Summary
O kit de ferramentas genômicas funcionais para os nematoides parasitéticos Strongyloides stercoralis e Strongyloides ratti inclui transgênese, mutagênese mediada por CRISPR/Cas9 e RNAi. Este protocolo demonstrará como usar a microinjeção intragonadal para introduzir componentes transgenes e CRISPR em S. stercoralis e S. ratti.
Abstract
O gênero Strongyloides consiste em várias espécies de nematoides penetrantes na pele com diferentes faixas hospedeiras, incluindo Strongyloides stercoralis e Strongyloides ratti. S. stercoralis é um nematode parasitário humano-parasitico e penetrante na pele que infecta aproximadamente 610 milhões de pessoas, enquanto o parasita de rato S. ratti está intimamente relacionado com S. stercoralis e é frequentemente usado como modelo de laboratório para S. stercoralis. Tanto S. stercoralis quanto S. ratti são facilmente favoráveis à geração de transgênicos e nocautes através da técnica de entrega de ácido nucleico exógeno da microinjeção intragonadal, e como tal, surgiram como sistemas de modelo para outros helmintos parasitas que ainda não são favoráveis a esta técnica.
Os adultos parasitéticos Strongyloides habitam o intestino delgado de seu hospedeiro e liberam descendentes no ambiente através das fezes. Uma vez no ambiente, as larvas se desenvolvem em adultos livres, que vivem em fezes e produzem descendentes que devem encontrar e invadir um novo hospedeiro. Esta geração ambiental é única para as espécies Strongyloides e semelhante o suficiente em morfologia ao modelo nematode de vida livre Caenorhabditis elegans que técnicas desenvolvidas para C. elegans podem ser adaptadas para uso com esses nematoides parasitas, incluindo microinjeção intragonadal. Usando microinjeção intragonadal, uma grande variedade de transgenes pode ser introduzida em Strongyloides. Os componentes CRISPR/Cas9 também podem ser microinjetados para criar larvas mutantes strongyloides . Aqui, descreve-se a técnica de microinjeção intragonadal em Strongyloides, incluindo a preparação de adultos livres, o procedimento de injeção e a seleção de progêneria transgênica. Imagens de larvas transgênicas strongyloides criadas usando mutagênese CRISPR/Cas9 estão incluídas. O objetivo deste artigo é permitir que outros pesquisadores usem a microinjeção para criar strongyloides transgênicos e mutantes.
Introduction
Strongyloides stercoralis tem sido negligenciado por muito tempo como um importante patógeno humano comparado com as minhocas mais reconhecidas e a lombriga Ascaris lumbricoides1. Estudos anteriores de carga de vermes muitas vezes subestimaram severamente a prevalência de S. stercoralis devido à baixa sensibilidade dos métodos diagnósticos comuns para S. stercoralis2. Nos últimos anos, estudos epidemiológicos baseados em ferramentas de diagnóstico aprimoradas estimaram que a verdadeira prevalência de infecções por S. stercoralis é muito maior do que o relatado anteriormente, aproximadamente 610 milhões de pessoas em todo o mundo2.
Tanto S. stercoralis quanto outras espécies strongyloides, incluindo o parasita de rato intimamente relacionado e o modelo de laboratório comum S. ratti, têm um ciclo de vida incomum que é vantajoso para estudos genômicos experimentais porque consiste tanto das gerações parasitárias quanto de vida livre (ambiental)3 (Figura 1). Especificamente, tanto S. stercoralis quanto S. ratti podem percorrer uma única geração de vida livre. A geração de vida livre consiste em larvas pós-parasitárias que se desenvolvem em machos e fêmeas adultos vivos livres; toda a descendência dos adultos livres se desenvolve em larvas infecciosas, que devem infectar um hospedeiro para continuar o ciclo de vida. Além disso, essa geração ambiental ou de vida livre pode ser manipulada experimentalmente em laboratório. Como adultos strongyloides de vida livre e adultos C. elegans compartilham morfologia semelhante, técnicas como microinjeção intragonadal que foram originalmente desenvolvidas para C. elegans podem ser adaptadas para uso com strongyloidesadultos de vida livre 4,5. Enquanto o DNA é geralmente introduzido em fêmeas adultas de vida livre, tanto machos quanto fêmeas de Strongyloides podem ser microinjetados6. Assim, ferramentas genômicas funcionais estão disponíveis para interrogar muitos aspectos da biologia de Strongyloides. Outros nematoides parasitas não possuem uma geração livre e, como resultado, não são tão facilmente favoráveis às técnicas genômicas funcionais3.
Figura 1: O ciclo de vida Strongyloides stercoralis. As fêmeas parasitárias S. stercoralis habitam o intestino delgado de seus hospedeiros mamíferos (humanos, primatas não humanos, cães). As fêmeas parasitas se reproduzem por partenogênese e colocam ovos dentro do intestino delgado. Os ovos eclodem enquanto ainda estão dentro do hospedeiro em larvas pós-parasitárias, que são então passadas para o ambiente com fezes. Se as larvas pós-parasitárias são machos, elas se desenvolvem em machos adultos vivos livres. Se as larvas pós-parasitárias forem fêmeas, elas podem se desenvolver em fêmeas adultas de vida livre (desenvolvimento indireto) ou larvas infecciosas de terceiro estágio (iL3s; desenvolvimento direto). Os machos e fêmeas que vivem livremente se reproduzem sexualmente para criar descendentes que são constrangidos a se tornarem iL3s. Sob certas condições, S. stercoralis também pode sofrer autoinfecção, na qual algumas das larvas pós-parasitárias permanecem dentro do intestino hospedeiro em vez de passar para o ambiente em fezes. Essas larvas podem evoluir para larvas autoinfetivas (L3a) dentro do hospedeiro, penetrar através da parede intestinal, migrar através do corpo e, eventualmente, retornar ao intestino para se tornarem adultos reprodutivos. O ciclo de vida de S. ratti é semelhante, exceto que S. ratti infecta ratos e não tem um ciclo autoinfetivo. A geração ambiental é fundamental para o uso de espécies Strongyloides para estudos genéticos. As fêmeas adultas de vida livre (P0) podem ser microinjetadas; sua descendência, que todos se tornarão iL3s, são os transgênicos F1 potenciais. Este valor foi modificado de Castelletto et al. 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
S. stercoralis compartilha muitos aspectos de sua biologia com outros nematoides gastrointestinais humanos-parasitas, incluindo invasão de hospedeiro e modulação imunológica hospedeira. Por exemplo, as minhocas parasitárias humanas nos gêneros Necator e Ancylostoma também infectam pela penetração da pele, navegam de forma semelhante através do corpo e, em última análise, residem como adultos parasitas no intestino delgado7. Assim, muitos nematoides gastrointestinais provavelmente usam comportamentos sensoriais comuns e técnicas de evasão imunológica. Como resultado, o conhecimento obtido de Strongyloides complementará os achados em outros nematoides menos geneticamente tratáveis e levará a uma compreensão mais completa desses parasitas complexos e importantes.
