Summary
Parazitik nematodlar Strongyloides stercoralis ve Strongyloides ratti için fonksiyonel genomik araç seti transgenez, CRISPR / Cas9 aracılı mutagenez ve RNAi'yi içerir. Bu protokol, transgenleri ve CRISPR bileşenlerini S. stercoralis ve S . ratti'ye tanıtmak için intragonadal mikroenjeksiyonun nasıl kullanılacağını gösterecektir.
Abstract
Strongyloides cinsi, Strongyloides stercoralis ve Strongyloides ratti dahil olmak üzere farklı konakçı aralıklarına sahip çok sayıda cilde nüfuz eden nematod türünden oluşur. S. stercoralis yaklaşık 610 milyon insanı enfekte eden insan-parazitik, cilde nüfuz eden bir nematoddur, sıçan paraziti S. ratti ise S. stercoralis ile yakından ilişkilidir ve genellikle S. stercoralis için bir laboratuvar modeli olarak kullanılır. Hem S. stercoralis hem de S. ratti, intragonadal mikroenjeksiyonun eksojen nükleik asit dağıtım tekniği ile transgenik ve nakavt oluşumuna kolayca uygundur ve bu nedenle, henüz bu tekniğe uygun olmayan diğer parazitik helmintler için model sistemler olarak ortaya çıkmıştır.
Paraziter Strongyloides yetişkinleri, konakçılarının ince bağırsağında yaşar ve dışkı yoluyla çevreye soy salgılarlar. Çevreye girdikten sonra, larvalar dışkıda yaşayan ve yeni bir konakçı bulması ve istila etmesi gereken soy üreten serbest yaşayan yetişkinlere dönüşür. Bu çevresel nesil, Strongyloides türlerine özgüdür ve morfolojide, C. elegans için geliştirilen tekniklerin, intragonadal mikroenjeksiyon da dahil olmak üzere bu parazitik nematodlarla kullanım için uyarlanabileceği serbest yaşayan nematod Caenorhabditis elegans modeline yeterince benzer. İntragonadal mikroenjeksiyon kullanılarak, Strongyloides'e çok çeşitli transgenler sokulabilir. CRISPR / Cas9 bileşenleri ayrıca mutant Strongyloides larvaları oluşturmak için mikroenjekte edilebilir. Burada, serbest yaşayan yetişkinlerin hazırlanması, enjeksiyon prosedürü ve transgenik döl seçimi de dahil olmak üzere Strongyloides'e intragonadal mikroenjeksiyon tekniği açıklanmaktadır. CRISPR / Cas9 mutagenezi kullanılarak oluşturulan transgenik Strongyloides larvalarının görüntüleri dahil edilmiştir. Bu makalenin amacı, diğer araştırmacıların transgenik ve mutant Strongyloides oluşturmak için mikroenjeksiyon kullanmalarını sağlamaktır.
Introduction
Strongyloides stercoralis uzun zamandır daha yaygın olarak tanınan kancalı kurtlara ve yuvarlak kurt Ascaris lumbricoides1'e kıyasla önemli bir insan patojeni olarak göz ardı edilmiştir. Solucan yükü ile ilgili önceki çalışmalar, S. stercoralis 2 için yaygın tanı yöntemlerinin düşük duyarlılığı nedeniyle S. stercoralis prevalansını sıklıkla ciddi şekilde hafife almıştır. Son yıllarda, gelişmiş tanı araçlarına dayanan epidemiyolojik çalışmalar, S. stercoralis enfeksiyonlarının gerçek prevalansının daha önce bildirilenden çok daha yüksek olduğunu, dünya çapında yaklaşık 610 milyon insanın2 olduğunu tahmin etmektedir.
Hem S. stercoralis hem de yakından ilişkili sıçan paraziti ve ortak laboratuvar modeli S. ratti de dahil olmak üzere diğer Strongyloides türleri, deneysel genomik çalışmalar için avantajlı olan alışılmadık bir yaşam döngüsüne sahiptir, çünkü hem parazitik hem de serbest yaşayan (çevresel) nesillerden oluşur3 (Şekil 1). Spesifik olarak, hem S. stercoralis hem de S. ratti, tek bir serbest yaşayan nesil boyunca döngü yapabilir. Serbest yaşayan nesil, serbest yaşayan yetişkin erkek ve dişilere dönüşen parazit sonrası larvalardan oluşur; Serbest yaşayan yetişkinlerin tüm soyları, yaşam döngüsüne devam etmek için bir konağı enfekte etmesi gereken enfektif larvalara dönüşür. Ayrıca, bu çevresel veya serbest yaşayan nesil laboratuvarda deneysel olarak manipüle edilebilir. Serbest yaşayan Strongyloides yetişkinleri ve C. elegans yetişkinleri benzer morfolojiyi paylaştığından, başlangıçta C. elegans için geliştirilen intragonadal mikroenjeksiyon gibi teknikler, serbest yaşayan yetişkin Strongyloides 4,5 ile kullanım için uyarlanabilir. DNA genellikle serbest yaşayan yetişkin kadınlara sokulmuş olsa da, Strongyloides'in hem erkekleri hem de dişileri mikroenjekte edilebilir6. Bu nedenle, Strongyloides'in biyolojisinin birçok yönünü sorgulamak için fonksiyonel genomik araçlar mevcuttur. Diğer paraziter nematodlar serbest yaşayan bir nesilden yoksundur ve sonuç olarak, fonksiyonel genomik tekniklere kolayca uygun değildir3.
Resim 1: Strongyloides stercoralis yaşam döngüsü. S. stercoralis parazitik dişileri, memeli konakçılarının (insanlar, insan olmayan primatlar, köpekler) ince bağırsağında yaşar. Paraziter dişiler partenogenez ile çoğalır ve ince bağırsakta yumurta bırakır. Yumurtalar hala konakçının içindeyken parazit sonrası larvalara yumurtadan çıkar ve bunlar daha sonra dışkı ile çevreye geçirilir. Post-paraziter larvalar erkekse, serbest yaşayan yetişkin erkeklere dönüşürler. Post-paraziter larvalar dişi ise, serbest yaşayan yetişkin dişilere (dolaylı gelişim) veya üçüncü aşama enfektif larvalara (iL3'ler; doğrudan gelişim) dönüşebilirler. Serbest yaşayan erkekler ve dişiler, iL3'ler haline gelmek için kısıtlanmış soylar oluşturmak için cinsel olarak çoğalırlar. Belirli koşullar altında, S. stercoralis ayrıca parazit sonrası larvaların bir kısmının dışkıda çevreye geçmek yerine konakçı bağırsağın içinde kaldığı otoenfeksiyona da maruz kalabilir. Bu larvalar, konakçının içinde otoenfektif larvalara (L3a) dönüşebilir, bağırsak duvarından nüfuz edebilir, vücuttan göç edebilir ve sonunda üreme yetişkinleri olmak için bağırsağa geri dönebilir. S. ratti'nin yaşam döngüsü benzerdir, ancak S. ratti sıçanları enfekte eder ve otoenfektif bir döngüye sahip değildir. Çevresel üretim, genetik çalışmalar için Strongyloides türlerini kullanmanın anahtarıdır. Serbest yaşayan yetişkin dişiler (P0) mikroenjekte edilebilir; hepsi iL3'ler haline gelecek olan soyları, potansiyelF1 transgenikleridir. Bu rakam Castelletto ve ark.'dan değiştirilmiştir. 3. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
S. stercoralis biyolojisinin birçok yönünü konakçı istilası ve konakçı immün modülasyonu dahil olmak üzere diğer gastrointestinal insan-paraziter nematodlarla paylaşır. Örneğin, Necator ve Ancylostoma cinslerindeki insan-parazitik kancalı kurtlar da cilt penetrasyonu ile enfekte olur, vücutta benzer şekilde gezinir ve sonuçta ince bağırsakta parazitik yetişkinler olarak bulunur7. Bu nedenle, birçok gastrointestinal nematod muhtemelen ortak duyusal davranışları ve immün kaçınma tekniklerini kullanır. Sonuç olarak, Strongyloides'ten toplanan bilgiler, genetik olarak daha az izlenebilir diğer nematodlardaki bulguları tamamlayacak ve bu karmaşık ve önemli parazitlerin daha eksiksiz bir şekilde anlaşılmasına yol açacaktır.
