Summary
Hier presenteren we de mediator release assay, met behulp van een rat basofiele leukemie cellijn getransfecteerd met de menselijke IgE receptor, om de degranulatie van effectorcellen te simuleren die typisch worden waargenomen bij type 1 allergische reacties. Deze methode onderzoekt de biologische activiteit van allergenen op een zeer gevoelige, reproduceerbare en aanpasbare manier.
Abstract
Mediator release assays analyseren in vitro immunoglobuline E (IgE)-gemedieerde degranulatie en secretie van mediatoren door effectorcellen, zoals mestcellen en basofielen, na stimulatie met seriële verdunningen van vermeende allergenen. Daarom vormen deze testen een essentieel hulpmiddel dat het in vivo degranulatieproces nabootst, dat optreedt bij blootstelling aan allergenen bij gesensibiliseerde patiënten of bij huidpriktests. Bovendien worden deze testen meestal gebruikt om het allergene potentieel van eiwitten en de reactiviteit van de reactiviteit van sera van patiënten te onderzoeken. Hierin beschrijven we een eenvoudig 2-daags protocol met behulp van een vereeuwigde basofiele leukemie cellijn van ratten getransfecteerd en gehistaliseerd met de menselijke IgE plasmamembraanreceptor met hoge affiniteit (FcεRI). Deze variant van de mediator release assay is een robuust, gevoelig en reproduceerbaar in vitro celgebaseerd systeem zonder de noodzaak om het antigeen te immobiliseren tot vaste matrices. Het protocol bestaat uit de volgende stappen: (1) aanvulling op inactivatie van menselijke sera, (2) oogsten, zaaien en passieve sensibilisatie van de cellen, (3) stimulatie met antigeen om mediatorafgifte te veroorzaken, en (4) meten van β-hexosaminidase-activiteit als surrogaat voor de vrijgegeven ontstekingsmediatoren, zoals histamine. De test is een nuttig hulpmiddel om de capaciteit van het allergeen-IgE-cross-linking te beoordelen om celdegranulatie te activeren en kan worden geïmplementeerd om allergeenextracten te standaardiseren, om de reactiviteit van patiënten op kleine of belangrijke allergenen en op allergene extracten (pollen, huidschilfers van katten, enz.) te vergelijken, om de potentie van allergeenhomologen, isovormen en vouwvarianten (bijv. Hypoallergeniciteit) te onderzoeken, evenals de effecten van liganden op de allergene activiteit. Een meer recente toepassing omvat het gebruik van de test om de werkzaamheid van de behandeling in de loop van allergeenimmunotherapie te controleren.
Introduction
Type I overgevoeligheidsreacties, gekenmerkt door immunoglobuline E (IgE) productie specifiek voor een respectievelijk antigeen, treffen bijna een derde van de wereldbevolking. Deze reacties worden geassocieerd met verschillende allergische manifestaties zoals astma en rhinoconjunctivitis en kunnen zelfs leiden tot systemische levensbedreigende reacties1. In tegenstelling tot in vivo tests zijn immunochemische benaderingen, zoals de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), uitsluitend geschikt voor het onderzoeken van de doelbinding van antilichamen, maar richten ze zich niet op het functionele aspect van eiwitten die onmiddellijke overgevoeligheidsreacties kunnen veroorzaken. De immobilisatie van de allergenen op vaste steunen (bijv. ELISA-platen) kan veranderingen in hun structurele integriteit en de vernietiging van allergierelevante epitopen veroorzaken2. Zelfs huidpriktests (SPT), het meest voorkomende hulpmiddel om sensibilisatie tegen bepaalde allergenen te bevestigen, hebben hun limieten met betrekking tot de detectie van symptomatische IgE-gemedieerde voedselallergie of allergene beschikbaarheid3,4. Om een ethische, zeer specifieke, gevoelige en kosteneffectieve methode te vinden voor het testen van de biologische potentie van allergenen om een type I overgevoeligheidsreactie te veroorzaken, zijn de zogenaamde mediator release assays vastgesteld.
Het principe van deze testen is gebaseerd op gebeurtenissen na de sensibilisatiefase en het bijbehorende vermogen van IgE om zich te binden aan de α-keten van de receptoren met hoge affiniteit die tot expressie komen op het oppervlak van effectorcellen, zoals mestcellen en basofielen. IgE wordt voornamelijk geproduceerd door plasmacellen in het mucosaal geassocieerde lymfoïde weefsel. Hoewel het de minst overvloedige immunoglobuline is (ongeveer 0,05% bij niet-atopische personen) in het bloed, bezit het een buitengewoon hoge biologische activiteit die de belangrijkste oorzaak is van allergische symptomen. De halfwaardetijd van IgE kan toenemen van 2-3 dagen tot enkele weken en zelfs maanden wanneer het gebonden is aan de receptoren op effectorcellen. Daaropvolgende binding van een antigeen aan het variabele gebied van twee receptorgebonden IgE-moleculen leidt tot hun verknoping gevolgd door de inductie van een stroomafwaartse signaalcascade in de effectorcel die leidt tot degranulatie en de afgifte van verschillende pro-inflammatoire mediatoren die vaatverwijding veroorzaken, zoals histamine, serineproteasen (bijv. Tryptase) en prostaglandinen5,6,7. De secretie van cytokines zoals interleukine 4 (IL-4) en IL-13 zijn verantwoordelijk voor het behoud van de inflammatoire T helper 2 (Th2) respons en de klasse-omschakeling van B-cellen naar IgE-producerende plasmacellen5,8,9. Aan de andere kant veroorzaakt vrijgegeven tromboxaan bronchoconstrictie en leukotriënen stimuleren gladde spiercontractie en vasculaire lekkage en spelen een cruciale rol bij luchtwegontsteking die leidt tot astma of allergische rhinitis10,11.
