Summary
Här presenterar vi medlaren release analys, med hjälp av en råtta basophilic leukemi cellinje transfected med den mänskliga IgE receptorn, för att simulera degranulation av effector celler som vanligtvis observeras i typ 1 allergiska reaktioner. Denna metod undersöker allergeners biologiska aktivitet på ett mycket känsligt, reproducerbart och anpassningsbart sätt.
Abstract
Mediator release analyser in vitro immunoglobulin E (IgE)-medierad degranulation och utsöndring av medlare av effectorceller, såsom mastceller och basofiler, vid stimulering med seriell utspädning av förmodade allergener. Därför utgör dessa analyser ett viktigt verktyg som efterliknar in vivo-degranuleringsprocessen, som uppstår vid allergenexponering hos sensibiliserade patienter eller i hudstickstester. Dessutom används dessa analyser vanligtvis för att undersöka proteiners allergiframkallande potential och reaktiviteten hos patienternas serum reaktivitet. Häri beskriver vi ett enkelt 2-dagars protokoll med hjälp av en odödlig råtta basophil leukemi cellinje transfected och humaniserade med den mänskliga hög affinitet IgE plasma-membran receptorn (FcεRI). Denna variant av medlarens frisättningsanalys är ett robust, känsligt och reproducerbart in vitro-cellbaserat system utan att antigenet behöver immobiliseras till fasta matriser. Protokollet består av följande steg: (1) komplementinaktivering av mänsklig serum, (2) skörd, sådd och passiv sensibilisering av cellerna, (3) stimulering med antigen för att orsaka medlarfrisättning och (4) mätning av β-hexosaminidasaktivitet som surrogat för de frisläppta inflammatoriska medlarna, såsom histamin. Analysen utgör ett användbart verktyg för att bedöma kapaciteten hos allergen-IgE-korslänkning till utlösande celldegranulering och kan implementeras för att standardisera allergenextrakt. att jämföra patienternas reaktivitet med mindre eller större allergiframkallande extrakt (pollen, kattdander osv.), för att undersöka styrkan hos allergenhomloger, isoformer och vikvarianter (t.ex. hypoallergenicitet), samt ligands effekter på den allergiframkallande aktiviteten. En nyare ansökan inkluderar användning av analysen för att övervaka behandlingseffekten under allergen immunterapi.
Introduction
Typ I överkänslighetsreaktioner, som kännetecknas av immunglobulin E (IgE) produktion specifik för ett respektive antigen, påverkar nästan en tredjedel av världens befolkning. Dessa reaktioner är förknippade med flera allergiska manifestationer som astma och rhinoconjunctivitis och kan till och med leda till systemiska livshotande reaktioner1. Till skillnad från in vivo-tester är immunkemiska metoder, såsom den enzymkopplade immunosorbentanalysen (ELISA), endast lämpliga för att undersöka målbindningen av antikroppar men tar inte upp den funktionella aspekten av proteiner som kan orsaka omedelbara överkänslighetsreaktioner. Immobiliseringen av allergenerna på fasta stöd (t.ex. ELISA-plattor) kan orsaka förändringar i deras strukturella integritet och förstörelsen av allergirelevantaepitoper 2. Även hudstickstester (SPT), det vanligaste verktyget för att bekräfta sensibilisering mot vissa allergener, har sina gränser för detektion av symtomatisk IgE-medierad matallergi eller allergentillgänglighet3,4. För att hitta en etisk, mycket specifik, känslig och kostnadseffektiv metod för att testa allergeners biologiska styrka för att orsaka en överkänslighetsreaktion av typ I har de så kallade medlarutgivningsanalyserna fastställts.
Principen för dessa analyser förlitar sig på händelser efter sensibiliseringsfasen och IgE: s medföljande förmåga att binda till α-kedjan av de hög affinitetsreceptorer som uttrycks på ytan av effektorceller, såsom mastceller och basofiler. IgE produceras huvudsakligen av plasmaceller i den mukosala associerade lymfoida vävnaden. Även om det är det minst rikliga immunglobulinet (cirka 0,05% hos icke-atopiska individer) i blodet, har det en utomordentligt hög biologisk aktivitet som är den främsta orsaken till allergiska symtom. Halveringstid av IgE kan öka från 2-3 dagar till flera veckor och till och med månader när de är bundna till dess receptorer på effectorceller. Efterföljande bindning av ett antigen till den variabla regionen av två receptorbundna IgE-molekyler leder till deras korslänkning följt av induktion av en nedströms signalerande kaskad i effektorcellen som leder till degranulering och frisättning av flera proinflammatoriska medlare som orsakar vasodilatation, såsom histamin, serinproteaser (t.ex. tryptase) och prostaglandiner5,6,7. Utsöndring av cytokiner som interleukin 4 (IL-4) och IL-13 är ansvariga för upprätthållandet av det inflammatoriska T-hjälp svaret 2 (Th2) och klassbytet av B-celler till IgE-producerandeplasmaceller 5,8,9. Å andra sidan orsakar frigjord trombin bronkkonstriction, och leukotriener stimulerar jämn muskelkontraktion samt vaskulär läckage och spelar en avgörande roll i luftvägsinflammation som leder till astma eller allergisk rinit10,11.