Bu mikroenjeksiyon protokolü, transgenik ve mutant döl yapmak için DNA'yı Strongyloides serbest yaşayan yetişkin dişilere sokma yöntemini özetlemektedir. Mikroenjeksiyonlar için yetişkin solucanların gelişimsel zamanlaması ve transgenik söllerin toplanması da dahil olmak üzere suş bakım gereksinimleri açıklanmaktadır. Protokoller ve tüm mikroenjeksiyon tekniğinin bir gösterimi, transgenik söllerin kültürlenmesi ve taranması için protokollerle birlikte, gerekli tüm ekipman ve sarf malzemelerinin bir listesi ile birlikte dahil edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Gerbiller S. stercoralis'i geçmek için kullanıldı ve sıçanlar S. ratti'yi geçmek için kullanıldı. Tüm prosedürler, AAALAC standartlarına ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna uyan UCLA Hayvan Araştırma Gözetim Ofisi (Protokol No. 2011-060-21A) tarafından onaylanmıştır. Aşağıdaki görevler mikroenjeksiyondan en az bir gün önce tamamlanmalıdır: solucan kültürleme, mikroenjeksiyon pedleri hazırlama, mikroenjeksiyon karışımı için yapılar oluşturma ve bakterileri (E. coli HB101) 6 cm Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakalarına yayma8. Serbest yaşayan dişiler, mikroenjekte edilmeden önce genç yetişkinlere dönüşmek için 25 ° C'de en az 24 saat dışkı sonrası toplama gerektirir. Mikroenjeksiyon pedleri tamamen kuru olmalıdır. Bakteriyel plakalar kurumalı ve küçük bir çim oluşturmalıdır.
1. Mikroenjeksiyon slaytlarının hazırlanması: enjekte edilmeden en az bir gün önce
NOT: Solucanlar, enjeksiyon için kuru agar pedli mikroenjeksiyon kapaklarına monte edilir.
- Bir ısı bloğunu 90 °C'ye ayarlayın.
- Bir borosilikat cam tüpe 5 mL ddH2O, daha sonra 100 mg agaroz ekleyin.
- Agaroz karışımını, agaroz çözülene kadar tüpteki bir alev üzerinde ısıtın.
- Agarozu sıvı halde tutmak için tüpü 90 ° C'ye ayarlanmış bir ısı bloğuna yerleştirin.
- Agaroz çözeltisinin ~ 180 μL'sini bir cam Pasteur pipet veya plastik uçlu bir pipet kullanarak bir kapak kapağına bırakın. Agarozu ince bir ped halinde düzleştirmek için hemen üstüne ikinci bir kapak kayması bırakın.
- 5-10 sn sonra, ikisini birbirinden kaydırarak üst kapak kaymasını çıkarın. Agar pedinin hangi slaytta olduğunu belirleyin ve yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
- Kırık bir kapak kapağından küçük bir cam parçası seçin ve forseps kullanarak pedin üst kenarına yakın agara hafifçe bastırın (Ek Şekil S1).
- Agaroz çözeltisi ile mikroenjeksiyon pedleri yapmaya devam edin.
- Agaroz pedlerini gece boyunca bankta veya fırında kurutun. Coverslip kutusunda saklayın.
NOT: Agaroz pedleri 2 aya kadar kullanılabilir, ancak yalnızca bir enjeksiyon çalışması için kullanılır.
2. Mikroenjeksiyon için solucanlar elde etmek için Strongyloides'in kültürlenmesi: enjeksiyondan 1 - 2 gün önce
NOT: Ek Materyalde, gerbillerin ve sıçanların nematodlarla nasıl enfekte edileceğine ve enfekte hayvanların dışkılarından nematodların nasıl toplanacağına dair ayrıntılı bir açıklama içeren bir gerinim bakım protokolü bulunabilir.
- Enjeksiyon gününden iki gün önce, enfekte olmuş hayvanları 9,10 gece boyunca toplama kafeslerine yerleştirin.
- Ertesi sabah, istila edilmiş dışkıları toplayın ve dışkı-kömür plakaları 9,10 yapın.
- Serbest yaşayan solucanların genç yetişkinlere dönüşmesine izin vermek için 24 saat boyunca 25 ° C'de bir plaka yerleştirin.
- Enjeksiyon gününden önceki gece, enfekte olmamış konakçı hayvanları toplama kafeslerine yerleştirin.
- Enjeksiyon gününde, enjeksiyon sonrası ekim için istila edilmemiş dışkı toplayın.
3. Mikroenjeksiyon karışımının yapılması: enjeksiyon gününden önce veya enjeksiyon gününde
NOT: Mikroenjeksiyon karışımı, solucan tamponlu salin (BU) içinde istenen konsantrasyona seyreltilmiş ilgili plazmidlerden oluşur (50 mM Na 2 HPO 4, 22 mM KH2PO4, 70 mM NaCl)11.
- Plazmid stoklarının konsantrasyonunu ve mikroenjeksiyon karışımında istenen konsantrasyonu belirleyin (Tablo 1).
| Mikroenjeksiyon karışımı: muhabir yapısı | |||
| Parça | Stok Konsantrasyonu | Miktar | Son Konsantrasyon |
| pMLC30 gpa-3::gfp | 300 ng/μL | 1,7 μL | 50 ng/μL |
| BU | Na | 8,3 μL | Na |
| toplam | 10 μL | 50 ng/μL | |
| Mikroenjeksiyon karışımı: CRISPR / Cas9 mutagenezi | |||
| Parça | Stok Konsantrasyonu | Miktar | Son Konsantrasyon |
| pMLC47 vergi-4 sgRNA | 300 ng/μL | 2,7 μL | 80 ng/μL |
| pEY11 Ss-vergi-4 HDR plazmid | 400 ng/μL | 2,0 μL | 80 ng/μL |
| pPV540 strCas9 plazmid | 350 ng/μL | 1,1 μL | 40 ng/μL |
| BU | Na | 4,2 μL | Na |
| toplam | 10 μL | 200 ng/μL | |
| Mikroenjeksiyon karışımı: piggyBac entegrasyonu | |||
| Parça | Stok Konsantrasyonu | Miktar | Son Konsantrasyon |
| pMLC30 gpa3::gfp | 300 ng/μL | 2,0 μL | 60 ng/μL |
| pPV402 transpozaz plazmidi | 450 ng/μL | 0,9 μL | 40 ng/μL |
| BU | Na | 7,1 μL | Na |
| toplam | 10 μL | 100 ng/μL | |
Tablo 1: Mikroenjeksiyon karışımlarına örnekler. Üç örnek mikroenjeksiyon karışımı için plazmidler ve konsantrasyonlar: biri gpa-3::GFP muhabiri yapı 10 için, biri Ss-tax-4 lokus 14,15'in CRISPR / Cas9 aracılı bozulması için ve biri de bir Ss-gpa-3::GFP yapısının piggyBac-aracılı entegrasyonu için 13,17,18. strCas9, Strongyloides kodon için optimize edilmiş Cas9 genini gösterir. Listelenen son konsantrasyonlar Strongyloides mikroenjeksiyon karışımlarında yaygın olarak kullanılır.
- BU'daki plazmidleri toplam 10-20 μL hacme kadar seyreltin.
- Karışımı 1-2 dakika boyunca 5.000 × g'lık bir filtre sütunundan döndürün.
- Mikroenjeksiyon karışımını hemen kullanın veya ileride kullanmak üzere -20 ° C'de saklayın.
4. Mikroenjeksiyon için genç yetişkin Strongyloides toplayın: enjeksiyon gününün sabahı
- Baermann aparatını 1 adet genç yetişkin Strongyloides fekal-kömür plakası ile kurun (Şekil 2).
NOT: Fekal-kömür plakası bazı enfektif larvalar içerebilir. Kişisel koruyucu ekipman laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz korumasından oluşur. Eldiven ile laboratuvar önlüğünün kılıfı arasında hiçbir cilt açığa çıkmamalıdır.
