Summary
Здесь мы представляем анализ высвобождения медиатора с использованием клеточной линии базофильного лейкоза крыс, трансфектированной рецептором IgE человека, для имитации дегрануляции эффекторных клеток, обычно наблюдаемой при аллергических реакциях типа 1. Этот метод исследует биологическую активность аллергенов высокочувствительным, воспроизводимым и настраиваемым способом.
Abstract
Анализы высвобождения медиаторов анализируют in vitro иммуноглобулин E (IgE)-опосредованную дегрануляцию и секрецию медиаторов эффекторными клетками, такими как тучные клетки и базофилы, при стимуляции серийными разбавлениями мнимых аллергенов. Таким образом, эти анализы представляют собой важный инструмент, который имитирует процесс дегрануляции in vivo, который происходит при воздействии аллергена у сенсибилизированных пациентов или в тестах на уколы кожи. Кроме того, эти анализы обычно используются для изучения аллергенной способности белков и реактивности сывороток пациентов. Здесь мы описываем простой 2-дневный протокол с использованием увековеченной клеточной линии базофильного лейкоза крыс, трансфектированной и гуманизированной высокоаффинным плазмационно-мембранным рецептором IgE человека (FcεRI). Этот вариант анализа высвобождения медиатора представляет собой надежную, чувствительную и воспроизводимую систему на основе клеток in vitro без необходимости иммобилизовать антиген в твердые матрицы. Протокол состоит из следующих этапов: (1) инактивация комплемента человеческих сывороток, (2) сбор, посев и пассивная сенсибилизация клеток, (3) стимуляция антигеном, вызывающим высвобождение медиатора, и (4) измерение активности β-гексозаминидазы в качестве суррогата высвобождающихся медиаторов воспалительного действия, таких как гистамин. Анализ представляет собой полезный инструмент для оценки способности сшивки аллерген-IgE вызывать дегрануляцию клеток и может быть реализован для стандартизации экстрактов аллергена, сравнения реактивности пациентов на незначительные или основные аллергены и на аллергенические экстракты (пыльца, кошачья перхоть и т. Д.), Для исследования эффективности гомологов аллергенов, изоформ и вариантов складок (например, гипоаллергенности), а также влияния лигандов на активность аллергена. Более позднее применение включает использование анализа для контроля эффективности лечения в процессе аллергенной иммунотерапии.
Introduction
Реакции гиперчувствительности I типа, характеризующиеся выработкой иммуноглобулина Е (IgE), специфичной для соответствующего антигена, затрагивают почти треть населения мира. Эти реакции связаны с несколькими аллергическими проявлениями, такими как астма и риноконъюнктивит и могут даже привести к системным опасным для жизни реакциям1. В отличие от тестов in vivo, иммунохимические подходы, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), подходят исключительно для исследования целевого связывания антител, но не затрагивают функциональный аспект белков, которые могут вызывать немедленные реакции гиперчувствительности. Иммобилизация аллергенов на твердых опорах (например, ИФА-пластинах) может вызвать изменения их структурной целостности и разрушение аллергических соответствующих эпитопов2. Даже кожные уколы (SPT), наиболее распространенный инструмент для подтверждения сенсибилизации к определенным аллергенам, имеют свои пределы в отношении обнаружения симптоматической IgE-опосредоточенной пищевой аллергии или доступности аллергенов3,4. Чтобы найти этичный, высокоспецифичный, чувствительный и экономически эффективный метод тестирования биологической эффективности аллергенов, вызывающих реакцию гиперчувствительности I типа, были созданы так называемые анализы высвобождения медиатора.
Принцип этих анализов основан на событиях, следующих за фазой сенсибилизации и сопутствующей способностью IgE связываться с α цепи высокоаффинные рецепторы, экспрессируемые на поверхности эффекторных клеток, таких как тучные клетки и базофилы. IgE в основном продуцируется плазматическими клетками в лимфоидной ткани, связанной со слизистой оболочкой. Хотя это наименее распространенный иммуноглобулин (около 0,05% у неатопических людей) в крови, он обладает чрезвычайно высокой биологической активностью, являясь основной причиной аллергических симптомов. Период полувыведения IgE может увеличиваться от 2-3 дней до нескольких недель и даже месяцев при связывке с его рецепторами на эффекторных клетках. Последующее связывание антигена с переменной областью двух рецептор-связанных молекул IgE приводит к их сшиванию с последующим индундуцированием нисходящего сигнального каскада в эффекторной клетке, что приводит к дегрануляции и высвобождению нескольких провоспалительных медиаторов, вызывающих вазодилатацию, таких как гистамин, сериновые протеазы (например, триптаза) и простагландины5,6,7. Секреция цитокинов, таких как интерлейкин 4 (IL-4) и IL-13, отвечает за поддержание воспалительного ответа Т-хелпер 2 (Th2) и переключение класса В-клеток на IgE-продуцирующие плазматические клетки5,8,9. С другой стороны, высвобождающийся тромбоксан вызывает бронхоконстрикцию, а лейкотриены стимулируют сокращение гладкой мускулатуры, а также утечку сосудов и играют решающую роль в воспалении дыхательных путей, приводящем к астме или аллергическому риниту10,11.