Este protocolo de microinjeção descreve o método para introduzir DNA em fêmeas adultas de vida livre strongyloides para fazer prole transgênico e mutante. Os requisitos de manutenção da cepa, incluindo o tempo de desenvolvimento de vermes adultos para microinjeções e a coleta de progêneria transgênica, são descritos. Protocolos e uma demonstração da técnica completa de microinjeção, juntamente com protocolos para cultivo e triagem de progêneria transgênica, estão incluídos, juntamente com uma lista de todos os equipamentos e consumíveis necessários.
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Protocol
NOTA: Gerbils foram usados para passagem de S. stercoralis, e ratos foram usados para passagem de S. ratti. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Escritório de Supervisão de Pesquisa Animal da UCLA (Protocolo nº 2011-060-21A), que adere às normas AAALAC e ao Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. As seguintes tarefas devem ser concluídas pelo menos um dia antes da microinjeção: cultivo de vermes, preparação de almofadas de microinjeção, criação de construções para a mistura de microinjeção e disseminação de bactérias (E. coli HB101)em placas de 6 cm Nematode Growth Media (NGM). As fêmeas livres requerem uma coleta mínima de 24h pós-fecal a 25 °C para se desenvolverem em adultos jovens antes de serem microinjetadas. As almofadas de microinjeção devem estar completamente secas. As placas bacterianas devem secar e estabelecer um pequeno gramado.
1. Preparação de slides de microinjeção: pelo menos um dia antes de injetar
NOTA: Os vermes são montados em tampas de microinjeção com almofadas de ágar seco para injeção.
- Coloque um bloco de calor a 90 °C.
- Adicione 5 mL de ddH2O, depois 100 mg de agarose a um tubo de vidro borossilicato.
- Aqueça a mistura de agarose no tubo sobre uma chama até que a agarose seja dissolvida.
- Coloque o tubo em um bloco de calor definido a 90 °C para manter a agarose no estado líquido.
- Solte ~180 μL da solução agarose em um deslizamento de tampa usando uma tubulação pasteur de vidro ou uma tubulação com uma ponta de plástico. Imediatamente solte uma segunda mancha de cobertura em cima para achatar a agarose em uma almofada fina.
- Depois de 5-10 s, remova a tampa superior deslizando os dois para fora. Determine em que slide a almofada de ágar está e coloque-a de frente para cima.
- Selecione um pequeno pedaço de fragmento de vidro de uma mancha de cobertura quebrada e pressione-o suavemente no ágar perto da borda superior da almofada usando fórceps (Figura Suplementar S1).
- Continue fazendo almofadas de microinjeção com a solução agarose.
- Seque as almofadas de agarose durante a noite no banco ou em um forno. Guarde na caixa de deslizamento.
NOTA: As almofadas de agarose podem ser usadas por até 2 meses, mas são usadas apenas para uma corrida de injeção.
2. Culturing Strongyloides para obter vermes para microinjeção: 1 - 2 dias antes da injeção
NOTA: Um protocolo de manutenção de cepas pode ser encontrado no Material Suplementar, que inclui uma descrição detalhada de como infectar gerbils e ratos com nematoides e colher nematoides das fezes de animais infectados.
- Dois dias antes do dia da injeção, coloque os animais infectados 9,10 em gaiolas de coleta durante a noite.
- Na manhã seguinte, recolher fezes infestadas e fazer placas fecais-carvão 9,10.
- Coloque uma placa a 25 °C por 24 h para permitir que os vermes livres se desenvolvam em adultos jovens.
- Na noite anterior ao dia da injeção, coloque animais hospedeiros não infectados em gaiolas de coleta.
- No dia da injeção, colete fezes não infestadas para cultivo pós-injeção.
3. Fazer a mistura de microinjeção: antes ou no dia da injeção
NOTA: A mistura de microinjeção consiste nos plasmídeos de interesse diluídos à concentração desejada em soro fisiológico tamponado por verme (BU) (50 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 70 mM NaCl)11.
- Determine a concentração dos estoques plasmídeos e a concentração desejada na mistura de microinjeção (Tabela 1).
| Mistura de microinjeção: construção de repórter | |||
| Componente | Concentração de Estoque | Quantidade | Concentração Final |
| pMLC30 gpa-3:::gfp | 300 ng/μL | 1,7 μL | 50 ng/μL |
| Bu | na | 8,3 μL | na |
| total | 10 μL | 50 ng/μL | |
| Mistura de microinjeção: MUTAGÊNESE CRISPR/Cas9 | |||
| Componente | Concentração de Estoque | Quantidade | Concentração Final |
| pMLC47 imposto-4 sgRNA | 300 ng/μL | 2,7 μL | 80 ng/μL |
| pEY11 Ss-tax-4 HDR plasmid | 400 ng/μL | 2,0 μL | 80 ng/μL |
| pPV540 strCas9 plasmid | 350 ng/μL | 1,1 μL | 40 ng/μL |
| Bu | na | 4,2 μL | na |
| total | 10 μL | 200 ng/μL | |
| Mistura de microinjeção: integração cofrinhoBac | |||
| Componente | Concentração de Estoque | Quantidade | Concentração Final |
| pMLC30 gpa3::gfp | 300 ng/μL | 2,0 μL | 60 ng/μL |
| pPV402 transposase plasmid | 450 ng/μL | 0,9 μL | 40 ng/μL |
| Bu | na | 7,1 μL | na |
| total | 10 μL | 100 ng/μL | |
Tabela 1: Exemplos de misturas de microinjeção. Os plasmídeos e concentrações para três misturas de microinjeção de exemplo: uma para um gpa-3::GFP repórter construção10, uma para crispr/cas9-mediada interrupção do lócus Ss-tax-4 14,15, e uma para a integração mediada por PiggyBac de um Ss-gpa-3::GFP construto 13,17,18. strCas9 denota o gene Cas9 otimizado para codon strongyloides. As concentrações finais listadas são comumente usadas em misturas de microinjeção Strongyloides.