Resim 2: Kültürlerden parazitik solucanlar toplamak için kullanılan Baermann aparatı10. Bir dışkı-kömür plakasının içeriği, bir ılık su sütununun üstüne yerleştirilir. Solucanlar suya göç eder ve huninin dibinde toplanır. (A) Baermann aparatını kurmak için, Baermann hunisinin standı bir C-kelepçesi ile tezgaha kelepçelenir. Huni ucuna tutturulmuş bir lastik tüp kıstırma kelepçeleri ile kapatılır ve damlamalar için tüpün altına bir yakalama kovası yerleştirilir. Cam huniye ılık su eklenir. (B) Fekal-kömür karışımı için plastik halka tutucu daha sonra 3 adet laboratuvar dokusu ile kaplanır (solda). Bir dışkı-kömür plakasının içeriğini (sağda) plastik halka tutucuya aktarmak için tahta bir çubuk veya dil depresörü (orta) kullanılır. (C) Fekal-kömür karışımı için plastik halka tutucunun tabanının yakın çekimi, tutucunun tabanını kaplayan çift naylon tül tabakasını gösterir. (D) Fekal-kömür tutucu daha sonra cam hunisinin üstüne yerleştirilir. (E) Laboratuvar dokusu su ile nemlendirilir ve fekal-kömür karışımı üzerine kapatılır. Çoğunlukla dışkı-odun kömürünü suya batırmak için daha fazla ılık su eklenir. (F) Baermann'ın komple kurulumu, fekal-kömür kültürü ılık suya batırılmış. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Bir O-ring kullanarak bir halka standına kauçuk toplama borulu bir cam huni takın ve bir kelepçe ile sabitleyin. Toplama borusunu 2 tutamlı kelepçelerle kapatın (Şekil 2A).
- Damlamaları yakalamak için huninin altına bir yakalama kovası yerleştirin.
- Huniye jantın 5 cm altına kadar ılık (yaklaşık 40 ° C) su ekleyin. Sistemin sızıntı yapmadığını doğrulayın.
- 2 plastik halkadan yapılmış, aralarında 2 kat naylon tül ağ bulunan ve üst üste binen 3 laboratuvar dokusu parçası bulunan Baermann tutucuyu hizalayın. Fekal-kömür karışımını Baermann tutucuya ekleyin (Şekil 2B,C).
- Baermann tutucuyu dışkı-kömür karışımı ile huniye yerleştirin. Dokuları fekal-kömür karışımının etrafına katlayın ve fekal-odun kömürünün çoğunu suya batırmak için yeterli su ekleyin. Huni kenarından 2 cm'nin üzerini doldurmayın (Şekil 2D,E).
- Kokuyu içermesi için huniyi 15 cm'lik plastik Petri kabı kapağı ile doldurun. Huni gerektiği gibi etiketleyin (Şekil 2F).
- Solucanları Baermann cihazından toplamak için 30 dakika ila 1 saat bekleyin.
- Huni'nin altındaki kauçuk borunun altında 50 mL'lik bir santrifüj tüpü tutun. 50 mL tüpe solucanlar içeren 30-40 mL su dağıtmak için alttaki kelepçeleri dikkatlice açın.
- Solucanları içeren Baermann suyunun 15 mL'sini 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 15 mL santrifüj tüpünü ~ 750 × g'de (yavaş ) 1 dakika boyunca döndürün. Alternatif olarak, solucanların yerçekiminin 10-15 dakika boyunca yerleşmesine izin verin.
- Süpernatantı ~ 2 mL'ye çıkarın ve herhangi bir solucanı öldürmek için süpernatantı iyotlu bir atık sıvı kaba atın.
- 15 mL toplama tüpüne daha fazla Baermann suyu ekleyin ve spini tekrarlayın. Süpernatantı ~ 2 mL'ye çıkarın ve adım 4.11'deki gibi atın.
- Tüm solucanlar 15 mL santrifüj tüpünde toplanana kadar 4.11 ve 4.12 adımlarını tekrarlayın. Son dönüşten sonra, mümkün olduğunca fazla su çıkarın.
- Tüpün dibindeki solucan peletini (40-100 μL) inceleyin. Hiçbir solucan görünmüyorsa, 1-2 saat daha bekleyin ve Baermann cihazından daha fazla solucan toplamayı deneyin.
- Solucanları mümkün olduğunca az su içinde, E. coli HB101 çim ile 6 cm2% NGM plakasına aktarın. Bu plakayı mikroenjeksiyon için kaynak plaka olarak kullanın.
- Fekal-kömür karışımını, seyreltilmiş iyotla (Lugol'un iyotunun% 50 seyreltilmesi) sulandırarak, damlamaları yakalamak için plastik filme sararak ve biyolojik olarak tehlikeli bir atık kabına yerleştirerek atın.
- Yakalama kovasına 10 mL seyreltilmiş iyot ekleyin ve fazla suyu Baermann'dan içine boşaltın.
- Yeniden kullanılabilir bileşenleri (huni, yakalama kovası, tüllü plastik tutucu, plastik kapak ve kelepçeler) % 10 ağartıcı ile yıkayın ve iyice durulayın.
5. Mikroenjeksiyon iğnelerinin çekilmesi ve yüklenmesi: enjeksiyondan hemen önce
- Bir iğne çektirme makinesi kullanarak cam kılcal tüpleri çekerek mikroenjeksiyon iğneleri hazırlayın.
NOT: 3 mm platin/iridyum filamenti ile donatılmış ticari bir iğne çektirme makinesi için örnek ayarlar Isı = 810-820, Çekme = 800-820, mikrometre = 2,5'tir. - İpuçlarını diseksiyon mikroskobu altında görüntüleyin. İğneler istenen şekle sahipse (Şekil 3A-F), 4-6 iğne (2-3 kılcal tüp) çekin. Uygun iğne şeklini elde etmek için, ayarları gerektiği gibi değiştirin: Isı veya Çekme ayarlarını 10 ile ayarlayın ve konik ve şaftın şekli daha uygun olana kadar yeni iğneler çekin.
Şekil 3: Mikroenjeksiyon iğneleri ve mikroenjeksiyon için en uygun bölgelere sahip bir Strongyloides stercoralis yetişkin dişi tanımlanmıştır. (A-F) Mikroenjeksiyon iğnelerinin görüntüleri. (A-B) Mikroenjeksiyon için doğru şekillendirilmiş bir iğnenin şaft konikliği (A) ve ucu (B). Uç, kütikülü delecek kadar keskin ve aşırı hasara neden olmayacak kadar dardır. (C-D) Mikroenjeksiyon için yanlış şekillendirilmiş bir mikroenjeksiyon iğnesinin şaft konik (C) ve ucu (D). Ucu çok künt ve geniştir ve solucana aşırı zarar verir. (E-F) Mikroenjeksiyon için çalışmak için çok uzun ve ince olması muhtemel bir iğnenin şaft koniği (E) ve ucu (F). F'deki uç, D'deki uca çok benzer. Bununla birlikte, şaft kütikülü etkili bir şekilde delmek için daha dar ve esnektir. Ek olarak, çok ince iğneler kolayca tıkanır. (G) İğnenin sağdan geldiğini varsayarsak, mikroenjeksiyon için doğru şekilde yerleştirilmiş tüm solucanın görüntüsü. Anterior aşağı ve sola; vulva ok ucu ile gösterilir. Gonad dişinin sağ tarafı boyunca görülebilir. Bu dişinin rahminde sadece bir yumurta vardır (yıldız işareti ile gösterilir). (H, I) Mikroenjeksiyon bölgelerinin büyütülmüş görünümleri. Okun açısı, enjeksiyon iğnesinin açısına yaklaşır. Vulva bir dönüm noktası olarak kullanılabilir; gonadın kollarından solucanın karşı tarafındadır. Gonadın kolları bağırsağın etrafında kıvrılır ve bölünen çekirdeklerin uçları vulvanın karşısındadır. (H) Gomadın arka kolu; (I) ön kol. Bunlardan biri veya her iki kol enjekte edilebilir. H, I için, sözleşmeler G'deki gibidir. Ölçek çubukları = 50 μm (B, D, F, H, I); 100 μm (A, C, E, G). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- İğneleri sabitlemek ve uçlarda toz birikmesini önlemek için çekilen iğneleri 15 cm'lik plastik bir Petri kabında bir parça haddelenmiş bantla saklayın.
