Summary
Dendritiske spines er viktige cellulære egenskaper i nervesystemet. Her beskrives levende avbildningsmetoder for å vurdere strukturen og funksjonen til dendritiske spines i C. elegans. Disse tilnærmingene støtter utviklingen av mutante skjermer for gener som definerer dendritisk ryggradsform eller funksjon.
Abstract
Dendritiske spines er spesialiserte steder for synaptisk innervering modulert av aktivitet og fungerer som substrater for læring og minne. Nylig har dendritiske spines blitt beskrevet for DD GABAergiske nevroner som inngangssteder fra presynaptiske kolinerge nevroner i motorkretsen til Caenorhabditis elegans. Denne synaptiske kretsen kan nå tjene som en kraftig ny in vivo-modell av ryggradsmorfogenese og funksjon som utnytter den lette genetikken og tilgjengeligheten til C. elegans til live-cell imaging.
Denne protokollen beskriver eksperimentelle strategier for å vurdere DD-ryggradens struktur og funksjon. I denne tilnærmingen brukes en superoppløsningsavbildningsstrategi for å visualisere de intrikate formene til aktinrike dendritiske spines. For å evaluere DD-ryggradsfunksjonen stimulerer den lysaktiverte opsinen, Chrimson, de presynaptiske kolinerge nevronene, og kalsiumindikatoren, GCaMP, rapporterer de fremkalte kalsiumtransientene i postsynaptiske DD-spines. Sammen utgjør disse metodene kraftige tilnærminger for å identifisere genetiske determinanter for dendritiske spines i C. elegans som også kan lede ryggradsmorfogenese og fungere i hjernen.
Introduction
Dendritiske spines er spesialiserte cellulære strukturer som mottar innspill fra nærliggende nevroner for synaptisk overføring. Aktivering av nevrotransmitterreseptorer hever intracellulært kalsium og nedstrøms signalveier i disse karakteristiske nevronfremspringene1. På grunn av den grunnleggende betydningen av dendritiske spines for nevrotransmisjon og deres feilregulering i nevrodevelopmental sykdommer1, er oppdagelsen av faktorer som modulerer dendritisk ryggradsmorfogenese og funksjon av stor interesse for nevrovitenskap.
Nylig har dendritiske spines blitt identifisert i C. elegans nervesystem basert på nøkkelegenskaper som deles med pattedyrs spines2. Denne bestemmelsen er avgjørende fordi den åpner muligheten for å utnytte fordelene ved C. elegans for å undersøke ryggradsbiologi. Dendrittiske pigger på dorsale D (DD) motornevroner mottar input fra kolinerge nevroner (VA og VB) i ventralnerven (figur 1A)2,3,4. Her presenteres avbildningsmetoder for å utforske strukturen til DD dendritiske spines og deres funksjon in vivo i et intakt nervesystem som er lett tilgjengelig for levende bildebehandling og genetisk analyse. For å overvåke formen på dendritiske spines, (1) cytosoliske fluorescerende proteiner, som fyller dendritisk prosess og spines; (2) membranbundne fluorescerende proteiner, som dekorerer grensen til dendritiske spines og dendritter; eller (3) aktinmarkørene, LifeAct5 eller Utrophin6, som er beriket i dendritiske spines, brukes, og avslører dermed deres form. For å overvåke funksjonaliteten til DD-spines, brukes GCaMP-fluorescens til å oppdage Ca ++-transienter fremkalt ved aktivering av den rødforskjøvne opsinen, Chrimson, i presynaptiske kolinerge nevroner7. Begge strategiene forventes å lette studiet av DD dendritiske spines i villtype og mutante dyr.
Protocol
1. Bestemmelse av strukturen til DD dendritiske spines
- Lag transgene ormer for å merke DD-spines
- Bruk flp-13-promotoren til å bygge en uttrykksvektor for etiketten av interesse (f.eks. cytoplasmatisk mCherry, MYR::mRuby, LifeAct::GFP, GFP::utrophin) (figur 1). Se den komplette listen over plasmider i tilleggsfil 1.