Forskningsverktyg för att analysera de flesta av de ovannämnda medlarna har etablerats, men med några stora nackdelar. Tryptase analyser är lämpliga kliniska metoder för mätning av systemisk anafylaxi genom mastcell aktivering men deras känslighet och specificitet i allergi diagnoser är för felaktig jämfört med guld standard metoder såsom SPT. Å andra sidan kan cysteinyl leukotriene-analyser inte diagnostisera allergier mot β-laktamer eller icke-steroida antiinflammatoriskaläkemedel 12. Protokoll för mätning av histamin som en stor medlare som släpptes ut i allergiska reaktioner upprättades redan på 1960-talet. När histamin släpps ut i perifert blod bryts det omedelbart ned av histamin metyltransferaser vilket resulterar i en plasmahalva på bara några minuter, vilket gör analysenganska utmanande 13. Bortsett från dess instabilitet visade sig övervakningen av histamin ha en låg specificitet och känslighet för läkemedelsallergier samt kommersiella livsmedelsproteiner och vepsgifter12.
In vitro-modeller med effektor cellinjer har införts som ett alternativ till arbetsintensiva förfaranden för isolering och odling av basofiler från allergiska patienter för att utföra frisättningsanalyser. Därför har råtta basophilic leukemi- (RBL-) baserade analys med hjälp av RBL-2H3 cellinjen fastställts3. Eftersom denna cellinje inte kan binda mänsklig IgE, transfekterades den först med α-, β- och γ-kedjan av den mänskliga IgE-plasmamembranreceptorn (FcεRI). Flera kloner har genererats och testats för uttrycksnivåer och homogenitet hos den mänskliga α-kedjan, varav klonen RBL-30/25 framträdde som den mest lovande kandidaten för in vitro-testning. Signal kaskad inducerad vid receptor aktivering av den transfected klonen testades via kalcium mobilisering analyser. Som en indikator för degranulation och surrogat för histaminfrisättning mättes lysosomalenzymet β-hexosaminidas, vilket har den betydande fördelen med högrestabilitet 14. Medlarens frisättning med RBL-30/25-celler når upp till 100% och används därför för att testa serum som härrör från allergiska patienter. Analysen testades för medlarfrisättningen efter utmanande sensibiliserade celler med kommersiella allergen extrakt. Detta ledde till konstaterandet att det finns en enorm variation i sammansättningen (upp till 60 gånger när det gäller den totala proteinhalten) av allergenextrakt som härrör från olika tillverkare och används för diagnostik (t.ex. SPT) eller terapeutiskametoder 3,15,16.
Häri ger vi en detaljerad beskrivning av RBL-protokollet för att utföra medlarens frisättningsanalys med hjälp av serum från allergiska donatorer. Under passiv sensibilisering fångas IgE i serumet av den höga affinitet fcεr1-receptorn uttryckt på ytan av de basofila cellerna. Vid antigenstimulering är bundna IgEs som är specifika för antigenet korslänkade, vilket utlöser celldegranulering och frisättningen av medlaren β-hexosaminidas. Aktiviteten hos β-hexosaminidas mäts därefter med hjälp av ett lämpligt substrat. För analysen användes huRBL-2H3 celler och kallas huRBL i följande protokoll. Protokollet beskriver en standardserie av antigenutspädning med 8 steg utspädda 1:10 från 1 μg/ml till 0,1 pg/ml allergen.
Protocol
Etiskt godkännande att använda serum som härrör från björkpollenallergiska patienter erhölls från den nederländska etiska kommittén (godkännandenummer: NL65758.018.18).
1. Säkerhetsrutiner
- Arbeta under sterila förhållanden med hjälp av en biologisk säkerhetsklass 2 arbetsbänk under experimentens första dag (Biosafety Level 2). Följ institutionens säkerhetsriktlinjer för användning av humant serum.
2. Komplettera inaktivering av mänsklig serum
- Skörda en tät kultur av P3X63Ag8.653 celler (kallas Ag8-celler hädanefter), från cellkulturkolven och överför dem till ett centrifugationsrör.
- Använd följande odlingsmedium för dessa celler: Modified Eagles's Minimum Essential Medium med minskad serumkoncentration, 1% Penicillin-Streptomycin (100 enheter Penna., 0,1 mg/mL Strep.), 5% värmeinaktiverad fetala kalv/bovint serum (FCSi).
- Centrifuge Ag8 celler i 5 min vid 250 x g vid rumstemperatur.
- Suspendera cellpelleten till en slutlig koncentration på cirka 1 x 106 celler/ml i huRBL-medium (Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, 4 mM L-Glutamin, 5% FCSi, 1% G418 (100% lager: 10 g/125 mL dH2O).
OBS: Underhåll Ag8-celler genom att passa även för framtida användning. - Späd ut mänsklig serum 1:10 i Ag8 cell suspension. Slutlig serumutspädning i analysen kommer att vara 1:20.
OBS: För serum med låg specifik IgE kan en 1:5 (1:10 slutlig utspädning) användas. - Inkubera i 1 timme vid 37 °C och 5-7% CO2.
3. Skörd och sådd av huRBL-celler
- Aspirera mediet från en T-75 cell odlingskolv försiktigt utan att röra huRBL-cellerna (huRBL-celler är vidhäftande). Se till att cellerna är cirka 50-90% konfluenta.