Onderzoeksinstrumenten voor het analyseren van de meeste van de bovengenoemde mediators zijn vastgesteld, hoewel met enkele grote nadelen. Tryptase-assays zijn geschikte klinische benaderingen voor het meten van systemische anafylaxie door mestcelactivering, maar hun gevoeligheid en specificiteit bij allergiediagnoses is te onnauwkeurig in vergelijking met gouden standaardmethoden zoals SPT. Aan de andere kant zijn cysteinyl leukotrieentests niet in staat om allergieën voor β-lactams of niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen te diagnosticeren12. Protocollen voor het meten van histamine als een belangrijke mediator die vrijkomt bij allergische reacties werden al in de jaren 1960 vastgesteld. Eenmaal vrijgegeven in het perifere bloed, wordt histamine onmiddellijk afgebroken door histaminemethyltransferasen, wat resulteert in een plasmahalfwaardetijd van slechts enkele minuten, waardoor de analyse ervan behoorlijk uitdagend is13. Afgezien van de instabiliteit, bleek de monitoring van histamine een lage specificiteit en gevoeligheid te hebben voor medicijnallergieën, evenals commerciële voedseleiwitten en wespengif12.
In vitro modellen met effectorcellijnen zijn geïntroduceerd als alternatief voor de arbeidsintensieve procedures van isolatie en cultivering van basofielen van allergische patiënten om afgiftetests uit te voeren. Daarom is de op basofiele leukemie (RBL) gebaseerde test bij ratten met behulp van de RBL-2H3-cellijn vastgesteld3. Omdat deze cellijn niet in staat is om menselijk IgE te binden, werd het eerst getransfecteerd met de α-, β- en γ-keten van de menselijke IgE-plasmamembraanreceptor (FcεRI). Verschillende klonen zijn gegenereerd en getest op expressieniveaus en homogeniteit van de menselijke α-chain, waarvan de kloon RBL-30/25 naar voren kwam als de meest veelbelovende kandidaat voor in vitro testen. De signaalcascade geïnduceerd bij receptoractivering van de getransfecteerde kloon werd getest via calciummobilisatietests. Als indicator voor degranulatie en surrogaat voor histamineafgifte werd het lysosomale enzym β-hexosaminidase gemeten, wat het aanzienlijke voordeel heeft van een hogere stabiliteit14. De mediatorafgifte met behulp van RBL-30/25-cellen bereikt tot 100% en wordt daarom gebruikt om sera afkomstig van allergische patiënten te testen. De test werd getest op de afgifte van de mediator na het uitdagen van gesensibiliseerde cellen met commerciële allergeenextracten. Dit leidde tot de bevinding dat er een enorme variatie is in de samenstelling (tot 60-voudig met betrekking tot het totale eiwitgehalte) van allergeenextracten afgeleid van verschillende fabrikanten en gebruikt voor diagnostische (bijv. SPT) of therapeutische benaderingen3,15,16.
Hierin geven we een gedetailleerde beschrijving van het RBL-protocol om de mediator release assay uit te voeren met behulp van serum van allergische donoren. Tijdens passieve sensibilisatie wordt IgE in het serum opgevangen door de hoge affiniteit FcεR1-receptor die tot expressie komt op het oppervlak van de basofiele cellen. Bij antigeenstimulatie zijn gebonden IgE's die specifiek zijn voor het antigeen verknoopt, waardoor celdegranulatie en de afgifte van de mediator β-hexosaminidase worden geactiveerd. De activiteit van β-hexosaminidase wordt vervolgens gemeten met behulp van een geschikt substraat. Voor de test werden huRBL-2H3-cellen gebruikt en huRBL genoemd in het volgende protocol. Het protocol beschrijft een standaard antigeenverdunningsreeks met 8 stappen verdund 1:10 variërend van 1 μg / ml tot 0,1 pg / ml allergeen.
Protocol
Ethische goedkeuring voor het gebruik van sera afkomstig van berkenpollenallergische patiënten is verkregen van de Nederlandse ethische commissie (erkenningsnummer: NL65758.018.18).
1. Veiligheidsprocedures
- Werk onder steriele omstandigheden met behulp van een werkbank van biologische veiligheidsklasse 2 tijdens de eerste dag van het experiment (bioveiligheidsniveau 2). Volg de veiligheidsrichtlijnen van de instelling voor het gebruik van menselijk serum.
2. Aanvulling op de inactivatie van menselijke sera
- Oogst een dichte kweek van P3X63Ag8.653-cellen (voortaan Ag8-cellen genoemd) uit de celkweekkolf en breng ze over in een centrifugatiebuis.
- Gebruik het volgende kweekmedium voor deze cellen: Modified Eagles's Minimum Essential Medium met verlaagde serumconcentratie, 1% penicilline-streptomycine (100 eenheden Pen., 0,1 mg / ml Strep.), 5% warmte-geïnactiveerd foetaal kalf / runderserum (FCSi).
- Centrifugeer Ag8-cellen gedurende 5 minuten bij 250 x g bij kamertemperatuur.
- Suspensie van de celkorrel opnieuw tot een eindconcentratie van ongeveer 1 x10 6 cellen/ml in huRBL-medium (Minimum Essential Medium Eagle met Alpha Modification, 4 mM L-Glutamine, 5% FCSi, 1% G418 (100% bouillon: 10 g/125 ml dH2O).
OPMERKING: Onderhoud Ag8-cellen door ook te passeren voor toekomstig gebruik. - Verdun menselijke sera 1:10 in Ag8-celsuspensie. De uiteindelijke serumverdunning in de test is 1:20.
OPMERKING: Voor sera met een laag specifiek IgE kan een 1:5 (1:10 eindverdunning) worden gebruikt. - Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C en 5%-7% CO2.
3. Oogsten en zaaien van huRBL-cellen
- Spirateer het medium voorzichtig uit een T-75 celkweekkolf zonder de huRBL-cellen aan te raken (huRBL-cellen zijn aanhangend). Zorg ervoor dat de cellen ongeveer 50% -90% confluent zijn.
