Summary
기생 선충류 Strongyloides stercoralis 및 Strongyloides ratti 에 대한 기능적 게놈 툴킷에는 트랜스제네시스, CRISPR/Cas9 매개 돌연변이유발 및 RNAi가 포함됩니다. 이 프로토콜은 성선 내 미세주사를 사용하여 전이유전자 및 CRISPR 성분을 S. stercoralis 및 S. ratti에 도입하는 방법을 입증할 것이다.
Abstract
Strongyloides 속은 Strongyloides stercoralis 및 Strongyloides ratti를 포함하여 다양한 숙주 범위를 가진 여러 종의 피부 침투 선충류로 구성됩니다. S. stercoralis는 약 610 만 명의 사람들을 감염시키는 인간 기생충, 피부 침투 선충류이며, 쥐 기생충 S. ratti는 S. stercoralis와 밀접한 관련이 있으며 종종 S. stercoralis의 실험실 모델로 사용됩니다. S. stercoralis 및 S. ratti 둘 다 성선 내 미세주사의 외인성 핵산 전달 기술을 통해 트랜스제닉 및 녹아웃의 생성에 쉽게 적응할 수 있으며, 따라서 아직이 기술에 적용 가능하지 않은 다른 기생충에 대한 모델 시스템으로 부상했습니다.
기생충 Strongyloides 성인은 숙주의 소장에 서식하며 대변을 통해 자손을 환경으로 방출합니다. 일단 환경에 들어가면, 애벌레는 배설물에 살고 새로운 숙주를 찾아 침략해야하는 자손을 생산하는 자유 생활 성인으로 발전합니다. 이러한 환경 생성은 Strongyloides 종에 고유하며 C. elegans를 위해 개발 된 기술이 성선 내 미세 주사를 포함하여 이러한 기생충 선충류와 함께 사용하도록 적응 될 수있는 모델 자유 살아있는 선충류 Caenorhabditis elegans 와 형태학적으로 충분히 유사합니다 . 성선 내 미세주사를 사용하여, 매우 다양한 전이유전자가 스트롱실로이드에 도입될 수 있다. CRISPR / Cas9 성분은 또한 돌연변이 Strongyloides 애벌레를 만들기 위해 미세 주입 될 수 있습니다. 여기에서, 자유 생존 성인의 제조, 주사 절차 및 트랜스제닉 자손의 선택을 포함하는 스트롱실로이드 로의 성선 내 미세주사의 기술이 기재되어 있다. CRISPR/Cas9 돌연변이유발을 사용하여 만든 형질전환 스트롱실로이드 유충의 이미지가 포함되어 있습니다. 이 논문의 목적은 다른 연구자들이 미세 주입을 사용하여 트랜스제닉 및 돌연변이 스트롱 틸로이드를 만들 수있게하는 것입니다.
Introduction
스트롱실로이드 스테로이드는 더 널리 알려진 갈고리벌레 및 회충 Ascaris lumbricoides1에 비해 중요한 인간 병원체로서 오랫동안 간과되어 왔다. 웜 부담에 대한 이전의 연구는 종종 S. stercoralis 2에 대한 일반적인 진단 방법의 민감도가 낮기 때문에 S. stercoralis의 유병률을 심각하게 과소 평가했습니다. 최근 몇 년 동안, 개선 된 진단 도구에 기초한 역학 연구는 S. stercoralis 감염의 진정한 유병률이 이전에보고 된 것보다 훨씬 높다고 추정했다(전 세계적으로 약 610 만 명).
밀접한 관련이 있는 쥐 기생충과 일반적인 실험실 모델 S. ratti를 포함한 S. stercoralis 및 다른 Strongyloides 종은 모두 기생 및 자유 생활 (환경) 세대 3으로 구성되어 있기 때문에 실험 게놈 연구에 유리한 비정상적인 수명주기를 가지고 있습니다 (그림 1). 특히, S. stercoralis와 S. ratti 모두 단일 자유 생활 세대를 통해 순환 할 수 있습니다. 자유 생활 세대는 자유롭게 사는 성인 남성과 여성으로 발전하는 기생 후 애벌레로 구성됩니다. 자유롭게 사는 성인의 모든 자손은 감염성 애벌레로 발전하며, 이는 수명주기를 계속하기 위해 숙주를 감염시켜야합니다. 또한,이 환경 또는 자유 생활 세대는 실험실에서 실험적으로 조작 될 수 있습니다. 자유 생활 Strongyloides 성인과 C. elegans 성인은 유사한 형태를 공유하기 때문에 원래 C. elegans를 위해 개발 된 성선 내 미세 주사와 같은 기술은 자유 생활 성인 Strongyloides 4,5와 함께 사용하도록 적용 할 수 있습니다. DNA는 일반적으로 자유 생활 성인 여성에게 도입되지만, 스트롱 틸로이드의 남성과 여성 모두 미세 주입 될 수 있습니다6. 따라서, 기능적 게놈 도구는 스트롱실로이드의 생물학의 많은 측면을 심문하기 위해 이용가능하다. 다른 기생 선충류는 자유 생존 세대가 부족하고, 결과적으로 기능적 게놈 기술에 쉽게 적응할 수 없다3.
그림 1: 스트롱실로이드 스테로이드 수명주기. S. stercoralis 기생 암컷은 포유류 숙주 (인간, 비 인간 영장류, 개)의 소장에 서식합니다. 기생 여성은 분파 발생에 의해 번식하고 소장 내에 알을 낳습니다. 알은 숙주 안에있는 동안 부화하여 기생 후 애벌레로 변한 다음 대변이있는 환경으로 전달됩니다. 기생 후 애벌레가 수컷 인 경우, 그들은 자유롭게 사는 성인 남성으로 발전합니다. 기생 후 유충이 암컷 인 경우, 자유 생활 성인 암컷 (간접 발달) 또는 3 단계 감염성 유충 (iL3s; 직접 발달)으로 발전 할 수 있습니다. 자유롭게 사는 남성과 여성은 성적으로 번식하여 iL3가되도록 제한받는 자손을 만듭니다. 특정 조건 하에서, S. stercoralis는 또한 대변의 환경으로 통과하기보다는 기생 후 유충 중 일부가 숙주 장 내부에 남아있는 자동 감염을 겪을 수 있습니다. 이 유충은 숙주 내부에서자가 감염 유충 (L3a)으로 발전하여 장 벽을 관통하고 신체를 통해 이동하며 결국 장으로 돌아와 생식 성인이 될 수 있습니다. S. ratti의 수명주기는 S. ratti가 쥐를 감염시키고 자동 감염주기가 없다는 점을 제외하고는 유사합니다. 환경 생성은 유전 연구에 Strongyloides 종을 사용하는 열쇠입니다. 자유 생존 성인 여성 (P0)은 미세 주입 될 수있다; 모두 iL3s가 될 그들의 자손은 잠재적 인F1 트랜스제닉입니다. 이 그림은 Castelletto et al.에서 수정되었습니다. 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
S. stercoralis는 숙주 침범 및 숙주 면역 조절을 포함한 다른 위장 인간 기생 선충류와 생물학의 많은 측면을 공유합니다. 예를 들어, Necator 및 Ancylostoma 속의 인간 기생 갈고리 벌레는 또한 피부 침투에 의해 감염되고, 신체를 통해 유사하게 탐색하며, 궁극적으로 소장7에서 기생 성인으로 거주합니다. 따라서 많은 위장 선충류는 일반적인 감각 행동과 면역 회피 기술을 사용할 가능성이 큽니다. 결과적으로, Strongyloides 에서 수집 된 지식은 유전적으로 덜 다루기 쉬운 다른 선충류의 발견을 보완하고 이러한 복잡하고 중요한 기생충에 대한보다 완전한 이해로 이어질 것입니다.