Исследовательские инструменты для анализа большинства вышеупомянутых посредников были созданы, хотя и с некоторыми серьезными недостатками. Анализы триптазы являются подходящими клиническими подходами для измерения системной анафилаксии через активацию тучных клеток, но их чувствительность и специфичность в диагностике аллергии слишком неточны по сравнению с методами золотого стандарта, такими как SPT. С другой стороны, цистеиниллейкотриеновые анализы не способны диагностировать аллергию на β-лактамы или нестероидные противовоспалительные препараты12. Протоколы измерения гистамина как основного медиатора, высвобождаемого при аллергических реакциях, были установлены уже в 1960-х годах. После высвобождения в периферической крови гистамин немедленно разлагается гистамин-метилтрансферазами, что приводит к периоду полувыведения плазмы всего несколько минут, что делает его анализ довольно сложным13. Помимо его нестабильности, мониторинг гистамина, как было показано, имеет низкую специфичность и чувствительность к лекарственной аллергии, а также к коммерческим пищевым белкам и ядам ос12.
Модели in vitro с эффекторными клеточными линиями были введены в качестве альтернативы трудоемким процедурам выделения и культивирования базофилов у аллергиков для выполнения анализов высвобождения. Таким образом, был установлен анализ на основе базофильного лейкоза крыс (RBL-) с использованием клеточной линии RBL-2H33. Поскольку эта клеточная линия не способна связывать человеческий IgE, она была впервые трансфектурной с α,β- и γ-цепью рецептора плазматической мембраны IgE человека (FcεRI). Несколько клонов были сгенерированы и протестированы на уровни экспрессии и однородности человеческой α цепи, из которых клон RBL-30/25 стал наиболее перспективным кандидатом для тестирования in vitro. Сигнальный каскад, индуцированный при активации рецептора трансфекционного клона, был протестирован с помощью анализов мобилизации кальция. В качестве индикатора дегрануляции и суррогата высвобождения гистамина измеряли лизосомальный фермент β-гексозаминидазы, что имеет существенное преимущество более высокой стабильности14. Высвобождение медиатора с использованием клеток RBL-30/25 достигает до 100% и, следовательно, используется для тестирования сывороток, полученных от аллергических пациентов. Анализ был протестирован на высвобождение медиатора после оспаривания сенсибилизированных клеток коммерческими экстрактами аллергенов. Это привело к выводу, что существуют огромные различия в составе (до 60 раз относительно общего содержания белка) экстрактов аллергенов, полученных от разных производителей и используемых для диагностических (например, SPT) или терапевтических подходов3,15,16.
Здесь мы предоставляем подробное описание протокола RBL для выполнения анализа высвобождения медиатора с использованием сыворотки от аллергических доноров. Во время пассивной сенсибилизации IgE в сыворотке крови захватывается рецептором FcεR1 с высоким сродством, экспрессируемым на поверхности базофильных клеток. При антиген-стимуляции связанные IgEs, специфичные для антигена, сшиваются, вызывая дегрануляцию клеток и высвобождение медиатора β-гексозаминидазы. Активность β-гексозаминидазы впоследствии измеряют с использованием подходящего субстрата. Для анализа использовались клетки huRBL-2H3, которые в следующем протоколе назывались huRBL. Протокол описывает стандартную серию разбавления антигена с 8 ступенями, разбавленными 1:10 в диапазоне от 1 мкг/мл до 0,1 пг/мл аллергена.
Protocol
Этическое разрешение на использование сыворосов, полученных от пациентов с аллергией на пыльцу березы, было получено от Голландского этического комитета (номер одобрения: NL65758.018.18).
1. Процедуры обеспечения безопасности
- Работа в стерильных условиях с использованием верстака класса биологической безопасности 2 в течение первого дня эксперимента (уровень биобезопасности 2). Следуйте рекомендациям по безопасности учреждения для использования сыворотки крови человека.
2. Дополнить инактивацию сыворороды человека
- Соберите плотную культуру клеток P3X63Ag8.653 (далее назовемых клетками Ag8) из колбы культуры клеток и перенесите их в центрифугированную трубку.
- Используйте следующую культуральную среду для этих клеток: Модифицированная минимальная необходимая среда Eagles со сниженной концентрацией в сыворотке крови, 1% пенициллин-стрептомицин (100 единиц Пен., 0,1 мг / мл Strep.), 5% термоинактивированная фетальная сыворотка для телят / крупного рогатого потребления (FCSi).
- Ячейки центрифуги Ag8 в течение 5 мин при 250 х г при комнатной температуре.
- Повторно суспендифицировать клеточную гранулу до конечной концентрации приблизительно 1х 10 6 клеток/мл в среде huRBL (минимально необходимая среда Eagle с альфа-модификацией, 4 мМ L-глутамина, 5% FCSi, 1% G418 (100% запас: 10 г/125 мл dH2O).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте ячейки Ag8 путем пропуска для будущего использования. - Разбавляют человеческие сыворотки 1:10 в клеточной суспензии Ag8. Окончательное разведение сыворотки в анализе составит 1:20.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сывороток с низким удельным IgE может использоваться 1:5 (окончательное разбавление 1:10). - Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C и 5%-7% CO2.
3. Сбор и посев клеток huRBL
- Тщательно аспирировать среду из колбы культуры клеток Т-75, не касаясь клеток huRBL (клетки huRBL являются адгезивными). Убедитесь, что клетки находятся на 50%-90% в спаде.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от слияния клеток, содержания клеток плотной колбы для культуры клеток Т-75 обычно достаточно для одной-двух 96-скважинных пластин. - Промыть клетки дважды, добавив 10 мл фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (DPBS). Добавьте DPBS на противоположную сторону колбы, а не непосредственно на ячейки.
