Parazitik nematodlar Strongyloides stercoralis ve Strongyloides ratti için fonksiyonel genomik araç seti transgenez, CRISPR / Cas9 aracılı mutagenez ve RNAi'yi içerir. Bu protokol, transgenleri ve CRISPR bileşenlerini S. stercoralis ve S . ratti'ye tanıtmak için intragonadal mikroenjeksiyonun nasıl kullanılacağını gösterecektir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Strongyloides Türlerinde Mikroenjeksiyon ile Transgenik ve Nakavt Üretimi
Bu makalede
Özet
Özet
Strongyloides cinsi, Strongyloides stercoralis ve Strongyloides ratti dahil olmak üzere farklı konakçı aralıklarına sahip çok sayıda cilde nüfuz eden nematod türünden oluşur. S. stercoralis yaklaşık 610 milyon insanı enfekte eden insan-parazitik, cilde nüfuz eden bir nematoddur, sıçan paraziti S. ratti ise S. stercoralis ile yakından ilişkilidir ve genellikle S. stercoralis için bir laboratuvar modeli olarak kullanılır. Hem S. stercoralis hem de S. ratti, intragonadal mikroenjeksiyonun eksojen nükleik asit dağıtım tekniği ile transgenik ve nakavt oluşumuna kolayca uygundur ve bu nedenle, henüz bu tekniğe uygun olmayan diğer parazitik helmintler için model sistemler olarak ortaya çıkmıştır.
Paraziter Strongyloides yetişkinleri, konakçılarının ince bağırsağında yaşar ve dışkı yoluyla çevreye soy salgılarlar. Çevreye girdikten sonra, larvalar dışkıda yaşayan ve yeni bir konakçı bulması ve istila etmesi gereken soy üreten serbest yaşayan yetişkinlere dönüşür. Bu çevresel nesil, Strongyloides türlerine özgüdür ve morfolojide, C. elegans için geliştirilen tekniklerin, intragonadal mikroenjeksiyon da dahil olmak üzere bu parazitik nematodlarla kullanım için uyarlanabileceği serbest yaşayan nematod Caenorhabditis elegans modeline yeterince benzer. İntragonadal mikroenjeksiyon kullanılarak, Strongyloides'e çok çeşitli transgenler sokulabilir. CRISPR / Cas9 bileşenleri ayrıca mutant Strongyloides larvaları oluşturmak için mikroenjekte edilebilir. Burada, serbest yaşayan yetişkinlerin hazırlanması, enjeksiyon prosedürü ve transgenik döl seçimi de dahil olmak üzere Strongyloides'e intragonadal mikroenjeksiyon tekniği açıklanmaktadır. CRISPR / Cas9 mutagenezi kullanılarak oluşturulan transgenik Strongyloides larvalarının görüntüleri dahil edilmiştir. Bu makalenin amacı, diğer araştırmacıların transgenik ve mutant Strongyloides oluşturmak için mikroenjeksiyon kullanmalarını sağlamaktır.
Giriş
Strongyloides stercoralis uzun zamandır daha yaygın olarak tanınan kancalı kurtlara ve yuvarlak kurt Ascaris lumbricoides1'e kıyasla önemli bir insan patojeni olarak göz ardı edilmiştir. Solucan yükü ile ilgili önceki çalışmalar, S. stercoralis 2 için yaygın tanı yöntemlerinin düşük duyarlılığı nedeniyle S. stercoralis prevalansını sıklıkla ciddi şekilde hafife almıştır. Son yıllarda, gelişmiş tanı araçlarına dayanan epidemiyolojik çalışmalar, S. stercoralis enfeksiyonlarının gerçek prevalansının daha önce bildirilenden çok daha yüksek olduğunu, dünya çapında yaklaşık....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Gerbiller S. stercoralis'i geçmek için kullanıldı ve sıçanlar S. ratti'yi geçmek için kullanıldı. Tüm prosedürler, AAALAC standartlarına ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna uyan UCLA Hayvan Araştırma Gözetim Ofisi (Protokol No. 2011-060-21A) tarafından onaylanmıştır. Aşağıdaki görevler mikroenjeksiyondan en az bir gün önce tamamlanmalıdır: solucan kültürleme, mikroenjeksiyon pedleri hazırlama, mikroenjeksiyon karışımı için yapılar oluşturma ve bakterileri (E. coli HB101) 6 cm Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakalarına yayma8. Serbest yaşayan dişiler, mikroenjekte edilmeden önce genç yetişkinl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Deney başarılı olursa,F1 larvaları ilgilenilen transgen ve / veya mutant fenotipini ifade edecektir (Şekil 4). Bununla birlikte, dönüşüm oranları oldukça değişkendir ve yapılara, solucanların sağlığına, enjeksiyon sonrası kültürleme koşullarına ve deneycinin becerisine bağlıdır. Genel olarak, başarılı bir deney, enjekte edilen dişi başına >15 F1 larva ve floresan belirteçler için% >3'lük bir dönüşüm oranı verecektir. Toplam canlı döl sayısı ortalama 10 larva / diş.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu mikroenjeksiyon protokolü, transgenez ve CRISPR / Cas9 aracılı mutagenez için yapıları S. stercoralis ve S. ratti'ye tanıtma yöntemlerini detaylandırır. Hem S. stercoralis hem de S. ratti için, enjeksiyon sonrası sağkalım ve transgenez veya mutajenez oranı, ince ayar yapılabilen çeşitli değişkenlere tabidir.