OBS: Beroende på cellkonfluensen är cellinnehållet i en tät T-75-cellkulturkolv vanligtvis tillräckligt för en till två 96-brunnsplattor. - Tvätta cellerna två gånger genom att tillsätta 10 ml av Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS). Tillsätt DPBS på motsatt sida av kolven och inte direkt på cellerna.
- Aspirera DPBS och tillsätt 5 ml förvärmd 1x trypsin-EDTA (0,05%/0,02% EDTA utspädd i DPBS) för cellavlossning.
- Inkubera kolven i 5 minuter vid 37 °C.
- Lossa cellerna genom att försiktigt knacka på kolven.
- Överför cellfjädringen till ett 15 ml centrifugationsrör och fyll på med huRBL-medium eller DPBS för att späda ut trypsin-EDTA.
- Centrifugera cellerna vid 250 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten och återanvänd pelleten i 5 ml huRBL medium för cellräkning.
- Räkna cellerna och späd dem i huRBL medium för att få en slutlig koncentration på 2 x 106 celler/ml.
- Använd en steril 96-brunnsplatta och tillsätt 50 μL huRBL-cellsuspension per brunn, vilket motsvarar 1 x 105 celler/brunn.
4. Passiv sensibilisering av huRBL-celler
- Centrifugera den förinkuberade Ag8/serumupphängningen i 5 min vid 250 x g.
- Överför 50 μL av den centrifugerade Ag8/serumupphängningen till varje brunn som innehåller huRBL-celler utan att störa Ag8-cellpelleten.
- Inkludera ingen antigenkontroll, som är sensibiliserad, men ostimulerade celler (tillsätt inte antigen), som fungerar som en indikation för den nedre signalplatån / bakgrunden. Bakgrund och maximala lysis kontroll brunnar behöver inte vara sensibiliserade med serum. Tillsätt istället 50 μL huRBL medium för att styra brunnar.
- Täck plattan med locket och inkubera över natten vid 37 °C och 5-7% CO2.
5. Antigenstimulerad degranulering och medlarutlösning
- Förbered antigenutspädningen i 1x Tyrodes buffert (9,5 g/L Tyrodes salter, 0,1% bovint serumalbumin (BSA), 0,5 g/L natriumvätiumkarbonat (NaHCO3)i dH2O) i förväg. En slutlig mängd på 100 μL per brunn behövs.
OBS: Inte alla allergener, antingen renas från naturliga källor eller rekombinant produceras, kan vara stabil i 1x Tyrodes buffert. Utför därför stabilitetstester i 1x Tyrodes buffert före analysproceduren. Alternativt späd 1x Tyrodes buffert i deuteriumoxid (D2O) för att öka signal-till-brusförhållandet för analysen. - Gör 8 utspädningar av det antigen som är av intresse för en utspädningsserie på 1:10 i reaktionsrör som börjar med antingen 10 eller 1 μg/ml protein.
OBS: Testa alltid utspädningsserien i förväg. Alternativt kan du anpassa utspädningsserien 1:10 (t.ex. 1:5, 1:20 eller 1:30) för att täcka hela frisättningskurvan. Dessutom kan startkoncentrationen variera beroende på den experimentella inställningen. - För att tvätta huRBL-celler pläterade på 96-brunnsplattan, ta bort det serumhaltiga cellmediet först genom att försiktigt aspirera, invertera och knacka på plattan på absorberande papper.
- Tvätta celler med 200 μL 1x Tyrodes buffert per brunn. Behandla alla brunnar på samma sätt.
OBS: Tillsätt tvättlösningen långsamt i cellerna för att inte störa dem. - Lämna den i ca 30 s och upprepa tvättsteget tre gånger totalt.
- Efter att ha tillslat tvättlösningen för sista gången, lämna lösningen i brunnarna tills den är redo att fortsätta med tillsats av antigenutspädningen.
OBS: Undvik att utsätta celler för luft för länge. - Överför 100 μL antigenlösning till varje brunn som innehåller de försensibiliserade huRBL-cellerna.
OBS: Om du analyserar flera olika parametrar, överför de enskilda proverna i utspädningsserien till en extra icke-bindande 96-brunnsplatta (använd samma layout som på huRBL-plattan) och överför dem efteråt med en flerkanalspipett direkt på huRBL-cellplattan. På så sätt kan man undvika att utsätta cellerna för luft för länge, vilket kan leda till dålig analysprestanda (lägre/ingen signal). - Täck kontrollbrunnar (maximalt lys och icke-sensibiliserade bakgrundsceller) med 100 μL 1x Tyrodes buffert. Stimulera inte dessa kontrollbrunnar med antigenet.
- Lägg dessutom till 100 μL 1x Tyrodes buffert till de sensibiliserade antigenbrunnarna i utspädningsserien, vilket behövs för att ta hänsyn till antigenoberoende spontan frisättning av sensibiliserade celler under dataanalys.
- Inkubera huRBL-celler i 1 timme vid 37 °C och 5-7% CO2.
6. Fluorescensmätning av β-hexosaminidasaktivitet
- Behandla brunnarna i den maximala lysskontrollen med 10 μL 10% Triton X-100 per brunn och blanda ordentligt för att lysa cellerna helt och få 100% frisättning av β-hexosaminidas.
- Tillsätt 50 μL substratlösning i en ny icke-bindande 96-brunnsplatta. Substratlösning för en 96-brunnsplatta: 5 ml citronanalysbuffert på 0,1 M, pH 4,5; och 80 μL 10 mM 4-metyllumbelliferyl N-acetyl-β-D-glukasinod.