- Аспирировать DPBS и добавить 5 мл предварительно подогретого 1x трипсина-ЭДТА (0,05%/0,02% ЭДТА, разведенного в DPBS) для отслоения клеток.
- Инкубировать колбу в течение 5 мин при 37 °C.
- Отсоегоните клетки, осторожно постукивая по колбе.
- Переложите клеточную суспензию в центрифугированную трубку 15 мл и заполните средой huRBL или DPBS для разбавления трипсина-ЭДТА.
- Центрифугировать ячейки при 250 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулу в 5 мл huRBL среды для подсчета клеток.
- Подсчитайте клетки и разбавьте их в среде huRBL для получения конечной концентрации 2 х10 6 клеток/мл.
- Используйте стерильную 96-скважинную пластину и добавьте 50 мкл клеточной суспензии huRBL на скважину, что эквивалентно 1 х 105 ячейкам/колодец.
4. Пассивная сенсибилизация клеток huRBL
- Центрифугировать предварительно инкубированную суспензию Ag8/сыворотку в течение 5 мин при 250 х г.
- Перенесите 50 мкл центрифугированной суспензии Ag8/сыворотки в каждую скважину, содержащую клетки huRBL, не нарушая гранулу клеток Ag8.
- Включают не антигенный контроль, которые являются сенсибилизированными, но нестимулированными клетками (не добавляют антиген), служащими показанием для нижнего сигнального плато/фона. Фоновые и максимальные лизисные контрольные скважины не нуждаются в сенсибилизации сывороткой. Вместо этого добавьте 50 мкл среды huRBL для управления скважинами.
- Накройте пластину крышкой и высиживайте в течение ночи при 37 °C и 5%-7% CO2.
5. Антиген-стимулированная дегрануляция и высвобождение медиатора
- Заранее подготовьте разведение антигена в 1x буфере Тирода (9,5 г/л солей Тирода, 0,1% бытового сывороточного альбумина (BSA), 0,5 г/л гидрокарбоната натрия (NaHCO3)в dH2O). Необходимо конечное количество 100 мкл на скважину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не каждый аллерген, очищенный от природных источников или рекомбинантно произведенный, может быть стабильным в буфере 1x Tyrode. Поэтому перед процедурой анализа выполните тесты на стабильность в буфере 1x Tyrode. Альтернативно, разбавляйте 1x буфер Тирода оксидом дейтерия(D2O) для увеличения отношения сигнал/шум анализа. - Сделайте 8 разведений интересующий антигена серии разбавления 1:10 в реакционных пробирках, начиная с 10 или 1 мкг/мл белка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда заранее тестируйте серию разбавления. В качестве альтернативы можно адаптировать серию разбавления 1:10 (например, 1:5, 1:20 или 1:30), чтобы покрыть полную кривую высвобождения. Кроме того, начальная концентрация может варьироваться в зависимости от экспериментальной установки. - Чтобы промыть ячейки huRBL, покрытые 96-скважинной пластиной, сначала удалите сыворотодержащую клеточную среду, тщательно аспирируя, переворачивая и постукивая пластиной по абсорбирующей бумаге.
- Промывные ячейки с 200 мкл буфера 1x Tyrodes на скважину. Относитесь ко всем колодцам одинаково.
ПРИМЕЧАНИЕ: Медленно добавляйте моющие растворы в клетки, чтобы не беспокоить их. - Оставьте его примерно на 30 с и повторите этап стирки в общей сложности три раза.
- После добавления промывного раствора в последний раз оставьте раствор в колодцах до готовности продолжить добавление разбавления антигена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте слишком долгого воздействия воздуха на клетки. - Перенесите 100 мкл раствора антигена в каждую скважину, содержащую предварительно сенсибилизированные клетки huRBL.
ПРИМЕЧАНИЕ: При анализе нескольких различных параметров перенесите отдельные образцы серии разбавления в дополнительную несвязывающую 96-скважинную пластину (используйте ту же компоновку, что и на пластине huRBL) и перенесите их затем с помощью многоканальной пипетки непосредственно на пластину ячейки huRBL. Таким образом, можно избежать слишком длительного воздействия на клетки воздуха, что может привести к плохой производительности анализа (более низкий / нет сигнала). - Покровные контрольные скважины (максимальный лизис и несенсибилизированные фоновые ячейки) со 100 мкл 1x буфера Тирода. Не стимулируйте эти контрольные колодцы антигеном.
- Кроме того, добавьте 100 мкл буфера 1x Tyrode в сенсибилизированные неантигенные скважины серии разбавления, что необходимо для учета антиген-независимого спонтанного высвобождения сенсибилизированных клеток во время анализа данных.
- Инкубировать huRBL клетки в течение 1 ч при 37 °C и 5%-7% CO2.
6. Измерение флуоресценции активности β-гексозаминидазы
- Обработайте скважины максимального контроля лизиса 10 мкл 10% Тритона Х-100 на скважину и правильно перемешайте, чтобы полностью лизировать клетки и получить 100% высвобождение β-гексозаминидазы.
- Добавьте 50 мкл раствора подложки в новую несвязывающую 96-скважинную пластину. Субстратный раствор для одной 96-скважинной пластины: 5 мл 0,1 М лимонного буфера, рН 4,5; и 80 мкл 10 мМ 4-метилумбеллифиферил N-ацетил-β-D-глюкозаминид.