- Mikroenjeksiyon karışımının 0,7 μL'lik bir damlasını şaftın açık ucuna yerleştirin. Konik şaftı 10 dakika içinde karışımla doldurmak için haddelenmiş bir bant parçası kullanarak iğneyi rafa dik olarak asın. İlkinin işe yaramaması durumunda bir seferde 2 iğne hazırlayın.
6. Mikroskobun hazırlanması ve iğnenin kırılması
NOT: Mikroenjeksiyon, iğnenin hareketini kontrol etmek için bir mikroenjektör kurulumuyla donatılmış 5x ve 40x hedefleri olan ters çevrilmiş bir mikroskop kullanır. Ters çevrilmiş mikroskop, titreşim gürültüsünü azaltmak için ağır bir masaya veya titreşim önleyici hava tablasına yerleştirilmelidir. Mikroenjektör iğne tutucusu, mikroenjeksiyon karışımını iletmek için gereken basıncı uygulayan azot gazına bağlanır. Solucanları aktarmak için yakındaki daha küçük bir diseksiyon mikroskobu kullanılır.
- Sıvı akışına bağlı olarak, iğneyi kırmak için gaz tankı basıncını ~ 40-60 psi'ye ve mikroenjeksiyon için ~ 30-50 psi'ye ayarlayın.
- Diseksiyon mikroskobunda, mikroenjeksiyon pedi kapağı üzerindeki cam parçasını, standart bir platin solucanı toplama kullanarak halokarbon yağı ile örtün.
- Mikroenjeksiyon pedi kapağını mikroenjeksiyon kapsamına yerleştirin ve yağla kaplı cam parçasını bulun. Cam parçasını, iğneyi kırmak için kullanılan yüzey olarak hizmet etmek için bir kenar iğnenin yönüne dik olacak şekilde hizalayın.
- Diseksiyon mikroskobunu kullanarak iğnenin konik şaftta kabarcık veya döküntü olmadığını doğrulayın. Ardından, iğneyi basınçlı tutucuya 1-1,5 cm sabitleyin.
- İğnenin ucunu mikroskop görüş alanının merkezine gözle yerleştirin. Daha sonra düşük büyütme altında, iğnenin ucunu cam parçasının yanına dik olarak görüş alanına yerleştirin.
- Yüksek güce geçin ve iğnenin ucunu camın kenarıyla, yakınına yakın ancak dokunmadan hizalayın.
NOT: Çekildiğinde, iğneler kapalı olarak kaynaştırılır. - Sıvı akışına izin vermek üzere iğnenin ucunu kırmak için, gazdan sürekli basınç uygularken cam parçasının yan tarafına hafifçe dokunun (Ek Şekil S1). Sıvı akmaya başladığında, ucun şeklini kontrol edin ve kolayca akan sıvı ile keskin olduğundan emin olun.
NOT: Sıvı çok hızlı akıyorsa veya ucu çok küntse, mikroenjeksiyon sırasında solucanlar zarar görecektir (Video 1 ve Şekil 3A-F). - Sıvı iğneden iyi akarken, mikroenjeksiyon kaydırağını diseksiyon kapsamına taşıyın ve solucanların yerleştirilmesi için agar pedine 1-2 μL halokarbon yağı damlaları yerleştirin.
- Fazla yüzey bakterilerini uzaklaştırmak ve mikroenjeksiyon için tek solucanları seçmek için 20-30 genç yetişkin Strongyloides'i bakterisiz %2'lik bir NGM plakasına en az 5 dakika boyunca aktarın. Enjekte ederken gerektiğinde NGM plakasına daha fazla solucan ekleyin.
7. Mikroenjeksiyon Strongyloides
- Bakterisiz% 2 NGM plakasından gonadında 1-4 yumurta bulunan bir Strongyloides genç yetişkin dişi seçmek için solucan seçiminde az miktarda halokarbon yağı kullanın.
- Solucanı agar pedi üzerinde küçük bir yağ damlasına aktarın. Solucan seçimini kullanarak, solucanı yavaşça sarılacak ve gonad görünür ve erişimi kolay olacak şekilde konumlandırın. Gonadın yönüne dikkat edin (Şekil 3G).
- Solucanı mikroenjeksiyon mikroskobu görüş alanına yerleştirin. Gondanın iğne ile aynı tarafta olduğundan ve iğnenin gonadla hafif bir açıyla temas edecek şekilde konumlandırıldığından emin olun (Şekil 3H, I).
- İğnenin ucunu aynı odak düzleminde solucanın yanına getirin. Solucanın ortasına yakın gonad kolunu hedefleyin. İğneyi nazikçe gonadın içine sokmak için mikroenjektörü kullanın (Video 2).
- Tüm gonad kolunu DNA çözeltisi ile nazikçe doldurmak için derhal iğneye basınç uygulayın. Yeterli sıvının ne zaman enjekte edildiğini gözle belirleyin (Video 2).
NOT: Gonadın doldurulması 2 sn'ye kadar sürebilir. - İğneyi çıkarın ve yaranın kapandığını belirlemek için kontrol edin.
NOT: Gonad vücut duvarından çıkıntı yaparsa solucan soy üretmek için çok hasar görür (Ek Video S1). - Görünürse gonadın diğer koluyla tekrarlayın.
- Enjeksiyon bittiğinde, iğnenin ucuyla agar pedi üzerine basınç uygulayarak iğnenin tıkanmadığını hızlı bir şekilde doğrulayın. Slaytı enjekte edilen solucanla diseksiyon mikroskobuna aktarın.
- Enjekte edilen solucanı kurtarmak için, önce agar pedinden yüzdürmek için solucanın üzerine birkaç damla BU yerleştirin.
- Bir solucan yavrusu üzerinde az miktarda HB101 bakterisi toplayın. Solucanı sıvıdan çıkarmak için solucan üzerindeki yapışkan bakterilerle solucana dokunun.
- Solucanı nazikçe HB101 çim içeren %2'lik bir NGM plakası olan geri kazanım plakasına aktarın.
NOT: Solucan birkaç dakika içinde emeklemeye başlamalıdır. - Birkaç dişi enjekte edildikten sonra, kaynak plakadan enjekte edilmemiş bazı erkekler ekleyin.
NOT: Beş kadın için en az bir erkek iyi bir temeldir; fazla erkek tercih edilir. - Deney için yeterli sayıda kadın enjekte edilene kadar tüm adımları tekrarlayın.
- Solucanların iyileşmesine ve çiftleşmesine izin vermek için yetişkinleri enjeksiyondan sonra en az 1 saat boyunca kurtarma plakasında bırakın.
8. Enjekte edilen Strongyloides'in geri kazanılması ve kültürlenmesi
- Enfekte hayvanlarla aynı protokolü kullanarak, enfekte olmamış konakçı hayvanlardan bir gecede dışkı toplayın.
- İnfüze edilmemiş dışkıyı az miktarda odun kömürü ile karıştırın (bu plakalar için dışkı - kömür oranı yaklaşık 2 ila 1).
- Az miktarda dışkı-kömür karışımını, nemli filtre kağıdı ile kaplı 6 cm'lik bir Petri kabına dökün. Karışımın tabağın kapağına temas etmediğinden emin olun.
- 3 μL'de ayarlanmış bir pipet kullanarak, solucanları dışkı-kömür plakasındaki dışkıya aktarın. Solucanları odun kömürüne değil, doğrudan dışkıya yerleştirin.
- Yetişkinlerin diseksiyon kapsamı kullanarak fekal-kömür plakasında olduğunu doğrulayın.
- Solucanları kültürlemek için, plakayı nemlendirilmiş bir odaya, yani nemli kağıt havlularla kaplı sıkı oturan bir kapağı olan plastik bir kutuya yerleştirin.
NOT: 2 gün sonra, larva aşamalarının bir karışımı olacaktır. 5 gün sonra, larvaların çoğu iL3'lere dönüşmüş olacaktır; birkaç genç larva kalacak. 7 gün sonra, tüm larvalar iL3s olmalıdır.