- Överför 50 μL cellövernatant av alla brunnar till den nya plattan som innehåller substratlösningen.
OBS: Pipetten supernaten försiktigt från huRBL-plattan för att inte störa huRBL-cellerna. - Inkubera plattan med substratlösning och cellspånmedel i 1 timme vid 37 °C för att möjliggöra omvandling av det fluorogena substratet.
OBS: Behåll huRBL-plattan för cellhållbarhetsanalys. - Tillsätt 100 μL stopplösning (15 g/L glycin, 11,7 g/L NaCl upplöst i dH2O, pH 10,7) per brunn.
- Mät fluorescensen vid 360 nm excitation och 465 nm utsläpp med hjälp av en plåtläsare.
7. Dataanalys
- För grundläggande beräkningar av procentuell frisläppt använder du alla kalkylbladsprogram.
- För borttagning av bakgrunds subtraktion/baslinje subtraherar du genomsnittet av bakgrundsbrunnarna från alla andra brunnar.
- Beräkna medelvärdet av maximala lyssbrunnar och expressdata för utspädningsserien i procent. På så sätt kan man uttrycka data i procent av cellfrisättning normaliserad till maximal enzymfrisättning orsakad av celllys.
- Fullständiga medlare för dosrespons representeras bäst som XY-grafer med antigenkoncentrationen på en logg på X-axeln och procentandelen medlare på Y-axeln.
- Lägg till värdena för antigenfri kontroll som en streckad linje för att ange bakgrunden eller den nedre platån.
OBS: Flera liknande behandlade serum kan jämföras med denna normaliseringsstrategi. För direkt jämförelse rekommenderas det vidare att beräkna den halva maximala frisättningen, vilket är den antigenkoncentration (i ng/mL) som krävs för halv maximal frisättning definierad som genomsnittet av de maximala och minimala värdena per kurva. Antigenkoncentrationen för att stimulera halv maximal frisättning beräknas genom interpolation av det halv maximala frisättningsvärdet till en logaritmisk regressionslinje.
Representative Results
Medlarens frisättningsanalys, baserad på huRBL-celler (figur 1A och B), resulterar i en klockformad dosresponskurva ( figur1C). För förenklad datarepresentation kan den antigenkoncentration som krävs för halv maximal medlare frigöras beräknas med linjär regression (figur 1D). En cellvishetsanalys utförs för att utesluta cytotoxiska effekter som härrör från antingen det sensibiliserande serumet eller det antigen som används för stimulering (figur 1E). Analysen kan användas för att testa reaktiviteten hos olika serum till ett visst antigen. I vårt fall svarade 4 av 5 serum, som härrör från björkpollenallergiska patienter, på Bet v 1 stimulering. Serum #1 visade den högsta medlarutgåvan (Figur 2). Serum #5 svarade inte på Bet v 1-stimulering och kan därför reagera på andra björkpollen allergener (t.ex. Bet v 2, profilin). Dessa data indikerar att Bet v 1 är ett potent allergen som ansvarar för IgE-medierade allergiska symtom. Genom att använda huRBL-analysen kan IgE:s korsreaktivitet mot homologa allergener bedömas(figur 3). Här svarade båda björkpollenallergiska patienter bra på Bet v 1, medan endast patient #2 svarade också på Cor a 1, Bet v 1-homolog mat allergen som finns i hasselnötter. Baserat på dessa data har patient #2 sannolikt högre Cor en 1-korsreaktiv IgE nivåer än patienten #1, vilket resulterar i muntliga allergi symtom vid hasselnötskonsumtion. Även bedömningen av mutantvarianternas allergivänliga karaktär av allergener (minskad styrka) kan analyseras och jämföras med deras motsvarighet av vildtyp(figur 4). I det medföljande exemplet skiftade frisättningskurvan för vikvarianten mot en högre antigenkoncentration jämfört med allergenet av vildtyp, vilket resulterade i en betydligt högre koncentration av antigen som var nödvändig för att prova halv maximal frisättning (figur 4B). Dessa data tyder på att den genererade mutant/vikvarianten är mindre allergiframkallande jämfört med det vilda proteinet. Denna minskade styrka för att utlösa IgE-medierad degranulation belyser den hypoallergena karaktären hos vikvarianten. Baserat på denna analys, den vik varianten är en intressant kandidat för allergen-specifika immunterapi eftersom det kan orsaka minskad IgE-associerade biverkningar under behandlingen.
