Summary
De functionele genomische toolkit voor de parasitaire nematoden Strongyloides stercoralis en Strongyloides ratti omvat transgenese, CRISPR/Cas9-gemedieerde mutagenese en RNAi. Dit protocol zal demonstreren hoe intragonadale micro-injectie kan worden gebruikt om transgenen en CRISPR-componenten in S. stercoralis en S. ratti te introduceren.
Abstract
Het geslacht Strongyloides bestaat uit meerdere soorten huiddoordringende nematoden met verschillende gastheerbereiken, waaronder Strongyloides stercoralis en Strongyloides ratti. S. stercoralis is een mens-parasitaire, huiddoordringende nematode die ongeveer 610 miljoen mensen infecteert, terwijl de rattenparasiet S. ratti nauw verwant is aan S. stercoralis en vaak wordt gebruikt als laboratoriummodel voor S. stercoralis. Zowel S. stercoralis als S. ratti zijn gemakkelijk vatbaar voor het genereren van transgenen en knock-outs door de exogene nucleïnezuurafgiftetechniek van intragonadale micro-injectie, en zijn als zodanig naar voren gekomen als modelsystemen voor andere parasitaire helminten die nog niet vatbaar zijn voor deze techniek.
Parasitaire Strongyloides-volwassenen bewonen de dunne darm van hun gastheer en geven nakomelingen via de ontlasting af aan de omgeving. Eenmaal in de omgeving ontwikkelen de larven zich tot vrijlevende volwassenen, die in uitwerpselen leven en nakomelingen produceren die een nieuwe gastheer moeten vinden en binnendringen. Deze milieugeneratie is uniek voor de Strongyloides-soorten en vergelijkbaar genoeg in morfologie met het model vrijlevende nematode Caenorhabditis elegans dat technieken ontwikkeld voor C. elegans kunnen worden aangepast voor gebruik met deze parasitaire nematoden, inclusief intragonadale micro-injectie. Met behulp van intragonadale micro-injectie kan een breed scala aan transgenen in Strongyloides worden geïntroduceerd. CRISPR/Cas9-componenten kunnen ook micro-geïnjecteerd worden om gemuteerde Strongyloides-larven te creëren. Hier wordt de techniek van intragonadale micro-injectie in Strongyloides beschreven, inclusief de bereiding van vrij levende volwassenen, de injectieprocedure en de selectie van transgene nakomelingen. Afbeeldingen van transgene Strongyloides-larven gemaakt met CRISPR / Cas9-mutagenese zijn opgenomen. Het doel van dit artikel is om andere onderzoekers in staat te stellen micro-injectie te gebruiken om transgene en mutante Strongyloides te creëren.
Introduction
Strongyloides stercoralis is lang over het hoofd gezien als een belangrijke menselijke ziekteverwekker in vergelijking met de meer algemeen erkende haakwormen en de rondworm Ascaris lumbricoides1. Eerdere studies naar wormbelasting onderschatten vaak de prevalentie van S. stercoralis vanwege de lage gevoeligheid van gangbare diagnostische methoden voor S. stercoralis2. In de afgelopen jaren hebben epidemiologische studies op basis van verbeterde diagnostische hulpmiddelen geschat dat de werkelijke prevalentie van S. stercoralis-infecties veel hoger is dan eerder gemeld, ongeveer 610 miljoen mensen wereldwijd2.
Zowel S. stercoralis als andere Strongyloides-soorten, waaronder de nauw verwante rattenparasiet en het gemeenschappelijke laboratoriummodel S. ratti, hebben een ongewone levenscyclus die voordelig is voor experimentele genomische studies omdat het bestaat uit zowel parasitaire als vrijlevende (milieu) generaties3 (figuur 1). Concreet kunnen zowel S. stercoralis als S. ratti door één vrijlevende generatie fietsen. De vrijlevende generatie bestaat uit postparasitaire larven die zich ontwikkelen tot vrijlevende volwassen mannetjes en vrouwtjes; alle nakomelingen van de vrij levende volwassenen ontwikkelen zich tot infectieuze larven, die een gastheer moeten infecteren om de levenscyclus voort te zetten. Bovendien kan deze milieu- of vrijlevende generatie experimenteel worden gemanipuleerd in het laboratorium. Omdat vrijlevende Strongyloides-volwassenen en C. elegans-volwassenen een vergelijkbare morfologie delen, kunnen technieken zoals intragonadale micro-injectie die oorspronkelijk werden ontwikkeld voor C. elegans worden aangepast voor gebruik met vrijlevende volwassen Strongyloides 4,5. Hoewel DNA over het algemeen wordt geïntroduceerd in vrijlevende volwassen vrouwtjes, kunnen zowel mannen als vrouwen van Strongyloides micro-geïnjecteerd worden6. Zo zijn functionele genomische hulpmiddelen beschikbaar om vele aspecten van de biologie van Strongyloides te ondervragen. Andere parasitaire nematoden missen een vrijlevende generatie en zijn daardoor niet zo gemakkelijk vatbaar voor functionele genomische technieken3.