9. Transgenik / nakavtları kurtarmak için F 1 larvalarının toplanması ve taranması
- Bir Baermann kurulumu kullanarak, larvaları enjeksiyon sonrası küçük ölçekli dışkı-kömür kültür plakalarından toplayın. Mümkün olduğunca çok larva elde etmek için, solucanları Baermann cihazından kurtarmadan önce en az 2 saat bekleyin.
- Larvaları 4.10-4.14 adımlarında olduğu gibi 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde yoğunlaştırın ve larvaları BU'lu küçük bir saat camına aktarın.
- Larvalar davranışsal deneyler için kullanılacaksa, tarama için kalın bir HB101 çimi ile% 2 NGM plakaları kullanın.
- 20-30 larvayı HB101 çimlerine aktarın.
NOT: Bakteriler larvaların hareketini yavaşlatacaktır. - Bir floresan diseksiyon mikroskobu altında, ilgilenilen transgeni ifade eden larvaları tanımlayın. Transgenik larvaları seçmek için bir solucan seçimi kullanın ve onları BÜ'lü küçük bir saat camına taşıyın.
- Başka bir küçük larva grubunu taramak için yeni bir HB101 plakası kullanın. Deneysel kullanım için yeterli larva toplandığında, HB101 plakalarını ve fazla solucanları seyreltilmiş iyotla (suda seyreltilmiş Lugol'un iyotunun% 50'si) tedavi edin ve biyolojik tehlike atıkları olarak atın. Alternatif olarak, alkil benzil amonyum klorürler içeren konsantre köpek kulübesi temizleyici kullanarak fazla solucanları öldürün.
- Solucanları hemen kullanın veya bir gecede az miktarda BU içinde sığ bir saat camında bırakın.
NOT: Sıvı çok derinse solucanlar hipoksik hale gelebilir. Larvaları bir gecede BU'da bırakmanın belirli davranışları etkilemesi mümkündür; Bu nedenle, larvaları 6 saat içinde davranışsal deneyler için kullanın.
- 20-30 larvayı HB101 çimlerine aktarın.
- Larvalar davranışsal tahliller için değil, mikroskopi için kullanılacaksa, solucanları tarama için geri dönüşümlü olarak nikotin felci ile hareketsiz hale getirin.
- Bir tıraş bıçağı kullanarak, solucanların plaka üzerindeki yerini takip etmeyi kolaylaştırmak için 10 cm'lik bir kemotaksis plakası12'nin plastik tabanına bir ızgara sürün.
- BÜ'deki ~ 3 μL larvayı ızgaradaki bir kareye bırakın. Gerektiği kadar kare doldurun. Larvalar plakanın kenarlarına kadar sürünebileceğinden, plakanın kenarlarına yakın olanları kullanmayın.
- Solucan damlalarına suya 15-20 μL damla% 1 nikotin ekleyin.
NOT: 4 dakika sonra solucanlar felç olacaktır. - Bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak solucanları tarayın.
- Transgenik larvaları 1-2 mL BÜ'lü küçük bir saat camına aktarmak için bir solucan seçimi kullanın.
NOT: Larvalar birkaç saat boyunca felç olur ve mikroskopi için mikroskop slaytlarına kolayca monte edilebilir. BU'da bir gecede bırakılırsa, iL3'ler iyileşir ve bazı tahliller veya memeli konakçı enfeksiyonu için kullanılabilir. Bununla birlikte, nikotin felci ve BÜ'de bir gecede inkübasyon bazı davranışları etkileyebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deney başarılı olursa,F1 larvaları ilgilenilen transgen ve / veya mutant fenotipini ifade edecektir (Şekil 4). Bununla birlikte, dönüşüm oranları oldukça değişkendir ve yapılara, solucanların sağlığına, enjeksiyon sonrası kültürleme koşullarına ve deneycinin becerisine bağlıdır. Genel olarak, başarılı bir deney, enjekte edilen dişi başına >15 F1 larva ve floresan belirteçler için% >3'lük bir dönüşüm oranı verecektir. Toplam canlı döl sayısı ortalama 10 larva / dişiden azsa, yapının toksik olması ve dönüştürülmüş larvaların hayatta kalmaması mümkündür. Çok sayıda floresan yumurta bulmak, ancak floresan larva bulmamak, enjeksiyon karışımının toksik olabileceğinin bir başka göstergesidir. Tekniği ilk öğrenirken, vücut duvarı kası13'te sağlam ifadeyi yönlendiren act-2::mRFPmars gibi iyi ifade eden bir yapı kullanılması önerilir (Şekil 4).
CRISPR / Cas9 aracılı hedefli mutagenez ile mutantlar üretilirken, potansiyel mutantların floresan 9,14,15'e göre tanımlanabilmesi için bir act-2::mRFPmars veya act-2::GFP transgen 13 içeren bir onarım şablonunun kullanılması önerilir. Strongyloides ekstrakromozomal dizilerden transgenleri eksprese ettiğinden, floresan F1 soyunun mRFPmars veya GFP'yi tek başına diziden eksprese edebileceğini veya hem diziden hem de entegre bir transgen 3,9,16'dan mRFPmars veya GFP'yi eksprese edebileceğini belirtmek önemlidir. Floresan ekspresyon paternine dayanarak transgenleri entegre etme olasılığı daha yüksek olan larvaları tanımlamak mümkündür: vücut duvarı kasındaki "yamalı" ekspresyon (Şekil 4A), transgen genoma entegre edilmediğinde daha yaygındır, oysa vücut duvarı kası boyunca tutarlı ekspresyon (Şekil 4B) ) sıklıkla, ancak her zaman değil, transgenin genoma entegre olduğunu gösterir. Bununla birlikte, tek başına ekspresyon kalıpları, mutantları kesin olarak tanımlamak için kullanılamaz – vücut duvarı kası boyunca tutarlı bir ifadeye sahip bazı solucanlar entegrasyon olaylarına sahip olmayabilir. Dahası, ifade kalıpları homozigot olan mutantları heterozigot veya mozaik olanlardan ayırt edemez. Bu nedenle, her solucan PCR-genotipli 9,14,15 olmalıdır. Kolayca görülebilen fenotipler veren genleri bozarken, bir onarım şablonu kullanmak gerekli olmayabilir. Örneğin, Strongyloides unc-22 geninin bozulması, heterozigot veya homozigot bozulma oranlarının% 10'un üzerinde olduğu baskın bir "seğirme" fenotipine neden olur9.