이 미세 주입 프로토콜은 트랜스제닉 및 돌연변이 자손을 만들기 위해 Strongyloides 자유 생활 성인 여성에게 DNA를 도입하는 방법을 설명합니다. 미세주사를 위한 성인 웜의 발달 시기 및 형질전환 자손의 수집을 포함하는 균주 유지 요건이 설명된다. 프로토콜 및 완전한 미세 주입 기술의 시연과 함께 트랜스제닉 자손을 배양하고 스크리닝하기위한 프로토콜이 포함되어 있으며 필요한 모든 장비 및 소모품 목록이 포함되어 있습니다.
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Protocol
참고 : Gerbils는 S. stercoralis를 통과시키는 데 사용되었고, 쥐는 S. ratti를 통과시키는 데 사용되었습니다. 모든 절차는 AAALAC 표준 및 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드를 준수하는 UCLA 동물 연구 감독 사무소 (프로토콜 번호 2011-060-21A)의 승인을 받았습니다. 웜 배양, 미세 주입 패드 준비, 미세 주입 믹스 구축, 박테리아 (대장균 HB101)를 6cm 선충류 성장 배지 (NGM) 플레이트8에 확산시키는 작업은 적어도 하루 전에 완료해야합니다. 자유 생존 여성은 미세 주입되기 전에 젊은 성인으로 발전하기 위해 25 °C에서 최소 24 시간의 분변 후 수집이 필요합니다. 미세주입 패드는 완전히 건조해야 합니다. 박테리아 판은 건조하고 작은 잔디밭을 만들어야합니다.
1. 미세 주입 슬라이드의 제조 : 적어도 주입 전 하루 전
참고: 웜은 주입을 위해 건조한 한천 패드가 있는 미세주입 커버슬립에 장착됩니다.
- 히트 블록을 90°C로 설정하십시오.
- 5 mL의ddH2O를 첨가한 다음, 100mg의 아가로스를 보로실리케이트 유리 튜브에 첨가한다.
- 튜브의 아가로스 믹스를 화염 위로 가열하여 아가로스가 용해 될 때까지 가열하십시오.
- 튜브를 90°C에서 설정된 열 블록에 두어 아가로스를 액체 상태로 유지시킨다.
- ~180 μL의 아가로스 용액을 유리 파스퇴르 피펫 또는 플라스틱 팁이 있는 피펫을 사용하여 커버슬립 상에 떨어뜨린다. 즉시 두 번째 커버 슬립을 위에 떨어 뜨려 아가로스를 얇은 패드로 평평하게하십시오.
- 5-10 초 후에 두 개를 밀어 상단 커버 슬립을 제거하십시오. 한천 패드가 어느 슬라이드에 있는지 확인하고 위로 향하게 눕히십시오.
- 깨진 커버슬립에서 작은 유리 파편을 선택하고 포셉을 사용하여 패드의 상단 가장자리 근처의 한천으로 부드럽게 누릅니다(보충 그림 S1).
- 아가로스 용액으로 미세 주입 패드를 계속 만드십시오.
- 아가로스 패드를 벤치나 오븐에서 하룻밤 동안 말리십시오. 커버슬립 박스에 보관하십시오.
참고: 아가로스 패드는 최대 2개월 동안 사용할 수 있지만 한 번의 주사 실행에만 사용할 수 있습니다.
2. 미세 주입을위한 웜을 얻기 위해 스트롱 틸로이드 배양 : 주사 1 - 2 일 전
참고 : 균주 유지 프로토콜은 게르빌 및 쥐를 선충류로 감염시키고 감염된 동물의 대변에서 선충류를 수확하는 방법에 대한 자세한 설명을 포함하는 보충 자료에서 찾을 수 있습니다.
- 주사 이틀 전에, 감염된 동물 9,10마리를 하룻밤 사이에 수집 케이지에 넣는다.
- 다음날 아침, 감염된 대변을 모으고 분변 숯 플레이트를 9,10으로 만드십시오.
- 플레이트를 25°C에서 24시간 동안 두어 자유 생활 웜이 젊은 성인으로 발전할 수 있도록 합니다.
- 주사 하루 전날 밤, 감염되지 않은 숙주 동물을 수집 케이지에 넣으십시오.
- 주입 당일에는 주입 후 재배를 위해 감염되지 않은 대변을 수집하십시오.
3. 미세 주사 믹스 만들기 : 주사 전 또는 당일
참고: 미세주입 믹스는 웜 완충 식염수(BU)(50 mM Na2HPO4,22 mM KH2PO4, 70 mM NaCl)11에서 원하는 농도로 희석된 관심있는플라스미드로 구성된다.
- 마이크로주입 믹스에서 플라스미드 스톡의 농도 및 원하는 농도를 결정한다(표 1).
| 미세주입 믹스: 리포터 컨스트럭트 | |||
| 구성 요소 | 재고 집중 | 분량 | 최종 집중 |
| pMLC30 gpa-3::gfp | 300 ng/μL | 1.7 μL | 50 ng/μL |
| 부 | 나 | 8.3 μL | 나 |
| 합계 | 10 μL | 50 ng/μL | |
| 미세주입 믹스: CRISPR/Cas9 돌연변이유발 | |||
| 구성 요소 | 재고 집중 | 분량 | 최종 집중 |
| pMLC47 tax-4 sgRNA | 300 ng/μL | 2.7 μL | 80 ng/μL |
| pEY11 Ss-tax-4 HDR 플라스미드 | 400 ng/μL | 2.0 μL | 80 ng/μL |
| pPV540 strCas9 플라스미드 | 350 ng/μL | 1.1 μL | 40 ng/μL |
| 부 | 나 | 4.2 μL | 나 |
| 합계 | 10 μL | 200 ng/μL | |
| 마이크로 주입 믹스 : piggyBac 통합 | |||
| 구성 요소 | 재고 집중 | 분량 | 최종 집중 |
| pMLC30 gpa3::gfp | 300 ng/μL | 2.0 μL | 60 ng/μL |
| pPV402 트랜스포사제 플라스미드 | 450 ng/μL | 0.9 μL | 40 ng/μL |
| 부 | 나 | 7.1 μL | 나 |
| 합계 | 10 μL | 100 ng/μL | |
표 1: 미세주입 믹스의 예. 플라스미드 및 농도는 3가지 예를 들어 미세주입 믹스: 하나는 gpa-3::GFP 리포터 작제물 10, 하나는 Ss-tax-4 유전자좌 14,15의 CRISPR/Cas9-매개된 파괴, 및 Ss-gpa-3::GFP 작제물 13,17,18의 piggyBac-매개된 통합을 위한 것이다. strCas9는 스트롱실로이드 코돈-최적화된 Cas9 유전자를 나타낸다. 나열된 최종 농도는 Strongyloides 미세 주입 믹스에 일반적으로 사용됩니다.
- 플라스미드를 BU에 10-20 μL의 총 부피로 희석한다.
- 믹스를 필터 컬럼을 통해 5,000 × g 에서 1-2분 동안 회전시킨다.
- 미세주입 믹스를 즉시 사용하거나 나중에 사용하기 위해 -20°C에 보관하십시오.