- Перенесите 50 мкл клеточного супернатанта всех скважин на новую пластину, содержащую раствор подложки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетка супернатанта осторожно снимает пластину huRBL, чтобы не нарушить работу клеток huRBL. - Инкубируют пластину с раствором субстрата и клеточным супернатантом в течение 1 ч при 37 °C, чтобы обеспечить конверсию фторгенного субстрата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните пластину huRBL для анализа жизнеспособности клеток. - Добавить 100 мкл остановочного раствора (15 г/л глицина, 11,7 г/л NaCl, растворенного в dH2O, рН 10,7) на лунку.
- Измерьте флуоресценцию при возбуждении 360 нм и излучении 465 нм с помощью пластинчатого считывателя.
7. Анализ данных
- Для базовых расчетов процентного выпуска используйте любое программное обеспечение для работы с электронными таблицами.
- Для фонового вычитания/удаления исходной линии вычтите среднее значение фоновых скважин из всех других скважин.
- Рассчитать среднее значение максимальных лизисных скважин и выразить данные по рядам разбавления в процентах. Таким образом, можно выразить данные в процентах от высвобождения клеток, нормализованных до максимального высвобождения фермента, вызванного лизисом клеток.
- Полные кривые высвобождения медиатора доза-реакция лучше всего представлены в виде графиков XY с концентрацией антигена на логарифме по оси X и процентом высвобождения медиатора на оси Y.
- Добавьте значения контроля без антигена в виде пунктирной линии, чтобы указать фон или нижнее плато.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько аналогично обработанных сыворо можно сравнить с использованием этой стратегии нормализации. Для прямого сравнения далее рекомендуется рассчитать половину максимального высвобождения, которая представляет собой концентрацию антигена (в нг/мл), необходимую для половины максимального высвобождения, определяемого как среднее значение максимальных и минимальных значений на кривую. Концентрация антигена для стимуляции половины максимального высвобождения рассчитывается путем интерполяции половины максимального значения высвобождения в линию логарифмической регрессии.
Representative Results
Анализ высвобождения медиатора, основанный на клетках huRBL(рис. 1A и B),приводит к колоколообразной кривой доза-реакция(рисунок 1C). Для упрощенного представления данных концентрация антигена, необходимая для половинного максимального высвобождения медиатора, может быть рассчитана с помощью линейной регрессии(рисунок 1D). Анализ жизнеспособности клеток проводится для исключения цитотоксических эффектов, полученных либо из сенсибилизирующей сыворотки, либо из антигена, используемого для стимуляции(рисунок 1Е). Анализ может быть использован для проверки реактивности различных сывороток на определенный антиген. В нашем случае 4 из 5 сывороточных, полученных от пациентов с аллергией на пыльцу березы, ответили на стимуляцию Bet v1. Сыворотка No1 показала самый высокий медиаторный выброс(рисунок 2). Сыворотка No5 не реагировала на стимуляцию Bet v 1 и, таким образом, могла реагировать на другие аллергены пыльцы березы (например, Bet v2, профилин). Эти данные указывают на то, что Bet v 1 является мощным аллергеном, ответственным за IgE-опосредованные аллергические симптомы. С помощью анализа huRBL можно оценить перекрестную реактивность IgE на гомологичные аллергены(рисунок 3). Здесь оба пациента с аллергией на пыльцу березы хорошо реагировали на Bet v 1, тогда как только пациент No 2 также ответил на Cor a 1, Bet v 1-гомологий пищевой аллерген, обнаруженный в фундуке. Основываясь на этих данных, пациент No 2, скорее всего, имеет более высокие уровни Cor a 1-перекрестно-реактивного IgE, чем пациент No 1, что приводит к симптомам пероральной аллергии при потреблении фундука. Даже оценку гипоаллергенной природы мутантных вариантов аллергенов (снижение потенции) можно проанализировать и сравнить с их аналогом дикого типа(рисунок 4). В приведенном примере кривая высвобождения складчатого варианта сместилась в сторону более высокой концентрации антигена по сравнению с аллергеном дикого типа, что привело к значительно более высокой концентрации антигена, необходимой для провоцирования половины максимального высвобождения(рисунок 4B). Эти данные подразумевают, что сгенерированный мутантный /складчатый вариант менее аллергенен по сравнению с белком дикого типа. Эта сниженная потенция для запуска IgE-опосредопосредооченной дегрануляции подчеркивает гипоаллергенный характер варианта складки. Основываясь на этом анализе, вариант складки является интересным кандидатом для аллерген-специфической иммунотерапии, поскольку он может вызвать снижение побочных эффектов, связанных с IgE, во время лечения.
