إعادة بناء 12 العمود الفقري من الصور المجهرية الإلكترونية للخلية العصبية DD12. أكد نهج تصوير الخلايا الحية أن التشكل الرقيق / على شكل فطر لأشواك DD يسود في أشكال العمود الفقري البالغة مقابل الأشكال البديلة (على سبيل المثال ، خيطي ، قصير ، متفرع) (الشكل 2 ب) ، وهو أيضا نموذجي للأشواك في الجهاز العصبي الناضجللثدييات 16.
تم استخدام استراتيجية علم البصريات الوراثي للسؤال عما إذا كانت الأشواك المتغصنة المفترضة التي تم اكتشافها بواسطة الفحص المجهري الضوئي عالي الدقة (الشكل 1 والشكل 2) تستجيب لإطلاق الناقل العصبي من مواقع ما قبل المشبكي ، وهي سمة مميزة للأشواك المتغصنة في الخلايا العصبية للثدييات. تم استخدام الضوء الأخضر (561 نانومتر) لتنشيط متغير قناة رودوبسين ، كريسمسون ، في الخلايا العصبية الكولينية قبل المشبكية والضوء الأزرق (488 نانومتر) للكشف عن التألق المعتمد على الكالسيوم ++ المنبعث من مسبار GCaMP السيتوبلازمي في العمود الفقري التغصني DD بعد المشبكي. اكتشفت هذه التجربة رشقات نارية عابرة لإشارة GCaMP في أشواك DD مباشرة بعد التنشيط البصري الجيني ل Chrimson في الخلايا العصبية VA قبل المشبكية (الشكل 3). يعتمد نجاح هذه التجربة على التعبير الموثوق به ل Chrimson في جميع الخلايا العصبية VA قبل المشبكي. في هذه الحالة ، تم استخدام تكامل الكروموسومات17 من علامة Punc-4::Chrimson لضمان تعبير VA متسق. يمكن أيضا إجراء هذه التجربة باستخدام مصفوفة خارج الكروموسومات. يمكن تأكيد تعبير Chrimson في خلية عصبية VA محددة بشكل مستقل ، على سبيل المثال ، عن طريق اقتران جين Chrimson المحوري بتسلسل قائد SL2 مع GFP موضعي نوويا في اتجاه مجرى النهر كعلامة تعبير مشترك2. من الضروري إجراء تجربة تحكم في غياب ATR للتأكد من أن إشارة GCaMP المقاسة تعتمد على التنشيط البصري الجيني ل Chrimson ، والذي يعتمد بشكل صارم على ATR (الشكل 4D). أخيرا ، نظرا لأن إشارات Ca++ المستثارة عابرة ، فمن الأهمية بمكان اعتماد بروتوكول تصوير يسمح بالتبديل السريع (<1 ثانية) بين إثارة 561 نانومتر واكتساب إشارة GCaMP باستخدام ليزر 488 نانومتر (الشكل 4).
الشكل 1: وضع العلامات على العمود الفقري الشجيري DD . (أ) (أعلى) ستة خلايا عصبية ظهرية D (DD1-DD6) في الحبل العصبي البطني ل C. elegans. (أسفل) في البالغين، تتصل أشواك DD الموجهة بطنيا (رأس السهم) بالمحطات قبل المشبكية للخلايا العصبية الحركية البطنية A (VA) و Ventral B (VB) (الأرجواني)، وتمتد وصلات DD إلى الحبل العصبي الظهري لتوفير إخراج GABAergic لعضلات الجسم (السهم)18. تم تعديل هذا الرقم من المرجع2. (ب) الصور المجهرية الفلورية (Airyscan) لأشواك DD الموسومة ب mCherry الخلوي ، mRuby myristoylated (MYR::mRuby) ، LifeAct::GFP و GFP::Utrophin في الديدان البالغة الشابة. تشير رؤوس الأسهم الرمادية إلى العمود الفقري. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. (C) الكثافة (العمود الفقري / 10 ميكرومتر) للأشواك المتغصنة العصبية DD الموسومة ب mCherry الخلوي (3.77 ± 0.9) ، MYR :: mRuby (3.09 ± 0.8) ، LifeAct::GFP (3.44 ± 1.1) أو GFP :: Utrophin (2.41 ± 0.8). يتم توزيع جميع العينات عادة. يظهر تحليل الأجسام الأحادي الاتجاه أن كثافات العمود الفقري ل mCherry الخلوي ، MYR :: mRuby ، و LifeAct::GFP لا تختلف اختلافا كبيرا (NS) ، في حين يتم تقليل كثافة العمود الفقري ل GFP :: Utrophin مقابل المسمى خلويا mCherry (p = 0.0016) و LifeAct::GFP (p = 0.0082). يمثل الخط الأحمر المتقطع كثافة العمود الفقري للخلايا العصبية DD التي تم تقييمها من إعادة بناء 3D EM (4.2 عمود فقري / 10 ميكرومتر). تم تعديل هذا الرقم من المرجع2. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تصوير العمود الفقري الشجيري DD. (أ) (أعلى) رسم تخطيطي لأشكال العمود الفقري. (أسفل) صور Airyscan لكل نوع من العمود الفقري (شريط المقياس = 500 نانومتر) المسمى LifeAct::GFP (أخضر) وإعادة بناء 3D بواسطة صور مجهرية إلكترونية تسلسلية لشخص بالغ متجمد عالي الضغط (أزرق). (ب) تردد العمود الفقري حسب النوع ، مرئي مع LifeAct::GFP: نحيف / فطر (55.5 ± 14.5٪) ، Filopodial (10.3 ± 8.70٪) ، قصير (18.8 ± 10.7٪) ، متفرع (15.42 ± 6.01٪). تردد العمود الفقري حسب النوع المرئي باستخدام MYR::mRuby: نحيف / فطر (52.2 ± 16.5٪) ، Filopodial (5.68 ± 7.0٪) ، قصير (33.1 ± 14.8٪) ، متفرع (9.02 ± 9.6٪). اختبار T غير المزاوج ، Filopodial (p = 0.0339) ؛ تختلف الأشواك القصيرة (p = 0.0009) والمتفرعة (p = 0.011) الموسومة بعلامة MYR :: mRuby بشكل كبير عن LifeAct::GFP. تم تعديل هذا الرقم من المرجع2. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: استراتيجيات الحصول على صور عالية الدقة لأشواك DD . (أ-ب) (أعلى) صور فلورية لزوائد شجيرية DD1 موسومة بعلامة خلوية (mCherry) بواسطة (A) كاشف Airyscan و (B) اكتساب Nyquist. (أسفل) يتم تصوير تغصنات DD (الحمراء) باستخدام برنامج تحليل الصور (خيار المسار التلقائي لتتبع الفتيل) ، ويتم توضيح أشواك DD (الأزرق) بيانيا باستخدام وحدة الكشف عن العمود الفقري شبه الآلي. يشير السهم إلى العمود الفقري المتفرع الموسع في C و D. تشير رؤوس الأسهم إلى الأشواك الرقيقة / الفطر المجاورة المتضخمة في C و D. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. (C-D) أمثلة متضخمة للعمود الفقري المتفرع (العلوي) (السهم) و (السفلي) اثنين من الأشواك الرفيعة / الفطر المجاورة (رؤوس الأسهم) التي تم الحصول عليها باستخدام (C) كاشف Airyscan أو عن طريق (D) اكتساب Nyquist. شريط المقياس = 500 نانومتر. البيانات المستنسخة من2. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تقييم وظيفة العمود الفقري DD. (أ) تعبر الخلايا العصبية الحركية DD عن مؤشر Ca++ GCaMP6s (أخضر) ، وتعبر الخلايا العصبية الحركية VA عن متغير القناة رودوبسين ، Chrimson (أرجواني) 7. (ب) طريقة تصوير تخطيطية لتركيب الديدان لقياسات Ca++ . (1) على شريحة مجهر نظيفة ، (2) ضع 2 ميكرولتر من حبات بولي 0.05 ميكرومتر ، (3) استخدم سلك بلاتيني ("اختيار دودة") لإضافة كرة صغيرة من الغراء الفائق و (4) دوامة في المحلول لتوليد خيوط خيطية من الغراء. (5) أضف 3 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9. (6) ضع ما يقرب من عشر يرقات L4 في المحلول ، (7) ضع حواف الغطاء والختم باستخدام الفازلين / الشمع. (جيم - دال) يرتبط تنشيط الخلايا العصبية VA بعابرات Ca++ في العمود الفقري DD1. مضان GCaMP6s المصور (على فترات 0.5 ثانية) مع تنشيط الضوء الدوري ل Chrimson (فترات 2.5 ثانية) يستحضر Ca++ عابرين مع (C) + ATR (n = 12) ولكن ليس في (D) عناصر التحكم (-ATR ، n = 12). اللوحات عبارة عن لقطات بمرور الوقت (الأوقات) ، قبل وبعد نبضة ضوء 561 نانومتر (خط وردي عمودي). أشرطة المقياس = 2 ميكرومتر. يتم الحصول على إشارة GCaMP6s من عائد الاستثمار (منطقة الاهتمام) عند طرف كل عمود فقري. (ه) مضان GCaMP6s خلال فترة التسجيل 10 ثوان المرسومة ل + ATR (أخضر) مقابل -ATR (تحكم ، رمادي) (ن = 12 مقطع فيديو). تشير الأشرطة الوردية العمودية إلى إضاءة 561 نانومتر (على سبيل المثال ، تنشيط Chrimson). تم تحفيز كل 4 مرات مع ضوء 561 نانومتر. تم جمع القياسات قبل