Şekil 4: Transgenik Strongyloides stercoralis larvaları. (A, B) S. stercoralis larvaları, vücut duvarı kasında eksprese edilen bir eylem-2::mRFPmars transgenini ifade eden13. Transgen, Ss-unc-22 lokus 9'un CRISPR / Cas9 aracılı bozulması için bir onarım şablonuna dahil edildi. (A) Ekstrakromozomal bir diziden ekspresyonu gösterebilen eksik veya "yamalı" bir eylem-2::mRFPmars ekspresyon modeline sahip bir S. stercoralis larvası. (B) Gen bozulmasını ve onarım şablonunun entegrasyonunu gösterebilecek daha eksiksiz eylem-2::mRFPmars ekspresyon modelini ifade eden bir S. stercoralis iL3. A, B için paneller diferansiyel parazit kontrastı (solda), floresan (ortada) ve birleştirilmiş (sağda) görüntüleri gösterir. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Kullanılabilir bir iğne yapmak için iğne kırma işleminin gösterilmesi. İğnenin ucu bir cam parçasının kenarına (en soldaki nesne) dokunulur. Sıvı ortaya çıktığında, iğne geri çekilir ve agarın üzerine taşınır. İğne ucu keskin bir noktaya gelir ve sıvı orta derecede hızlı akar. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 2: Başarılı bir enjeksiyonun gösterilmesi. Gondanın arka kolu sağda açık gri bir yapı olarak görülebilir. İğnenin ucu ve gonad aynı odak düzleminde olmalıdır. İğne solucanın üzerinde veya altında veya vücut boyunca yakalamadan kayarsa, pozisyonu ayarlayın. İğnenin ucu vücut duvarını hafifçe girintilendirecektir. Mikromanipülatöre bağlı iğne tutucuya hızlı bir dokunuş, ucu yavaşça vücut duvarından ve gonadın içine itecektir. İğne gonadın içine girdikten sonra, basınç uygulayın ve DNA çözeltisini enjekte edin. Sıvı gözle görülür şekilde gonadı taşmalıdır. İğnenin ucu çıkarıldığında yara kapanırsa, solucanın hayatta kalması muhtemeldir. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Malzeme: Strongyloides gerinim bakımı. Bu protokol, gerbillerde S. stercoralis ve sıçanlarda S. ratti için bakım prosedürünü özetlemektedir. Her nematod ve konakçı için kullanılan enfektif dozu içerir. Konakçılar anestezi altında deri altı enjeksiyonları ile enfekte olurlar. Her nematod-konakçı kombinasyonu için enfeksiyonların açıklıktan pik larva çıkışına ve açıklık kaybına ilerlemesi tanımlanmıştır. İstilacı dışkıları toplamak ve dışkı-kömür yetiştirme plakalarını yapmak için kullanılan protokol de açıklanmaktadır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S1: Mikroenjeksiyon iğnesini kırmak için küçük bir cam parçası olan bir kapak parçası üzerinde kurutulmuş bir agar pedinden oluşan bir mikroenjeksiyon slaytının görüntüsü. Agar taslağı ve parça anahattı netlik için buraya eklenmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Film S1: Hasarlı bir gonadla sonuçlanan bir enjeksiyonun gösterilmesi. Gomadın ön kolu odaktadır. Hafif basınç uygulanması, iğnedeki çözeltinin hala serbestçe aktığını gösterir. İğnenin ucu gonad ile aynı odak düzlemindedir ve hafif bir açıya yöneliktir. İğnenin ucu yerleştirildikten sonra, çözelti solucana enjekte edilir ve gonadı doldurur. Bununla birlikte, iğne çıkarıldığında, gonadın bir parçası kütiküldeki yaradan dışarı çıkar. Malzeme gözle görülür şekilde dışarı akıyor. Bu solucanın hayatta kalması pek mümkün değildir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu mikroenjeksiyon protokolü, transgenez ve CRISPR / Cas9 aracılı mutagenez için yapıları S. stercoralis ve S. ratti'ye tanıtma yöntemlerini detaylandırır. Hem S. stercoralis hem de S. ratti için, enjeksiyon sonrası sağkalım ve transgenez veya mutajenez oranı, ince ayar yapılabilen çeşitli değişkenlere tabidir.
Başarılı transgenez için ilk kritik düşünce, plazmid transgenlerinin nasıl oluşturulduğudur. Önceki çalışmalar, Strongyloides'teki eksojen transgenlerin ekspresyonunun, Strongyloides 5' promotörlerinin ve 3' UTR elemanlarının 3,13,19'un kullanılmasını gerektirdiğini bulmuştur. C. elegans yapılarına benzer şekilde, Strongyloides yapıları genellikle Ss-era-1 gen 13'teki gibi gen-spesifik bir promotör ve ortak bir3' UTR kullanır. Kodlama bölgesinin kodon optimizasyonu da Strongyloides'teki ifade için önemli olabilir. Son zamanlarda, Strongyloides ve diğer nematodlar için kodlama dizilerini kodon ile optimize eden web tabanlı bir uygulama olan Wild Worm Codon Adaptor,20 geliştirildi. Son olarak, Strongyloides'te titizlikle test edilmemiş olsa da, intronların hem C. elegans 21'de hem de böcekle ilişkili nematod Pristionchus pacificus 22'de eksojen transgenlerin ekspresyonunu arttırdığı gösterilmiştir ve Strongyloides'te de ekspresyonu arttırdığı varsayılmaktadır. Wild Worm Codon Adaptörü, değiştirilmiş dizi20'ye üç adede kadar intron dahil etme seçeneklerine sahiptir.
Mikroenjeksiyon karışımının bileşimi ve verilmesi, transgenez oranını veF1 soyunun hayatta kalmasını etkiler. BU salin rutin olarak karışımlar için seyreltici olarak kullanılır, ancak ddH2O kullanmak da bir seçenektir. Karışımdaki bileşenlerin konsantrasyonları ve/veya oranı, dönüşüm hızını artırmak için ayarlanabilir. İlgilenilen plazmidlerin daha yüksek konsantrasyonları transgenez oranını artırabilir, ancak genellikle daha az toplam soy ile sonuçlanır. Transgen ekspresyonu gözlenmezse veya sadece ölü transgenik yumurtalar bulunursa, transgenlerin toksik olması veya plazmid stoklarındaki bir şeyin transjeniklerin ölümüne neden olması mümkündür. İkinci durumda, farklı bir yöntem kullanarak (örneğin, farklı bir miniprep kiti kullanarak) yeni plazmid stokları yapmak, transjenik elde etmek için yeterli olabilir. Mikroenjeksiyon karışımına lipofectamin eklenmesi de transgenez23 oranını artırabilir.
Karışımı veren mikroenjeksiyon iğnesinin şekli de hayatta kalma ve transgenez oranlarını etkiler (Şekil 3A-F, Video 1, Video 2 ve Ek Video S1). İğne, kütiküle nüfuz edecek kadar keskin olmalı ve aşırı hasara neden olmayacak kadar dar olmalıdır. Bir günden fazla saklanan iğneler döküntü biriktirebileceğinden ve mikroenjeksiyonlar sırasında tıkanabileceğinden, kullanımdan hemen önce iğnelerin çekilmesi önerilir. Enjekte edilen dişilerin mikroenjeksiyon pedinden zarar görmeden geri kazanılması birkaç farklı yöntemle gerçekleştirilebilir. Bir teknik, solucanları enjeksiyon pedinden bir BÜ damlası içinde yüzdürmek ve daha sonra solucanları toplamak için bir solucan seçiminde HB101 kullanmaktır. Kurtarma için diğer teknikler arasında solucanların BU içinde yüzdürülmesi ve bir pipet ucu veya küçük bir boya fırçası kullanılarak toplanması veya solucanları bir kurtarma plakasına taşımak için tek başına bir solucan toplaması sayılabilir.
Mikroenjekte edilen dişilerden herhangi bir soy elde edilmediyse, bu, enjekte edilen dişilerin mikroenjeksiyon işleminde hasar gördüğünü veya enjeksiyon sonrası kültürleme koşullarının yetersiz olduğunu düşündürmektedir. Denenebilecek bir dizi farklı enjeksiyon sonrası kültürleme koşulu vardır. Yukarıda tarif edilen küçük ölçekli fekal-kömür kültürleri genellikle HB101'li NGM plakalarından daha iyi solucan sağkalımını destekler. Bununla birlikte, enjekte edilen solucanların hayatta kalmasını ve Fekal-kömür plakaları üzerinde F1 larvalarının gelişimini takip etmek zor olabilir ve bu plakalarda yumurta görünmez. Solucanların NGM plakalarında fekal-kömür plakaları yerine HB101 ile kültürlenmesinin bir avantajı, sorun giderme için yararlı olabilecek yumurtlama ve larva gelişiminin dikkatli bir şekilde gözlemlenmesine izin vermektir. HB101'li V12 plakaları da hayatta kalma24'ü artırmak için kullanılabilir. Son olarak, enjeksiyon sonrası S. ratti kültürü için tek bir sıçan dışkı peletine sahip bir kemotaksis plakası12 kullanılabilir. Erkekler ve enjekte edilen dişiler doğrudan sıçan dışkı peletine aktarılır. 5-7 gün içinde, yukarıda tarif edildiği gibi bir Baermann aparatı kullanılarak agar ve dışkıdan solucanlar toplanır.