- Bruk etablerte metoder for å generere en transgen linje merking DD spines 8,9.
- Forbered tetningsmassen
- Lag en 1:1-blanding av parafinbasert innebyggingsmedium10 (se materialtabell).
- Varm opp mediet ved 60 °C til det smelter, deretter aliquot i mikrosentrifugerør på 1,5 ml og oppretthold en varmeblokk ved 60-70 °C.
MERK: Tetningsmasse kan vare i 4 uker i varmeblokken.
- Forbered en bedøvelse.
- Lag lagerløsninger i destillert H2O på 1% Tricaine og 1 M levamisol (se Materialtabell). Oppbevares ved -20 °C.
- Forbered en arbeidsløsning på 0,05% Tricaine og 15 mM levamisolbedøvelse, som beskrevet i trinn 1.3.3-1.3.511.
- Bland 75 μL av 1% Tricaine lager og 22,5 μL av 1 M levamisol.
- Legg til M9-buffer til et endelig volum på 1,5 ml.
- Aliquot 10 μL på 0,05% Tricaine, 15 mM levamisol i 0,5 ml mikrosentrifugerør og oppbevares ved -20 °C.
NOTAT: Bedøvelsesblandingen er følsom for temperatur, og individuelle aliquots av arbeidsløsningen bør ikke fryses på nytt etter tining for hvert forsøk. Se tilleggsfil 2 for en oppskrift på M9-buffer.
- Skaff bilder med høy oppløsning
- Forbered 10% agarose og oppretthold den i vannbadet ved 60 ° C.
MERK: Se rapporten av Monica Driscoll i WormBook12. - Monter 15-20 unge voksne på 10% agaroseputer og tilsett 3 μL bedøvelse (se trinn 3).
- Påfør dekselet (ormer immobiliseres innen 5 minutter).
- Forsegl kantene på dekselet med smeltet klebemiddelblanding (se materialtabell).
- Skaff deg bilder
- Anskaffelse av superoppløsning
- Bruk et konfokalmikroskop for laserskanning utstyrt for superoppløsningsmikroskopi med en 63x / 1.40 Plan-Apochromat oljeobjektivlinse for å oppnå en liten pikselstørrelse (f.eks. < 50 nm). Skaff deg Z-stabler ved hjelp av trinnstørrelsen som anbefales av produsentens programvare (se Materialtabell).
- Samle en serie optiske seksjoner som spenner over det totale volumet av DD-ventralprosessen (f.eks. 15-20 skiver ved 0,19 μm trinnstørrelse eller 2-3μm tykk). Send inn Z-stacker for bildebehandling med produsentens programvare og analyser bilder med en score høyere enn 7 (figur 1B, figur 2 og figur 3).
- Nyquist-oppkjøpet
- Bruk et konfokalmikroskop for laserskanning for å velge den optimale pikselstørrelsen for bølgelengden til lys og numerisk blenderåpning på objektivlinsen som er i bruk (f.eks. 40x / 1.4 Plan Fluorolje-objektiv).
MERK: Den mindre pikselstørrelsen vil avsløre den fine strukturen til DD-spines. - Send inn stabel for 3D-dekonvolusjon ved hjelp av automatisk algoritme (se tabell over materialer) (figur 3).
- Bruk et konfokalmikroskop for laserskanning for å velge den optimale pikselstørrelsen for bølgelengden til lys og numerisk blenderåpning på objektivlinsen som er i bruk (f.eks. 40x / 1.4 Plan Fluorolje-objektiv).
- Bruk det minste Z-trinnet som er mulig (f.eks. bestemt av Piezo-stadiet) fordi oversampling i Z kan gi skarpere bilder etter 3D-dekonvolusjon13.
- Anskaffelse av superoppløsning
- Forbered 10% agarose og oppretthold den i vannbadet ved 60 ° C.