OPMERKING: Afhankelijk van de celconfluentie is de celinhoud van een dichte T-75 celkweekkolf meestal voldoende voor één tot twee 96-well platen. - Was de cellen tweemaal door 10 ml Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) toe te voegen. Voeg DPBS toe aan de andere kant van de kolf en niet rechtstreeks op de cellen.
- Aspirateer DPBS en voeg 5 ml voorverwarmde 1x trypsine-EDTA (0,05% /0,02% EDTA verdund in DPBS) toe voor celdetachement.
- Incubeer de kolf gedurende 5 min bij 37 °C.
- Maak de cellen los door voorzichtig op de kolf te tikken.
- Breng de celsuspensie over in een centrifugatiebuis van 15 ml en vul deze met huRBL-medium of DPBS om de trypsine-EDTA te verdunnen.
- Centrifugeer de cellen bij 250 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Aspirateer het supernatant en resuspend de pellet in 5 ml huRBL-medium voor het tellen van cellen.
- Tel de cellen en verdun ze in huRBL-medium om een eindconcentratie van 2 x 106 cellen /ml te verkrijgen.
- Gebruik een steriele 96-well plaat en voeg 50 μL huRBL cell suspension per put toe, wat overeenkomt met 1 x 105 cellen/put.
4. Passieve sensibilisatie van huRBL-cellen
- Centrifugeer de voorgebroede Ag8/serumsuspensie gedurende 5 minuten bij 250 x g.
- Breng 50 μL van de gecentrifugeerde Ag8/serumsuspensie over in elke put met huRBL-cellen zonder de Ag8-celpellet te verstoren.
- Neem de geen antigeencontrole op, die gesensibiliseerde, maar niet-gestimuleerde cellen zijn (voeg geen antigeen toe), die dienen als een indicatie voor het onderste signaalplateau / achtergrond. Achtergrond- en maximale lysiscontroleputten hoeven niet te worden gesensibiliseerd met serum. Voeg in plaats daarvan 50 μL huRBL-medium toe om de putjes te regelen.
- Bedek de plaat met het deksel en incubeer een nacht bij 37 °C en 5%-7% CO2.
5. Antigeen-gestimuleerde degranulatie en mediator release
- Bereid de antigeenverdunning van tevoren in 1x Tyrode's buffer (9,5 g/L Tyrode's zouten, 0,1% runderserumalbumine (BSA), 0,5 g/L Natriumwaterstofcarbonaat (NaHCO3) in dH2O). Een uiteindelijke hoeveelheid van 100 μL per put is nodig.
OPMERKING: Niet elk allergeen, gezuiverd uit natuurlijke bronnen of recombinant geproduceerd, kan stabiel zijn in de buffer van 1x Tyrode. Voer daarom stabiliteitstests uit in de buffer van 1x Tyrode voorafgaand aan de testprocedure. Als alternatief kunt u de buffer van 1x Tyrode verdunnen in deuteriumoxide (D2O) om de signaal-ruisverhouding van de test te verhogen. - Maak 8 verdunningen van het antigeen van belang van een 1:10 verdunningsreeks in reactiebuizen beginnend met 10 of 1 μg / ml eiwit.
OPMERKING: Test de verdunningsreeks altijd vooraf. U kunt ook de verdunningsreeks van 1:10 (bijvoorbeeld 1:5, 1:20 of 1:30) aanpassen om de volledige afgiftecurve te dekken. Bovendien kan de startconcentratie variëren, afhankelijk van de experimentele opstelling. - Om huRBL-cellen op de 96-wells plaat te wassen, verwijdert u eerst het sera-bevattende celmedium door de plaat voorzichtig aan te zuigen, om te keren en op absorberend papier te tikken.
- Was cellen met 200 μL van 1x Tyrodes's buffer per put. Behandel alle putten op dezelfde manier.
OPMERKING: Voeg de wasoplossing langzaam toe aan de cellen om ze niet te storen. - Laat het ongeveer 30 s staan en herhaal de wasstap in totaal drie keer.
- Nadat u de wasoplossing voor de laatste keer hebt toegevoegd, laat u de oplossing in de putjes totdat u klaar bent om door te gaan met het toevoegen van de antigeenverdunning.
OPMERKING: Vermijd het blootstellen van cellen aan lucht voor te lang. - Breng 100 μL antigeenoplossing over naar elke put met de voorgesensibiliseerde huRBL-cellen.
OPMERKING: Als u verschillende parameters analyseert, breng dan de afzonderlijke monsters van de verdunningsreeks over in een extra niet-bindende 96-wells plaat (gebruik dezelfde lay-out als op de huRBL-plaat) en breng ze daarna over met een meerkanaals pipet rechtstreeks op de huRBL-celplaat. Op deze manier kan worden voorkomen dat de cellen te lang aan lucht worden blootgesteld, wat kan resulteren in slechte testprestaties (lager / geen signaal). - Dek controleputten (maximale lysis en niet-sensitiseerde achtergrondcellen) af met 100 μL 1x Tyrode's buffer. Stimuleer deze controleputten niet met het antigeen.
- Voeg bovendien 100 μL van 1x Tyrode's buffer toe aan de gesensibiliseerde no-antigeenputten van de verdunningsreeks, wat nodig is om rekening te houden met antigeenonafhankelijke spontane afgifte van gesensibiliseerde cellen tijdens data-analyse.
- Incubeer huRBL-cellen gedurende 1 uur bij 37 °C en 5%-7% CO2.
6. Fluorescentiemeting van β-hexosaminidase-activiteit
- Behandel de putjes van de maximale lysiscontrole met 10 μL van 10% Triton X-100 per put en meng goed om de cellen volledig te lyseren en de 100% afgifte van β-hexosaminidase te verkrijgen.
- Voeg 50 μL substraatoplossing toe aan een nieuwe niet-bindende 96-wells plaat. Substraatoplossing voor één 96-putplaat: 5 ml 0,1 M citroentestbuffer, pH 4,5; en 80 μL van 10 mM 4-methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide.