Başarılı transgenez için ilk kritik düşünce, plazmid transgenlerinin nasıl oluşturulduğudur. Önceki çalışmalar, Strongyloides'teki eksojen transgenl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
pPV540 ve pPV402, Pennsylvania Üniversitesi'nden Dr. James Lok'un nazik hediyeleriydi. Astra Bryant'a makale hakkındaki yararlı yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Hastalığın Patogenezinde Burroughs-Wellcome Fonu Araştırmacıları Ödülü, Howard Hughes Tıp Enstitüsü Fakülte Bursiyeri Ödülü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 DC017959 (E.A.H.) tarafından finanse edilmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| (&eksi;)-Nikotin, ≥ %99 (GC), sıvı | Kurtları felç etmek için | Sigma-Aldrich | N3876-5ML |
| 3" demir C-kelepçe, 3" x 2" (kapasite x derinlik) | VWR | 470121-790 | Tezgah üstü kurulumu sabitlemek için C-kelepçe |
| Slaytlar için Agarose LE | Phoenix | RBA-500 | agaroz |
| Kemik kömürü, 4 lb kova, 10 x 28 ağ | Dışkı-odun | Ebonex | yok |
| Kemik kömürü, granüller, 10 x 28 ağ | Reade | bonechar10x28 | odun kömürü (yukarıdakilere alternatif) |
| Kaba mikromanipülatör | Narishige | MMN-1 | kaba mikromanipülatör |
| Corning Costar Spin-X santrifüj tüpü filtreleri | Fisher | 07-200-385 | mikrofiltre sütunu |
| Kapak camı, 48 x 60 mm, No. 1 kalınlık | Beyin Araştırma Laboratuvarı | 4860-1 | lameller (48 x 60 mm) |
| Derin Petri kapları, 6 havalandırma deliği, 100 mm çaplı ağır versiyon | VWR | 82050-918 | 10 cm Petri kapları (dışkı-kömür kültürleri için) |
| Eisco imbik tabanı, çubuklu | Fisher | 12-000-101 | Baermann cihazı için stand |
| Eppendorf FemtoJet mikro enjektör mikro yükleyici uçları | VWR | 89009-310 | mikroenjeksiyon iğnelerini doldurmak için |
| Fisherbrand emici alt pedler Fisher | 14-206-62 | tezgah kağıdı (hazırlamak için) | |
| Fisherbrand Dökme Demir Halkalar | Fisher | 14-050CQ | Baermann o-ring |
| Fisherbrand üç köşeli polipropilen beherler Fisher | 14-955-111F | Plastik beher (karıştırma için) | |
| Fisherbrand üç köşeli polipropilen beherler | Fisher | 14-955-111F | Plastik beher (yakalama kovası/su kovası için) |
| Fisherbrand üç köşeli polipropilen beherler | Fisher | 14-955-111F | Plastik beher (x2) (tutucu yapmak için) |
| Şırıngada Gorilla epoxie | McMaster-Carr | 7541A51 | tutkal (boru takmak için) |
| Halokarbon yağı 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | halokarbon yağı |
| Yiyecek ve içecek için yüksek sıcaklıkta silikon kauçuk boru, 1/2 "ID, 5/8" OD | McMaster-Carr | 3038K24 | boru (huni için) |
| KIMAX hunileri, uzun sap, 60 derece; Açı, Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Baermann hunisi |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science tezgah üstü koruyucular | Fisher | 15-235-101 | tezgah kağıdı (hazırlamak için) |
| Floresan özellikli Leica stereomikroskop | Transgenik solucanları tanımlamak ve sıralamak için | Leica | M165 FC |
| microINJECTOR pirinç düz kol iğne tutucu | Tritech | MINJ-4 | mikroenjeksiyon iğne tutucu |
| microINJECTOR sistemi | Tritech | MINJ-1 | mikroenjeksiyon sistemi |
| Moğol Gerbilleri | Charles Nehri Laboratuvarları | 213-S | . stercoralis'in bakımı için Moğol Gerbil gerbilleri, erkek 4-6 hafta |