Figuur 1: De levenscyclus van Strongyloides stercoralis. De S. stercoralis parasitaire vrouwtjes bewonen de dunne darm van hun zoogdiergastheren (mensen, niet-menselijke primaten, honden). De parasitaire vrouwtjes reproduceren door parthenogenese en leggen eieren in de dunne darm. De eieren komen uit terwijl ze zich nog in de gastheer bevinden in postparasitaire larven, die vervolgens met uitwerpselen in de omgeving worden gebracht. Als de postparasitaire larven mannelijk zijn, ontwikkelen ze zich tot vrijlevende volwassen mannetjes. Als de postparasitaire larven vrouwelijk zijn, kunnen ze zich ontwikkelen tot vrijlevende volwassen vrouwtjes (indirecte ontwikkeling) of infectieve larven in het derde stadium (iL3s; directe ontwikkeling). De vrijlevende mannetjes en vrouwtjes planten zich seksueel voort om nakomelingen te creëren die gedwongen zijn om iL3's te worden. Onder bepaalde omstandigheden kan S. stercoralis ook auto-infectie ondergaan, waarbij sommige van de postparasitaire larven in de darm van de gastheer blijven in plaats van in uitwerpselen in de omgeving te komen. Deze larven kunnen zich ontwikkelen tot auto-infectieuze larven (L3a) in de gastheer, doordringen door de darmwand, migreren door het lichaam en uiteindelijk terugkeren naar de darm om reproductieve volwassenen te worden. De levenscyclus van S. ratti is vergelijkbaar, behalve dat S. ratti ratten infecteert en geen auto-infectieve cyclus heeft. De milieugeneratie is de sleutel tot het gebruik van Strongyloides-soorten voor genetische studies. De vrij levende volwassen vrouwtjes (P0) kunnen micro-geïnjecteerd worden; hun nakomelingen, die allemaal iL3's zullen worden, zijn de potentiële F 1-transgenen. Dit cijfer is aangepast van Castelletto et al. 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
S. stercoralis deelt vele aspecten van zijn biologie met andere gastro-intestinale humaan-parasitaire nematoden, waaronder gastheerinvasie en gastheerimmuunmodulatie. Bijvoorbeeld, menselijk-parasitaire haakwormen in de geslachten Necator en Ancylostoma infecteren ook door huidpenetratie, navigeren op dezelfde manier door het lichaam en verblijven uiteindelijk als parasitaire volwassenen in de dunne darm7. Veel gastro-intestinale nematoden gebruiken dus waarschijnlijk gemeenschappelijk sensorisch gedrag en immuunontwijkingstechnieken. Als gevolg hiervan zal de kennis die is opgedaan bij Strongyloides de bevindingen in andere minder genetisch hanteerbare nematoden aanvullen en leiden tot een vollediger begrip van deze complexe en belangrijke parasieten.
Dit micro-injectieprotocol schetst de methode voor het introduceren van DNA in Strongyloides vrijlevende volwassen vrouwtjes om transgene en mutante nakomelingen te maken. De vereisten voor stamonderhoud, inclusief de ontwikkelingstijd van volwassen wormen voor micro-injecties en het verzamelen van transgene nakomelingen, worden beschreven. Protocollen en een demonstratie van de volledige micro-injectietechniek, samen met protocollen voor het kweken en screenen van transgene nakomelingen, zijn inbegrepen, samen met een lijst van alle benodigde apparatuur en verbruiksartikelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Gerbils werden gebruikt om S. stercoralis te passeren, en ratten werden gebruikt om S. ratti te passeren. Alle procedures zijn goedgekeurd door het UCLA Office of Animal Research Oversight (Protocol nr. 2011-060-21A), dat zich houdt aan de AAALAC-normen en de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. De volgende taken moeten ten minste één dag vóór het micro-injecteren worden voltooid: wormen kweken, micro-injectiepads voorbereiden, constructies maken voor het micro-injectiemengsel en bacteriën (E. coli HB101) verspreiden op 6 cm Nematode Growth Media (NGM) -platen8. De vrij levende vrouwtjes hebben minimaal 24 uur post-fecale verzameling bij 25 °C nodig om zich te ontwikkelen tot jonge volwassenen voordat ze kunnen worden gemicro-geïnjecteerd. Micro-injectiepads moeten volledig droog zijn. Bacteriële platen moeten drogen en een klein gazon vormen.