- Breng 50 μL celsupernatant van alle putten over naar de nieuwe plaat met de substraatoplossing.
OPMERKING: Pipetteer het supernatant voorzichtig van de huRBL-plaat om de huRBL-cellen niet te verstoren. - Incubeer de plaat met substraatoplossing en celsupernatant gedurende 1 uur bij 37 °C om omzetting van het fluorogene substraat mogelijk te maken.
OPMERKING: Bewaar de huRBL-plaat voor de levensvatbaarheidstest van de cel. - Voeg 100 μL stopoplossing (15 g/L glycine, 11,7 g/L NaCl opgelost in dH2O, pH 10,7) per putje toe.
- Meet de fluorescentie bij 360 nm excitatie en 465 nm emissie met behulp van een plaatlezer.
7. Data-analyse
- Gebruik voor basisberekeningen van het percentage vrijgave een spreadsheetsoftware.
- Voor het aftrekken/verwijderen van de achtergrondbasislijn, trekt u het gemiddelde van de achtergrondputten af van alle andere putten.
- Bereken het gemiddelde van de maximale lysisputten en druk de gegevens van de verdunningsreeks in procenten uit. Op deze manier kan men gegevens uitdrukken als een percentage van de celafgifte genormaliseerd tot de maximale enzymafgifte veroorzaakt door cellysis.
- Volledige dosis-respons mediator release curven worden het best weergegeven als XY-grafieken met de antigeenconcentratie op een log op de X-as en het percentage mediatorafgifte op de Y-as.
- Voeg de waarden van het besturingselement zonder antigeen toe als een stippellijn om de achtergrond of het onderste plateau aan te geven.
OPMERKING: Verschillende vergelijkbaar behandelde sera kunnen worden vergeleken met behulp van deze normalisatiestrategie. Voor directe vergelijking wordt verder aanbevolen om de halve maximale afgifte te berekenen, dat is de antigeenconcentratie (in ng / ml) die nodig is voor de helft van de maximale afgifte, gedefinieerd als het gemiddelde van de maximale en minimale waarden per curve. De antigeenconcentratie om de half maximale afgifte te stimuleren wordt berekend door interpolatie van de half maximale afgiftewaarde in een logaritmische regressielijn.
Representative Results
De mediator release assay, gebaseerd op huRBL cellen (Figuur 1A en B), resulteert in een klokvormige dosis-respons curve ( Figuur1C). Voor vereenvoudigde gegevensweergave kan de antigeenconcentratie die nodig is voor de halve maximale mediatorafgifte worden berekend met behulp van lineaire regressie (figuur 1D). Een cel levensvatbaarheidstest wordt uitgevoerd om cytotoxische effecten afgeleid van het sensibiliserende serum of het antigeen dat wordt gebruikt voor stimulatie uit te sluiten (figuur 1E). De test kan worden gebruikt om de reactiviteit van verschillende sera op een bepaald antigeen te testen. In ons geval reageerden 4 van de 5 sera, afgeleid van berkenpollenallergische patiënten, op Bet v 1-stimulatie. Serum #1 toonde de hoogste mediatorafgifte(figuur 2). Serum #5 reageerde niet op Bet v 1-stimulatie en zou dus kunnen reageren op andere berkenpollenallergenen (bijv. Bet v 2, profilin). Deze gegevens geven aan dat Bet v 1 een krachtig allergeen is dat verantwoordelijk is voor IgE-gemedieerde allergische symptomen. Met behulp van de huRBL-test kan de kruisreactiviteit van IgE op homologe allergenen worden beoordeeld(figuur 3). Hier reageerden beide berkenpollenallergische patiënten goed op Bet v 1, terwijl alleen patiënt # 2 ook reageerde op Cor a 1, het Bet v 1-homologe voedselallergeen dat in hazelnoten wordt aangetroffen. Op basis van deze gegevens heeft patiënt # 2 hoogstwaarschijnlijk hogere Cor een 1-kruisreactief IgE-niveau dan patiënt # 1, wat resulteert in orale allergiesymptomen bij hazelnootconsumptie. Zelfs de beoordeling van de hypoallergene aard van mutante varianten van allergenen (verminderde potentie) kan worden geanalyseerd en vergeleken met hun wild-type tegenhanger(figuur 4). In het gegeven voorbeeld verschoof de afgiftecurve van de vouwvariant naar een hogere antigeenconcentratie in vergelijking met het wild-type allergeen, wat resulteerde in een significant hogere concentratie antigeen die nodig is om half maximale afgifte te veroorzaken (figuur 4B). Deze gegevens impliceren dat de gegenereerde mutant/vouwvariant minder allergeen is in vergelijking met het wild-type eiwit. Deze verminderde potentie om IgE-gemedieerde degranulatie te activeren, benadrukt het hypoallergene karakter van de vouwvariant. Op basis van deze test is de vouwvariant een interessante kandidaat voor allergeenspecifieke immunotherapie, omdat het tijdens de behandeling verminderde IgE-geassocieerde bijwerkingen kan veroorzaken.