وبعد كل نبضة من ضوء 561 نانومتر. (F) مخطط مضان GCaMP6s قبل وبعد كل نبضة من ضوء 561 نانومتر. تم قياس مضان GCaMP6s 1 ثانية بعد كل نبضة من ضوء 561 نانومتر. نظرا لأن العينات لا يتم توزيعها بشكل طبيعي ، فقد تم تطبيق اختبار فريدمان غير المعلمي المزدوج لتصحيح المقارنات المتعددة لمضان GCaMP6s قبل مقابل. بعد 561 نانومتر تحفيز الضوء للديدان نمت إما مع ATR (+ ATR ، الأخضر) (*** p = 0.0004 ، ن = 48 قياسات) أو في حالة عدم وجود ATR (-ATR ، رمادي) (NS ، غير مهم ، p = 0.0962 ، ن = 48 قياسا). تم تعديل هذا الرقم من المرجع2. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الملف التكميلي 1: قائمة البلازميدات المستخدمة في الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: تكوين وإعداد المخزن المؤقت M9. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
تم اختيار كاشف Airyscan للحصول على لقطات من أشواك DD لأنه يوفر نسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى ودقة أفضل من المجاهر متحدة البؤر التقليدية19,20. يسمح تصوير AiryScan أيضا باستخدام بروتينات الفلورسنت التقليدية (على سبيل المثال ، GFP ، mCherry ، إلخ) ، وهي متاحة الآن على نطاق واسع ل C. elegans. على الرغم من أنه يمكن الحصول على صور عالية الدقة باستخدام طرق أخرى فائقة الدقة (على سبيل المثال ، STORM ، STED ، PALM) ، تتطلب هذه الطرق بروتينات فلورية قابلة للتنشيط الضوئي أو قابلة للتبديل الضوئي21. كبديل ل Airyscan، يوصى باستخدام المجاهر متحدة البؤر التقليدية. على سبيل المثال ، يحقق التصوير باستخدام اكتساب Nyquist (الشكل 3) حجم البكسل باستخدام هدف 40x / 1.3 يبلغ 123.9 نانومتر ، وهو ما يكفي لتمييز الأنواع المورفولوجية للعمود الفقري (الشكل 2).
لتحديد كثافة العمود الفقري ، يوصى باستخدام بروتين فلوري خلوي مثل (1) mCherry أو GFP ، (2) LifeAct لتسمية الهيكل الخلوي الأكتين ، أو (3) بروتين فلوري ميريستويل (على سبيل المثال ، MYR::mRuby) لتسمية غشاء البلازما (الشكل 1B). وبالمقارنة ، فإن بروتين ربط F-actin Utrophin يقلل من كثافة العمود الفقري (الشكل 1C) ، مما يشير إلى وجود تأثير سلبي على تشكل العمود الفقري عندما يتم التعبير عن Utrophin بشكل مفرط.
يجب أن تساعد طرق التصوير الحالية في تحديد المتغيرات الجينية التي تحكم مورفولوجيا العمود الفقري1،16. يمكن تقييم مورفولوجيا العمود الفقري DD (أي رقيقة / فطر ، خيطي ، قصير ، متفرع ، انظر الشكل 2) من إسقاطات ثنائية الأبعاد مفردة للصور الجانبية للحبل العصبي البطني نظرا لأن معظم أشواك DD تتبنى اتجاها موجها بطنيا مميزا. في هذه المقارنات ، من الضروري استخدام نفس علامة الفلورسنت لكل حالة حيث يبدو أن الأنواع المورفولوجية الظاهرة للعمود الفقري تتأثر بطريقة وضع العلامات (على سبيل المثال ، MYR::mRuby مقابل لايف أكت::GFP). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ أن أشكال العمود الفقري ديناميكية ومن المحتمل أن تغير شكلها استجابة للإشارات الخارجية 2,16. وبالتالي ، من الضروري أيضا مقارنة أشكال العمود الفقري بين الأنماط الجينية في مراحل نمو مماثلة وفي ظل ظروف مماثلة.
يعد اتجاه الحبل البطني C. elegans أمرا حيويا للغاية للحصول على صورة دقيقة. يجب أن يكون كل من الحبال البطنية والظهرية على جانبي الحيوان مرئيين في نفس المستوى Z ، مما يشير إلى أن الدودة موجهة على جانبها (الشكل 1B). من الأفضل عدم جمع صور للديدان التي تتحرك أو تتلامس مع الديدان أو الفقاعات الأخرى بالقرب من الحبل البطني ، لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى تدهور صور العمود الفقري.
لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي ، يجب إعداد شرائح جديدة مباشرة قبل كل عملية استحواذ. من الأفضل تصوير الديدان الملامسة لألياف الغراء الرقيقة فقط مقابل. "كرات من الغراء تميل إلى تجفيف الديدان وتدهور الصورة (الشكل 4 ب). في التجربة الموضحة في الشكل 4، تنشط نبضة الضوء التي مقدارها 561 نانومتر مجال الرؤية بأكمله. لزيادة الدقة الزمنية والمكانية للكشف عن عابري Ca++ المحليين ، على سبيل المثال ، داخل أشواك DD الفردية ، يمكن استخدام ماسح ضوئي صغير galvo تم إعداده لخط الليزر 561 نانومتر لتحفيز منطقة أصغر من الاهتمام17.
Disclosures
نعلن عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم إجراء التصوير والتحليل على Imaris في المورد المشترك لتصوير خلايا فاندربيلت (CIRS) بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (CA68485 و DK20593 و DK58404 و DK59637 و EY08126). يتم دعم LSM 880 من خلال المنحة 1S10OD201630. تم إجراء التصوير على قرص دوار نيكون في مركز نيكون للتميز. نشكر جيني شافر ، مديرة CISR ، وبريان ميليس على التدريب والمناقشات الثاقبة وأعضاء مختبر بورنيت: ديلان بورنيت ، أيدان فينيكس ، ونيلاي تانيجا على المشورة. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة إلى DMM (R01NS081259 و R01NS106951) ومنحة جمعية القلب الأمريكية إلى ACC (18PRE33960581).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
| diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
| Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
| ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
| Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
| NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
| NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
| Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
| Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
| SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
| Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
| vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
| Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
| Microscope for super-resolution imaging | |||
| LSM880 | Zeiss | ||
| AiryScan detector | Zeiss | ||
| Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
| Laser lines | |||
| Stage controller | |||
| Microscope for Nyquist image acquisition | |||
| A1R Confocal | Nikon | ||
| Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
| 488 nm, 16mW | |||
| 561 nm, 17mW | |||
| Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
| Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
| Andor DU-897 EMCCD camera | |||
| Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
| 488 nm, 65mW | |||
| 561 nm, 86mW | |||
| 525 nm (+/- 18 nm) | |||
| 605 nm (+/- 35 nm) |
References
- Sala, C., Segal, M. Dendritic Spines: The Locus of Structural and Functional Plasticity. Physiological Reviews. 94 (1), 141-188 (2014).
- Cuentas-Condori, A., et al. C. elegans neurons have functional dendritic spines. Elife. 8, 47918 (2019).
- Philbrook, A., et al. Neurexin directs partner-specific synaptic connectivity in C. Elegans. Elife. 7, 35692 (2018).
- Oliver, D., Alexander, K., Francis, M. M. Molecular Mechanisms Directing Spine Outgrowth and Synaptic Partner Selection in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Neuroscience. 12, 10-13 (2018).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- Ladt, K., Ganguly, A., Roy, S. Axonal actin in action: Imaging actin dynamics in neurons. Methods of Cell Biology. 131, 91-106 (2016).
- Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual color neural activation and behavior control with chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (4), 1029-1034 (2015).
- Mello, C., Kramer, J., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrahcormosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C . elegans Using Microinjection. Journal of Visualized Experiments. (18), e833 (2008).
- Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-specific expression profiling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developemntal Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
- Mccarter, J., Bartlett, B., Dang, T., Schedl, T. Soma - Germ Cell Interactions in Caenorhabditis elegans : Multiple Events of Hermaphrodite Germline Development Require the Somatic Sheath and Spermathecal Lineages. Developemntal Biology. 181 (2), 121-143 (1997).
- Driscoll, M. Mounting animals for observation with Nomarski DIC optics. WormBook. , (2008).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Hotulainen, P., Hoogenraad, C. C. Actin in dendritic spines connecting dynamics to function. Journal of Cell Biology. 189 (4), 619-629 (2010).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are They All the Same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121 (9), 2877-2886 (1995).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Ventral Nerve Cord of Caenorhadbitis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society. 275 (938), 327-348 (1976).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
- Huff, J. The Fast mode for ZEISS LSM 880 with Airyscan high-speed confocal imaging with super-resolution and improved signal-to-noise ratio. Nature Methods. 13, (2016).
- Jacquemet, G., Carisey, A. F., Hamidi, H., Henriques, R., Leterrier, C. The cell biologist's guide to super-resolution microscopy. Journal of Cell Science. 133 (11), 240713 (2020).