4. 미세 주사를 위해 젊은 성인 Strongyloides를 수집하십시오 : 주사 일의 아침
- 젊은 성인 스트롱실로이드 의 분변 숯 플레이트 1개로 Baermann 장치를 설치하십시오(그림 2).
참고 : 분변 숯 플레이트에는 감염성 유충이 포함될 수 있습니다. 개인 보호 장비는 실험실 코트, 장갑 및 눈 보호로 구성됩니다. 장갑과 실험실 코트의 슬리브 사이에 피부가 노출되어서는 안됩니다.
그림 2: 배양물10에서 기생 웜을 수집하는 데 사용되는 Baermann 장치. 분변 - 숯 판의 내용물은 따뜻한 물 기둥의 상단에 배치됩니다. 웜은 물로 이동하여 깔때기 바닥에 모입니다. (A) Baermann 장치를 설치하기 위해 Baermann 깔때기의 스탠드는 C 클램프로 벤치에 고정됩니다. 깔때기 끝에 부착 된 고무 튜브는 핀치 클램프로 닫히고 물방울을 위해 튜브 아래에 캐치 버킷이 배치됩니다. 따뜻한 물이 유리 깔때기에 추가됩니다. (B) 분변 - 숯 믹스의 플라스틱 링 홀더는 실험실 조직 3 개로 줄 지어 있습니다 (왼쪽). 나무 막대기 또는 혀 감압기 (중간)는 분변 숯 판 (오른쪽)의 내용물을 플라스틱 링 홀더로 옮기는 데 사용됩니다. (C) 분변 - 숯 믹스를위한 플라스틱 링 홀더의 바닥을 클로즈업하여 홀더의 바닥을 감싸는 나일론 툴레의 이중층을 보여줍니다. (D) 분변-숯 홀더는 유리 깔때기의 상부에 배치된다. (E) 실험실 조직은 물로 적셔서 분변 - 숯 믹스 위에 닫힌다. 더 따뜻한 물이 배설물 - 숯을 대부분 잠수시키기 위해 첨가됩니다. (F) 배설물 - 숯 문화가 따뜻한 물 속에 잠겨있는 완전한 Baermann 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- O 링을 사용하여 링 스탠드에 고무 수집 튜브가있는 유리 깔때기를 설치하고 클램프로 고정하십시오. 2개의 핀치 클램프로 수집 튜브를 닫습니다(그림 2A).
- 깔때기 아래에 캐치 버킷을 놓아 물방울을 잡으십시오.
- 깔때기에 따뜻한 물(약 40°C)을 림 아래 5cm까지 추가합니다. 시스템이 새지 않는지 확인합니다.
- Baermann 홀더를 줄 지어 2 개의 플라스틱 링으로 만든 체로 나일론 툴레 그물 2 층이 그 사이에 고정되어 있으며 3 개의 겹치는 실험실 조직 조각이 있습니다. 분변-숯 혼합물을 Baermann 홀더에 첨가하십시오(그림 2B,C).
- 배설물 - 숯 혼합물이있는 Baermann 홀더를 깔때기에 놓습니다. 분변 - 숯 믹스 주위의 조직을 접고 분변 - 숯의 대부분을 잠수하기에 충분한 물을 첨가하십시오. 깔때기 테두리에서 2cm 이상 채우지 마십시오(그림 2D,E).
- 깔때기를 15cm 플라스틱 페트리 접시 뚜껑으로 덮어 냄새를 억제하십시오. 필요에 따라 깔때기에 레이블을 지정합니다(그림 2F).
- Baermann 장치에서 웜을 수집하기 위해 30 분에서 1 시간 정도 기다리십시오.
- 깔때기 바닥의 고무 튜브 아래에 50mL 원심분리 튜브를 잡으십시오. 바닥에있는 클램프를 조심스럽게 열어 웜이 들어있는 물 30-40 mL를 50 mL 튜브에 분배하십시오.
- 웜이 포함된 Baermann 물 15 mL를 15 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 15 mL 원심분리 튜브를 ∼750 × g에서 1분 동안 회전 시킨다(느림). 또는 웜이 중력에 10-15 분 동안 정착하도록하십시오.
- ~ 2 mL의 상층액을 제거하고 상층액을 요오드가 함유 된 폐액 용기에 버려 웜을 죽입니다.
- 15mL 수집 튜브에 Baermann 물을 더 넣고 스핀을 반복하십시오. 상층액을 ∼2 mL로 제거하고 단계 4.11에서와 같이 폐기한다.
- 모든 웜이 15 mL 원심분리 튜브에 수집될 때까지 단계 4.11 및 4.12를 반복한다. 마지막 회전 후 가능한 한 많은 물을 제거하십시오.
- 튜브 바닥에있는 웜 펠릿 (40-100 μL)을 검사하십시오. 웜이 보이지 않으면 1-2 시간 더 기다렸다가 Baermann 장치에서 더 많은 웜을 수집하십시오.
- 웜을 가능한 한 적은 물에 담아 대장균 HB101의 잔디밭이 있는 6cm 2% NGM 플레이트로 옮깁니다. 이 플레이트를 미세주입을 위한 소스 플레이트 로서 사용하십시오.
- 분변 - 숯 믹스를 희석 된 요오드 (물에 Lugol의 요오드를 50 % 희석 한 것)로 처리하고 플라스틱 필름에 싸서 물방울을 잡은 다음 생물학적 위험 폐기물 용기에 넣으십시오.
- 희석 된 요오드 10 mL를 캐치 버킷에 넣고 Baermann에서 여분의 물을 배수하십시오.
- 재사용 가능한 구성 요소 (깔때기, 캐치 버킷, 툴레가있는 플라스틱 홀더, 플라스틱 뚜껑 및 클램프)를 10 % 표백제로 씻고 철저히 헹구십시오.
5. 당기고 적재 미세 주입 바늘 : 주사 직전에
- 바늘 풀러를 사용하여 유리 모세관 튜브를 당겨 미세 주입 바늘을 준비하십시오.
참고: 3mm 백금/이리듐 필라멘트가 장착된 상업용 바늘 풀러의 기본 설정은 열 = 810-820, 당김 = 800-820, 마이크로미터 = 2.5입니다. - 해부 현미경으로 팁을보십시오. 바늘이 원하는 모양이면 (그림 3A-F) 4-6 개의 바늘 (2-3 개의 모세관 튜브)을 당깁니다. 적절한 바늘 모양을 얻으려면 필요에 따라 설정을 변경하십시오 : 열 또는 당김 설정을 10으로 조정하고 테이퍼와 샤프트의 모양이 더 적합 할 때까지 새 바늘을 당깁니다.