Рисунок 1:Гуманизированные RBL-клетки и репрезентативная колоколообразная кривая IgE-аллергена, индуцированного сшивкой β высвобождения гексозаминидазы. Клетки RBL прилипают к колбам культуры, что придает им палочковидную форму, когда они пытаются прикрепиться(A). Идеальный уровень слияния для клеток, которые должны быть собраны, составляет не более 90%(B). Ячейки показаны при увеличении 40x и 10x соответственно. Клетки, которые были сенсибилизированы сывороткой человека из аллергической пыльцы березы, реагируя на вызов рекомбинантным Bet v1 (rBet v1), основным аллергеном пыльцы березы(C). В качестве суррогата высвобождения медиатора активность β-гексозаминидазы измеряется в клеточных супернатантах. Колоколообразная кривая является результатом моновалентного занятия эпитопов антигена на IgE из-за избытка аллергена, который конкурентно ингибирует сшивку аллерген-IgE при высоких концентрациях антигена. Другим объяснением низкого высвобождения при высоких концентрациях аллергенов является ингибирование внутриклеточных путей в присутствии избыточного антигена. Для определения концентрации аллергена, необходимой для получения половинного максимального высвобождения, использовалась линия логарифмической регрессии, основанная на экспериментальных значениях, представляющих линейную часть наклона кривой высвобождения медиатора(D). Красная пунктирная линия представляет логарифмическую линию регрессии, используемую для расчета. Формула линии регрессии показана красным цветом. Половинное максимальное высвобождение определяется как: половинное максимальное высвобождение = (минимальное значение выпуска + максимальное значение выпуска)/2. В примере расчетный половинный максимальный выпуск составил 20,6%. Репрезентативную сыворотку человека, используемую в этом эксперименте, разбавляли 1:20 для инкубации с клетками huRBL, а концентрация антигена, используемая для стимуляции, варьировалась от 100 мкг/мл до 0,004 пг/мл Bet v1. Анализ жизнеспособности клеток, в данном случае анализ МТТ, проводили с оставшимися клетками после стимуляции антигена для оценки влияния сенсибилизирующей сыворотки, а также разбавления антигена на жизнеспособность клеток и количество клеток(E). Необработанные фоновые клетки и лизированные клетки (максимальный лизис) показаны в виде пунктирной линии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Репрезентативные кривые β-гексозаминидазы процент высвобождения пяти различных человеческих сывороток. Тот же диапазон концентраций антигена rBet v1 инкубировали с клетками huRBL, которые были сенсибилизированы сыворотками различных сенсибилизированных особей пыльцы березы. Существует четкая разница в процентном высвобождении между различными пациентами, соответствующая тяжести их симптомов. Обратите внимание, что пациент No5 не реагирует на основной аллерген пыльцы березы Bet v 1. Все пять человеческих сывороток, используемых для получения этих кривых высвобождения медиатора, были разбавлены одинаково 1:20 для инкубации с клетками huRBL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Перекрестная реактивность IgE, полученного из сывороток пыльцы березы, сенсибилизированных пациентов с Bet v1 гомологичным аллергеном фундука Cor a 1. Две репрезентативные сыворотки пациентов, сенсибилизированных к пыльце березы, сильно реагируют на Bet v1, а также в меньшей степени на гомологичный аллерген Cor a 1. Пациент 2 демонстрирует значительную реакцию на Cor a 1 и, таким образом, вероятно, будет проявлять симптомы пероральной аллергии при потреблении фундука, по сравнению с пациентом 1, где высвобождение медиатора почти незначительно. Пунктирная линия представляет собой контроль без антигена, который представляет собой клетки, сенсибилизированные сыворотками человека, но не стимулируемые аллергеном, и, таким образом, служит индикатором нижнего сигнального плато / фона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Сравнение процентного высвобождения между rBet v1 диким типом и гипоаллергенным складчатым вариантом. Ту же сыворотку березового пыльцево-сенсибилизированного индивидуума инкубировали с rBet v1 дикого типа (wt) и гипоаллергенным складчатым вариантом основного аллергена пыльцы березы(A). Несмотря на то, что медиаторное высвобождение наблюдается в обоих антигенах, наблюдается явный сдвиг в сторону более высоких концентраций антигенов при сравнении складчатого варианта с диким типом rBet v 1 для того же процентного высвобождения. Стандартным способом сравнения разницы в процентном высвобождении различных антигенов является расчет концентрации антигена, необходимой для достижения половинного максимального высвобождения(B). Обычно это выполняется в биологических репликатах (тестирование одного и того же диапазона антигенов для каждого аллергена в разных сыворотки человека). Обычно, чтобы сделать какие-либо значимые выводы, выпуск медиатора проводят с сывороподъемками не менее 8 до 10 различных пациентов. Здесь в качестве примера приведены результаты четырех различных сывороток. Для статистического анализа использовался парный t-тест. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; p ≤ 0,001; p ≤ 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Потенциальные вопросы и устранение неполадок | Решение |
| Изменчивость анализа из-за измененной реакции клеток | Убедитесь, что число циклов прохождения клеток не превышает 20-30 проходов. Делайте замороженные запасы на ранних проходах для будущих экспериментов. |
| Скорее полагаться на биологические реплики (использование различных сывороток), чем на технические. | |