- Diluir os plasmídeos em BU para um volume total de 10-20 μL.
- Gire a mistura através de uma coluna de filtro a 5.000 × g por 1-2 min.
- Use a mistura de microinjeção imediatamente ou armazene-a a -20 °C para uso futuro.
4. Colete strongyloides para microinjeção: manhã do dia da injeção
- Configure o aparelho Baermann com 1 placa fecal-carvão de strongyloides jovens adultos (Figura 2).
NOTA: A placa fecal-carvão pode conter algumas larvas infecciosas. O equipamento de proteção individual consiste em um jaleco, luvas e proteção ocular. Nenhuma pele deve ser exposta entre a luva e a manga do jaleco.
Figura 2: O aparelho Baermann costumava coletar vermes parasitas das culturas10. O conteúdo de uma placa fecal-carvão é colocado no topo de uma coluna de água morna. Os vermes migram para a água e coletam no fundo do funil. (A) Para configurar o aparelho Baermann, a posição do funil Baermann é presa ao banco com um grampo C. Um tubo de borracha preso à extremidade do funil é fechado com grampos de beliscão, e um balde de captura é colocado sob o tubo para gotejamentos. Água morna é adicionada ao funil de vidro. (B) O suporte do anel plástico para a mistura fecal-carvão é então forrado com 3 pedaços de tecidos de laboratório (esquerda). Uma vara de madeira ou depressor de língua (meio) é usado para transferir o conteúdo de uma placa fecal-carvão (à direita) para o suporte do anel de plástico. (C) Um close-up da parte inferior do suporte do anel plástico para a mistura fecal-carvão, mostrando a camada dupla de tule de nylon forrando a parte inferior do suporte. (D) O suporte de carvão fecal é então colocado na parte superior do funil de vidro. (E) O tecido de laboratório é umedecido com água e fechado sobre a mistura fecal-carvão. Mais água morna é adicionada para submergir principalmente o carvão fecal. (F) A configuração completa de Baermann, com a cultura fecal-carvão submerso sob água morna. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Instale um funil de vidro com tubos de coleta de borracha em um suporte de anel usando um anel O e fixe-o com um grampo. Feche a tubulação de coleta com 2 grampos de pinça (Figura 2A).
- Coloque um balde debaixo do funil para pegar gotas.
- Adicione água quente (aproximadamente 40 °C) ao funil a 5 cm abaixo da borda. Verifique se o sistema não está vazando.
- Fora o suporte Baermann, uma peneira feita de 2 anéis plásticos com 2 camadas de rede de tule de nylon presas entre eles, com 3 pedaços sobrepostos de tecido de laboratório. Adicione a mistura fecal-carvão ao suporte Baermann (Figura 2B,C).
- Coloque o suporte Baermann com a mistura fecal-carvão no funil. Dobre os tecidos ao redor da mistura fecal-carvão e adicione água suficiente para submergir a maior parte do carvão fecal. Não encha acima de 2 cm da borda do funil (Figura 2D,E).
- Cubra o funil com uma tampa de placa de Petri de plástico de 15 cm para conter o odor. Rotule o funil conforme necessário (Figura 2F).
- Espere 30 min a 1 h para recolher os vermes do aparelho Baermann.
- Segure um tubo de centrífugas de 50 mL sob a tubulação de borracha na parte inferior do funil. Abra cuidadosamente os grampos na parte inferior para distribuir 30-40 mL de água contendo vermes no tubo de 50 mL.
- Transfira 15 mL da água Baermann contendo os vermes para um tubo de centrífuga de 15 mL. Gire o tubo de centrífuga de 15 mL por 1 min a ~750 × g (lento). Alternativamente, permitir que os vermes se contentem com 10-15 min.
- Remova o supernatante para ~2 mL e descarte o supernatante em um recipiente líquido de resíduos com iodo para matar qualquer verme.
- Adicione mais água Baermann ao tubo de coleta de 15 mL e repita o giro. Remova o supernatante para ~2 mL e descarte como na etapa 4.11.
- Repita as etapas 4.11 e 4.12 até que todos os vermes sejam coletados no tubo centrífuga de 15 mL. Após o giro final, remova o máximo de água possível.
- Inspecione a pelota de vermes (40-100 μL) na parte inferior do tubo. Se nenhum verme for visível, espere por mais 1-2 h e tente coletar mais vermes do aparelho Baermann.
- Transfira os vermes em tão pouca água quanto possível para uma placa de 6 cm 2% de NGM com um gramado de E. coli HB101. Use esta placa como a placa de origem para a microinjeção.
- Descarte a mistura fecal-carvão tratando-a com iodo diluído (uma diluição de 50% do iodo de Lugol na água), embrulhando-o em filme plástico para pegar gotas, e colocando-o em um recipiente de resíduos de risco biológico.
- Adicione 10 mL de iodo diluído ao balde de captura e escorra o excesso de água do Baermann nele.
- Lave os componentes reutilizáveis (o funil, o balde de captura, o suporte plástico com tule, a tampa plástica e os grampos) com 10% de alvejante e enxágue bem.
5. Puxar e carregar agulhas de microinjeção: pouco antes da injeção
- Prepare agulhas de microinjeção puxando tubos capilares de vidro usando um puxador de agulha.
NOTA: As configurações de exemplo para um puxador de agulha comercial equipado com um filamento de platina/irídio de 3 mm são Calor = 810-820, Pull = 800-820, micrômetro = 2,5. - Veja as dicas em um microscópio de dissecação. Se as agulhas tiverem a forma desejada (Figura 3A-F), puxe agulhas 4-6 (2-3 tubos capilares). Para alcançar a forma adequada da agulha, altere as configurações conforme necessário: ajuste as configurações de Calor ou Puxão por 10 e puxe novas agulhas até que a forma do afunilador e do eixo sejam mais apropriadas.