그림 3: 미세주사 바늘 및 미세주사를 위한 최적의 부위를 가진 스트롱실로이드 스테로이드 성인 여성 확인. (A-F) 미세주사 바늘의 이미지. (A-B) 샤프트 테이퍼(A)와 팁(B)은 미세주입을 위해 정확하게 형상화된 바늘이다. 팁은 큐티클을 관통 할만큼 날카 롭고 과도한 손상을 일으키지 않을 정도로 좁습니다. (C-D) 샤프트 테이퍼(C)와 팁(D)은 미세주입을 위해 잘못 형성된 미세주입 바늘이다. 팁이 너무 무뚝뚝하고 넓어서 웜에 과도한 손상을 줄 수 있습니다. (E-F) 샤프트 테이퍼(E)와 바늘의 팁(F)은 미세주입을 위해 작동하기에는 너무 길고 가느다란 것 같다. F의 팁은 D의 팁과 매우 유사합니다. 그러나 샤프트는 좁고 너무 유연하여 큐티클을 효과적으로 관통 할 수 없습니다. 또한, 매우 가느 다란 바늘이 쉽게 막히게됩니다. (G) 바늘이 오른쪽에서 들어오고 있다고 가정하여 미세 주입을 위해 올바르게 배치 된 전체 웜의 이미지. 앞쪽은 아래로, 왼쪽으로; 외음부는 화살촉으로 표시됩니다. 생식선은 여성의 오른쪽을 따라 볼 수 있습니다. 이 여성은 자궁에 단 하나의 난자 만 가지고 있습니다 (별표로 표시). (H, I) 미세 주사 부위의 확대 된 전망. 화살표의 각도는 주사 바늘의 각도와 비슷합니다. 외음부는 랜드 마크로 사용할 수 있습니다. 그것은 생식선의 팔에서 웜의 반대편에 있습니다. 생식선의 팔은 장 주위를 구부리고 분열 핵이있는 끝은 외음부 반대편에 있습니다. (h) 성선의 후부 팔; (I) 전방 팔. 한쪽 또는 양쪽 팔을 주입 할 수 있습니다. H, I의 경우, 규칙은 G에서와 같습니다. 스케일 바 = 50 μm (B, D, F, H, I); 100 μm (A, C, E, G). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 당겨진 바늘을 15cm 플라스틱 페트리 접시에 압연 테이프 조각으로 보관하여 바늘을 고정하고 팁에 먼지가 쌓이지 않도록하십시오.
- 0.7 μL 방울의 미세주입 믹스를 샤프트의 개방 단부에 놓는다. 바늘을 선반에 수직으로 매달아 압연된 테이프 조각을 사용하여 10분 이내에 믹스로 테이퍼링된 샤프트를 채운다. 첫 번째 바늘이 작동하지 않을 경우를 대비하여 한 번에 2 개의 바늘을 준비하십시오.
6. 현미경 준비 및 바늘 깨기
참고: 미세주입은 바늘의 움직임을 제어하기 위해 미세인젝터 설정이 장착된 5x 및 40x 목표의 반전 현미경을 사용합니다. 거꾸로 된 현미경은 진동 소음을 줄이기 위해 무거운 테이블이나 진동 방지 공기 테이블에 놓아야합니다. 마이크로 인젝터 바늘 홀더는 마이크로 주입 믹스를 전달하는 데 필요한 압력을 가하는 질소 가스에 연결됩니다. 근처의 더 작은 해부 현미경이 웜을 옮기는 데 사용됩니다.
- 바늘을 깨기 위해 가스 탱크 압력을 ~ 40-60 psi로 설정하고 액체 흐름에 따라 미세 주입의 경우 ~ 30-50 psi로 설정하십시오.
- 해부 현미경에서 표준 백금 웜 픽을 사용하여 마이크로 인젝션 패드 커버 슬립의 유리 파편을 할로 카본 오일로 덮으십시오.
- 미세 주입 패드 커버 슬립을 미세 주입 범위에 놓고 오일로 덮인 유리 파편을 찾습니다. 가장자리가 바늘의 방향에 수직이 되도록 유리 파편을 정렬하여 바늘을 부러 뜨리는 데 사용되는 표면 역할을합니다.
- 해부 현미경을 사용하여 바늘에 테이퍼 샤프트에 기포 또는 이물질이 없는지 확인합니다. 그런 다음 바늘을 1-1.5 cm의 가압 홀더에 고정하십시오.
- 바늘의 끝을 현미경 시야의 중앙에 위치시킵니다. 그런 다음 낮은 배율로 바늘 끝을 시야각에 놓고 유리 파편의 측면에 수직으로 놓습니다.
- 고출력으로 전환하고 바늘 끝을 유리 가장자리에 맞 춥니 다. 근처에 있지만 만지지 마십시오.
참고 : 당기면 바늘이 융합되어 닫힙니다. - 액체 흐름을 허용하기 위해 바늘의 끝을 부러 뜨리려면 가스로부터 지속적인 압력을 가하면서 유리 조각의 측면을 부드럽게 누릅니다 (보충 그림 S1). 액체가 흐르기 시작하면 팁의 모양을 확인하고 쉽게 흐르는 액체로 날카로운지 확인하십시오.
참고: 액체가 너무 빨리 흐르거나 끝이 너무 둔한 경우 미세 주입 중에 웜이 손상됩니다(비디오 1 및 그림 3A-F). - 액체가 바늘에서 잘 흐르면 미세 주입 슬라이드를 해부 범위로 옮기고 웜을 배치하기 위해 한천 패드에 1-2 μL 할로 카본 오일 방울을 놓습니다.
- 20-30 명의 젊은 성인 Strongyloides를 박테리아가없는 2 % NGM 플레이트로 적어도 5 분 동안 옮겨 과도한 표면 박테리아를 제거하고 미세 주입을 위해 단일 웜을 선택하십시오. 주입하는 동안 필요에 따라 NGM 플레이트에 더 많은 웜을 추가하십시오.
7. Microinjecting Strongyloides
- 웜 픽에 소량의 할로카본 오일을 사용하여 박테리아가없는 2 % NGM 플레이트에서 생식선에 1-4 개의 알을 가진 Strongyloides 젊은 성인 여성을 선택하십시오.
- 웜을 한천 패드의 작은 기름 방울로 옮기십시오. 웜 픽을 사용하여 웜이 감겨지지 않도록 부드럽게 배치하고 생식선이 보이고 접근하기 쉽습니다. 생식선의 방향을 확인합니다(그림 3G).
- 웜을 미세 주입 현미경 시야에 배치합니다. 생식선이 바늘과 같은 쪽에 있고 바늘이 약간의 각도로 생식선에 닿을 수 있도록 배치하십시오 (그림 3H, I).
- 바늘 끝을 동일한 초점면의 웜 옆으로 가져 오십시오. 웜의 중간 근처의 생식선 팔을 겨냥하십시오. 마이크로 인젝터를 사용하여 바늘을 생식선에 부드럽게 삽입하십시오 (비디오 2).
- 즉시 바늘에 압력을 가하여 전체 생식선 팔을 DNA 용액으로 부드럽게 채 웁니다. 충분한 유체가 주입되었을 때 눈으로 결정하십시오 (비디오 2).
참고 : 생식선을 채우는 데 최대 2 초가 걸릴 수 있습니다. - 바늘을 제거하고 상처가 닫히는지 확인하십시오.
참고: 생식선이 체벽을 통해 돌출되면 웜이 너무 손상되어 자손을 생성하지 못합니다(보충 비디오 S1). - 생식선의 다른 팔이 보이면 반복하십시오.
- 주입이 끝나면 한천 패드에 바늘 끝으로 압력을 가하여 바늘이 막히지 않았는지 신속하게 확인하십시오. 주입 된 웜으로 슬라이드를 해부 현미경으로 옮깁니다.
- 주입 된 웜을 복구하려면 먼저 웜에 BU 몇 방울을 떨어 뜨려 한천 패드에서 떼어냅니다.
- 웜 픽에 소량의 HB101 박테리아를 수집하십시오. 웜 픽의 부착 박테리아로 웜을 터치하여 액체에서 제거하십시오.
- 웜을 HB101 잔디밭이 들어있는 2% NGM 플레이트인 회수 플레이트로 부드럽게 옮깁니다.
참고: 웜은 몇 분 안에 크롤링을 시작해야 합니다. - 몇 마리의 암컷을 주입 한 후 소스 플레이트에서 주입되지 않은 남성을 추가하십시오.