Figur 1:Humaniserade RBL-celler och en representativ klockformad kurva av IgE-allergen korslänkande inducerad β-hexosaminidasfrisättning. RBL-celler är vidhäftande med odlingskolvarna, vilket ger dem en stavliknande form när de försöker fästa sig (A). En idealisk nivå av sammanflöde för celler som ska skördas är inte mer än 90% (B). Cellerna visas under förstoring av 40x respektive 10x. Celler som sensibiliserades med humant serum av en björkpollenallergisk individ som reagerade vid utmaning med rekombinant Bet v 1 (rBet v 1), den stora björkpollen allergen (C). Som surrogat för medlare release mäts β-hexosaminidase aktivitet i cell supernatants. Den klockformade kurvan är resultatet av en monovalent ockupation av antigenepisodoper på IgE på grund av överskottet av allergen, vilket konkurrenskraftigt hämmar allergen-IgE-korslänkningen vid höga antigenkoncentrationer. En annan förklaring till den låga frisättningen vid höga allergenkoncentrationer är hämning av intracellulära vägar i närvaro av överskott av antigen. För bestämning av den allergenkoncentration som krävs för att erhålla halv maximal frisättning användes en logaritmisk regressionslinje baserad på de experimentella värden som representerar den linjära delen av medlarens utlösningskurva (D). Den röda prickade linjen representerar den logaritmiska regressionslinjen som används för beräkning. Formeln för regressionslinjen visas i rött. Den halv maximale frisättningen definieras som: halv maximal frisättning = (lägsta frisättningsvärde + maximalt frisättningsvärde)/2. I exemplet var den beräknade halvan maximal release 20,6%. Det representativa humanserum som användes i detta experiment späddes ut 1:20 för inkubation med huRBL-celler, och antigenkoncentrationen som används för stimulering varierade från 100 μg/ml till 0,004 pg/ml bet v 1. En cell viabilitetsanalys, i detta fall en MTT-analys, utfördes med de återstående cellerna efter antigen stimulering för att bedöma påverkan av sensibiliserande serum samt antigen utspädning på cell livskraft och cellräkning (E). Obehandlade bakgrundsceller och lysceller (maximal lys) visas som prickad linje. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativa kurvor β-hexosaminidas procent frisättning av fem olika mänskliga serum. Samma antigenkoncentrationsområde av rBet v 1 inkuberades med huRBL celler som var sensibiliserade med serum av olika björk pollen sensibiliserade individer. Det finns en tydlig skillnad i procentfrisättning mellan de olika patienterna som motsvarar svårighetsgraden av deras symtom. Observera att patient #5 inte reagerar på det stora björkpollen allergenet Bet v 1. Alla fem mänskliga serum som används för att erhålla dessa medlare release kurvor späddes lika 1:20 för inkubation med huRBL celler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Cross-reactivity av IgE härledd från serum av björkpollen sensibiliserade patienter med Bet v 1 homolog hasselnöts allergen Cor a 1. Två representativa serum av patienter sensibiliserade till björk pollen reagerar starkt på Bet v 1 samt i mindre utsträckning till den homologa allergen Cor en 1. Patient 2 visar en signifikant reaktion på Cor a 1, och kommer därför sannolikt att uppvisa orala allergisymtom vid hasselnötskonsumtion, jämfört med patient 1 där medlarens frisättning är nästan försumbar. Den prickade linjen representerar antigenkontrollen, som är celler som är sensibiliserade med den mänskliga serumet men inte stimuleras med ett allergen och därmed fungerar som indikation för den nedre signalplatån / bakgrunden. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 4:Jämförelse av procentfrisättning mellan rBet v 1 vildtyp och en allergivänlig vikvariant. Samma serum av en björk pollen-sensibiliserad individ inkuberades med rBet v 1 vild typ (wt) och en hypoallergen vik-variant av den stora björk pollen allergen (A). Även om medlarfrisättning ses i båda antigenerna, finns det en tydlig förskjutning mot högre antigenkoncentrationer när man jämför vikvarianten med vild typ rBet v 1 för samma procent release. Ett standardiserat sätt att jämföra skillnaden i procentfrisättning av olika antigener är att beräkna den koncentration av antigen som behövs för att uppnå hälften av den maximala frisättningen (B). Detta utförs vanligtvis i biologiska replikat (testning av samma antigenområde för varje allergen i olika mänskliga serum). Vanligtvis, för att dra några betydande slutsatser, utförs medlaren release med serum från minst 8 till 10 olika patienter. Här plottas resultaten av fyra olika serum som ett exempel. Ett parat t-testanvändes för statistisk analys. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; p ≤ 0,001, p ≤ 0.0001. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Potentiella frågor och felsökning | Lösning |
| Analys-till-analysvariation på grund av förändrad cellresponsivitet | Se till att cellpassagecykelnumret inte överstiger 20 till 30 passager. Gör frysta lager vid tidiga passager för framtida experiment. |
| Lita snarare på biologiska replikat (användning av olika serum) än tekniska. | |
| Serum innehåller låga nivåer av specifik IgE | En lägre slutlig serumutspädning kan användas (dvs. 1:10) i stället för 1:20. Omvänt kan serum som innehåller höga nivåer av specifik IgE spädas ut ytterligare (1:30 eller 1:40). |
| Det finns inte tillräckligt med celler för att utföra analysen | Se till att sammanflödet i en T-75-kolv är cirka 50-90%. Passage fler flaskor. |
| Cytotoxiska effekter av serum, dvs. på grund av ofullständig komplementinaktivering | Utför en cell viabilitetsanalys utöver medlarens frisättningsanalys. Öka Ag8-koncentrationen för att undvika ofullständig komplementinaktivering. |
| Låg signal | Förbättra signal-till-brusförhållandet för analysen genom att späda ut 1x Tyrodes buffert i deuteriumoxid (D2O) i stället för dH2O, eller genom att använda en serum med högre nivåer av specifik IgE för allergenet av intresse. |
| Allergen är inte stabilt i Tyrodes buffert (t.ex. nederbörd) | Gör stabilitetstester i 1x Tyrodes buffert före analysproceduren. Ersättning av Tyrodes buffert rekommenderas inte. |