Figuur 1: Gesualiseerde RBL-cellen en een representatieve klokvormige curve van IgE-allergeen cross-linking-geïnduceerde β-hexosaminidase afgifte. RBL-cellen hechten zich aan de kweekkolven, waardoor ze een staafachtige vorm krijgen terwijl ze zichzelf proberen te hechten (A). Een ideaal niveau van samenvloeiing voor cellen die moeten worden geoogst, is niet meer dan 90%(B). Cellen worden weergegeven onder een vergroting van respectievelijk 40x en 10x. Cellen die werden gesensibiliseerd met menselijk serum van een berkenpollenallergisch individu dat reageert op uitdaging met recombinant Bet v 1 (rBet v 1), het belangrijkste berkenpollenallergeen (C). Als surrogaat voor mediatorafgifte wordt de β-hexosaminidase-activiteit gemeten in celsupernatanten. De klokvormige curve is het gevolg van een monovalente bezetting van antigeeneptopen op IgE als gevolg van het teveel aan allergeen, dat het allergeen-IgE-crosslinking bij hoge antigeenconcentraties competitief remt. Een andere verklaring voor de lage afgifte bij hoge allergeenconcentraties is de remming van intracellulaire routes in aanwezigheid van overtollig antigeen. Voor de bepaling van de allergeenconcentratie die nodig is om een half maximale afgifte te verkrijgen, werd een logaritmische regressielijn gebruikt op basis van de experimentele waarden die het lineaire deel van de helling van de mediatorafgiftecurve vertegenwoordigen (D). De rode stippellijn vertegenwoordigt de logaritmische regressielijn die wordt gebruikt voor berekening. De formule van de regressielijn wordt in het rood weergegeven. De half maximale vrijgave wordt gedefinieerd als: half maximale vrijgave = (minimale vrijgavewaarde + maximale vrijgavewaarde)/2. In het voorbeeld was de berekende half maximale afgifte 20,6%. Het representatieve menselijke serum dat in dit experiment werd gebruikt, werd 1:20 verdund voor incubatie met huRBL-cellen en de antigeenconcentratie die werd gebruikt voor stimulatie varieerde van 100 μg / ml tot 0,004 pg / ml Bet v 1. Een cel levensvatbaarheidstest, in dit geval een MTT-test, werd uitgevoerd met de resterende cellen na antigeenstimulatie om de invloed van het sensibiliserende serum en van de antigeenverdunning op de levensvatbaarheid van de cel en het celgetal (E) te beoordelen. Onbehandelde achtergrondcellen en gelyseerde cellen (maximale lysis) worden weergegeven als stippellijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve curven van β-hexosaminidase procent afgifte van vijf verschillende menselijke sera. Hetzelfde antigeenconcentratiebereik van rBet v 1 werd geïncubeerd met huRBL-cellen die werden gesensibiliseerd met sera van verschillende berkenpollengevoelige individuen. Er is een duidelijk verschil in procentuele afgifte tussen de verschillende patiënten die overeenkomt met de ernst van hun symptomen. Merk op dat patiënt #5 niet-reactief is op het belangrijkste berkenpollenallergeen Bet v 1. Alle vijf menselijke sera die werden gebruikt om deze mediatorafgiftecurven te verkrijgen, werden gelijkelijk 1:20 verdund voor incubatie met huRBL-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kruisreactiviteit van IgE afgeleid van sera van berkenpollen gesensibiliseerde patiënten met het Bet v 1 homologe hazelnootallergeen Cor a 1. Twee representatieve sera van patiënten die gevoelig zijn voor berkenpollen reageren sterk op Bet v 1 en in mindere mate op het homologe allergeen Cor a 1. Patiënt 2 vertoont een significante reactie op Cor a 1 en zal dus waarschijnlijk orale allergiesymptomen vertonen bij hazelnootconsumptie, vergeleken met patiënt 1 waar de afgifte van de mediator bijna verwaarloosbaar is. De stippellijn vertegenwoordigt de no-antigeencontrole, dat zijn cellen die gesensibiliseerd zijn met de menselijke sera, maar niet worden gestimuleerd met een allergeen, en dient dus als indicatie voor het onderste signaalplateau / achtergrond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vergelijking van procentuele afgifte tussen rBet v 1 wild type en een hypoallergene vouwvariant. Hetzelfde serum van een berkenpollengevoelig individu werd geïncubeerd met rBet v 1 wild type (wt) en een hypoallergene vouwvariant van het belangrijkste berkenpollenallergeen (A). Hoewel mediator release wordt gezien in beide antigenen, is er een duidelijke verschuiving naar hogere antigeenconcentraties bij het vergelijken van de fold-variant met wild type rBet v 1 voor hetzelfde percentage afgifte. Een standaardmano manier om het verschil in procenten afgifte van verschillende antigenen te vergelijken, is het berekenen van de concentratie antigeen die nodig is om een halve maximale afgifte te bereiken (B). Dit wordt meestal uitgevoerd in biologische replicaties (testen van hetzelfde antigeenbereik voor elk allergeen in verschillende menselijke sera). Meestal, om significante conclusies te trekken, wordt de mediatorvrijgave uitgevoerd met sera van ten minste 8 tot 10 verschillende patiënten. Hier worden de resultaten van vier verschillende sera als voorbeeld uitgezet. Een gepaarde t-testwerd gebruikt voor statistische analyse. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; p ≤ 0,001; p ≤ 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Mogelijke vragen en probleemoplossing | Oplossing |
| Assay-to-assay variabiliteit als gevolg van veranderde celresponsiviteit | Zorg ervoor dat het aantal celpassagecycli niet groter is dan 20 tot 30 passages. Maak bevroren voorraden bij vroege passages voor toekomstige experimenten. |
| Vertrouw liever op biologische replicaties (gebruik van verschillende sera) dan op technische. | |