참고 : 다섯 명의 여성을위한 최소 한 명의 남성이 좋은 기준선입니다. 과도한 남성이 선호됩니다. - 실험을 위해 충분한 암컷이 주입 될 때까지 모든 단계를 반복하십시오.
- 웜이 회복되고 짝짓기를 할 수 있도록 주사 후 적어도 1 시간 동안 성인을 회복판에 두십시오.
8. 주입 된 스트롱 틸로이드의 회복 및 배양
- 감염된 동물과 동일한 프로토콜을 사용하여 감염되지 않은 숙주 동물로부터 밤새 대변을 수집하십시오.
- 감염되지 않은 대변을 소량의 숯과 섞으십시오 (이 접시의 경우 대변 대 숯 비율이 약 2 대 1).
- 소량의 분변 - 숯 믹스를 축축한 여과지가 늘어선 6cm 페트리 접시에 붓습니다. 믹스가 접시의 뚜껑에 닿지 않도록하십시오.
- 회수 플레이트를 BU로 넘치십시오. 3 μL로 설정된 피펫을 사용하여 웜을 분변 숯 플레이트의 대변으로 옮깁니다. 숯이 아닌 대변에 벌레를 직접 놓습니다.
- 성인이 해부 범위를 사용하여 분변 숯 접시에 있는지 확인하십시오.
- 웜을 배양하려면 플레이트를 가습 챔버, 즉 젖은 종이 타월이 늘어선 꽉 끼는 뚜껑이있는 플라스틱 상자에 놓습니다.
참고 : 2 일 후, 애벌레 단계가 섞여있을 것입니다. 5 일 후, 대부분의 애벌레는 iL3s로 발전 할 것입니다. 몇 마리의 어린 애벌레가 남아있을 것입니다. 7 일 후, 모든 애벌레는 iL3s이어야합니다.
9. F1 유충을 수집하고 선별하여 형질전환/녹아웃을 회수합니다.
- Baermann 설정을 사용하여 주사 후 소규모 분변 숯 배양 플레이트에서 유충을 수집하십시오. 가능한 한 많은 애벌레를 얻으려면 Baermann 장치에서 웜을 회수하기 전에 적어도 2 시간 동안 기다리십시오.
- 단계 4.10-4.14에서와 같이 15 mL 원심분리 튜브에 유충을 농축시키고 유충을 BU가있는 작은 시계 유리로 옮깁니다.
- 유충이 행동 실험에 사용될 경우, 스크리닝을 위해 HB101의 두꺼운 잔디밭이있는 2 % NGM 플레이트를 사용하십시오.
- 20-30 마리의 유충을 HB101 잔디밭으로 옮깁니다.
참고 : 박테리아는 애벌레의 움직임을 늦출 것입니다. - 형광 해부 현미경으로 관심있는 이식 유전자를 발현하는 유충을 확인하십시오. 웜 픽을 사용하여 형질전환 유충을 선택하고 BU가있는 작은 시계 유리로 옮깁니다.
- 새로운 HB101 플레이트를 사용하여 또 다른 작은 유충 배치를 선별하십시오. 실험적 사용을 위해 충분한 유충을 수집하면 HB101 플레이트와 과도한 웜을 희석 된 요오드 (물에 희석 된 50 % Lugol의 요오드)로 처리하고 생물학적 위험 폐기물로 버리십시오. 대안적으로, 알킬벤질암모늄 클로라이드를 함유하는 농축된 켄넬 클리너를 사용하여 과량의 웜을 죽인다.
- 웜을 즉시 사용하거나 하룻밤 사이에 소량의 BU로 얕은 시계 유리에 두십시오.
참고 : 액체가 너무 깊으면 웜이 저산소가 될 수 있습니다. 밤새 BU에 애벌레를 남겨 두는 것이 특정 행동에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 6 시간 이내에 행동 실험에 애벌레를 사용하십시오.
- 20-30 마리의 유충을 HB101 잔디밭으로 옮깁니다.
- 유충이 행동 분석이 아닌 현미경 검사에 사용될 경우, 니코틴 마비에 의해 웜을 가역적으로 고정시켜 스크리닝하십시오.
- 면도날을 사용하여 10cm 화학주성 플레이트(12 )의 플라스틱 바닥에 격자를 채점하여 플레이트 상의 웜의 위치를 더 쉽게 추적할 수 있도록 한다.
- BU에있는 ~ 3 μL의 유충을 그리드의 사각형에 떨어 뜨립니다. 필요한 만큼 사각형을 채웁니다. 애벌레가 판의 측면으로 기어 갈 수 있으므로 접시의 가장자리 근처의 것들은 사용하지 마십시오.
- 웜 방울에 물에 1 % 니코틴 15-20 μL 방울을 넣으십시오.
참고 : 4 분 후에 웜이 마비됩니다. - 형광 해부 현미경을 사용하여 웜을 선별합니다.
- 웜 픽을 사용하여 트랜스제닉 유충을 1-2mL의 BU가 있는 작은 시계 유리로 옮깁니다.
참고 : 유충은 몇 시간 동안 마비되며 현미경 검사를 위해 현미경 슬라이드에 쉽게 장착 할 수 있습니다. BU에서 밤새 방치하면, iL3s는 회복될 것이고, 일부 검정 또는 포유동물 숙주 감염에 사용될 수 있다. 그러나, 니코틴 마비 및 BU에서의 하룻밤 배양은 특정 행동에 영향을 미칠 수 있다.
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Representative Results
실험이 성공하면,F1 유충은 관심있는 전이유전자 및/또는 돌연변이 표현형을 발현할 것이다(그림 4). 그러나 형질전환 속도는 매우 가변적이며 구성물, 웜의 건강, 주사 후 배양 조건 및 실험자의 기술에 따라 다릅니다. 일반적으로, 성공적인 실험은 주입된 암컷 당 >15 F1 유충을 산출하고 형광 마커에 대해 >3%의 형질전환 속도를 산출할 것이다. 살아있는 자손의 총 수가 평균 10 마리 미만의 애벌레 / 암컷이라면, 그 구조는 독성이 있고 변형 된 유충은 생존하지 못할 수 있습니다. 형광 유충이 아닌 많은 수의 형광 알을 발견하는 것은 주사 혼합이 유독 할 수 있다는 또 다른 표시입니다. 이 기술을 처음 학습할 때는 체벽 근육(13)에서 강력한 표현을 유도하는 act-2::mRFPmars와 같이 잘 표현되는 구조를 사용하는 것이 좋습니다(그림 4).