Figura 3: Agulhas de microinjeção e uma fêmea adulta Strongyloides stercoralis com locais ideais para microinjeção identificadas. (A-F) Imagens de agulhas de microinjeção. (A-B) O eixo (A) e a ponta (B) de uma agulha que é corretamente moldada para microinjeção. A ponta é afiada o suficiente para perfurar a cutícula e estreita o suficiente para não causar danos excessivos. (C-D) O afunilador do eixo (C) e a ponta (D) de uma agulha de microinjeção que é incorretamente moldada para microinjeção. A ponta é muito contundente e larga, e causará danos excessivos ao verme. (E-F) O eixo (E) e a ponta (F) de uma agulha que provavelmente será muito longa e esbelta para trabalhar para microinjeção. A dica em F é muito semelhante à ponta em D. No entanto, o eixo é mais estreito e flexível demais para perfurar efetivamente a cutícula. Além disso, agulhas muito esbeltas entupem facilmente. (G) Uma imagem de todo o verme corretamente posicionada para microinjeção, assumindo que a agulha está vindo da direita. Anterior é para baixo e para a esquerda; a vulva é indicada pela ponta da flecha. A gônda é visível ao longo do lado direito da fêmea. Esta fêmea tem apenas um óvulo no útero (indicado pelo asterisco). (H, I) Vistas ampliadas dos locais de microinjeção. O ângulo da seta aproxima o ângulo da agulha de injeção. A vulva pode ser usada como um marco; está no lado oposto do verme dos braços da gônus. Os braços da gônnad curva ao redor do intestino, e as extremidades com os núcleos divisórias são opostos à vulva. (H) O braço posterior da gônada; (I) o braço anterior. Ou ambos os braços podem ser injetados. Para H, eu, convenções são como em G. Barras de escala = 50 μm (B, D, F, H, I); 100 μm (A, C, E, G). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Guarde as agulhas puxadas em uma placa de Petri de plástico de 15 cm com um pedaço de fita laminada para fixar as agulhas e para evitar o acúmulo de poeira nas pontas.
- Coloque uma gota de 0,7 μL da mistura de microinjeção na extremidade aberta do eixo. Pendure a agulha perpendicular a uma prateleira usando um pedaço de fita laminado para encher o eixo afilado com a mistura dentro de 10 minutos. Prepare 2 agulhas de cada vez caso a primeira não funcione.
6. Preparar o microscópio e quebrar a agulha
NOTA: A microinjeção utiliza um microscópio invertido com objetivos de 5x e 40x equipados com uma configuração de microinjetor para controlar o movimento da agulha. O microscópio invertido deve ser colocado sobre uma mesa pesada ou mesa de ar anti-vibração para reduzir o ruído vibracional. O suporte de agulha microinjetor está conectado ao gás nitrogênio que aplica a pressão necessária para entregar a mistura de microinjeção. Um microscópio de dissecação menor nas proximidades é usado para transferir os vermes.
- Coloque a pressão do tanque de gás em ~40-60 psi para quebrar a agulha e ~30-50 psi para microinjeção, dependendo do fluxo líquido.
- No microscópio de dissecação, cubra o fragmento de vidro na tampa da almofada de microinjeção com óleo de halocarboneto usando uma picareta de verme de platina padrão.
- Coloque a tampa da almofada de microinjeção no escopo da microinjeção e localize o fragmento de vidro coberto de óleo. Alinhe o fragmento de vidro de tal forma que uma borda seja perpendicular à direção da agulha para servir como a superfície usada para quebrar a agulha.
- Verifique se a agulha não tem bolhas ou detritos no eixo afilado usando o microscópio de dissecação. Em seguida, fixar a agulha de 1-1,5 cm no suporte pressurizado.
- Posicione a ponta da agulha no centro do campo de microscópio de visão a olho. Em seguida, sob baixa ampliação, posicione a ponta da agulha no campo de visão, perpendicular ao lado do fragmento de vidro.
- Mude para alta potência e alinhe a ponta da agulha com a borda do vidro, perto, mas não tocá-la.
NOTA: Quando puxadas, as agulhas são fundidas fechadas. - Para quebrar a ponta da agulha para permitir o fluxo líquido, bata-a suavemente na lateral do pedaço de vidro enquanto aplica pressão contínua do gás (Figura Suplementar S1). Uma vez que o líquido comece a fluir, verifique a forma da ponta e certifique-se de que ela está afiada com líquido fluindo facilmente.
NOTA: Se o líquido estiver fluindo muito rápido ou a extremidade estiver muito brusca, os vermes serão danificados durante a microinjeção (Vídeo 1 e Figura 3A-F). - Quando o líquido estiver fluindo bem da agulha, mova o slide de microinjeção para o escopo de dissecação e coloque gotas de óleo de halocarbono de 1-2 μL na almofada de ágar para colocação dos vermes.
- Transfira 20-30 strongyloides jovens adultos para uma placa de 2% de NGM sem bactérias por pelo menos 5 minutos para remover bactérias superficiais em excesso e selecionar vermes únicos para microinjeção. Adicione mais worms à placa NGM conforme necessário durante a injeção.
7. Microinjeção strongyloides
- Use uma pequena quantidade de óleo de halocarbono em uma picareta de vermes para selecionar uma fêmea adulta jovem Strongyloides com 1-4 ovos em sua gônnad da placa de 2% NGM sem bactérias.
- Transfira o verme para uma pequena gota de óleo no ágar pad. Usando a picareta de verme, posicione suavemente o worm para que ele não seja enrolado e a gônada seja visível e de fácil acesso. Observe a direção da gôngeo (Figura 3G).
- Posicione o verme no campo de visão do microscópio de microinjeção. Certifique-se de que a gônada está do mesmo lado da agulha e posicionada para que a agulha entre em contato com a gônada em um leve ângulo (Figura 3H,I).
- Leve a ponta da agulha para o lado do verme no mesmo plano focal. Mire no braço de gônada perto do meio do verme. Use o microinjetor para inserir a agulha suavemente na gônada (Vídeo 2).
- Aplique imediatamente pressão na agulha para encher suavemente todo o braço da gônada com a solução de DNA. Determine pelo olho quando o fluido suficiente foi injetado (Vídeo 2).
NOTA: Pode levar até 2 s para encher a gônus. - Remova a agulha e verifique se a ferida se fecha.
NOTA: O verme está muito danificado para produzir prole se a gôndula se projetar através da parede do corpo (Vídeo Suplementar S1). - Repita com o outro braço da gônada se estiver visível.
- Quando terminar a injeção, verifique rapidamente se a agulha não está entupida aplicando pressão com a ponta da agulha no ágar pad. Transfira o slide com o verme injetado para o microscópio de dissecação.
- Para recuperar o verme injetado, primeiro lugar algumas gotas de BU no verme para flutuar-lo fora do ágar pad.
- Colete uma pequena quantidade de bactérias HB101 em uma picareta de vermes. Toque no verme com as bactérias aderentes na picareta de vermes para removê-lo do líquido.
- Transfira suavemente o worm para a placa de recuperação , uma placa de 2% de NGM contendo um gramado HB101.