1. Bereiding van micro-injectieglaasjes: ten minste één dag vóór het injecteren
OPMERKING: Wormen worden gemonteerd op micro-injectie coverslips met droge agar pads voor injectie.
- Stel een warmteblok in op 90 °C.
- Voeg 5 ml ddH2O en vervolgens 100 mg agarose toe aan een buis van borosilicaatglas.
- Verwarm het agarosemengsel in de buis boven een vlam totdat de agarose is opgelost.
- Plaats de buis in een warmteblok op 90 °C om de agarose in vloeibare toestand te houden.
- Laat ~180 μL van de agarose-oplossing op een afdekplaat vallen met behulp van een glazen Pasteur-pipet of een pipet met een plastic punt. Laat onmiddellijk een tweede coverslip bovenop vallen om de agarose plat te maken in een dun kussen.
- Verwijder na 5-10 s de bovenste coverslip door de twee uit elkaar te schuiven. Bepaal op welke schuif de agarpad staat en leg deze met de voorkant naar boven.
- Selecteer een klein stukje glasscherf uit een gebroken deklip en druk het voorzichtig in de agar aan de bovenrand van de pad met behulp van een tang (Supplemental Figure S1).
- Ga verder met het maken van micro-injectiepads met de agarose-oplossing.
- Droog de agarose pads een nacht op de bank of in een oven. Bewaren in de coverslip doos.
OPMERKING: De agarose pads kunnen maximaal 2 maanden worden gebruikt, maar worden slechts voor één injectierun gebruikt.
2. Kweken van Strongyloides om wormen te verkrijgen voor micro-injectie: 1 - 2 dagen vóór injectie
OPMERKING: Een stamonderhoudsprotocol is te vinden in het aanvullend materiaal, dat een gedetailleerde beschrijving bevat van hoe gerbils en ratten met nematoden kunnen worden geïnfecteerd en nematoden kunnen worden geoogst uit de ontlasting van geïnfecteerde dieren.
- Plaats de besmette dierentwee dagen voor de injectiedag 9,10 's nachts in opvangkooien.
- Verzamel de volgende ochtend besmette uitwerpselen en maak fecale-houtskoolplaten 9,10.
- Plaats een plaat op 25 °C gedurende 24 uur zodat de vrijlevende wormen zich kunnen ontwikkelen tot jonge volwassenen.
- Plaats de nacht voor de injectiedag niet-geïnfecteerde gastheerdieren in verzamelkooien.
- Verzamel op de injectiedag niet-geïnfecteerde uitwerpselen voor de teelt na injectie.
3. Het maken van de micro-injectiemix: voorafgaand aan of op de dag van injectie
OPMERKING: Het micro-injectiemengsel bestaat uit de interessante plasmiden verdund tot de gewenste concentratie in worm gebufferde zoutoplossing (BU) (50 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 70 mM NaCl)11.
- Bepaal de concentratie van de plasmidevoorraden en de gewenste concentratie in het micro-injectiemengsel (tabel 1).