CRISPR/Cas9 매개된 표적화된 돌연변이유발에 의해 돌연변이를 생성할 때, 형광 9,14,15에 기초하여 잠재적인 돌연변이체가 확인될 수 있도록 act-2::mRFPmars 또는 act-2::GFP 전이유전자 13을 함유하는 복구 주형의 사용을 권장한다. 스트롱실로이드는 염색체 외 어레이로부터의 전이유전자를 발현하기 때문에, 형광F1 자손은 어레이로부터 단독으로 mRFPmars 또는 GFP를 발현하거나 어레이 및 통합된 전이 유전자3,9,16 둘 다로부터 mRFPmars 또는 GFP를 발현할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 형광 발현 패턴에 기초하여 통합된 전이유전자를 가질 가능성이 더 높은 유충을 동정할 수 있다: 체벽 근육에서의 "패치" 발현(도 4A)은 전이유전자가 게놈에 통합되지 않을 때 더 흔한 반면, 체벽 근육 전체에 걸쳐 일관된 발현이 가능하다(도 4B). )는 종종, 항상 그렇지는 않지만, 전이유전자가 게놈에 통합되었음을 나타낸다. 그러나, 발현 패턴만으로는 돌연변이를 결정적으로 식별하는데 사용될 수 없다-체벽 근육 전체에 걸쳐 일관된 발현을 갖는 일부 웜은 통합 이벤트를 갖지 않을 수 있다. 더욱이, 발현 패턴은 동형접합체인 돌연변이체와 이형접합체 또는 모자이크인 돌연변이체를 구별할 수 없다. 따라서, 각 웜은 PCR 유전자형 9,14,15이어야 한다. 쉽게 보이는 표현형을 산출하는 유전자를 파괴 할 때, 복구 주형을 사용할 필요가 없을 수도 있습니다. 예를 들어, Strongyloides unc-22 유전자의 파괴는 이형접합체 또는 동형접합성 파괴의 비율이 10%9 이상인 지배적인 "트위쳐" 표현형을 초래한다.
도 4: 트랜스제닉 스트롱틸로이드 스테로이드 유충. (A, B) 체벽 근육에서 발현하는 Act-2::mRFPmars 트랜스유전자를 발현하는 S. stercoralis 유충13. 전이유전자는 Ss-unc-22 유전자좌 9의 CRISPR/Cas9-매개된 파괴를 위한 복구 주형에 통합되었다. (A) 불완전하거나 "패치"가 있는 S. stercoralis 유충은 염색체 외 어레이로부터의 발현을 나타낼 수 있는 act-2::mRFPmars 발현 패턴을 갖는다. (b) 보다 완전한 act-2::mRFPmars 발현 패턴을 발현하는 S. stercoralis iL3가 복구 주형의 유전자 파괴 및 통합을 나타낼 수 있다. A, B의 경우 패널은 차동 간섭 대비(왼쪽), 형광등(중간) 및 병합(오른쪽) 이미지를 표시합니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1 : 사용 가능한 바늘을 만들기 위해 바늘을 깨는 과정의 데모. 바늘 끝은 유리 파편 (맨 왼쪽의 물체)의 가장자리에 두드리게됩니다. 액체가 나오면 바늘을 뒤로 당겨 한천 위로 내려갑니다. 바늘 끝이 날카로운 지점에 도달하고 액체가 적당히 빠르게 흐릅니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2 : 성공적인 주사의 시연. 생식선의 뒷팔은 오른쪽에 연한 회색 구조로 보입니다. 바늘과 생식선의 끝은 동일한 초점면에 있어야합니다. 바늘이 잡히지 않고 웜 위 또는 아래 또는 몸을 따라 미끄러지면 위치를 조정하십시오. 바늘 끝은 신체 벽을 약간 들여 씁니다. 미세 조작기에 부착 된 바늘 홀더를 빠르게 탭하면 팁이 신체 벽을 통해 생식선으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 바늘이 생식선 안에 있으면 압력을 가하고 DNA 용액을 주입하십시오. 액체는 눈에 띄게 생식선을 범람시켜야합니다. 바늘 끝이 제거 될 때 상처가 닫히면 웜이 생존 할 가능성이 큽니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 물자: Strongyloides 긴장 유지. 이 프로토콜은 쥐의 S. stercoralis 와 쥐의 S. ratti 에 대한 유지 보수 절차를 설명합니다. 그것은 각 선충류 및 숙주에 사용되는 감염 용량을 포함한다. 숙주는 마취하에 피하 주사를 통해 감염됩니다. 개통도에서 피크 애벌레 출력으로의 감염의 진행, 개통성의 상실에 이르기까지 각 선충류-숙주 조합에 대해 기술된다. 감염된 대변을 수집하고 분변 - 숯 재배 판을 만드는 데 사용되는 프로토콜도 설명되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: 미세주사 바늘을 깨뜨리기 위한 작은 유리 파편이 있는 커버슬립 상에 건조된 한천 패드로 구성된 미세주입 슬라이드의 이미지이다. 한천 윤곽선과 샤드 윤곽선이 명확성을 위해 여기에 추가됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 S1 : 손상된 생식선을 초래하는 주사의 데모. 생식선의 앞쪽 팔에 초점이 맞춰져 있습니다. 약간의 압력을 가하면 바늘의 용액이 여전히 자유롭게 흘러 나오고 있음을 알 수 있습니다. 바늘 끝은 생식선과 동일한 초점 평면에 있으며 약간의 각도를 목표로합니다. 바늘 끝이 삽입되면 용액이 웜에 주입되어 생식선을 채 웁니다. 그러나 바늘이 제거되면 생식선 조각이 큐티클의 상처를 통해 튀어 나옵니다. 재료가 눈에 띄게 흘러 나오고 있습니다. 이 웜은 생존 할 가능성이 거의 없습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 미세주입 프로토콜 은 S. stercoralis 및 S. ratti에 트랜스제네시스 및 CRISPR/Cas9 매개 돌연변이유발을 위한 작제물을 도입하는 방법을 상세 히 기술한다. S. stercoralis 및 S. ratti 둘 다에 대해, 주사 후 생존 및 형질감염 또는 돌연변이 유발의 속도는 미세 조정될 수 있는 몇 가지 변수의 적용을 받는다.
성공적인 전이형성을 위한 첫 번째 중요한 고려 사항은 플라스미드 전이유전자가 어떻게 구축되는지입니다. 이전의 연구들은 스트롱실로이드에서 외인성 전이유전자의 발현이 스트롱실로이드 5' 프로모터 및 3' UTR 요소 3,13,19의 사용을 필요로 한다는 것을 발견했다. C. elegans 작제물과 유사하게, 스트롱실로이드 작제물은 일반적으로 Ss-era-1 유전자 13으로부터의 것과 같은 유전자 특이적 프로모터 및 공통3' UTR을 사용한다. 코돈-코딩 영역의 최적화는 또한 스트롱실로이드에서의 발현에 중요할 수 있다. 최근에는 Strongyloides 및 기타 선충류에 대한 코딩 시퀀스를 코돈 최적화하는 웹 기반 앱 인 Wild Worm Codon Adaptor가개발되었습니다 20. 마지막으로, 스트롱실로이드에서 엄격하게 시험되지는 않았지만, 인트론은 C. elegans21 및 곤충 관련 선충류 Pristionchus pacificus22 모두에서 외인성 전이유전자의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌으며 Strongyloides에서도 발현을 증가시키는 것으로 추정된다. 와일드 웜 코돈 어댑터는 수정된 시퀀스(20)에 최대 세 개의 인트론을 포함시키기 위한 옵션을 갖는다.
미세주입 믹스의 조성물 및 전달은F1 자손의 형질발생 속도 및 생존에 영향을 미친다. BU 식염수는 일상적으로 믹스의 희석제로 사용되지만ddH2O를 사용하는 것도 옵션입니다. 혼합 중의 성분의 농도 및/또는 비율은 형질전환 속도를 향상시키기 위해 조정될 수 있다. 관심있는 플라스미드의 농도가 높을수록 형질발생 속도가 증가할 수 있지만 종종 총 자손이 줄어든다. 이식유전자 발현이 관찰되지 않거나 죽은 트랜스제닉 난자만 발견되면, 이식유전자가 독성이 있거나 플라스미드 스톡의 무언가가 트랜스제닉의 죽음을 야기할 수 있다. 후자의 경우, 다른 방법을 사용하여(예를 들어, 상이한 미니프렙 키트를 사용하여) 새로운 플라스미드 스톡을 만드는 것은 트랜스제닉을 수득하기에 충분할 수 있다. 리포펙타민을 미세주입 믹스에 첨가하는 것은 또한 트랜스제네시스(23)의 속도를 향상시킬 수 있다.