| Problem med att hitta rätt startkoncentration för respektive allergen | Anpassning av utspädningsserien för att täcka hela frisättningskurvan (fler utspädningssteg, 1:20 utspädning istället för 1:10). |
| Dålig analysprestanda indikerad av låg/ingen signal | Undvik cytotoxiska effekter från antingen serum- eller antigenstimulering (t.ex. enzymatiska allergener). Tvätta och blötlägg cellerna noggrant. Undvik att utsättas för luft för länge och förhindra att cellerna torkar ut. |
| Hur vet jag om den nedre signalplatån är nåd? | Lägg till "inga antigen"-kontroller på din tallrik. Dessa är sensibiliserade cell, som stimulerades endast med 1x Tyrodes buffert men utan ett allergen. |
| Behöver jag en positiv kontroll utöver de maximala lysisbrunnarna? | Som ytterligare positiv kontroll kan en serum- och antigenkombination som är känd för att orsaka degranulation användas eller en anti-FcεR1-antikropp. |
| Hur många brunnar behöver jag? | Det beror på din titreringsserie, antalet antigener och serum du vill analysera. Planera layouten för 96-brunnsplattorna beroende på hur många serum / antigener du ska testa. Glöm inte att lägga till "inga antigenkontroller", bakgrundscellerna (icke-sensibiliserade, icke-stimulerade) samt de maximala lyssbrunnarna. |
| Hur många serum ska jag testa? Och behöver jag replikat? | Även om analysen är ganska robust finns det viss analys-till-analysvariation på grund av förändrad cellresponsivitet. Därför rekommenderas att snarare förlita sig på biologiska replikat (med hjälp av olika serum) än på tekniska replikat. Minst åtta olika serum är tillräckligt för att analysera allergener. Som visas i bild 4B kan dock betydande resultat redan erhållas med mindre serum. |
Tabell 1: Felsökning.
Discussion
Den häri beskrivna huRBL cellbaserade medlare release analys är en robust metod som lätt kan utföras och genomföras i alla laboratorium. Det enda kravet är att celler måste odlas under sterila förhållanden. Analysen används för att bedöma sannolikheten för en allergen eller allergiframkallande källa för att framkalla patienternas IgE-crosslinking och basophil degranulation17. Analysen kan enkelt anpassas till alla allergener eller allergiframkallande källor så länge patientens serum med en hög nivå av specifik IgE, som erkänner allergenet av intresse, finns tillgängligt. Det rekommenderas att utföra en cell livskraftsanalys utöver medlaren release assay för att ta hänsyn till eventuella cytotoxiska effekter som kan leda till dålig analysprestanda. Detta kan bero på ofullständig komplementinaktivering av serum eller andra serum-härledda cytotoxiska effekter. Även antigenet i sig, till exempel på grund av proteolytisk/ enzymatisk aktivitet, kan skada huRBL-cellerna. Vi använder vanligtvis en cell livskraft analys med MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) för att utvärdera potentiella cytotoxiska effekter. Analysen kan enkelt utföras med huRBL-cellerna kvar efter att cellens supernatant samlades in och överfördes (se steg 6.3 i protokollet). Jämfört med andra immunkemiska metoder, såsom ELISA och western blotting, för att bestämma den allergiframkallande potentialen hos antingen enskilda allergener eller komplexa extrakt baserade på allergen-IgE-bindning, kan denna analys upptäcka inte bara bindningen av IgE till ett allergen utan kan också mäta funktionaliteten hos både, mänsklig IgE och allergen, för att provocera IgE-medierad basofildegranulation18. Således kan det bidra till att studera svårighetsgraden av allergiska symtom ex vivo med hjälp av patienternas serum. Analysen rapporteras vara mer konsekvent och effektiv än de klassiska passiva testning anafylaxitesterna eftersom analysen använder RBL-2H3-cellerna, som är relativt lätta att hantera och producerar mindre variation i resultat jämfört med primära celler, såsom mastceller eller mänskliga basofiler19,20. Utöver detta ger analysen en god representation av allergeners biologiska aktivitet och kan noggrant uppskatta den totala allergenhalten i ett givet komplext prov3. För felsökning av vissa steg i protokollet, se tabell 1.
När det gäller tillämpligheten av denna version av medlarens frisättningsanalys har den mestadels använts för forskningsändamål men också för standardisering av allergiframkallande extrakt baserat på deras biologiska aktivitet. Detta inkluderar analys av olika partier av SPT-lösningar, provokationstestlösning samt extrakt som används för allergenspecifik immunterapi; som visas för pollen, kattdander, husdammmyt och jordnötsextrakt, liksom bipågift3,17,21. Tekniken kan tillämpas speciellt vid diagnos av matallergier, eftersom den kan upptäcka även minimala mängder allergiframkallande beståndsdelar i komplexa livsmedelsprodukter som jordnötter, mjölk, vete och ägg22. I detta avseende har det också rapporterats som ett värdefullt verktyg för bedömning av allergiframkallande ämnen hos animaliska livsmedel, såsom tropomyosiner, och kan bidra till att skilja potenta allergener från icke-allergener23. Som forskningsverktyg används analysen för att studera effekterna av livsmedelsbearbetning samt för att utvärdera påverkan av ligandbindning till allergener och dess effekt på allergiframkallandeegenskaper 24,25. Till exempel visades bindningen av Bet v 1 till ligands inte påverka allergen-IgE korslänkning, även om det orsakade en ökning av dess termiska och proteolytiska stabilitet25. Analysen kan användas för att jämföra patientens reaktivitet med mindre och större allergener, samt för att undersöka korsreaktiviteten hos allergenhomologer och isoformer, vilket visas i vårt exempel med Bet v 1 och det homologa mat-allergenet Cor a 1 (Figur 3). När det gäller allergenisoformer användes medlarens frisättningsanalys för att identifiera den stora allergen Amb a 1,01 som den mest potenta IgE-reaktiva isoformen i ragweed pollen (Ambrosia artemisiifolia). I jämförelse visade de andra två identifierade isoformerna i ragweed pollen extrakt, Amb en 1,02 och Amb en 1,03, visade minskad reaktivitet till patienternas IgE26.