| Micro-injectiemix: reporterconstructie | |||
| Bestanddeel | Voorraad concentratie | Aantal | Eindconcentratie |
| pMLC30 GPA-3::GFP | 300 ng/μL | 1,7 μL | 50 ng/μL |
| Bu | na | 8,3 μL | na |
| totaal | 10 μL | 50 ng/μL | |
| Micro-injectie mix: CRISPR/Cas9 mutagenese | |||
| Bestanddeel | Voorraad concentratie | Aantal | Eindconcentratie |
| pMLC47 belasting-4 sgRNA | 300 ng/μL | 2,7 μL | 80 ng/μL |
| pEY11 Ss-tax-4 HDR plasmide | 400 ng/μL | 2,0 μL | 80 ng/μL |
| pPV540 strCas9 plasmide | 350 ng/μL | 1,1 μL | 40 ng/μL |
| Bu | na | 4,2 μL | na |
| totaal | 10 μL | 200 ng/μL | |
| Microinjectiemix: piggyBac-integratie | |||
| Bestanddeel | Voorraad concentratie | Aantal | Eindconcentratie |
| pMLC30 gpa3::gfp | 300 ng/μL | 2,0 μL | 60 ng/μL |
| pPV402 transposase plasmide | 450 ng/μL | 0,9 μL | 40 ng/μL |
| Bu | na | 7,1 μL | na |
| totaal | 10 μL | 100 ng/μL | |
Tabel 1: Voorbeelden van micro-injectiemengsels. De plasmiden en concentraties voor drie voorbeeld micro-injectiemixen: één voor een gpa-3::GFP reporter construct10, één voor CRISPR/Cas9-gemedieerde verstoring van de Ss-tax-4 locus14,15, en één voor piggyBac-gemedieerde integratie van een Ss-gpa-3::GFP construct 13,17,18. strCas9 duidt op het Strongyloides codon-geoptimaliseerd Cas9-gen. De vermelde eindconcentraties worden vaak gebruikt in Strongyloides micro-injectiemengsels.
- Verdun de plasmiden in BU tot een totaal volume van 10-20 μL.
- Draai het mengsel door een filterkolom op 5.000 × g gedurende 1-2 minuten.
- Gebruik het micro-injectiemengsel onmiddellijk of bewaar het bij -20 °C voor toekomstig gebruik.
4. Verzamel jongvolwassen Strongyloides voor micro-injectie: ochtend van de injectiedag
- Stel het Baermann-apparaat in met 1 fecale-houtskoolplaat van jongvolwassen Strongyloides (figuur 2).
OPMERKING: De fecale-houtskoolplaat kan enkele infectieuze larven bevatten. Persoonlijke beschermingsmiddelen bestaan uit een laboratoriumjas, handschoenen en oogbescherming. Er mag geen huid worden blootgesteld tussen de handschoen en de mouw van de laboratoriumjas.
Figuur 2: Het Baermann-apparaat dat wordt gebruikt om parasitaire wormen uit culturen te verzamelen10. De inhoud van een fecale houtskoolplaat wordt bovenop een kolom warm water geplaatst. De wormen migreren in het water en verzamelen zich op de bodem van de trechter. (A) Voor het opzetten van het Baermann-apparaat wordt de standaard voor de Baermann-trechter met een C-klem aan de bank geklemd. Een rubberen buis die aan het uiteinde van de trechter is bevestigd, wordt gesloten met knijpklemmen en er wordt een vangbemmer onder de buis geplaatst voor druppels. Warm water wordt toegevoegd aan de glazen trechter. (B) De plastic ringhouder voor het fecaal-houtskoolmengsel wordt vervolgens bekleed met 3 stukjes laboratoriumweefsel (links). Een houten stok of tongdepressor (midden) wordt gebruikt om de inhoud van een fecaal-houtskoolplaat (rechts) in de plastic ringhouder over te brengen. (C) Een close-up van de onderkant van de plastic ringhouder voor het fecaal-houtskoolmengsel, met de dubbele laag nylon tule die de onderkant van de houder bekleedt. (D) De fecale houtskoolhouder wordt vervolgens op de bovenkant van de glazen trechter geplaatst. (E) Het laboratoriumweefsel wordt bevochtigd met water en gesloten over het fecaal-houtskoolmengsel. Meer warm water wordt toegevoegd om de fecale houtskool grotendeels onder te dompelen. (F) De complete Baermann-opstelling, waarbij de fecale-houtskoolcultuur onder warm water wordt ondergedompeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Installeer een glazen trechter met rubberen opvangbuis op een ringstandaard met behulp van een O-ring en bevestig deze met een klem. Sluit de opvangbuis met 2 knijpklemmen (figuur 2A).
- Plaats een vangbemmer onder de trechter om druppels op te vangen.
- Voeg warm (ongeveer 40 °C) water toe aan de trechter tot 5 cm onder de rand. Controleer of het systeem niet lekt.