믹스를 전달하는 미세주사 바늘의 형상은 또한 생존 및 형질발생 속도에 영향을 미친다(도 3A-F, 비디오 1, 비디오 2 및 보충 비디오 S1). 바늘은 큐티클에 침투 할 수있을만큼 날카 롭고 과도한 손상을 초래하지 않을 정도로 좁아야합니다. 하루 이상 보관 된 바늘이 파편을 축적하고 미세 주사 중에 막힐 수 있으므로 사용 직전에 바늘을 당기는 것이 좋습니다. 미세주입 패드로부터 주입된 암컷을 손상시키지 않고 회수하는 것은 몇 가지 다른 방법으로 달성될 수 있다. 한 가지 기술은 BU 한 방울로 주입 패드에서 웜을 떼어 낸 다음 웜 픽에서 HB101을 사용하여 웜을 수집하는 것입니다. 복구를위한 다른 기술로는 BU에 웜을 부유시키고 피펫 팁 또는 작은 페인트 브러시를 사용하여 웜을 수집하거나 웜 픽 만 사용하여 웜을 복구 플레이트로 옮기는 것이 포함됩니다.
미세 주입 된 암컷으로부터 자손을 얻지 못했다면, 이것은 주사 된 암컷이 미세 주사 과정에서 손상되었거나 주사 후 배양 조건이 최적이 아님을 시사합니다. 시도될 수 있는 다수의 상이한 주입 후 배양 조건이 있다. 위에서 설명한 소규모 분변-숯 배양은 일반적으로 HB101을 사용한 NGM 플레이트보다 더 나은 웜 생존을 지원합니다. 그러나 주입 된 웜의 생존과 분변 - 숯 판에F1 유충의 발달을 따르는 것은 어려울 수 있으며,이 판에는 알이 보이지 않습니다. 분변 숯 플레이트 대신 HB101로 NGM 플레이트에서 웜을 배양하는 이점은 알을 낳고 애벌레 발달을주의 깊게 관찰 할 수 있다는 것입니다.이 문제는 문제 해결에 유용 할 수 있습니다. HB101을 갖는 V12 플레이트는 또한 생존률(24)을 증가시키는데 사용될 수 있다. 마지막으로, 단일 래트 분변 펠릿을 갖는 화학주성 플레이트(12 )가 S. ratti 주입 후 배양에 사용될 수 있다. 수컷과 주사 된 암컷은 쥐 분변 펠릿으로 직접 옮겨집니다. 5-7 일 후, 웜은 위에서 설명한 바와 같이 Baermann 장치를 사용하여 한천 및 대변에서 수집됩니다.
미세주사를 위한 스트롱실로이드성인 스트롱실로이드를 얻기 위해, 갓 제조된 분변-숯 플레이트는 25°C에서 24시간 동안 또는 20°C에서 48시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 그러나 암컷이 너무 어리면 미세 주사 과정에서 생존하지 못할 수도 있습니다. ~48시간 동안 20°C에서 배양된 분변-숯 플레이트로부터 수집된 성인은 미세주입 과정을 견딜 가능성이 더 높다. 그러나, 이들 성인은 25°C에서 24시간 인큐베이션으로부터 수득된 성인보다 나이가 많기 때문에, 이들은 페언드로서 존재하지 않으며 더 낮은 형질전환 속도를 가질 수 있다. 초보자는 고령자부터 시작하여 기술이 향상됨에 따라 약간 젊은 성인으로 전환하는 것을 선호 할 수 있습니다.
C. elegans와 마찬가지로, Strongyloides 종은 F1 세대에서 염색체 외 어레이 및 게놈 통합 구축물로부터 전이유전자를 발현할 수 있다. C. elegans와는 달리, Strongyloides 종은 염색체 외 어레이가 PCR13에 의해 여전히 검출 가능하더라도F2 및 후속 세대에서 게놈 통합 전이유전자 만 발현합니다. 염색체 외 어레이를 발현하는F1 트랜스제닉 유충은 게놈 통합 또는 다수의 트랜스제닉 웜을 필요로 하지 않는 실험에 사용될 수 있다. 게놈 통합은 내인성 유전자에 태그를 지정하거나 집단 기반 분석에서 많은 수의 웜을 테스트해야하는 실험에 필요할 수 있습니다. 스트롱실로이드에서 전이유전자의 게놈 통합을 위한 두 가지 방법이 있다: piggyBac 트랜스포존-매개 통합17 및 CRISPR/Cas9-매개된 통합9. piggyBac 트랜스포존-매개 통합은 게놈26 내의 TTAA 부위로 화물을 표적화하기 위해 piggyBac 트랜스포자제를 사용한다. TTAA 모티프는 스트롱실로이드 종의 AT-풍부 게놈에서 상당히 흔하기 때문에, 통합은 종종 게놈 내의 하나 이상의 부위에 있다. 대조적으로, CRISPR/Cas9-매개된 통합은 특정 표적 유전자좌9에서 전이유전자를 통합하는데 사용될 수 있다.
CRISPR/Cas9 시스템은 또한 표적화된 유전자 녹아웃(9,27)을 생성하는데 사용될 수 있다. 스트롱실로이드 게놈의 AT 풍부함으로 인해, 선충류28에 대한 최적의 5'-N18GGNGG-3' 서열을 함유하는 사용 가능한 Cas9 표적 부위를 찾는 것은 어려운 과제이다. 종종, 표적화를 위한 유전자에 단지 하나 또는 두 개의 부위가 있다. 바람직한 방법은 게놈 유전자좌 내로의 상동성-지시된 복구에 의해 전이유전자와 형광 마커를 함유하는 복구 주형의 통합을 수반하여, 유전자의 완전한 파괴를 초래한다. 잠재적인 녹아웃은 전이유전자 9,14,15,29의 발현에 의해 확인될 수 있다. 그러나, 이식유전자 발현만으로는 어레이로부터의 발현 대 통합된 전이유전자로서의 유전자형을 지시하지 않으며 종종 구별할 수 없다. 따라서,F1 형질전환 유충은 동형접합성 녹아웃(9)을 확인하기 위해 사후 지노타이핑을 필요로 한다. 복구 주형의 부재 하에서, 표적 유전자좌의 돌연변이 유발은 고주파에서 발생하지만 큰 결실을 초래할 수 있다9.
트랜스제닉 또는 돌연변이F1 유충을 생성하는 것은 S. stercoralis에서 비교적 간단하지만, 안정한 라인을 생성하는 것은 숙주 통과의 필요성 때문에 매우 어렵다. 실험실에서 몽골 게르빌 (Mongolian gerbil)은 S. stercoralis에 대한 허용 숙주이지만30 호선을 확립하기에 충분한 F2 유충을 생산할 수있는 감염을 확립하기 위해서는 고용량의 웜이 필요합니다. 감염성 유충의 약 6 %만이 기생 암컷30이됩니다. 더욱이, 트랜스제닉 유충이 게놈 통합 없이 어레이 발현을 갖는다면, 그들은 두 번째 게르빌 숙주를 감염시키는 데 필요한 트랜스유전자-발현 자손을 생성하지 않을 것이다. 게놈 통합 유충이 생식 기생충 성인이되는 충분한 수의 가능성을 높이려면 초기 접종에서 최소 400-500 마리의 형질전환 유충을 권장합니다. 게르빌을 프레드니손30으로 치료함으로써 특허 감염을 확립하는데 필요한 유충의 수를 줄일 수 있다. 그럼에도 불구하고, S. stercoralis의 안정한 라인을 성공적으로 확립하기에 충분한 통합 트랜스제닉 또는 돌연변이 웜을 축적하는 것은 어려울 수 있다. 그러나, 단일 웜 검정을 위해 충분한 수의 트랜스제닉 S. stercoralis F1 유충을14,15 마리 배양하는 것이 일반적으로 가능하다.