NOTA: O verme deve começar a rastejar em poucos minutos. - Depois que algumas fêmeas foram injetadas, adicione alguns machos não injetados da placa de origem.
NOTA: O mínimo de um macho para cinco fêmeas é uma boa linha de base; um excesso de machos é preferido. - Repita todos os passos até que fêmeas suficientes tenham sido injetadas para o experimento.
- Deixe os adultos na placa de recuperação por pelo menos 1h após a injeção para permitir que os vermes se recuperem e acasalem.
8. Recuperação e cultivo de Strongyloides injetados
- Coletar fezes durante a noite de animais hospedeiros não infectados, usando o mesmo protocolo que para animais infectados.
- Misture as fezes não infestadas com uma pequena quantidade de carvão (fezes à relação carvão de aproximadamente 2 a 1 para essas placas).
- Despeje uma pequena quantidade da mistura fecal-carvão em uma placa de Petri de 6 cm forrada com papel filtro úmido. Certifique-se de que a mistura não toque na tampa do prato.
- Diluir a placa de recuperação com BU. Utilizando um conjunto de tubulação a 3 μL, transfira os vermes para as fezes na placa fecal-carvão. Coloque os vermes diretamente nas fezes, não no carvão.
- Verifique se os adultos estão na placa fecal-carvão usando um escopo de dissecação.
- Para cultivar os vermes, coloque a placa em uma câmara umidificada, ou seja, uma caixa de plástico com uma tampa apertada forrada com toalhas de papel úmidas.
NOTA: Após 2 dias, haverá uma mistura de estágios larvais. Após 5 dias, a maioria das larvas terá se desenvolvido em iL3s; algumas larvas mais jovens permanecerão. Depois de 7 dias, todas as larvas devem ser iL3s.
9. Coleta e triagem de larvas F 1 para recuperar transgênicos/nocautes
- Usando uma configuração Baermann, colete as larvas das placas de cultivo de carvão fecal de pequena escala pós-injeção. Para obter o máximo de larvas possível, espere pelo menos 2 h antes de recuperar os vermes do aparelho Baermann.
- Concentre as larvas em um tubo de centrífuga de 15 mL como nos passos 4.10-4.14 e transfira as larvas para um pequeno vidro de relógio com BU.
- Se as larvas serão usadas para experimentos comportamentais, use placas de NGM de 2% com um gramado grosso de HB101 para triagem.
- Transfira 20-30 larvas para o gramado HB101.
NOTA: A bactéria vai retardar o movimento das larvas. - Sob um microscópio de dissecação de fluorescência, identifique as larvas expressando o transgene de interesse. Use uma picareta de vermes para selecionar as larvas transgênicas e movê-las para um pequeno vidro de relógio com BU.
- Use uma nova placa HB101 para testar outro pequeno lote de larvas. Quando forem coletadas larvas suficientes para uso experimental, trate as placas hb101 e o excesso de vermes com iodo diluído (50% de iodo lugol diluído em água) e descarte-os como resíduos de risco biológico. Alternativamente, mate o excesso de vermes usando limpador de canil concentrado contendo cloretos de amônio benzilo.
- Use os worms imediatamente ou deixe-os em um vidro de relógio raso em uma pequena quantidade de BU durante a noite.
NOTA: Os vermes podem ficar hipóxicos se o líquido for muito profundo. É possível que deixar larvas na BU durante a noite pode afetar certos comportamentos; portanto, use larvas para experimentos comportamentais dentro de 6 h.
- Transfira 20-30 larvas para o gramado HB101.
- Se as larvas serão usadas para microscopia e não ensaios comportamentais, então imobilize os vermes por paralisia de nicotina reversivelmente para triagem.
- Usando uma lâmina de barbear, marque uma grade no fundo plástico de uma placa de 10 cm de quimioterapia12 para facilitar o controle da localização dos vermes na placa.
- Solte ~3 μL de larvas em BU em um quadrado na grade. Encha quantos quadrados necessários. Não utilize os próximos às bordas da placa, pois as larvas podem rastejar para os lados da placa.
- Adicione 15-20 gotas de μL de 1% de nicotina na água às gotas de verme.
NOTA: Depois de 4 minutos, os vermes ficarão paralisados. - Tela os vermes usando um microscópio dissecando fluorescência.
- Use uma picareta de vermes para transferir as larvas transgênicas para um pequeno vidro de relógio com 1-2 mL de BU.
NOTA: As larvas ficarão paralisadas por várias horas e podem ser facilmente montadas em lâminas de microscópio para microscopia. Se deixado durante a noite em BU, os iL3s se recuperarão e podem ser usados para alguns ensaios ou infecção por hospedeiro mamífero. No entanto, a paralisia da nicotina e a incubação noturna na BU podem afetar certos comportamentos.
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Representative Results
Se o experimento foi bem sucedido, as larvas F1 expressarão o fenótipo de interesse transgênico e/ou mutante (Figura 4). No entanto, as taxas de transformação são altamente variáveis e dependem dos construtos, da saúde dos vermes, das condições de cultivo pós-injeção e da habilidade do experimentador. Em geral, um experimento bem sucedido produzirá > 15 larvas F1 por fêmea injetada e uma taxa de transformação de >3% para marcadores fluorescentes. Se o número total de progêneres vivos é em média menos de 10 larvas/fêmeas, então é possível que a construção seja tóxica, e as larvas transformadas não estejam sobrevivendo. Encontrar um grande número de ovos fluorescentes, mas não larvas fluorescentes, é outra indicação de que a mistura de injeção pode ser tóxica. Ao aprender a técnica pela primeira vez, recomenda-se usar um construto que expresse bem, como o ato-2::mRFPmars, que impulsiona a expressão robusta no músculo da parede corporal13 (Figura 4).