Under de senaste åren har analysen tillämpats för att studera potentiella antiallergiska föreningar och nya allergivänliga varianter av allergener, vilket hjälper till att identifiera lämpliga kandidater för allergenspecifik immunterapi27,28. Ett annat nytt tillvägagångssätt är att använda analysen för att övervaka behandlingseffekten under allergenspecifik immunterapi. I detta avseende utvecklade vår forskargrupp ett huRBL-analyshämningssystem, som korrelerade väl med minskningen av patientens symptompoäng under allergenspecifik immunterapi29. Analysen har också föreslagits för att studera de immunsuppressiva effekterna av TGFβ1 på allergeninducerad IgE-medierad degranulation30.
Begränsningarna i analysen är att även om huRBL-cellerna har vissa egenskaper hos mastceller eller basofiler, efterliknar de inte helt den naturliga funktionen hos dessa effektorceller. Till exempel uttrycker mastceller i stor utsträckning mönsterigenkänningsreceptorn Toll-liknande receptor 4 (TLR4), nödvändig för patogenigenkänning, medan den är helt bristfällig i RBL-2H3-cellerna31. På grund av denna skillnad i funktionalitet efterliknar analysen inte helt den verkliga situationen, som måste hållas i åtanke när man tolkar uppgifterna. Dessutom, eftersom huRBL-cellerna är cancerframkallande basofila celler, kan förändringar i odlingsförhållanden och långvarig odling leda till fenotypiska skillnader som leder till förändrade resultat mellan olikalaboratorier 20. En annan aspekt är valet av allergenkoncentration som måste beaktas vid anpassning av denna metod eftersom höga allergenkoncentrationer kan leda till icke-IgE-medierad degranulering på grund av förekomsten av höga mängder proteaser eller endotoxiner18. Andra begränsningar är beroendet av mänsklig serum med relativt höga specifika IgE-nivåer (RAST klass 5-6), och behovet av cellkultursystem, vilket fortfarande är ett hinder som måste övervinnas för att implementera tekniken i den dagliga kliniska rutinen.
Bortsett från dessa begränsningar representerar huRBL-analysen ett värdefullt forskningsverktyg för diagnos och behandling av allergiska sjukdomar och kan användas i ett brett spektrum av applikationer.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka prof. Dr. Stefan Vieths vid institutionen för molekylär allergologi, Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Tyskland, för att ha tillhandahållit de humaniserade / FcεRI-transfecterade RBL-cellerna och för att han gav sitt samtycke till att skriva detta forskningsmetodikpapper. Vi vill tacka prof. Dr. Fatima Ferreira för att ge utmärkt feedback. Vi vill också tacka prof. Dr. Ronald van Ree och Dr. Jaap Akkerdaas vid Institutionen för experimentell immunologi, Amsterdam University Medical Centers, plats AMC, Amsterdam, Nederländerna, för att de har gett sitt samtycke till att offentliggöra representativa uppgifter i detta metoddokument, som genererades under projektet BM4SIT - innovationer för allergi (www.BM4SIT.eu). Författarnas arbete har fått stöd av Den österrikiska vetenskapsfonden (projekt P32189), av universitetet i Salzburgs prioriterade program Allergy-Cancer-BioNano Research Centre, av doktorandprogrammet Immunitet i cancer och allergi-ICA finansierat av Österrikiska vetenskapsfonden (FWF W01213) och av BM4SIT-projektet (bidragsnummer 601763) från Europeiska unionens sjunde ramprogram FP7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | M2133 | |
| 96-well plate for huRBL cells (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, flat-bottom microplate) | ThermoFisher Scientific | 167008 | |
| 96-well plate for substrate solution and cell supernatant (Greiner Bio-One non-treated 96-well microplates) | Fisher Scientific | 655101 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 10735078001 | |
| Citric acid | Applichem | 131018 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS without calcium and magnesium) | Sigma | D8537 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Glycine | Applichem | A3707 | |
| Heat-inactivated fetal calf/bovine serum (FCSi) | Sigma | F0804 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, with ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | M8042 | |
| Opti-MEM reduced serum medium, GlutaMAX supplement | Gibco/ThermoFisher Scientific | 51985034 | |
| Penicillin-Streptomycin (10K units Pen. 10 mg/mL Strep.) | Sigma | P4333 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Applichem | A2942 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Applichem | 131638 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | 59418C | |
| Tyrode’s salt | Sigma | T2145 |
References
- Curin, M., et al. Next-generation of allergen-specific immunotherapies: molecular approaches. Current Allergy and Asthma Reports. 18 (7), 39 (2018).