- Bekleed de Baermann houder, een zeef gemaakt van 2 plastic ringen met 2 lagen nylon tule gaas ertussen, met 3 overlappende stukjes laboratoriumweefsel. Voeg het fecaal-houtskoolmengsel toe aan de Baermann-houder (figuur 2B,C).
- Plaats de Baermannhouder met het fecaal-houtskoolmengsel in de trechter. Vouw de weefsels rond de fecale-houtskoolmix en voeg voldoende water toe om het grootste deel van de fecale houtskool onder te dompelen. Vul niet meer dan 2 cm vanaf de rand van de trechter (figuur 2D,E).
- Bedek de trechter met een plastic petrischaaldeksel van 15 cm om de geur te bevatten. Label de trechter indien nodig (figuur 2F).
- Wacht 30 minuten tot 1 uur om de wormen van het Baermann-apparaat te verzamelen.
- Houd een centrifugebuis van 50 ml onder de rubberen buis aan de onderkant van de trechter. Open voorzichtig de klemmen aan de onderkant om 30-40 ml water met wormen in de buis van 50 ml te doseren.
- Breng 15 ml van het Baermann-water met de wormen over in een centrifugebuis van 15 ml. Draai de centrifugebuis van 15 ml gedurende 1 minuut op ~ 750 × g (langzaam). Of laat de wormen 10-15 minuten aan de zwaartekracht bezinken.
- Verwijder het supernatant tot ~ 2 ml en gooi het supernatant weg in een afvalvloeistofcontainer met jodium om eventuele wormen te doden.
- Voeg meer Baermann-water toe aan de opvangbuis van 15 ml en herhaal de spin. Verwijder het supernatant tot ~2 ml en gooi het weg zoals in stap 4.11.
- Herhaal stap 4.11 en 4.12 totdat alle wormen zijn verzameld in de centrifugebuis van 15 ml. Verwijder na de laatste spin zoveel mogelijk water.
- Inspecteer de pellet van wormen (40-100 μL) op de bodem van de buis. Als er geen wormen zichtbaar zijn, wacht dan nog eens 1-2 uur en probeer meer wormen uit het Baermann-apparaat te verzamelen.
- Breng de wormen in zo min mogelijk water over op een 6 cm 2% NGM plaat met een gazon van E. coli HB101. Gebruik deze plaat als bronplaat voor de microinjectie.
- Gooi het fecale-houtskoolmengsel weg door het te behandelen met verdund jodium (een verdunning van 50% van Lugol's jodium in water), het in plastic film te wikkelen om druppels op te vangen en het in een biohazard afvalcontainer te plaatsen.
- Voeg 10 ml verdund jodium toe aan de vanghemmer en giet het overtollige water van de Baermann erin af.
- Was de herbruikbare componenten (de trechter, de vangbemmer, de plastic houder met tule, het plastic deksel en de klemmen) met 10% bleekmiddel en spoel grondig af.
5. Trekken en laden van micro-injectienaalden: vlak voor injectie
- Bereid micro-injectienaalden voor door glazen capillaire buisjes te trekken met behulp van een naaldtrekker.
OPMERKING: Voorbeeldinstellingen voor een commerciële naaldtrekker uitgerust met een 3 mm platina / iridiumfilament zijn Heat = 810-820, Pull = 800-820, micrometer = 2,5. - Bekijk de tips onder een ontleedmicroscoop. Als de naalden de gewenste vorm hebben (figuur 3A-F), trek dan aan 4-6 naalden (2-3 capillaire buisjes). Om de juiste naaldvorm te bereiken, wijzigt u de instellingen indien nodig: pas de instellingen voor warmte of trekkracht aan met 10 en trek aan nieuwe naalden totdat de vorm van de taps toelopende en schacht meer geschikt zijn.