- Bilde analyse
- Bruk passende bildebehandlingsprogramvare (se Materialtabell) for å lage maksimale intensitetsprojeksjoner av Z-stablene14.
- Tell fremspringene manuelt på DD-dendriten.
MERK: Fremspring er vinkelrette forlengelser fra hovedakselen (figur 1B, pilspisser). - Bestem lengden på DD-dendritten scoret for å beregne tettheten av spines per 10 μm DD dendrit (figur 1C).
- Klassifiser pigger som tynn/sopp, filopodial, stubby eller forgrenet (figur 2A).
MERK: Tynne / sopp spines viser en smal base (nakke) og en bredere spiss (hode). Filopodial spines viser ikke en innsnevret base (ingen nakke), men har en konstant bredde. Stubby spines har en bred base og spiss. Forgrenede pigger er fremspring med mer enn ett tips.
2. Vurdering av aktivering av DD dendrittiske spines ved presynaptisk kolinerg signalering
- Lag transgene ormer ved hjelp av konvensjonelle teknikker (f.eks. mikroinjeksjon)8,9
- Bruk flp-13-promotoren til å drive uttrykk for Ca ++ -sensoren, GCaMP6s, i DD-nevroner og unc-4-promotoren for å drive uttrykk for Chrimson, en rødforskjøvet kanalrhodopsin, i presynaptiske VA-nevroner (figur 4A). Se listen over plasmider i tilleggsfil 1.
- Forbered All-trans Retinal (ATR) og kontrollplater.
MERK: ATR er en nødvendig kofaktor for at Chrimson skal fungere som en optogenetisk aktivert ionekanal.- Forbered 100 mM ATR lagerløsning i etanol (100%). Oppbevares ved -20 °C i 1 ml aliquots.
- Under en laminær strømningshette, tilsett 300 μL over natten OP50 bakteriekultur og 0,25 μL ATR til hver 60 mm NGM (Nematode Growth Medium) næringsagarplate og spred med en steril glassstang.
- For kontroller, tilsett 300 μL OP50-bakterier og 0,25 μL etanol (100%) til en separat gruppe NGM-plater.
- La platene sitte i panseret ved romtemperatur i 24 timer (beskyttet mot omgivelseslys) for å tillate bakterievekst.
MERK: Plater kan brukes etter den første 24 timers inkubasjonen eller vedlikeholdes ved 4 °C for bruk innen 5 dager.
- Konfigurere eksperimentet
- Plasser fem NC3569 L4-trinns larver på OP50-sådd ATR eller kontrollplater som mangler ATR og vokser i mørke ved 23 °C.
- Tre dager senere, bruk et stereo dissekere mikroskop for å bekrefte vulva utvikling for å plukke L4 trinn avkom fra ATR og kontrollplater for avbildning som beskrevet i trinn 2.4.1-2.4.3.
- På et mikroskopglass plasserer du 2 μL 0,05 μm polyperler (2,5 % faste stoffer m/v) (se materialtabell).
- Bruk en platinatråd ("ormplukking") for å legge til en liten kule av superlim til løsningen og virvle forsiktig for å generere filamentøse "tråder" av lim. Tilsett deretter 3 μL M9-buffer (figur 4B).
- Plasser omtrent ti L4 larver i løsningen og påfør et deksel.
MERK: Limfibre vil tilfeldig kontakte ormer og immobilisere dem etter at dekselet er påført. Ormer som er innebygd i store globuler av lim, virker uttørket og bør ikke avbildes. - Tetningskanter på dekselet som nevnt i trinn 1.4.4.
- Registrering av fremkalte Ca++- transienter i dendritiske pigger.
- Bruk et roterende diskkonfokalmikroskop utstyrt med et følsomt CCD-kamera, en 100x TIRF-oljeobjektivlinse og 488 nm og 561 nm laserlinjer (se materialtabell).
- Juster mikroskopstadiet for å plassere DD-pigger i fokalplanet.