- Okamoto-Uchida, Y., et al. Different results of IgE binding- and crosslinking-Based allergy tests caused by allergen immobilization. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 39 (10), 1662-1666 (2016).
- Vogel, L., Lüttkopf, D., Hatahet, L., Haustein, D., Vieths, S. Development of a functional in vitro assay as a novel tool for the standardization of allergen extracts in the human system. Allergy. 60 (8), 1021-1028 (2005).
- Ocmant, A., et al. Basophil activation tests for the diagnosis of food allergy in children. Clinical and Experimental Allergy. 39 (8), 1234-1245 (2009).
- Platts-Mills, T. A. The role of immunoglobulin E in allergy and asthma. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (8), Pt 2 1-5 (2001).
- Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nature Medicine. 18 (5), 693-704 (2012).
- Lawrence, M. G., et al. Half-life of IgE in serum and skin: Consequences for anti-IgE therapy in patients with allergic disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (2), 422-428 (2017).
- Draber, P., Halova, I., Polakovicova, I., Kawakami, T. Signal transduction and chemotaxis in mast cells. European Journal of Pharmacology. 778, 11-23 (2016).
- Peebles, R. S. Prostaglandins in asthma and allergic diseases. Pharmacology & Therapeutics. 193, 1-19 (2019).
- Cyphert, J. M., et al. Allergic inflammation induces a persistent mechanistic switch in thromboxane-mediated airway constriction in the mouse. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (1), 140-151 (2012).
- Méndez-Enríquez, E., Hallgren, J. Mast cells and their progenitors in allergic asthma. Frontiers Immunology. 10, 821 (2019).
- Demoly, P., Lebel, B., Arnoux, B.
- Yamaga, S., et al. Decreased intracellular histamine concentration and basophil activation in anaphylaxis. Allergology International. 69 (1), 78-83 (2020).
- Huang, L., et al. A rapid and sensitive assay based on particle analysis for cell degranulation detection in basophils and mast cells. Pharmacological Research. 111, 374-383 (2016).
- González-Pérez, R., Poza-Guedes, P., Barrios Del Pino, Y., Matheu, V., Sánchez-Machín, I. Evaluation of major mite allergens from European standardized commercial extracts for in vivo diagnosis: addressing the need for precision medicine. Clinical and Translational Allergy. 9, 14 (2019).
- Focke, M., Marth, K., Valenta, R. Molecular composition and biological activity of commercial birch pollen allergen extracts. European Journal of Clinical Investigation. 39 (5), 429-436 (2009).
- Hoffmann, A., Vieths, S., Haustein, D. Biologic allergen assay for in vivo test allergens with an in vitro model of the murine type I reaction. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 99 (2), 227-232 (1997).
- Sun, N., Zhou, C., Zhou, X., Sun, L., Che, H. Use of a rat basophil leukemia (RBL) cell-based immunological assay for allergen identification, clinical diagnosis of allergy, and identification of anti-allergy agents for use in immunotherapy. Journal of Immunotoxicology. 12 (2), 199-205 (2015).
- Kaul, S., Hoffmann, A. Mediator release assay of rat basophil leukemia cells as alternative for passive cutaneous anaphylaxis testing (PCA) in laboratory animals. Altex. 18 (1), 55-58 (2001).
- Passante, E., Frankish, N. The RBL-2H3 cell line: its provenance and suitability as a model for the mast cell. Inflammation Research. 58 (11), 737-745 (2009).
- Kaul, S., et al. Mediator release assays based on human or murine immunoglobulin E in allergen standardization. Clinical and Experimental Allergy. 37 (1), 141-150 (2007).
- Huang, J., et al. Application of in vitro and in vivo models in the study of food allergy. Food Science and Human Wellness. 7 (4), 235-243 (2018).
- Klueber, J., et al. Homologous tropomyosins from vertebrate and invertebrate: Recombinant calibrator proteins in functional biological assays for tropomyosin allergenicity assessment of novel animal foods. Clinical and Experimental Allergy. 50 (1), 105-116 (2020).
- Zhang, T., et al. Different thermal processing effects on peanut allergenicity. Journal of the Science of Food and Agriculture. 99 (5), 2321-2328 (2019).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Wolf, M., et al. Amb a 1 isoforms: Unequal siblings with distinct immunological features. Allergy. 72 (12), 1874-1882 (2017).
- Eichhorn, S., et al. Rational design, structure-activity relationship, and immunogenicity of hypoallergenic Pru p 3 variants. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (18), 1900336 (2019).
- Abd Rani, N. Z., et al. Mechanistic studies of the antiallergic activity of phyllanthus amarus Schum. and Thonn. and its compounds. Molecules. 26 (3), (2021).
- Huber, S., et al. Does clinical outcome of birch pollen immunotherapy relate to induction of blocking antibodies preventing IgE from allergen binding? A pilot study monitoring responses during first year of AIT. Clinical and Translational Allergy. 8 (1), 39 (2018).
- Araujo, G. R., et al. TGFβ1 mimetic peptide modulates immune response to grass pollen allergens in mice. Allergy. 75 (4), 882-891 (2020).
- Passante, E., Frankish, N. Deficiencies in elements involved in TLR4-receptor signalling in RBL-2H3 cells. Inflammation Research. 59, Suppl 2 185-186 (2010).