| Sera bevat lage niveaus van specifieke IgE | Een lagere uiteindelijke serumverdunning kan worden gebruikt (d.w.z. 1:10) in plaats van 1:20. Omgekeerd kunnen sera met hoge niveaus van specifiek IgE verder worden verdund (1:30 of 1:40). |
| Niet genoeg cellen om de test uit te voeren | Zorg ervoor dat de samenvloeiing in een T-75 kolf ongeveer 50-90% is. Passage meer kolven. |
| Cytotoxische effecten van sera, d.w.z. als gevolg van onvolledige complement-inactivatie | Voer een cel levensvatbaarheidstest uit naast de mediator release assay. Verhoog de Ag8-concentratie om onvolledige complement-inactivatie te voorkomen. |
| Laag signaal | Verbeter de signaal-ruisverhouding van de test door de buffer van 1x Tyrode te verdunn in deuteriumoxide (D2O) in plaats van dH2O, of door een sera te gebruiken met hogere niveaus van specifiek IgE voor het allergeen van belang. |
| Allergeen is niet stabiel in de buffer van Tyrode (bijv. neerslag) | Voer stabiliteitstests uit in de buffer van 1x Tyrode voorafgaand aan de testprocedure. Vervanging van de buffer van Tyrode wordt niet aanbevolen. |
| Problemen met het vinden van de juiste startconcentratie voor het betreffende allergeen | Aanpassing van verdunningsreeksen om de volledige afgiftecurve te dekken (meer verdunningsstappen, 1:20 verdunning in plaats van 1:10). |
| Slechte testprestaties aangegeven door laag/geen signaal | Vermijd cytotoxische effecten van sera of antigeenstimulatie (bijv. enzymatische allergenen). Was en week de cellen zorgvuldig. Vermijd blootstelling aan lucht te lang en voorkom dat cellen uitdrogen. |
| Hoe weet ik of het onderste signaalplateau is bereikt? | Voeg "geen antigeen" -bedieningselementen toe aan uw bord. Dit zijn gesensibiliseerde cellen, die alleen werden gestimuleerd met 1x Tyrode's buffer maar zonder allergeen. |
| Heb ik naast de maximale lysisputten ook een positieve controle nodig? | Als extra positieve controle kan een serum- en antigeencombinatie worden gebruikt waarvan bekend is dat deze degranulatie veroorzaakt of een anti-FcεR1-antilichaam. |
| Hoeveel putten heb ik nodig? | Dat hangt af van je titratiereeks, het aantal antigenen en sera dat je wilt analyseren. Plan de lay-out voor de 96-putplaten op basis van het aantal sera /antigenen dat u gaat testen. Vergeet niet om de "geen antigeencontroles", de achtergrondcellen (niet-gesensibiliseerd, niet-gestimuleerd) en de maximale lysisputten toe te voegen. |
| Hoeveel sera moet ik testen? En heb ik replica's nodig? | Hoewel de test vrij robuust is, is er enige assay-to-assay variabiliteit als gevolg van veranderde celresponsiviteit. Daarom wordt aanbevolen om eerder te vertrouwen op biologische replicaties (met behulp van verschillende sera) dan op technische replicaties. Een minimum van acht verschillende sera is voldoende om allergenen te analyseren. Zoals te zien is in fig. 4B, kunnen er echter al significante resultaten worden verkregen met minder sera. |
Tabel 1: Problemen oplossen.
Discussion
De hierin beschreven huRBL cel-gebaseerde mediator release assay is een robuuste methode die gemakkelijk kan worden uitgevoerd en geïmplementeerd in elk laboratorium. De enige vereiste is dat cellen onder steriele omstandigheden moeten worden gekweekt. De test wordt gebruikt om de waarschijnlijkheid van een allergeen of allergene bron te beoordelen om de IgE-crosslinking en basofiele degranulatie van patiënten op te roepen17. De test kan gemakkelijk worden aangepast aan elk allergeen of allergene bron, zolang het serum van de patiënt met een hoog niveau van specifiek IgE, waarbij het allergeen van belang wordt herkend, beschikbaar is. Het wordt aanbevolen om naast de mediator release assay een cel levensvatbaarheidstest uit te voeren om rekening te houden met mogelijke cytotoxische effecten die kunnen leiden tot slechte testprestaties. Dit kan te wijten zijn aan onvolledige complement-inactivatie van de sera of andere van serum afgeleide cytotoxische effecten. Zelfs het antigeen zelf, bijvoorbeeld vanwege proteolytische / enzymatische activiteit, kan de huRBL-cellen beschadigen. We gebruiken meestal een cel levensvatbaarheidstest met MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) om potentiële cytotoxische effecten te evalueren. De test kan eenvoudig worden uitgevoerd met de huRBL-cellen die overblijven nadat het celsupernatant is verzameld en overgedragen (zie stap 6.3. van het protocol). Vergeleken met andere immunochemische methoden, zoals ELISA's en western blotting, voor het bepalen van het allergene potentieel van individuele allergenen of complexe extracten op basis van allergeen-IgE-binding, kan deze test niet alleen de binding van IgE aan een allergeen detecteren, maar kan ook de functionaliteit van zowel menselijk IgE als het allergeen meten, om IgE-gemedieerde basofieldegranulatie uit te lokken18. Het kan dus helpen bij het bestuderen van de ernst van allergische symptomen ex vivo met behulp van sera van patiënten. De test is naar verluidt consistenter en efficiënter dan de klassieke passieve cutane anafylaxietests, omdat de test gebruik maakt van de RBL-2H3-cellen, die relatief gemakkelijk te hanteren zijn en minder variabiliteit in resultaten produceren in vergelijking met primaire cellen, zoals mestcellen of menselijke basofielen19,20. Daarnaast geeft de test een goede weergave van de biologische activiteit van allergenen en kan het totale allergeengehalte in een bepaald complex monster nauwkeurig worden geschat3. Voor het oplossen van problemen met bepaalde stappen in het protocol raadpleegt u tabel 1.