- Sett opp time-lapse-innsamling for å belyse prøven med 488 nm laserlinje hver ramme (for å oppdage GCaMP6s fluorescens) og 561 nm laserlinjen med jevne mellomrom (for Chrimson-eksitasjon).
MERK: Bruk for eksempel 488 nm lys for å fange påfølgende øyeblikksbilder (200 ms) av GCaMP6s-signal kombinert med en 200 ms puls på 561 nm lys hver 5. ramme (figur 4C-E). Med denne konfigurasjonen oppdages GCaMP-nivåer før og etter hver 561 nm-puls ~ 1 s fra hverandre (200 ms 488 nm laser for å oppdage GCaMP før VA-aktivering, 200 ms 561 nm puls for å aktivere VA og ~ 600 ms for å bytte mellom laserlinjer og utslippsfiltre. Med dette oppsettet aktiveres VA-nevroner hver 2,5 s.
- Analyse av in vivo Ca++ -avbildning
- Bruk 2D-dekonvolusjon og bildejustering for å korrigere mindre avvik som oppstår fra ormbevegelsen under anskaffelsen (se Materialtabell).
- Definer DD-dendritisk ryggrad som interesseområde (avkastning i figur 4C-D).
- Dupliser avkastningen og flytt til et nærliggende område inne i ormen for å samle bakgrunnssignal (dvs. støy).
- Bruk passende programvare (se Materialtabell) for å eksportere GCaMP6s intensiteter for å utmerke seg for hvert tidspunkt. Trekk bakgrunnsfluorescens fra ryggraden ROI-fluorescens.
- Bestem endringen i fluorescens ved å trekke GCaMP6s fluorescens i rammen umiddelbart før 561 nm eksitasjon (F0) fra hvert tidspunkt etter eksitasjon (ΔF), og deretter dividere med F0 for å bestemme ΔF / F0 (figur 4E).
- Lag grafer over de normaliserte sporene (se tabell over materialer).
- Utfør en parret statistisk test for hver måling av GCaMP6s fluorescens før og etter hver puls på 561 nm lys.
MERK: Denne tilnærmingen utelukker effektivt tilfeldige svingninger i GCaMP6s fluorescens som ellers reduserer den statistiske kraften ved å sammenligne det gjennomsnittlige GCaMP6s-signalet fra alle målinger før og etter 561 nm eksitasjon (figur 4F). - For målinger som viser en normal eller gaussisk fordeling, bruk en parret parametrisk ANOVA-test og korriger for flere sammenligninger for hver av de to gruppene (ATR før vs. etter, ingen ATR før vs. etter). Alternativt, for data som ikke er normalfordelt, bruk en ikke-parametrisk ANOVA med posthoc-korreksjon for multippel testing.
MERK: Ormer dyrket på plater som mangler ATR ("ingen ATR") er nødvendige kontroller og bør ikke vise 561 nm-aktiverte Ca ++ transienter fordi ATR er nødvendig for Chrimson funksjon.
Representative Results
Målinger med tre uavhengige markører (cytosolisk mCherry, LifeAct::GFP, MYR::mRuby) ga en gjennomsnittlig tetthet på 3,4 ± 1,03 DD dendrittiske pigger per 10 μm DD-dendritt hos unge voksne av villtype (figur 1B,C). For denne analysen ble målingene oppnådd med GFP::Utrophin-markøren som ga en signifikant lavere ryggradstetthet ekskludert (2,4 ± 0,74, figur 1) på grunn av interaksjoner av Utrophin med aktincytoskjelettet6 som potensielt driver ryggradsmorfogenese15. Målingene av ryggradstetthet i lysmikroskopet er sammenlignbare med verdien av 4, 2 spines / 10 μm dendrit oppnådd ved rekonstruksjon av 12 spines fra elektronmikrografer av DD1-nevronet2. Levendecelleavbildningsmetoden bekreftet at den tynne/soppformede morfologien til DD-piggene dominerer i de voksne vs. alternative ryggradsformene (f.eks. filopodial, stubby, forgrenet) (figur 2B), som også er typisk for pigger i det modne pattedyrs nervesystem16.