Ao gerar mutantes por mutagênese direcionada mediada pelo CRISPR/Cas9, recomenda-se o uso de um modelo de reparo contendo um ato-2::mRFPmars ou act-2::GFP transgene13 é recomendado para que os mutantes potenciais possam ser identificados com base na fluorescência 9,14,15. É importante notar que, como strongyloides expressam transgenes de matrizes extracromosomais, a prole F1 fluorescente pode expressar mRFPmars ou GFP apenas da matriz ou expressar mRFPmars ou GFP tanto da matriz quanto de um transgeneintegrado 3,9,16. É possível identificar larvas mais propensas a ter transgênicos integrados com base no padrão de expressão fluorescente: a expressão "irregular" no músculo da parede corporal (Figura 4A) é mais comum quando o transgene não é integrado ao genoma, enquanto a expressão consistente em todo o músculo da parede corporal (Figura 4B ), muitas vezes, mas nem sempre, indica que o transgene se integrou ao genoma. No entanto, os padrões de expressão sozinhos não podem ser usados para identificar conclusivamente mutantes - alguns vermes com expressão consistente em todo o músculo da parede corporal podem não ter eventos de integração. Além disso, padrões de expressão não podem distinguir mutantes que são homozigos daqueles que são heterozigosos ou mosaicos. Assim, cada verme deve ser pcr genótipado 9,14,15. Ao interromper genes que produzem fenótipos facilmente visíveis, pode não ser necessário usar um modelo de reparo. Por exemplo, a interrupção do gene Strongyloides unc-22 resulta em um fenótipo dominante de "twitcher", com taxas de interrupções heterozigosas ou homozigos acima de 10%9.
Figura 4: Larvas transgênicas Strongyloides stercoralis . (A, B) S. stercoralis larvas expressando um ato-2::mRFPmars transgene, que expressa no músculo da parede corporal13. O transgene foi incorporado em um modelo de reparo para a interrupção mediada pelo CRISPR/Cas9 do lócus Ss-unc-22 9. (A) Uma larva S. stercoralis com um padrão de expressão incompleto ou "irregular", act-2::mRFPmars que pode indicar expressão de uma matriz extracromosomal. (B) Um S. stercoralis iL3 expressando o padrão de expressão act-2::mRFPmars mais completo que pode indicar interrupção genética e integração do modelo de reparo. Para A, B, os painéis mostram contraste de interferência diferencial (esquerda), fluorescente (meio) e imagens mescladas (direita). Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Demonstração do processo de quebra de agulha para fazer uma agulha útil. A ponta da agulha é batida contra a borda de um fragmento de vidro (objeto na extrema esquerda). Quando o líquido emerge, a agulha é puxada para trás e movida para baixo para o ágar. A ponta da agulha chega a um ponto afiado, e o líquido flui moderadamente rápido. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Demonstração de uma injeção bem sucedida. O braço posterior da gônada é visível como uma estrutura cinza clara à direita. A ponta da agulha e a gônada devem estar no mesmo plano focal. Se a agulha deslizar sobre ou sob o verme ou ao longo do corpo sem pegar, ajuste a posição. A ponta da agulha vai ligeiramente dentro da parede do corpo. Uma toque rápida no suporte da agulha presa ao micromanipulador empurrará suavemente a ponta através da parede do corpo e para dentro da gônada. Uma vez que a agulha esteja dentro da gônada, aplique pressão e injete a solução de DNA. O líquido deve inundar visivelmente a gônus. Se a ferida fechar quando a ponta da agulha for removida, é provável que o verme sobreviva. Clique aqui para baixar este vídeo.
Material Suplementar: Manutenção da cepa Strongyloides . Este protocolo descreve o procedimento de manutenção de S. stercoralis em gerbils e S. ratti em ratos. Inclui a dose infecciosa usada para cada nematoide e hospedeiro. Os hospedeiros são infectados por injeções subcutâneas sob anestesia. A progressão das infecções de patência para o pico da produção larval à perda de patência é descrita para cada combinação nematode-hospedeiro. O protocolo usado para coletar fezes infestadas e fazer as placas de cultivo fecal-carvão também é descrito. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S1: Uma imagem de um slide de microinjeção consistindo de uma almofada de ágar seco em um deslizamento de tampa com um pequeno fragmento de vidro para quebrar a agulha de microinjeção. O contorno do ágar e o contorno do fragmento são adicionados aqui para clareza. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Filme Suplementar S1: Demonstração de uma injeção resultando em uma gônus danificada. O braço anterior da gônada está em foco. Aplicar uma leve pressão mostra que a solução na agulha ainda está fluindo livremente. A ponta da agulha está no mesmo plano focal que a gônada e é apontada para um leve ângulo. Uma vez que a ponta da agulha é inserida, a solução é injetada no verme e enche a gônada. No entanto, quando a agulha é removida, um pedaço da gônada se projeta através da ferida na cutícula. O material está visivelmente fluindo. É improvável que este verme sobreviva. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Este protocolo de microinjeção detalha os métodos para a introdução de construções para transgênese e mutagênese mediada por CRISPR/Cas9 em S. stercoralis e S. ratti. Tanto para S. stercoralis quanto para S. ratti, a sobrevida pós-injeção e a taxa de transgênese ou mutagênese estão sujeitas a várias variáveis que podem ser ajustadas.
A primeira consideração crítica para a transgênese bem sucedida é como transgenes plasmídeos são construídos. Estudos anteriores descobriram que a expressão de transgênicos exógenos em Strongyloides requer o uso de promotores strongyloides 5' e 3' utr elementos 3,13,19. Semelhante às construções de C. elegans, as construções strongyloides geralmente usam um promotor específico de genes e um UTR comum de 3'' , como o do gene Ss-era-1 13. A otimização da região de codificação também pode ser importante para a expressão em Strongyloides. Recentemente, o Wild Worm Codon Adaptor, um aplicativo baseado na Web que otimiza sequências de codificação para Strongyloides e outros nematoides, foi desenvolvido20. Finalmente, embora não rigorosamente testados em Strongyloides, introns têm sido mostrados para aumentar a expressão de transgenes exógenos tanto em C. elegans21 quanto no nematode pristionchus pacificus22 associados a insetos e presume-se que aumentou a expressão em Strongyloides também. O Wild Worm Codon Adaptor tem opções para incluir até três introns na sequência modificada20.
A composição e a entrega do mix de microinjeção afetam a taxa de transgênese e a sobrevivência da prole F1 . O soro fisiológico BU é usado rotineiramente como diluído para misturas, embora o uso de ddH2O também seja uma opção. As concentrações e/ou razão de componentes na mistura podem ser ajustadas para melhorar a taxa de transformação. Concentrações mais altas dos plasmídeos de juros podem aumentar a taxa de transgênese, mas muitas vezes resultam em menos descendência total. Se nenhuma expressão transgênica for observada ou apenas ovos transgênicos mortos forem encontrados, é possível que os transgenes sejam tóxicos, ou que algo nos estoques plasmídeos esteja causando a morte dos transgênicos. Neste último caso, fazer novos estoques de plasmídeos usando um método diferente (por exemplo, usando um kit miniprep diferente) pode ser suficiente para a obtenção de transgênicos. Adicionar lipofectamina à mistura de microinjeção também pode melhorar a taxa de transgênese23.