Wat betreft de toepasbaarheid van deze versie van de mediator release assay, het is meestal gebruikt voor onderzoeksdoeleinden, maar ook voor de standaardisatie van allergene extracten op basis van hun biologische activiteit. Dit omvat de analyse van verschillende batches SPT-oplossingen, provocatietestoplossing, evenals extracten die worden gebruikt voor allergeenspecifieke immunotherapie; zoals getoond voor pollen, huidschilfers van katten, huisstofmijt en pinda-extracten, evenals bijengif3,17,21. De techniek kan vooral worden toegepast bij het diagnosticeren van voedselallergieën, omdat het zelfs minimale hoeveelheden allergene bestanddelen in complexe voedingsmiddelen zoals pinda's, melk, tarwe en eieren kan detecteren22. In dit verband is het ook gerapporteerd als een waardevol hulpmiddel voor de beoordeling van de allergeniciteit van dierlijke voedselallergenen, zoals tropomyosinen, en kan het helpen bij het onderscheiden van krachtige allergenen van niet-allergenen23. Als onderzoeksinstrument wordt de test gebruikt om de impact van voedselverwerking te bestuderen en om de invloed van ligandbinding op allergenen en het effect ervan op allergeniciteit te evalueren24,25. Het was bijvoorbeeld aangetoond dat de binding van Bet v 1 aan liganden de allergeen-IgE-crosslinking niet beïnvloedde, hoewel het een toename van de thermische en proteolytische stabiliteit veroorzaakte25. De test kan worden gebruikt om de reactiviteit van de patiënt op kleine en belangrijke allergenen te vergelijken, evenals om de kruisreactiviteit van allergenenhomologen en isovormen te onderzoeken, zoals te zien is in ons voorbeeld met Bet v 1 en het homologe voedselallergeen Cor a 1 (figuur 3). Met betrekking tot allergene isovormen werd de mediator release assay gebruikt om het belangrijkste allergeen Amb a 1.01 te identificeren als de meest krachtige IgE-reactieve isovorm in ambrosiapollen (Ambrosia artemisiifolia). Ter vergelijking: de andere twee geïdentificeerde isovormen in ambrosiapollenextracten, Amb a 1.02 en Amb a 1.03, vertoonden een verminderde reactiviteit op het IgE26 vanpatiënten.
In de afgelopen jaren is de test toegepast om potentiële anti-allergische verbindingen en nieuwe hypoallergene varianten van allergenen te bestuderen, wat helpt bij de identificatie van geschikte kandidaten voor allergeenspecifieke immunotherapie27,28. Een andere nieuwe benadering is om de test te gebruiken om de werkzaamheid van de behandeling te controleren in de loop van allergeenspecifieke immunotherapie. In dit verband ontwikkelde onze onderzoeksgroep een huRBL-testremmingssysteem, dat goed correleerde met de vermindering van de symptoomscore van de patiënt tijdens allergeenspecifieke immunotherapie29. De test is ook voorgesteld om de immunosuppressieve effecten van TGFβ1 op allergeen-geïnduceerde IgE-gemedieerde degranulatiete bestuderen 30.
De beperkingen van de test zijn dat hoewel de huRBL-cellen enkele kenmerken van mestcellen of basofielen bezitten, ze de natuurlijke functie van deze effectorcellen niet volledig nabootsen. Mestcellen drukken bijvoorbeeld op grote schaal de patroonherkenningsreceptor Toll-like receptor 4 (TLR4) uit, die nodig is voor pathogeenherkenning, terwijl deze volledig tekortschiet in de RBL-2H3-cellen31. Vanwege dit verschil in functionaliteit bootst de test de echte situatie niet volledig na, wat in gedachten moet worden gehouden bij het interpreteren van de gegevens. Aangezien de huRBL-cellen kankerachtige basofiele cellen zijn, kunnen veranderingen in kweekomstandigheden en langdurige kweek bovendien leiden tot fenotypische verschillen die leiden tot veranderde resultaten tussen verschillende laboratoria20. Een ander aspect is de keuze van de allergeenconcentratie waarmee rekening moet worden gehouden bij het aanpassen van deze methode, aangezien hoge allergeenconcentraties kunnen leiden tot niet-IgE-gemedieerde degranulatie als gevolg van de aanwezigheid van grote hoeveelheden proteasen of endotoxinen18. Andere beperkingen zijn de afhankelijkheid van menselijke sera met relatief hoge specifieke IgE-niveaus (RAST-klasse 5-6) en de behoefte aan celkweeksystemen, wat een obstakel blijft dat moet worden overwonnen om de techniek in de dagelijkse klinische routine te implementeren.
Afgezien van deze beperkingen, vertegenwoordigt de huRBL-test een waardevol onderzoeksinstrument voor de diagnose en behandeling van allergische aandoeningen en kan deze in een breed scala aan toepassingen worden gebruikt.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen prof. Dr. Stefan Vieths van de afdeling Moleculaire Allergologie, Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Duitsland, bedanken voor het leveren van de ges vermenselijkte / FcεRI-getransfecteerde RBL-cellen en voor het geven van zijn toestemming om dit onderzoeksmethodologiepaper te schrijven. We willen Prof. Dr. Fatima Ferreira bedanken voor het geven van uitstekende feedback. Verder willen we Prof. Dr. Ronald van Ree en Dr. Jaap Akkerdaas van de afdeling Experimentele Immunologie, Amsterdam Universitair Medische Centra, locatie AMC, Amsterdam, Nederland, bedanken voor hun toestemming voor het publiceren van representatieve gegevens in dit methodenpaper, die zijn gegenereerd in de loop van het project BM4SIT - innovaties voor allergie (www.BM4SIT.eu). Het werk van de auteurs is ondersteund door het Oostenrijkse Wetenschapsfonds (Project P32189), door het prioriteitsprogramma Allergie-Kanker-BioNano Research Centre van de Universiteit van Salzburg, door het doctoraatsprogramma Immuniteit in Kanker en Allergie-ICA gefinancierd door het Oostenrijkse Wetenschapsfonds (FWF W01213) en door het BM4SIT-project (subsidienummer 601763) uit het zevende kaderprogramma van de Europese Unie FP7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | M2133 | |
| 96-well plate for huRBL cells (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, flat-bottom microplate) | ThermoFisher Scientific | 167008 | |
| 96-well plate for substrate solution and cell supernatant (Greiner Bio-One non-treated 96-well microplates) | Fisher Scientific | 655101 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 10735078001 | |
| Citric acid | Applichem | 131018 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS without calcium and magnesium) | Sigma | D8537 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Glycine | Applichem | A3707 | |
| Heat-inactivated fetal calf/bovine serum (FCSi) | Sigma | F0804 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, with ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | M8042 | |
| Opti-MEM reduced serum medium, GlutaMAX supplement | Gibco/ThermoFisher Scientific | 51985034 | |
| Penicillin-Streptomycin (10K units Pen. 10 mg/mL Strep.) | Sigma | P4333 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Applichem | A2942 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Applichem | 131638 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | 59418C | |
| Tyrode’s salt | Sigma | T2145 |
References
- Curin, M., et al. Next-generation of allergen-specific immunotherapies: molecular approaches. Current Allergy and Asthma Reports. 18 (7), 39 (2018).