En optogenetisk strategi ble brukt for å spørre om de presumptive dendrittiske ryggradene oppdaget ved høyoppløselig lysmikroskopi (figur 1 og figur 2) reagerer på nevrotransmitterfrigivelse fra presynaptiske steder, et karakteristisk kjennetegn på dendritiske spines i pattedyrneuroner. Grønt lys (561 nm) ble brukt til å aktivere en kanalrhodopsinvariant, Chrimson, i presynaptiske kolinerge nevroner og blått lys (488 nm) for å oppdage Ca ++-avhengig fluorescens som sendes ut av en cytoplasmatisk GCaMP-sonde i postsynaptiske DD-dendrittiske ryggrader. Dette eksperimentet oppdaget forbigående utbrudd av GCaMP-signal i DD-spines umiddelbart etter optogenetisk aktivering av Chrimson i presynaptiske VA-nevroner (figur 3). Suksessen til dette eksperimentet avhenger av det pålitelige uttrykket av Chrimson i alle presynaptiske VA-nevroner. I dette tilfellet ble en kromosomal integrant17 av Punc-4: : Chrimson-markøren brukt for å sikre konsistent VA-uttrykk. Dette eksperimentet kan også utføres med en ekstrakromosomal matrise. Chrimson-uttrykk i et spesifikt VA-nevron kan uavhengig bekreftes, for eksempel ved å koble Chrimson-transgenet til en SL2-transplikert ledersekvens med en nedstrøms kjernefysisk lokalisert GFP som en meduttrykksmarkør2. Det er viktig å utføre et kontrolleksperiment i fravær av ATR for å bekrefte at det målte GCaMP-signalet avhenger av optogenetisk aktivering av Chrimson, som er strengt ATR-avhengig (figur 4D). Til slutt, fordi fremkalte Ca ++ -signaler er forbigående, er det avgjørende å vedta en bildeprotokoll som tillater rask bytte (<1 s) mellom 561 nm eksitasjon og GCaMP-signalinnsamling med 488 nm laser (figur 4).
Figur 1: Merking av DD dendrittiske pigger . (A) (Topp) Seks dorsale D (DD1-DD6) nevroner i den ventrale nervestrengen til C. elegans. (Nederst) Hos voksne kontakter ventralt rettede DD-ryggrader (pilspiss) presynaptiske terminaler av Ventral A (VA) og Ventral B (VB) motorneuroner (magenta), og DD-kommissurer strekker seg til dorsale nervetråd for å gi GABAergisk utgang til kroppsmuskler (pil)18. Dette tallet er endret fra referanse2. (B) Fluorescerende mikrografer (Airyscan) av DD-pigger merket med cytosolisk mCherry, myristoylert mRuby (MYR::mRuby), LifeAct::GFP og GFP::Utrophin i unge voksne ormer. Grå pilspisser peker på pigger. Skalabar = 2 μm. (C) Tetthet (spines/10 μm) av DD neuron dendritic spines merket med cytosolisk mCherry (3,77 ± 0,9), MYR::mRuby (3,09 ± 0,8), LifeAct::GFP (3,44 ± 1,1) eller GFP::Utrophin (2,41 ± 0,8). Alle prøver er normalfordelt. Enveis ANOVA viser at ryggradstettheter for cytosolisk mCherry, MYR::mRuby og LifeAct::GFP ikke er signifikant (NS) forskjellige, mens ryggradstettheten reduseres for GFP::Utrophin vs. cytosolisk merket mCherry (p = 0,0016) og LifeAct::GFP (p = 0,0082). Den stiplede røde linjen representerer ryggradstettheten til DD-nevroner vurdert fra 3D EM-rekonstruksjon (4,2 spines / 10 μm). Dette tallet er endret fra referanse2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Imaging DD dendritic spines. (A) (Øverst) Skjematisk av ryggradsformer. (Nederst) Airyscan-bilder av hver type ryggrad (Scale bar = 500 nm) merket med LifeAct:: GFP (grønn) og 3D-rekonstruksjoner av serielle elektronmikrografier av en høytrykksfrossen voksen (blå). (B) Ryggradsfrekvens etter type, visualisert