| Nasco Whirl-Pak kolay kapatılabilir çantalar, 18 oz | VWR | 11216-776 | Whirl-Pak numune torbaları |
| Naylon tül (ağ) | Jo-Ann Kumaşlar | zprd_14061949a | Baermann tutucu için naylon örgü |
| Platin tel, 36 Gauge, inç başına | Thomas Scientific | 1233S72 | solucan penaları için platin/iridyum tel |
| Püriten dil bastırıcılar, 152 mm (U) x 17,5 mm (G) | VWR | 62505-007 | ahşap çubuklar (numuneleri karıştırmak için) |
| QIAprep Spin Miniprep Kiti (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN mini hazırlık kiti |
| Sıçanlar-Uzun Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE | S. ratti'nin bakımı için uzun Evans sıçanları, dişi 4-6 hafta |
| Sıçanlar-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd: Sprague Dawley S | . ratti'nin bakımı için SD sıçanlar, dişi 4-6 hafta |
| Gerçekten Kullanışlı Kutular kapaklı yarı saydam saklama kutuları, 1,6 L kapasiteli, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Ofis Deposu | 452369 | nemlendirilmiş oda |
| için plastik kutularÇoban teknoloji panosu, 8 x 16,5 inç | Newco | 999589 | teknoloji panosu |
| Paslanmaz çelik yükseltilmiş tel zemin | Ancare | R20SSRWF | tel kafes altları |
| StalkMarket kompostlanabilir çatal bıçak takımı kaşıkları, 6", beyaz, 1.000'lik paket | Ofis Deposu | 9587303 | kaşık |
| Stender kabı, istifleme tipi, 37 x 25 mm | Carolina (Bilim) | 741012 | saat gözlükleri (küçük, yuvarlak) |
| Stereomikroskop | Motic | K-400 LED | diseksiyon hazırlık kapsamı |
| Depolama çantası, renk açık/beyaz, dış yükseklik 4-7/8 inç, dış uzunluk 13-5/8 inç, Sterilit | Grainger | 53GN16 | nemlendirilmiş hazne için plastik kutular |
| Sutter P-30 mikropipet çektirme | Platin/iridyum filamentli Sutter | P-30/P | |
| Syracuse saat gözlükleri | Fisher | S34826 | saat gözlükleri (büyük, yuvarlak) |
| Thermo Scientific Castaloy sabit açılı kelepçeler | Fisher | 05-769-2Q | huni kelepçeleri (2x) |
| Üç eksenli asılı joystick yağ hidrolik mikromanipülatör | Narishige | MM0-4 | ince mikromanipülatör |
| Birleşik Mohr pinchcock kelepçeleri | Fisher | S99422 | Sıkıştırma kelepçeleri (2x) |
| Havalandırmalı, keskin kenarlı Petri kapları (60 mm çap) | Tritech Araştırma | T3308P | 6 cm Petri kapları (küçük ölçekli dışkı-kömür kültürleri için) |
| VWR hafif hizmet tipi doku silecekleri | VWR | 82003-820 | Baermann tutucu |
| saat camı için astar, kare, Carolina'da 1-5/8 | (Bilim) | 742300 | saat camı (küçük, kare) |
| Whatman kalitatif sınıf düz daireler, derece 1, 5,5 cm çap | Fisher | 09-805B | filtre kağıdı (6 cm Petri için tabaklar) |
| Whatman kalitatif sınıf düz daireler, sınıf 1, 9 cm çap | Fisher | 09-805D | filtre kağıdı (10 cm Petri kapları için) |
| World Precision Instrument borosilikat cam kılcal, 1,2 mm x 4 inç | Fisher | 50-821-813 | mikroenjeksiyon iğneleri için cam kılcal damarlar |
| X-Acto Bıçakları, 11 No'lu Bıçaklı 1 No'lu Bıçak | Ofis Deposu | 238816 | Solucan kazmalarını tutmak için bıçaksız X-Acto bıçakları |
| Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n/a | ters mikroskop |
Kaynaklar
- Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165(2013).
- Buonfrate, D., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