A forma da agulha de microinjeção que fornece a mistura também afeta as taxas de sobrevivência e transgênese (Figura 3A-F, Vídeo 1, Vídeo 2 e Vídeo Suplementar S1). A agulha deve ser afiada o suficiente para penetrar na cutícula e estreita o suficiente para não resultar em danos excessivos. Recomenda-se puxar agulhas pouco antes do uso, pois agulhas armazenadas por mais de um dia podem acumular detritos e ficar entupidas durante microinjeções. Recuperar fêmeas injetadas da almofada de microinjeção sem danificá-las pode ser realizado com alguns métodos diferentes. Uma técnica é flutuar os vermes da almofada de injeção em uma gota de BU, e então usar HB101 em uma picareta de vermes para coletar os vermes. Outras técnicas de recuperação incluem flutuar os vermes em BU e colecioná-los usando uma ponta de pipeta ou um pequeno pincel ou simplesmente usar uma picareta de vermes sozinho para mover os vermes para uma placa de recuperação.
Se nenhuma progêmia foi obtida das fêmeas microinjetadas, isso sugere que ou as fêmeas injetadas foram danificadas no processo de microinjeção ou as condições de cultivo pós-injeção eram subótimas. Há uma série de diferentes condições de cultivo pós-injeção que podem ser experimentas. As culturas fecais-carvão de pequena escala descritas acima geralmente suportam melhor sobrevivência de vermes do que placas de NGM com HB101. No entanto, pode ser difícil acompanhar a sobrevivência dos vermes injetados e o desenvolvimento das larvas F1 em placas de carvão fecal, e os ovos não são visíveis nessas placas. Uma vantagem de esculpir vermes em placas de NGM com HB101 em vez de placas fecais-carvão é permitir a observação cuidadosa do desenvolvimento de ovos e larvas, o que pode ser útil para a solução de problemas. Placas V12 com HB101 também podem ser usadas para aumentar a sobrevivência24. Finalmente, uma placa dequimiotaxis 12 com uma única pelota fecal de rato pode ser usada para a cultura pós-injeção de S. ratti . Os machos e fêmeas injetadas são transferidos diretamente para a pelota fecal de rato. Em 5-7 dias, vermes são coletados do ágar e fezes usando um aparelho Baermann, como descrito acima.
Para obter adultos Strongyloides para microinjeção, placas fecais-carvão recém-preparadas podem ser incubadas a 25 °C por 24 h ou 20 °C por 48 h. Os adultos strongyloides criados a 25 °C por 24 horas são jovens o suficiente para produzir um grande número de progênero25. No entanto, se as fêmeas são muito jovens, elas podem não sobreviver ao processo de microinjeção. Adultos coletados de placas fecais-carvão que foram incubados a 20 °C por ~48 h são mais propensos a tolerar o processo de microinjeção. No entanto, como esses adultos são mais velhos do que os adultos obtidos a partir de uma incubação de 24 h a 25 °C, eles não são tão fecund e podem ter uma taxa de transformação menor. Os novatos podem preferir começar com idosos e depois mudar para adultos ligeiramente mais jovens à medida que as habilidades melhoram.
Como C. elegans, as espécies strongyloides podem expressar transgênicos de matrizes extracromosomais e construções integradas ao genoma na geração F1 . Ao contrário de C. elegans, as espécies strongyloides só expressarão transgenes integrados ao genoma nas gerações F2 e subsequentes, embora as matrizes extracromosomais ainda sejam detectáveis pelo PCR13. As larvas transgênicas F1 que expressam matrizes extracromosomais podem ser usadas para experimentos que não requerem integração de genomas ou um grande número de vermes transgênicos. A integração do genoma pode ser necessária para experimentos que requerem a marcação de genes endógenos ou o teste de um grande número de vermes em ensaios de base populacional. Existem dois métodos para integração genoma de transgenes em Strongyloides: integração mediada por piggyBac17 e integração mediada por CRISPR/Cas99. A integração transposon-mediada por piggyBac usa a transposição de piggyBac para direcionar a carga para locais da TTAA no genoma26. Como o motivo TTAA é bastante comum no genoma rico em AT da espécie Strongyloides , a integração é frequentemente em mais de um local do genoma. Em contraste, a integração mediada pelo CRISPR/Cas9 pode ser usada para integrar transgenes em um locusde destino específico 9.
O sistema CRISPR/Cas9 também pode ser usado para gerar nocautes genéticosdirecionados 9,27. Devido à riqueza AT do genoma Strongyloides, encontrar locais-alvo utilizáveis cas9 contendo a sequência ótima de 5'-N18GGNGG-3' para nematoides28 é um desafio. Frequentemente, há apenas um ou dois locais em um gene para segmentação. O método preferido envolve a integração de um modelo de reparo contendo um transgene com um marcador fluorescente por reparo direcionado por homologia no lócus genômico, resultando em completa interrupção do gene. Possíveis nocautes podem ser identificados pela expressão do transgene 9,14,15,29. No entanto, a expressão transgênica por si só não é indicativa do genótipo, pois a expressão de matrizes versus transgênicos integrados é muitas vezes indistinguível. Assim, as larvas transgênicas F1 requerem genotipagem pós-hoc para identificar nocautes homozigos9. Na ausência de um modelo de reparo, a mutagênese do lócus alvo ocorre em alta frequência, mas pode resultar em grandes exclusões9.
Embora a geração de larvas transgênicas ou mutantes F1 seja relativamente simples em S. stercoralis, gerar linhas estáveis é extremamente difícil devido à necessidade de passagem do hospedeiro. Em laboratório, o gerbil mongol é um hospedeiro permissivo para S. stercoralis, mas requer uma alta dose de vermes para estabelecer uma infecção capaz de produzir larvas F2 suficientes para estabelecer a linha30. Apenas aproximadamente 6% das larvas infecciosas tornam-se fêmeas parasitas30. Além disso, se as larvas transgênicas tiverem expressão de matriz sem integração de genomas, elas não produzirão a prole transgênica necessária para infectar um segundo hospedeiro gerbil. Para aumentar as chances de um número suficiente de larvas integradas ao genoma se tornarem adultos reprodutivos parasitárias, recomenda-se um mínimo de 400-500 larvas transgênicas no inóculo inicial. Pode ser possível reduzir o número de larvas necessárias para estabelecer uma infecção patente, tratando os gerbils com prednisona30. No entanto, é provável que seja difícil acumular vermes transgênicos ou mutantes suficientes para estabelecer com sucesso uma linha estável de S. stercoralis. No entanto, é geralmente viável acumular um número suficiente de larvas transgênicas S. stercoralis F1 para ensaios de um único verme14,15.