Strongyloides yetişkinlerini mikroenjeksiyon için elde etmek için, taze hazırlanmış fekal-kömür plakaları 24 saat boyunca 25 ° C'de veya 48 saat için 20 ° C'de inkübeedilebilir. Bununla birlikte, dişiler çok gençse, mikroenjeksiyon işleminden sağ çıkamayabilirler. ~ 48 saat boyunca 20 ° C'de inkübe edilen fekal-kömür plakalarından toplanan yetişkinlerin mikroenjeksiyon işlemini tolere etme olasılığı daha yüksektir. Bununla birlikte, bu yetişkinler 25 ° C'de 24 saatlik bir inkübasyondan elde edilen yetişkinlerden daha yaşlı olduklarından, doğurgan değildirler ve daha düşük bir dönüşüm oranına sahip olabilirler. Acemiler yaşlı yetişkinlerle başlamayı ve daha sonra beceriler geliştikçe biraz daha genç yetişkinlere geçmeyi tercih edebilir.
C. elegans gibi, Strongyloides türleri de F1 neslindeki ekstrakromozomal dizilerden ve genoma entegre yapılardan transgenleri eksprese edebilir. C. elegans'ın aksine, Strongyloides türleri, ekstrakromozomal diziler hala PCR13 tarafından tespit edilebilse de, sadeceF2 ve sonraki nesillerde genoma entegre transgenleri eksprese edecektir. Ekstrakromozomal dizileri eksprese edenF1 transgenik larvaları, genom entegrasyonu veya çok sayıda transgenik solucan gerektirmeyen deneyler için kullanılabilir. Endojen genlerin etiketlenmesini veya popülasyon bazlı tahlillerde çok sayıda solucanın test edilmesini gerektiren deneyler için genom entegrasyonu gerekebilir. Strongyloides'te transgenlerin genom entegrasyonu için iki yöntem vardır: piggyBac transpozon aracılı entegrasyon17 ve CRISPR / Cas9 aracılı entegrasyon9. piggyBac transpozon aracılı entegrasyon, genom26'daki TTAA bölgelerine kargoyu hedeflemek için piggyBac transpozazını kullanır. TTAA motifi, Strongyloides türlerinin AT bakımından zengin genomunda oldukça yaygın olduğundan, entegrasyon genellikle genomda birden fazla bölgede bulunur. Buna karşılık, CRISPR / Cas9 aracılı entegrasyon, transgenleri belirli bir hedef lokus9'da entegre etmek için kullanılabilir.
CRISPR / Cas9 sistemi, hedeflenen gen nakavtları 9,27'yi üretmek için de kullanılabilir. Strongyloides genomunun AT zenginliği nedeniyle, nematodlar28 için en uygun 5'-N18GGNGG-3' dizisini içeren kullanılabilir Cas9 hedef bölgelerini bulmak zordur. Sıklıkla, hedefleme için bir gende sadece bir veya iki bölge vardır. Tercih edilen yöntem, bir transgen içeren bir onarım şablonunun, homolojiye yönelik onarım yoluyla floresan bir belirteçle genomik lokusa entegrasyonunu içerir ve genin tamamen bozulmasına neden olur. Potansiyel nakavtlar, transgen 9,14,15,29'un ekspresyonu ile tanımlanabilir. Bununla birlikte, transgen ekspresyonu tek başına genotipin göstergesi değildir, çünkü dizilerden ve entegre transgenlerden ekspresyon genellikle ayırt edilemez. Bu nedenle, F1 transgenik larvaları, homozigot nakavtları tanımlamak için post-hoc genotiplemeyi gerektirir9. Bir onarım şablonunun yokluğunda, hedef lokusun mutagenezisi yüksek frekansta meydana gelir, ancak büyük delesyonlara neden olabilir9.
Transgenik veya mutantF1 larvalarının üretilmesi S. stercoralis'te nispeten basit olmasına rağmen, konakçı geçişine duyulan ihtiyaç nedeniyle kararlı çizgiler üretmek son derece zordur. Laboratuvarda, Moğol gerbili, S. stercoralis için izin verilen bir konakçıdır, ancak hat30'u oluşturmak için yeterli F2 larvası üretebilen bir enfeksiyon oluşturmak için yüksekdozda solucan gerektirir. Enfektif larvaların sadece% 6'sı parazitik dişiler haline gelir30. Ayrıca, transgenik larvalar genom entegrasyonu olmadan dizi ekspresyonuna sahipse, ikinci bir gerbil konağını enfekte etmek için gereken transgen ekspresyonu üretmezler. Yeterli sayıda genomla bütünleşmiş larvaların üreme paraziter yetişkinleri olma şansını arttırmak için, ilk inokulumda en az 400-500 transgenik larva önerilir. Gerbilleri prednizon30 ile tedavi ederek patent enfeksiyonu oluşturmak için gereken larva sayısını azaltmak mümkün olabilir. Bununla birlikte, kararlı bir S. stercoralis hattını başarılı bir şekilde oluşturmak için yeterince entegre transgenik veya mutant solucan biriktirmenin zor olması muhtemeldir. Bununla birlikte, tek solucan tahlilleri 14,15 için yeterli sayıda transgenik S. stercoralis F1 larvasının toplanması genellikle mümkündür.
Strongyloides ratti, kararlı transgenik veya nakavt hatları üretmenin daha büyük fizibilitesinin belirgin bir avantajına sahiptir17,31. S. ratti serbest yaşayan yetişkin dişiler, mikroenjeksiyon işlemine S. stercoralis serbest yaşayan yetişkin kadınlardan daha az toleranslıdır; S. ratti dişileri genellikle S. stercoralis dişilerinden daha az genel larva üretir ve dönüşüm oranı da31'den düşüktür. Bununla birlikte, kararlı bir S. ratti hattı oluşturmak için sadece birkaç transgenik veya nakavt F1 larvası gereklidir. S. ratti, sıçanların doğal bir paraziti olduğundan, patent enfeksiyonu oluşturmak için sadece birkaç S. ratti enfektif larvası yeterlidir32. Bu nedenle, kararlı bir çizgi oluşturmak için yeterli sayıda transgenik veya mutant larva toplamak genellikle mümkündür. Strongyloides türleri F 1 neslini geçen ekstrakromozomal dizileri ifade etmeyeceğinden, sadecegenoma entegreF1 larvaları kararlı bir transgenik çizgi13 üretebilir. Genotiplemeden önce entegre transgenlere sahip solucanları tanımlamak genellikle imkansızdır, bu nedenle protokol tüm transgenikF1 larvalarını toplamak ve bunları bir sıçana enjekte etmektir. Bu larvaların küçük bir yüzdesi istenen entegrasyon olayına sahip olacaktır; Bu larvalar kararlı çizginin temelini oluşturacaktır. PiggyBac yöntemi genellikle herhangi bir solucanda birden fazla entegrasyon olayıyla sonuçlandığından, transgenin neredeyse% 100'ü transgenik larvaların bir sıçan17 yoluyla birkaç tur geçmesinden sonra elde edilebilir.