| Сыворотки содержат низкие уровни специфического IgE | Можно использовать более низкое конечное разведение сыворотки (т.е. 1:10) вместо 1:20. И наоборот, сыворотки, содержащие высокие уровни специфического IgE, могут быть дополнительно разбавлены (1:30 или 1:40). |
| Недостаточно клеток для выполнения анализа | Убедитесь, что слияние в колбе Т-75 составляет около 50-90%. Проходите больше колбы. |
| Цитотоксические эффекты сывороток, т. е. обусловленные неполной комплемент-инактивацией | Выполните анализ жизнеспособности клеток в дополнение к анализу высвобождения медиатора. Увеличить концентрацию Ag8, чтобы избежать неполной инактивации комплемента. |
| Низкий сигнал | Улучшить отношение сигнал/шум анализа путем разбавления буфера 1x Тирода в оксиде дейтерия (D2O) вместо dH2O или путем использования сыворотки с более высокими уровнями Специфического IgE для интересующего аллергена. |
| Аллерген не стабилен в буфере Тирода (например, осадки) | Перед процедурой анализа провести тесты на стабильность в 1x буфере Tyrode. Замена буфера Tyrode не рекомендуется. |
| Проблемы с поиском правильной начальной концентрации для соответствующего аллергена | Адаптация серий разбавления для покрытия полной кривой высвобождения (больше ступеней разбавления, разбавление 1:20 вместо 1:10). |
| Плохая производительность анализа, обозначенная низким/нет сигналом | Избегайте цитотоксических эффектов от стимуляции сывороток или антигенов (например, ферментативных аллергенов). Тщательно вымойте и замочите клетки. Избегайте слишком длительного воздействия воздуха и предотвращайте высыхание клеток. |
| Как узнать, достигнуто ли нижнее сигнальное плато? | Добавьте элементы управления «без антигена» на свою тарелку. Это сенсибилизированные клетки, которые стимулировались только 1x буфером Тирода, но без аллергена. |
| Нужен ли положительный контроль в дополнение к максимальным лизисным скважинам? | В качестве дополнительного положительного контроля может быть использована комбинация сыворотки и антигена, которая, как известно, вызывает дегрануляцию, или антитело против FcεR1. |
| Сколько скважин мне нужно? | Это зависит от вашей серии титрования, количества антигенов и сывороток, которые вы хотите проанализировать. Спланируйте расположение плит с 96 скважинами в соответствии с тем, сколько сывороток / антигенов вы собираетесь протестировать. Не забудьте добавить «контроль без антигена», фоновые клетки (несенсибилизированные, нестимулированные), а также максимальные лизисные колодцы. |
| Сколько сывороток следует протестировать? И нужны ли мне реплики? | Хотя анализ довольно надежен, существует некоторая изменчивость анализа из-за измененной реакции клеток. Поэтому рекомендуется скорее полагаться на биологические реплики (с использованием различных сывороток), чем на технические реплики. Минимум восьми различных сыворосок достаточно для анализа аллергенов. Однако, как показано на рис.4В, значительные результаты уже можно получить, используя меньшее количество сывороосин. |
Таблица 1: Устранение неполадок.
Discussion
Описанный в настоящем описании анализ высвобождения медиатора на основе клеток huRBL является надежным методом, который может быть легко выполнен и реализован в любой лаборатории. Единственное требование заключается в том, что клетки должны культивироваться в стерильных условиях. Анализ используется для оценки вероятности того, что аллерген или аллергенный источник вызовет у пациентов IgE-сшивание и базофильная дегрануляция17. Анализ может быть легко адаптирован к любому аллергену или аллергену, если доступна сыворотка пациента с высоким уровнем специфического IgE, распознавая интересующих аллерген. Рекомендуется проводить анализ жизнеспособности клеток в дополнение к анализу высвобождения медиатора, чтобы учесть любые потенциальные цитотоксические эффекты, которые могут привести к плохой производительности анализа. Это может быть связано с неполной инактивацией комплемента сывороток или другими сывороточными цитотоксическими эффектами. Даже сам антиген, например, из-за протеолитической / ферментативной активности, может нанести вред клеткам huRBL. Мы обычно используем анализ жизнеспособности клеток с помощью MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида) для оценки потенциальных цитотоксических эффектов. Анализ может быть легко выполнен с клетками huRBL, оставшимися после того, как супернатант клетки был собран и передан (см. шаг 6.3. протокола). По сравнению с другими иммунохимическими методами, такими как ИФА и вестерн-блоттинг, для определения аллергенального потенциала как отдельных аллергенов, либо сложных экстрактов на основе связывания аллергена-IgE, этот анализ может обнаружить не только связывание IgE с аллергеном, но также может измерить функциональность как человеческого IgE, так и аллергена, чтобы спровоцировать IgE-опосредованную базофильную дегрануляцию18. Таким образом, он может помочь в изучении тяжести аллергических симптомов ex vivo с использованием сывороток пациентов. Сообщается, что анализ более последовательный и эффективный, чем классические пассивные тесты на анафилаксию кожи, поскольку в анализе используются клетки RBL-2H3, которые относительно просты в обращении и дают меньшую изменчивость результатов по сравнению с первичными клетками, такими как тучные клетки или базофилы человека19,20. В дополнение к этому, анализ обеспечивает хорошее представление о биологической активности аллергенов и может точно оценить общее содержание аллергенов в данном сложном образце3. Для устранения неполадок определенных шагов в протоколе, пожалуйста, обратитесь к таблице 1.