- Okamoto-Uchida, Y., et al. Different results of IgE binding- and crosslinking-Based allergy tests caused by allergen immobilization. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 39 (10), 1662-1666 (2016).
- Vogel, L., Lüttkopf, D., Hatahet, L., Haustein, D., Vieths, S. Development of a functional in vitro assay as a novel tool for the standardization of allergen extracts in the human system. Allergy. 60 (8), 1021-1028 (2005).
- Ocmant, A., et al. Basophil activation tests for the diagnosis of food allergy in children. Clinical and Experimental Allergy. 39 (8), 1234-1245 (2009).
- Platts-Mills, T. A. The role of immunoglobulin E in allergy and asthma. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (8), Pt 2 1-5 (2001).
- Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nature Medicine. 18 (5), 693-704 (2012).
- Lawrence, M. G., et al. Half-life of IgE in serum and skin: Consequences for anti-IgE therapy in patients with allergic disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (2), 422-428 (2017).
- Draber, P., Halova, I., Polakovicova, I., Kawakami, T. Signal transduction and chemotaxis in mast cells. European Journal of Pharmacology. 778, 11-23 (2016).
- Peebles, R. S. Prostaglandins in asthma and allergic diseases. Pharmacology & Therapeutics. 193, 1-19 (2019).
- Cyphert, J. M., et al. Allergic inflammation induces a persistent mechanistic switch in thromboxane-mediated airway constriction in the mouse. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (1), 140-151 (2012).
- Méndez-Enríquez, E., Hallgren, J. Mast cells and their progenitors in allergic asthma. Frontiers Immunology. 10, 821 (2019).
- Demoly, P., Lebel, B., Arnoux, B.
- Yamaga, S., et al. Decreased intracellular histamine concentration and basophil activation in anaphylaxis. Allergology International. 69 (1), 78-83 (2020).
- Huang, L., et al. A rapid and sensitive assay based on particle analysis for cell degranulation detection in basophils and mast cells. Pharmacological Research. 111, 374-383 (2016).
- González-Pérez, R., Poza-Guedes, P., Barrios Del Pino, Y., Matheu, V., Sánchez-Machín, I. Evaluation of major mite allergens from European standardized commercial extracts for in vivo diagnosis: addressing the need for precision medicine. Clinical and Translational Allergy. 9, 14 (2019).
- Focke, M., Marth, K., Valenta, R. Molecular composition and biological activity of commercial birch pollen allergen extracts. European Journal of Clinical Investigation. 39 (5), 429-436 (2009).
- Hoffmann, A., Vieths, S., Haustein, D. Biologic allergen assay for in vivo test allergens with an in vitro model of the murine type I reaction. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 99 (2), 227-232 (1997).
- Sun, N., Zhou, C., Zhou, X., Sun, L., Che, H. Use of a rat basophil leukemia (RBL) cell-based immunological assay for allergen identification, clinical diagnosis of allergy, and identification of anti-allergy agents for use in immunotherapy. Journal of Immunotoxicology. 12 (2), 199-205 (2015).
- Kaul, S., Hoffmann, A. Mediator release assay of rat basophil leukemia cells as alternative for passive cutaneous anaphylaxis testing (PCA) in laboratory animals. Altex. 18 (1), 55-58 (2001).
- Passante, E., Frankish, N. The RBL-2H3 cell line: its provenance and suitability as a model for the mast cell. Inflammation Research. 58 (11), 737-745 (2009).
- Kaul, S., et al. Mediator release assays based on human or murine immunoglobulin E in allergen standardization. Clinical and Experimental Allergy. 37 (1), 141-150 (2007).
- Huang, J., et al. Application of in vitro and in vivo models in the study of food allergy. Food Science and Human Wellness. 7 (4), 235-243 (2018).
- Klueber, J., et al. Homologous tropomyosins from vertebrate and invertebrate: Recombinant calibrator proteins in functional biological assays for tropomyosin allergenicity assessment of novel animal foods. Clinical and Experimental Allergy. 50 (1), 105-116 (2020).
- Zhang, T., et al. Different thermal processing effects on peanut allergenicity. Journal of the Science of Food and Agriculture. 99 (5), 2321-2328 (2019).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Wolf, M., et al. Amb a 1 isoforms: Unequal siblings with distinct immunological features. Allergy. 72 (12), 1874-1882 (2017).
- Eichhorn, S., et al. Rational design, structure-activity relationship, and immunogenicity of hypoallergenic Pru p 3 variants. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (18), 1900336 (2019).
- Abd Rani, N. Z., et al. Mechanistic studies of the antiallergic activity of phyllanthus amarus Schum. and Thonn. and its compounds. Molecules. 26 (3), (2021).
- Huber, S., et al. Does clinical outcome of birch pollen immunotherapy relate to induction of blocking antibodies preventing IgE from allergen binding? A pilot study monitoring responses during first year of AIT. Clinical and Translational Allergy. 8 (1), 39 (2018).
- Araujo, G. R., et al. TGFβ1 mimetic peptide modulates immune response to grass pollen allergens in mice. Allergy. 75 (4), 882-891 (2020).
- Passante, E., Frankish, N. Deficiencies in elements involved in TLR4-receptor signalling in RBL-2H3 cells. Inflammation Research. 59, Suppl 2 185-186 (2010).