med LifeAct:: GFP: Tynn / sopp (55,5 ± 14,5%), Filopodial (10,3 ± 8,70%), Stubby (18,8 ± 10,7%), Forgrenet (15,42 ± 6,01%). Spines frekvens etter type visualisert med MYR::mRuby: Tynn/sopp (52,2 ± 16,5%), Filopodial (5,68 ± 7,0%), Stubby (33,1 ± 14,8%), Forgrenet (9,02 ± 9,6%). Uparret T-test, Filopodial (p = 0,0339); Stubby (p = 0,0009) og forgrenede (p = 0,011) pigger merket med MYR::mRuby-markøren er signifikant forskjellige fra LifeAct::GFP. Dette tallet er endret fra referanse2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Strategier for å ta høyoppløselige bilder av DD-pigger. (A-B) (øverst) Fluorescerende bilder av DD1-dendritter merket med en cytosolisk markør (mCherry) av (A) Airyscan-detektor og (B) Nyquist-oppkjøp. (Nederst) DD dendrit (rød) er avbildet med en bildeanalyseprogramvare (auto-path option of filament tracer), og DD spines (blå) er grafisk illustrert ved hjelp av den halvautomatiske spines detection module. Pil peker på forgrenet ryggrad forstørret i C og D. Pilspisser betegner nærliggende tynne / sopprygger forstørret i C og D. Skalastang = 2 μm. (C-D) Forstørrede eksempler på (topp) forgrenet ryggrad (pil) og (nederst) to nærliggende tynne / sopprygger (pilspisser) oppnådd med (C) Airyscan-detektor eller ved (D) Nyquist-oppkjøp. Skala bar = 500 nm. Data gjengitt fra2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Vurdering av funksjonen til DD-pigger. (A) DD-motorneuroner uttrykker Ca ++ -indikatoren GCaMP6s (grønn), og VA-motorneuroner uttrykker channelrhodopsin-varianten, Chrimson (magenta)7. (B) Skjematisk fremstillingsmetode for montering av ormer for Ca ++ målinger. (1) På et rent mikroskopglass (2) plasser 2 μL 0,05 μm polyperler, (3) bruk en platinatråd ("ormplukk") for å legge til en liten kule superlim og (4) virvle inn i løsningen for å generere filamentøse limstrenger. (5) Legg til 3μL M9 buffer. (6) Plasser ca. ti L4 larver i løsningen, (7) påfør deksel og tetningskanter med vaselin / voks. (C-D) Aktivering av VA-nevroner korrelerer med Ca++ -transienter i DD1-ryggrader. GCaMP6s fluorescens avbildet (ved 0,5 s intervaller) med periodisk lysaktivering av Chrimson (2,5 s intervaller) fremkaller Ca ++ transienter med (C) +ATR (n = 12), men ikke i (D) kontroller (-ATR, n = 12). Paneler er øyeblikksbilder over tid (er), før og etter puls på 561 nm lys (vertikal rosa linje). Skala barer = 2 μm. GCaMP6s signal er anskaffet fra en ROI (Region of Interest) på spissen av hver ryggrad. (E) GCaMP6s fluorescens i løpet av opptaksperioden på 10 s plottet for +ATR (grønn) vs -ATR (kontroll, grå) (n = 12 videoer). Vertikale rosa stolper angir 561 nm belysning (f.eks. Chrimson-aktivering). Hvert dyr ble stimulert 4 ganger med 561 nm lys. Målinger ble samlet inn før og etter hver puls på 561 nm lys. (F) Plott av GCaMP6s fluorescens før og etter hver puls på 561 nm lys. GCaMP6s fluorescens ble målt 1 s etter hver puls på 561 nm lys. Fordi prøver ikke er normalfordelt, ble en parret ikke-parametrisk Friedman-test brukt for å korrigere for flere sammenligninger av GCaMP6s fluorescens før vs. etter 561 nm lysstimulering for ormer dyrket enten med ATR (+ATR, grønn) (*** p = 0,0004, n = 48 målinger) eller i fravær av ATR (-ATR, grå) (NS, Ikke signifikant, p = 0,0962, n = 48 målinger). Dette tallet er endret fra referanse2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Liste over plasmider som ble brukt i studien. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Sammensetning og fremstilling av M9-buffer. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Airyscan-detektoren ble valgt for å skaffe øyeblikksbilder av DD-pigger fordi den gir et høyere signal-til-støy-forhold og bedre oppløsning enn konvensjonelle konfokale mikroskoper19,20. AiryScan-avbildning tillater også bruk av konvensjonelle fluorescerende proteiner (f.eks. GFP, mCherry, etc.), nå allment tilgjengelig for C. elegans. Selv om bilder med høyere oppløsning kan oppnås med andre superoppløsningsmetoder (f.eks. STORM, STED, PALM), krever disse metodene fotoaktiverbare eller fotobyttbare fluorescerende proteiner21. Som et alternativ til Airyscan anbefales konvensjonelle konfokale mikroskoper. For eksempel oppnår bildebehandling med Nyquist-oppkjøp (figur 3) pikselstørrelsen ved hjelp av et 40x/1.3-mål på 123,9 nm, tilstrekkelig til å skille ryggradens morfologiske typer (figur 2).
For å bestemme ryggradens tetthet, anbefales det å bruke et cytosolisk fluorescerende protein som (1) mCherry eller GFP, (2) LifeAct for å merke aktincytoskjelettet, eller (3) et myristoylert fluorescerende protein (f.eks. MYR: : mRuby) for å merke plasmamembranen (figur 1B). Til sammenligning reduserer det F-aktinbindende proteinet Utrophin ryggradstettheten (figur 1C), noe som indikerer en negativ effekt på ryggradens morfogenese når Utrophin er overuttrykt.
De nåværende bildemetodene skal bidra til å identifisere genetiske varianter som styrer ryggradsmorfologi 1,16. DD-ryggradens morfologi (dvs. tynn/sopp, filopodial, stubby, forgrenet, se figur 2) kan vurderes ut fra enkle 2D-projeksjoner av laterale bilder av den ventrale nervestrengen siden de fleste DD-pigger har en karakteristisk ventralt rettet orientering. I disse sammenligningene er det viktig å bruke samme fluorescerende markør for hver tilstand siden tilsynelatende ryggradsmorfologiske typer ser ut til å være påvirket av merkingsmetoden (f.eks. MYR::mRuby vs. LifeAct::GFP). I tillegg ble det bemerket at ryggradsformene er dynamiske og sannsynligvis endrer form som svar på de eksterne signalene 2,16. Dermed er det også viktig å sammenligne ryggradsformer mellom genotyper i lignende utviklingsstadier og under lignende forhold.
Orienteringen av C. elegans ventral ledning er kritisk viktig for nøyaktig bildeopptak. Både ventrale og dorsale ledninger på motsatte sider av dyret skal være synlige i samme Z-plan, noe som indikerer at ormen er orientert på siden (figur 1B). Det er best å ikke samle bilder av ormer som beveger seg eller er i kontakt med andre ormer eller bobler nær ventralledningen, da dette kan forringe bilder av spines.
For in vivo kalsiumavbildning må friske lysbilder tilberedes umiddelbart før hvert oppkjøp. Det er best å avbilde ormer i kontakt med bare tynne limfibre vs. "klumper" av lim som har en tendens til å tørke ormer og forringe bildet (figur 4B). I eksperimentet vist i figur 4 aktiverer pulsen på 561 nm lys hele synsfeltet. For å øke den tidsmessige og romlige oppløsningen for å oppdage lokale Ca ++ transienter, for eksempel i individuelle DD-spines, kan en galvo mini-skanner satt opp for 561 nm laserlinjen brukes til å stimulere et mindre område av interesse17.