Что касается применимости этой версии анализа высвобождения медиатора, она в основном использовалась в исследовательских целях, а также для стандартизации аллергенных экстрактов на основе их биологической активности. Сюда входит анализ различных партий растворов ППТ, провокационно-тестового раствора, а также экстрактов, используемых для аллерген-специфической иммунотерапии; как показано для пыльцы, кошачьей похотли, клеща домашней пыли и экстрактов арахиса, а также пчелиного яда3,17,21. Метод может быть применен особенно при диагностике пищевой аллергии, так как он может обнаруживать даже минимальное количество аллергенных компонентов в сложных пищевых продуктах, таких как арахис, молоко, пшеница и яйца22. В этом отношении также сообщалось как ценный инструмент для оценки аллергенности пищевых аллергенов животных, таких как тропомиозины, и может помочь в различении сильнодействующих аллергенов от неаллергенов23. В качестве исследовательского инструмента анализ используется для изучения влияния пищевой промышленности, а также для оценки влияния связывания лигандов с аллергенами и его влияния на аллергенность24,25. Например, было показано, что связывание Bet v1 с лигандами не влияет на сшивку аллерген-IgE, хотя и вызывает увеличение его тепловой и протеолитической стабильности25. Анализ может быть использован для сравнения реактивности пациента на незначительные и основные аллергены, а также для исследования перекрестной реактивности гомологов и изоформ аллергенов, как показано в нашем примере с использованием Bet v1 и гомологичного пищевого аллергена Cor a 1(рисунок 3). Что касается изоформ аллергенов, то для идентификации основного аллергена Amb a 1.01 был использован анализ высвобождения медиатора как наиболее мощной IgE-реакционноспособной изоформы в пыльце амброзии(Ambrosia artemisiifolia). Для сравнения, две другие идентифицированные изоформы в экстрактах пыльцы амброзии, Amb a 1,02 и Amb 1,03, показали снижение реактивности к IgE26пациентов.
В последние годы анализ был применен для изучения потенциальных противоаллергических соединений и новых гипоаллергенных вариантов аллергенов, помогая в идентификации подходящих кандидатов для аллерген-специфической иммунотерапии27,28. Другим новым подходом является использование анализа для мониторинга эффективности лечения в ходе аллерген-специфической иммунотерапии. В связи с этим наша исследовательская группа разработала систему ингибирования анализа huRBL, которая хорошо коррелирует со снижением симптоматической оценки пациента во время аллерген-специфической иммунотерапии29. Анализ также был предложен для изучения иммуносупрессивных эффектов TGFβ1 на аллерген-индуцированную IgE-опосредованную дегрануляцию30.
Ограничения анализа заключаются в том, что, хотя клетки huRBL обладают некоторыми особенностями тучных клеток или базофилов, они не полностью имитируют естественную функцию этих эффекторных клеток. Например, тучные клетки широко экспрессирует рецептор распознавания образов Toll-подобный рецептор 4 (TLR4), необходимый для распознавания патогенов, тогда как он полностью дефицитен в клетках RBL-2H331. Из-за этой разницы в функциональности анализ не полностью имитирует реальную ситуацию, которую необходимо иметь в виду при интерпретации данных. Кроме того, поскольку клетки huRBL являются раковыми базофильными клетками, изменения условий культивирования и длительное культивирование могут привести к фенотипическим различиям, приводящим к изменению результатов среди различных лабораторий20. Другим аспектом является выбор концентрации аллергена, который должен быть принят во внимание при адаптации этого метода, поскольку высокие концентрации аллергенов могут привести к не-IgE опосредороженной дегрануляции из-за присутствия большого количества протеаз или эндотоксинов18. Другими ограничениями являются зависимость от человеческих сывороток с относительно высокими удельными уровнями IgE (класс RAST 5-6) и потребность в системах клеточных культур, которая остается препятствием, которое необходимо преодолеть, чтобы внедрить технику в повседневную клиническую рутину.
Помимо этих ограничений, анализ huRBL представляет собой ценный исследовательский инструмент для диагностики и лечения аллергических заболеваний и может использоваться в широком спектре применений.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить профессора д-ра Стефана Витса из отделения молекулярной аллергологии, Paul-Ehrlich-Institut, Ланген, Германия, за предоставление гуманизированных / FcεRI-трансфебрифицированных RBL клеток и за его согласие на написание этой методологии исследования. Мы хотим поблагодарить профессора д-ра Фатиму Феррейру за отличную обратную связь. Мы также хотели бы поблагодарить профессора д-ра Рональда ван Ри и д-ра Яапа Аккердааса из Департамента экспериментальной иммунологии Медицинских центров Амстердамского университета, место расположения AMC, Амстердам, Нидерланды, за их согласие на публикацию репрезентативных данных, представленных в этой работе по методам, которые были получены в ходе проекта BM4SIT - инновации для аллергии (www.BM4SIT.eu). Работа авторов была поддержана Австрийским научным фондом (проект P32189), приоритетной программой Университета Зальцбурга Allergy-Cancer-BioNano Research Centre, докторской программой Immunity in Cancer and Allergy-ICA, финансируемой Австрийским научным фондом (FWF W01213), и проектом BM4SIT (номер гранта 601763) из Седьмой рамочной программы Европейского союза FP7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | M2133 | |
| 96-well plate for huRBL cells (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, flat-bottom microplate) | ThermoFisher Scientific | 167008 | |
| 96-well plate for substrate solution and cell supernatant (Greiner Bio-One non-treated 96-well microplates) | Fisher Scientific | 655101 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 10735078001 | |
| Citric acid | Applichem | 131018 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS without calcium and magnesium) | Sigma | D8537 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Glycine | Applichem | A3707 | |
| Heat-inactivated fetal calf/bovine serum (FCSi) | Sigma | F0804 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, with ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | M8042 | |
| Opti-MEM reduced serum medium, GlutaMAX supplement | Gibco/ThermoFisher Scientific | 51985034 | |
| Penicillin-Streptomycin (10K units Pen. 10 mg/mL Strep.) | Sigma | P4333 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Applichem | A2942 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Applichem | 131638 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | 59418C | |
| Tyrode’s salt | Sigma | T2145 |
References
- Curin, M., et al. Next-generation of allergen-specific immunotherapies: molecular approaches. Current Allergy and Asthma Reports. 18 (7), 39 (2018).