스트롱실로이드라티는 안정한 트랜스제닉 또는 녹아웃 라인(17,31)을 생성하는 더 큰 실현 가능성의 뚜렷한 이점을 갖는다. S. ratti free-living 성인 여성은 S. stercoralis free-living 성인 여성보다 미세주사 과정에 덜 관대하다; S. ratti 암컷은 일반적으로 S. stercoralis 암컷보다 전체 유충을 적게 생산하며 변형률 또한31 미만입니다. 그러나, S. ratti의 안정한 라인을 확립하기 위해 단지 몇 개의 트랜스제닉 또는 녹아웃F1 유충만이 요구된다. S. ratti는 쥐의 천연 기생충이기 때문에, 단지 몇 마리의 S. ratti 감염성 유충만이 특허 감염(32)을 확립하기에 충분하다. 따라서, 안정한 선을 확립하기에 충분한 수의 트랜스제닉 또는 돌연변이 유충을 일반적으로 축적할 수 있다. 스트롱실로이드 종은 F1 세대를 지나서 염색체 외 어레이를 발현하지 않기 때문에, 게놈 통합F1 유충만이 안정한 트랜스제닉 라인13을 생성할 수 있다. 유전자형 작성 전에 통합된 전이유전자를 가진 웜을 확인하는 것은 일반적으로 불가능하므로, 프로토콜은 모든 트랜스제닉F1 유충을 수집하여 쥐에 주입하는 것이다. 이 유충의 일부 작은 비율은 원하는 통합 이벤트를 가질 것입니다. 이 유충은 안정된 선의 기초를 형성 할 것입니다. piggyBac 방법은 종종 임의의 개별 웜에서 하나 이상의 통합 이벤트를 초래하기 때문에, 쥐17을 통한 트랜스제닉 유충의 몇 번의 통과 후에 트랜스유전자의 거의 100% 전달이 달성될 수 있다.
요약하면, 여기에 기재된 기술은 트랜스제닉 또는 녹아웃 S. stercoralis 및 S. ratti를 생성하는데 사용될 수 있다. 이는 공간적 및 시간적 기능을 결정하기 위한 전이유전자의 세포 특이적 발현, 돌연변이체의 생성, 및 단백질의 내인성 태깅을 포함하나 이에 한정되지 않는 광범위한 잠재적 실험을 가능하게 한다(14,15,29,33,34,35). 장기적으로 트랜스제닉 스트롱실로이드의 사용으로 얻은 지식은 S. stercoralis 및 기타 장 기생충 선충류로 인한 인간 감염을 퇴치하기위한 새로운 전략을 개발하는 데 사용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
pPV540과 pPV402는 펜실베니아 대학의 제임스 록 박사의 친절한 선물이었다. 원고에 대한 유용한 의견을 주신 Astra Bryant에게 감사드립니다. 이 연구는 Burroughs-Wellcome Fund Investigators가 Pathogenesis of Disease Award, Howard Hughes Medical Institute Faculty Scholar Award 및 National Institutes of Health R01 DC017959 (E.A.H.)의 자금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | nicotine for paralyzing worms |
| 3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) | VWR | 470121-790 | C-clamp to secure setup to bench top |
| Agarose LE | Phenix | RBA-500 | agarose for slides |
| Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh | Ebonex | n/a | charcoal for fecal-charcoal cultures |
| Bone char, granules, 10 x 28 mesh | Reade | bonechar10x28 | charcoal for fecal-cultures (alternative to the above) |
| Coarse micromanipulator | Narishige | MMN-1 | coarse micromanipulator |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Fisher | 07-200-385 | microfilter column |
| Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness | Brain Research Lab | 4860-1 | coverslips (48 x 60 mm) |
| Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter | VWR | 82050-918 | 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures) |
| Eisco retort base w/ rod | Fisher | 12-000-101 | stand for Baermann apparatus |
| Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips | VWR | 89009-310 | for filling microinjection needles |
| Fisherbrand absorbent underpads | Fisher | 14-206-62 | bench paper (for prepping) |
| Fisherbrand Cast-Iron Rings | Fisher | 14-050CQ | Baermann o-ring |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for mixing) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for catch bucket/water bucket) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (x2) (to make holder) |
| Gorilla epoxie in syringe | McMaster-Carr | 7541A51 | glue (to attach tubing) |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | halocarbon oil |
| High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD | McMaster-Carr | 3038K24 | tubing (for funnel) |
| KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Baermann funnel |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors | Fisher | 15-235-101 | bench paper (for prepping) |
| Leica stereomicroscope with fluorescence | Leica | M165 FC | GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms |
| microINJECTOR brass straight arm needle-holder | Tritech | MINJ-4 | microinjection needle holder |
| microINJECTOR system | Tritech | MINJ-1 | microinjection system |
| Mongolian Gerbils | Charles River Laboratories | 213-Mongolian Gerbil | gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks |
| Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz | VWR | 11216-776 | Whirl-Pak sample bags |
| Nylon tulle (mesh) | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | nylon mesh for Baermann holder |
| Platinum wire, 36 Gauge, per inch | Thomas Scientific | 1233S72 | platinum/iridium wire for worm picks |
| Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) | VWR | 62505-007 | wood sticks (for mixing samples) |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN miniprep kit |
| Rats-Long Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE Long Evans | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Office Depot | 452369 | plastic boxes for humidified chamber |
| Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches | Newco | 999589 | techboard |
| Stainless steel raised wire floor | Ancare | R20SSRWF | wire cage bottoms |
| StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 | Office Depot | 9587303 | spoons |
| Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm | Carolina (Science) | 741012 | watch glasses (small, round) |
| Stereomicroscope | Motic | K-400 LED | dissecting prep scope |
| Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite | Grainger | 53GN16 | plastic boxes for humidified chamber |
| Sutter P-30 micropipette puller | Sutter | P-30/P | needle puller with platinum/iridium filament |
| Syracuse watch glasses | Fisher | S34826 | watch glasses (large, round) |
| Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps | Fisher | 05-769-2Q | funnel clamps (2x) |
| Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator | Narishige | MM0-4 | fine micromanipulator |
| United Mohr pinchcock clamps | Fisher | S99422 | Pinch clamps (2x) |
| Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) | Tritech Research | T3308P | 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures) |
| VWR light-duty tissue wipers | VWR | 82003-820 | lining for Baermann holder |
| watch glass, square, 1-5/8 in | Carolina (Science) | 742300 | watch glasses (small, square) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter | Fisher | 09-805B | filter paper (for 6 cm Petri dishes) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter | Fisher | 09-805D | filter paper (for 10 cm Petri dishes) |
| World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in | Fisher | 50-821-813 | glass capillaries for microinjection needles |
| X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade | Office Depot | 238816 | X-Acto knives without blades to hold worm picks |
| Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n/a | inverted microscope |
References
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