Strongyloides ratti tem a clara vantagem da maior viabilidade de gerar linhas transgênicas ou eliminatórias estáveis17,31. As fêmeas adultas de vida livre S. ratti são menos tolerantes ao processo de microinjeção do que as fêmeas adultas de vida livre de S. stercoralis; As fêmeas S. ratti geralmente produzem menos larvas globais do que as fêmeas S. stercoralis, e a taxa de transformação também é menor31. No entanto, apenas algumas larvas transgênicas ou knockout F1 são necessárias para estabelecer uma linha estável de S. ratti. Como S. ratti é um parasita natural de ratos, apenas algumas larvas infecciosas de S. ratti são suficientes para estabelecer uma infecção patente32. Assim, é geralmente possível acumular número suficiente de larvas transgênicas ou mutantes para estabelecer uma linha estável. Como as espécies strongyloides não expressarão matrizes extracromosomais além da geração F1, apenas as larvas F1 integradas ao genoma podem produzir uma linha transgênica estável13. Geralmente é impossível identificar vermes com transgenes integrados antes da genotipagem, então o protocolo é coletar todas as larvas transgênicas F1 e injetá-las em um rato. Uma pequena porcentagem dessas larvas terá o evento de integração desejado; essas larvas formarão a base para a linha estável. Como o método piggyBac muitas vezes resulta em mais de um evento de integração em qualquer verme individual, quase 100% de transmissão do transgene pode ser alcançada após algumas rodadas de passagem de larvas transgênicas através de um rato17.
Em resumo, a técnica aqui descrita pode ser usada para gerar s. stercoralis e S. ratti transgênicos ou nocautes. Isso permite uma ampla gama de experimentos potenciais, incluindo, mas não se limitando à expressão específica celular de transgenes, à geração de mutantes e à marcação endógena de proteínas para determinar funções espaciais e temporais 14,15,29,33,34,35. A longo prazo, o conhecimento adquirido com o uso de Strongyloides transgênicos pode ser usado para desenvolver novas estratégias de combate a infecções humanas com S. stercoralis e outros nematoides parasitéticos intestinais.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
pPV540 e pPV402 foram presentes gentis do Dr. James Lok na Universidade da Pensilvânia. Agradecemos a Astra Bryant por comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado por um Burroughs-Wellcome Fund Investigators no Prêmio Patogênese da Doença, um Howard Hughes Medical Institute Faculty Scholar Award, e National Institutes of Health R01 DC017959 (E.A.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | nicotine for paralyzing worms |
| 3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) | VWR | 470121-790 | C-clamp to secure setup to bench top |
| Agarose LE | Phenix | RBA-500 | agarose for slides |
| Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh | Ebonex | n/a | charcoal for fecal-charcoal cultures |
| Bone char, granules, 10 x 28 mesh | Reade | bonechar10x28 | charcoal for fecal-cultures (alternative to the above) |
| Coarse micromanipulator | Narishige | MMN-1 | coarse micromanipulator |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Fisher | 07-200-385 | microfilter column |
| Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness | Brain Research Lab | 4860-1 | coverslips (48 x 60 mm) |
| Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter | VWR | 82050-918 | 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures) |
| Eisco retort base w/ rod | Fisher | 12-000-101 | stand for Baermann apparatus |
| Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips | VWR | 89009-310 | for filling microinjection needles |
| Fisherbrand absorbent underpads | Fisher | 14-206-62 | bench paper (for prepping) |
| Fisherbrand Cast-Iron Rings | Fisher | 14-050CQ | Baermann o-ring |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for mixing) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for catch bucket/water bucket) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (x2) (to make holder) |
| Gorilla epoxie in syringe | McMaster-Carr | 7541A51 | glue (to attach tubing) |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | halocarbon oil |
| High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD | McMaster-Carr | 3038K24 | tubing (for funnel) |
| KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Baermann funnel |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors | Fisher | 15-235-101 | bench paper (for prepping) |
| Leica stereomicroscope with fluorescence | Leica | M165 FC | GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms |
| microINJECTOR brass straight arm needle-holder | Tritech | MINJ-4 | microinjection needle holder |
| microINJECTOR system | Tritech | MINJ-1 | microinjection system |
| Mongolian Gerbils | Charles River Laboratories | 213-Mongolian Gerbil | gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks |
| Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz | VWR | 11216-776 | Whirl-Pak sample bags |
| Nylon tulle (mesh) | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | nylon mesh for Baermann holder |
| Platinum wire, 36 Gauge, per inch | Thomas Scientific | 1233S72 | platinum/iridium wire for worm picks |
| Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) | VWR | 62505-007 | wood sticks (for mixing samples) |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN miniprep kit |
| Rats-Long Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE Long Evans | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Office Depot | 452369 | plastic boxes for humidified chamber |
| Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches | Newco | 999589 | techboard |
| Stainless steel raised wire floor | Ancare | R20SSRWF | wire cage bottoms |
| StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 | Office Depot | 9587303 | spoons |
| Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm | Carolina (Science) | 741012 | watch glasses (small, round) |
| Stereomicroscope | Motic | K-400 LED | dissecting prep scope |
| Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite | Grainger | 53GN16 | plastic boxes for humidified chamber |
| Sutter P-30 micropipette puller | Sutter | P-30/P | needle puller with platinum/iridium filament |
| Syracuse watch glasses | Fisher | S34826 | watch glasses (large, round) |
| Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps | Fisher | 05-769-2Q | funnel clamps (2x) |
| Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator | Narishige | MM0-4 | fine micromanipulator |
| United Mohr pinchcock clamps | Fisher | S99422 | Pinch clamps (2x) |
| Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) | Tritech Research | T3308P | 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures) |
| VWR light-duty tissue wipers | VWR | 82003-820 | lining for Baermann holder |
| watch glass, square, 1-5/8 in | Carolina (Science) | 742300 | watch glasses (small, square) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter | Fisher | 09-805B | filter paper (for 6 cm Petri dishes) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter | Fisher | 09-805D | filter paper (for 10 cm Petri dishes) |
| World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in | Fisher | 50-821-813 | glass capillaries for microinjection needles |
| X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade | Office Depot | 238816 | X-Acto knives without blades to hold worm picks |
| Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n/a | inverted microscope |
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