- Okamoto-Uchida, Y., et al. Different results of IgE binding- and crosslinking-Based allergy tests caused by allergen immobilization. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 39 (10), 1662-1666 (2016).
- Vogel, L., Lüttkopf, D., Hatahet, L., Haustein, D., Vieths, S. Development of a functional in vitro assay as a novel tool for the standardization of allergen extracts in the human system. Allergy. 60 (8), 1021-1028 (2005).
- Ocmant, A., et al. Basophil activation tests for the diagnosis of food allergy in children. Clinical and Experimental Allergy. 39 (8), 1234-1245 (2009).
- Platts-Mills, T. A. The role of immunoglobulin E in allergy and asthma. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (8), Pt 2 1-5 (2001).
- Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nature Medicine. 18 (5), 693-704 (2012).
- Lawrence, M. G., et al. Half-life of IgE in serum and skin: Consequences for anti-IgE therapy in patients with allergic disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (2), 422-428 (2017).
- Draber, P., Halova, I., Polakovicova, I., Kawakami, T. Signal transduction and chemotaxis in mast cells. European Journal of Pharmacology. 778, 11-23 (2016).
- Peebles, R. S. Prostaglandins in asthma and allergic diseases. Pharmacology & Therapeutics. 193, 1-19 (2019).
- Cyphert, J. M., et al. Allergic inflammation induces a persistent mechanistic switch in thromboxane-mediated airway constriction in the mouse. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (1), 140-151 (2012).
- Méndez-Enríquez, E., Hallgren, J. Mast cells and their progenitors in allergic asthma. Frontiers Immunology. 10, 821 (2019).
- Demoly, P., Lebel, B., Arnoux, B.
- Yamaga, S., et al. Decreased intracellular histamine concentration and basophil activation in anaphylaxis. Allergology International. 69 (1), 78-83 (2020).
- Huang, L., et al. A rapid and sensitive assay based on particle analysis for cell degranulation detection in basophils and mast cells. Pharmacological Research. 111, 374-383 (2016).
- González-Pérez, R., Poza-Guedes, P., Barrios Del Pino, Y., Matheu, V., Sánchez-Machín, I. Evaluation of major mite allergens from European standardized commercial extracts for in vivo diagnosis: addressing the need for precision medicine. Clinical and Translational Allergy. 9, 14 (2019).
- Focke, M., Marth, K., Valenta, R. Molecular composition and biological activity of commercial birch pollen allergen extracts. European Journal of Clinical Investigation. 39 (5), 429-436 (2009).
- Hoffmann, A., Vieths, S., Haustein, D. Biologic allergen assay for in vivo test allergens with an in vitro model of the murine type I reaction. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 99 (2), 227-232 (1997).
- Sun, N., Zhou, C., Zhou, X., Sun, L., Che, H. Use of a rat basophil leukemia (RBL) cell-based immunological assay for allergen identification, clinical diagnosis of allergy, and identification of anti-allergy agents for use in immunotherapy. Journal of Immunotoxicology. 12 (2), 199-205 (2015).
- Kaul, S., Hoffmann, A. Mediator release assay of rat basophil leukemia cells as alternative for passive cutaneous anaphylaxis testing (PCA) in laboratory animals. Altex. 18 (1), 55-58 (2001).
- Passante, E., Frankish, N. The RBL-2H3 cell line: its provenance and suitability as a model for the mast cell. Inflammation Research. 58 (11), 737-745 (2009).
- Kaul, S., et al. Mediator release assays based on human or murine immunoglobulin E in allergen standardization. Clinical and Experimental Allergy. 37 (1), 141-150 (2007).
- Huang, J., et al. Application of in vitro and in vivo models in the study of food allergy. Food Science and Human Wellness. 7 (4), 235-243 (2018).
- Klueber, J., et al. Homologous tropomyosins from vertebrate and invertebrate: Recombinant calibrator proteins in functional biological assays for tropomyosin allergenicity assessment of novel animal foods. Clinical and Experimental Allergy. 50 (1), 105-116 (2020).
- Zhang, T., et al. Different thermal processing effects on peanut allergenicity. Journal of the Science of Food and Agriculture. 99 (5), 2321-2328 (2019).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Wolf, M., et al. Amb a 1 isoforms: Unequal siblings with distinct immunological features. Allergy. 72 (12), 1874-1882 (2017).
- Eichhorn, S., et al. Rational design, structure-activity relationship, and immunogenicity of hypoallergenic Pru p 3 variants. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (18), 1900336 (2019).
- Abd Rani, N. Z., et al. Mechanistic studies of the antiallergic activity of phyllanthus amarus Schum. and Thonn. and its compounds. Molecules. 26 (3), (2021).
- Huber, S., et al. Does clinical outcome of birch pollen immunotherapy relate to induction of blocking antibodies preventing IgE from allergen binding? A pilot study monitoring responses during first year of AIT. Clinical and Translational Allergy. 8 (1), 39 (2018).
- Araujo, G. R., et al. TGFβ1 mimetic peptide modulates immune response to grass pollen allergens in mice. Allergy. 75 (4), 882-891 (2020).
- Passante, E., Frankish, N. Deficiencies in elements involved in TLR4-receptor signalling in RBL-2H3 cells. Inflammation Research. 59, Suppl 2 185-186 (2010).