Disclosures
Vi oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Avbildning og analyse på Imaris ble utført i Vanderbilt Cell Imaging Shared Resource (CIRS) støttet av NIH (CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 og EY08126). LSM 880 støttes av tilskudd 1S10OD201630. Avbildning på en Nikon-spinnedisk ble utført ved Nikon Center of Excellence. Vi takker Jenny Schafer, CISR-direktør, og Bryan Millis for opplæring og innsiktsfulle diskusjoner og medlemmer av Burnette-laboratoriet: Dylan Burnette, Aidan Fenix og Nilay Taneja for råd. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd til DMM (R01NS081259 og R01NS106951) og en American Heart Association stipend til ACC (18PRE33960581).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
| diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
| Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
| ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
| Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
| NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
| NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
| Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
| Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
| SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
| Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
| vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
| Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
| Microscope for super-resolution imaging | |||
| LSM880 | Zeiss | ||
| AiryScan detector | Zeiss | ||
| Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
| Laser lines | |||
| Stage controller | |||
| Microscope for Nyquist image acquisition | |||
| A1R Confocal | Nikon | ||
| Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
| 488 nm, 16mW | |||
| 561 nm, 17mW | |||
| Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
| Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
| Andor DU-897 EMCCD camera | |||
| Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
| 488 nm, 65mW | |||
| 561 nm, 86mW | |||
| 525 nm (+/- 18 nm) | |||
| 605 nm (+/- 35 nm) |
References
- Sala, C., Segal, M. Dendritic Spines: The Locus of Structural and Functional Plasticity. Physiological Reviews. 94 (1), 141-188 (2014).
- Cuentas-Condori, A., et al. C. elegans neurons have functional dendritic spines. Elife. 8, 47918 (2019).
- Philbrook, A., et al. Neurexin directs partner-specific synaptic connectivity in C. Elegans. Elife. 7, 35692 (2018).
- Oliver, D., Alexander, K., Francis, M. M. Molecular Mechanisms Directing Spine Outgrowth and Synaptic Partner Selection in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Neuroscience. 12, 10-13 (2018).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- Ladt, K., Ganguly, A., Roy, S. Axonal actin in action: Imaging actin dynamics in neurons. Methods of Cell Biology. 131, 91-106 (2016).
- Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual color neural activation and behavior control with chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (4), 1029-1034 (2015).
- Mello, C., Kramer, J., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrahcormosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C . elegans Using Microinjection. Journal of Visualized Experiments. (18), e833 (2008).
- Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-specific expression profiling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developemntal Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
- Mccarter, J., Bartlett, B., Dang, T., Schedl, T. Soma - Germ Cell Interactions in Caenorhabditis elegans : Multiple Events of Hermaphrodite Germline Development Require the Somatic Sheath and Spermathecal Lineages. Developemntal Biology. 181 (2), 121-143 (1997).
- Driscoll, M. Mounting animals for observation with Nomarski DIC optics. WormBook. , (2008).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Hotulainen, P., Hoogenraad, C. C. Actin in dendritic spines connecting dynamics to function. Journal of Cell Biology. 189 (4), 619-629 (2010).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are They All the Same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121 (9), 2877-2886 (1995).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Ventral Nerve Cord of Caenorhadbitis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society. 275 (938), 327-348 (1976).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
- Huff, J. The Fast mode for ZEISS LSM 880 with Airyscan high-speed confocal imaging with super-resolution and improved signal-to-noise ratio. Nature Methods. 13, (2016).
- Jacquemet, G., Carisey, A. F., Hamidi, H., Henriques, R., Leterrier, C. The cell biologist's guide to super-resolution microscopy. Journal of Cell Science. 133 (11), 240713 (2020).