Özetle, burada açıklanan teknik, transgenik veya nakavt S. stercoralis ve S. ratti üretmek için kullanılabilir. Bu, transgenlerin hücreye özgü ekspresyonu, mutantların üretimi ve uzaysal ve zamansal fonksiyonları belirlemek için proteinlerin endojen etiketlenmesi dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çok çeşitli potansiyel deneylere olanak tanır 14,15,29,33,34,35. Uzun vadede, transgenik Strongyloides kullanımından elde edilen bilgiler, S. stercoralis ve diğer bağırsak paraziter nematodları ile insan enfeksiyonlarıyla mücadele etmek için yeni stratejiler geliştirmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
pPV540 ve pPV402, Pennsylvania Üniversitesi'nden Dr. James Lok'un nazik hediyeleriydi. Astra Bryant'a makale hakkındaki yararlı yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Hastalığın Patogenezinde Burroughs-Wellcome Fonu Araştırmacıları Ödülü, Howard Hughes Tıp Enstitüsü Fakülte Bursiyeri Ödülü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 DC017959 (E.A.H.) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | nicotine for paralyzing worms |
| 3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) | VWR | 470121-790 | C-clamp to secure setup to bench top |
| Agarose LE | Phenix | RBA-500 | agarose for slides |
| Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh | Ebonex | n/a | charcoal for fecal-charcoal cultures |
| Bone char, granules, 10 x 28 mesh | Reade | bonechar10x28 | charcoal for fecal-cultures (alternative to the above) |
| Coarse micromanipulator | Narishige | MMN-1 | coarse micromanipulator |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Fisher | 07-200-385 | microfilter column |
| Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness | Brain Research Lab | 4860-1 | coverslips (48 x 60 mm) |
| Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter | VWR | 82050-918 | 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures) |
| Eisco retort base w/ rod | Fisher | 12-000-101 | stand for Baermann apparatus |
| Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips | VWR | 89009-310 | for filling microinjection needles |
| Fisherbrand absorbent underpads | Fisher | 14-206-62 | bench paper (for prepping) |
| Fisherbrand Cast-Iron Rings | Fisher | 14-050CQ | Baermann o-ring |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for mixing) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for catch bucket/water bucket) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (x2) (to make holder) |
| Gorilla epoxie in syringe | McMaster-Carr | 7541A51 | glue (to attach tubing) |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | halocarbon oil |
| High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD | McMaster-Carr | 3038K24 | tubing (for funnel) |
| KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Baermann funnel |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors | Fisher | 15-235-101 | bench paper (for prepping) |
| Leica stereomicroscope with fluorescence | Leica | M165 FC | GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms |
| microINJECTOR brass straight arm needle-holder | Tritech | MINJ-4 | microinjection needle holder |
| microINJECTOR system | Tritech | MINJ-1 | microinjection system |
| Mongolian Gerbils | Charles River Laboratories | 213-Mongolian Gerbil | gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks |
| Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz | VWR | 11216-776 | Whirl-Pak sample bags |
| Nylon tulle (mesh) | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | nylon mesh for Baermann holder |
| Platinum wire, 36 Gauge, per inch | Thomas Scientific | 1233S72 | platinum/iridium wire for worm picks |
| Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) | VWR | 62505-007 | wood sticks (for mixing samples) |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN miniprep kit |
| Rats-Long Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE Long Evans | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Office Depot | 452369 | plastic boxes for humidified chamber |
| Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches | Newco | 999589 | techboard |
| Stainless steel raised wire floor | Ancare | R20SSRWF | wire cage bottoms |
| StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 | Office Depot | 9587303 | spoons |
| Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm | Carolina (Science) | 741012 | watch glasses (small, round) |
| Stereomicroscope | Motic | K-400 LED | dissecting prep scope |
| Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite | Grainger | 53GN16 | plastic boxes for humidified chamber |
| Sutter P-30 micropipette puller | Sutter | P-30/P | needle puller with platinum/iridium filament |
| Syracuse watch glasses | Fisher | S34826 | watch glasses (large, round) |
| Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps | Fisher | 05-769-2Q | funnel clamps (2x) |
| Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator | Narishige | MM0-4 | fine micromanipulator |
| United Mohr pinchcock clamps | Fisher | S99422 | Pinch clamps (2x) |
| Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) | Tritech Research | T3308P | 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures) |
| VWR light-duty tissue wipers | VWR | 82003-820 | lining for Baermann holder |
| watch glass, square, 1-5/8 in | Carolina (Science) | 742300 | watch glasses (small, square) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter | Fisher | 09-805B | filter paper (for 6 cm Petri dishes) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter | Fisher | 09-805D | filter paper (for 10 cm Petri dishes) |
| World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in | Fisher | 50-821-813 | glass capillaries for microinjection needles |
| X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade | Office Depot | 238816 | X-Acto knives without blades to hold worm picks |
| Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n/a | inverted microscope |
References
- Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165 (2013).
- Buonfrate, D., et al. The global prevalence of Strongyloides stercoralis infection. Pathogens. 9 (6), 468 (2020).
- Castelletto, M. L., Gang, S. S., Hallem, E. A. Recent advances in functional genomics for parasitic nematodes of mammals. Journal of Experimental Biology. 223, Pt Suppl 1 206482 (2020).
- Evans, T. C., et al. Transformation and microinjection. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2006).
- Lok, J. B., Unnasch, T. R., et al. Transgenesis in animal parasitic nematodes: Strongyloides spp. and Brugia spp. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2013).
- Shao, H. G., Li, X. S., Lok, J. B. Heritable genetic transformation of Strongyloides stercoralis by microinjection of plasmid DNA constructs into the male germline. International Journal for Parasitology. 47 (9), 511-515 (2017).
- Schafer, T. W., Skopic, A.
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Gang, S. S., et al. Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode. PLoS Pathogens. 13 (10), 1006675 (2017).
- Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: a model for translational research on parasitic nematode biology. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2007).
- Hawdon, J. M., Schad, G. A. Long-term storage of hookworm infective larvae in buffered saline solution maintains larval responsiveness to host signals. Proceedings of the Helminthological Society of Washington (USA). 58 (1), 140-142 (1991).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Junio, A. B., et al. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR. Experimental Parasitology. 118 (2), 253-265 (2008).
- Gang, S. S., et al. Chemosensory mechanisms of host seeking and infectivity in skin-penetrating nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (30), 17913-17923 (2020).
- Bryant, A. S., et al. A critical role for thermosensation in host seeking by skin-penetrating nematodes. Current Biology. 28 (14), 2338-2347 (2018).
- Lok, J. B. Nucleic acid transfection and transgenesis in parasitic nematodes. Parasitology. 139 (5), 574-588 (2012).
- Shao, H., et al. Transposon-mediated chromosomal integration of transgenes in the parasitic nematode Strongyloides ratti and establishment of stable transgenic lines. PLoS Pathogens. 8 (8), 1002871 (2012).
- Lok, J. piggyBac: a vehicle for integrative DNA transformation of parasitic nematodes. Mobile Genetic Elements. 3 (2), 24417 (2013).
- Li, X., et al. Successful transgenesis of the parasitic nematode Strongyloides stercoralis requires endogenous non-coding control elements. International Journal for Parasitology. 36 (6), 671-679 (2006).
- Bryant, A. S., Hallem, E. A. The Wild Worm Codon Adapter: a web tool for automated codon adaptation of transgenes for expression in non-Caenorhabditis nematodes. G3. 3 (7), (2021).
- Crane, M., et al. In vivo measurements reveal a single 5'-intron is sufficient to increase protein expression level in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 9192 (2019).
- Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
- Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems. Scientific Reports. 9 (1), 483 (2019).
- Dulovic, A., Puller, V., Streit, A. Optimizing culture conditions for free-living stages of the nematode parasite Strongyloides ratti. Experimental Parasitology. 168, 25-30 (2016).
- Harvey, S. C., Gemmill, A. W., Read, A. F., Viney, M. E. The control of morph development in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 267 (1457), 2057-2063 (2000).
- Kim, A., Pyykko, I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Molecular and Cellular Biochemistry. 354 (1-2), 301-309 (2011).
- Lok, J. B., Shao, H., Massey, H. C., Li, X. Transgenesis in Strongyloides and related parasitic nematodes: historical perspectives, current functional genomic applications and progress towards gene disruption and editing. Parasitology. 144 (3), 327-342 (2017).
- Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).
- Cheong, M. C., et al. Identification of a nuclear receptor/coactivator developmental signaling pathway in the nematode parasite Strongyloides stercoralis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (8), 2021864118 (2021).
- Nolan, T. J., Megyeri, Z., Bhopale, V. M., Schad, G. A. Strongyloides stercoralis: the first rodent model for uncomplicated and hyperinfective strongyloidiasis, the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Journal of Infectious Diseases. 168 (6), 1479-1484 (1993).
- Li, X., et al. Transgenesis in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Molecular and Biochemical Parasitology. 179 (2), 114-119 (2011).
- Viney, M. E. Exploiting the life cycle of Strongyloides ratti. Parasitology Today. 15 (6), 231-235 (1999).
- Stoltzfus, J. D., Massey, H. C., Nolan, T. J., Griffith, S. D., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis age-1: a potential regulator of infective larval development in a parasitic nematode. PLoS ONE. 7 (6), 38587 (2012).
- Castelletto, M. L., Massey, H. C., Lok, J. B. Morphogenesis of Strongyloides stercoralis infective larvae requires the DAF-16 ortholog FKTF-1. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000370 (2009).
- Douglas, B., et al. Transgenic expression of a T cell epitope in Strongyloides ratti reveals that helminth-specific CD4+ T cells constitute both Th2 and Treg populations. PLoS Pathogens. 17 (7), 1009709 (2021).