Figuur 3: Microinjectienaalden en een Strongyloides stercoralis volwassen vrouwtje met optimale plaatsen voor micro-injectie geïdentificeerd. (A-F) Afbeeldingen van microinjectienaalden. (A-B) De as taps toelopen (A) en de punt (B) van een naald die correct is gevormd voor micro-injectie. De punt is scherp genoeg om de nagelriem te doorboren en smal genoeg om geen overmatige schade aan te richten. (C-D) De as taps toelopen (C) en de punt (D) van een microinjectienaald die verkeerd is gevormd voor micro-injectie. De punt is te bot en breed en zal overmatige schade aan de worm veroorzaken. (E-F) De as taps toelopen (E) en de punt (F) van een naald die waarschijnlijk te lang en slank is om te werken voor micro-injectie. De punt in F lijkt erg op de punt in D. De schacht is echter smaller en te flexibel om de cuticula effectief te doorboren. Bovendien verstoppen zeer slanke naalden gemakkelijk. (G) Een afbeelding van de hele worm correct gepositioneerd voor micro-injectie, ervan uitgaande dat de naald van rechts komt. Anterior is naar beneden en naar links; de vulva wordt aangegeven door de pijlpunt. De geslachtsklier is zichtbaar langs de rechterkant van het vrouwtje. Dit vrouwtje heeft slechts één ei in haar baarmoeder (aangegeven door het sterretje). (H, I) Vergrote weergaven van de microinjectiesites. De hoek van de pijl benadert de hoek van de injectienaald. De vulva kan worden gebruikt als oriëntatiepunt; het bevindt zich aan de andere kant van de worm van de armen van de geslachtsklier. De armen van de geslachtsklier buigen rond de darm en de uiteinden met de delende kernen bevinden zich tegenover de vulva. (H) de achterste arm van de geslachtsklier; (I) de voorste arm. Een of beide armen kunnen worden geïnjecteerd. Voor H, I zijn conventies zoals in G. Schaalstaven = 50 μm (B, D, F, H, I); 100 μm (A, C, E, G). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Bewaar de getrokken naalden in een plastic petrischaaltje van 15 cm met een stuk gerolde tape om de naalden vast te zetten en stofophoping op de uiteinden te voorkomen.
- Plaats een druppel van 0,7 μL van het micro-injectiemengsel op het open uiteinde van de as. Hang de naald loodrecht op een plank met een gerold stuk tape om de taps toelopende schacht binnen 10 minuten met het mengsel te vullen. Bereid 2 naalden tegelijk voor het geval de eerste niet werkt.
6. De microscoop voorbereiden en de naald breken
OPMERKING: Micro-injectie maakt gebruik van een omgekeerde microscoop met 5x en 40x objectieven uitgerust met een micro-injectoropstelling om de beweging van de naald te regelen. De omgekeerde microscoop moet op een zware tafel of antitrillingsluchttafel worden geplaatst om trillingsgeluid te verminderen. De microinjector naaldhouder is verbonden met stikstofgas dat de druk uitoefent die nodig is om het micro-injectiemengsel af te leveren. Een kleinere ontleedmicroscoop in de buurt wordt gebruikt om de wormen over te brengen.
- Stel de druk van de gastank in op ~ 40-60 psi voor het breken van de naald en op ~ 30-50 psi voor micro-injectie, afhankelijk van de vloeistofstroom.
- Bedek op de ontleedmicroscoop de glasscherf op de micro-injectiepaddeksel met halocarbonolie met behulp van een standaard platinawormpluk.
- Plaats de afdekplaat van het microinjectiepad op de microinjectiekijker en lokaliseer de glasscherf bedekt met olie. Lijn de glasscherf zo uit dat een rand loodrecht op de richting van de naald staat om te dienen als het oppervlak dat wordt gebruikt om de naald te breken.
- Controleer met de ontleedmicroscoop of de naald geen bubbels of vuil in de taps toelopende schacht heeft. Bevestig vervolgens de naald 1-1,5 cm in de houder onder druk.
- Plaats de punt van de naald in het midden van het gezichtsveld van de microscoop met het oog. Plaats vervolgens onder lage vergroting de punt van de naald in het gezichtsveld, loodrecht op de zijkant van de glasscherf.
- Schakel over op hoog vermogen en lijn de punt van de naald uit met de rand van het glas, in de buurt maar niet aanrakend.
OPMERKING: Wanneer eraan wordt getrokken, worden de naalden gesloten gesmolten. - Om de punt van de naald te breken om vloeistofstroom mogelijk te maken, tikt u deze voorzichtig op de zijkant van het stuk glas terwijl u continue druk uitoefent op het gas (aanvullende figuur S1). Zodra de vloeistof begint te stromen, controleert u de vorm van de punt en zorgt u ervoor dat deze scherp is met gemakkelijk stromende vloeistof.
OPMERKING: Als de vloeistof te snel stroomt of het uiteinde te stomp is, worden de wormen beschadigd tijdens micro-injectie (video 1 en figuur 3A-F). - Wanneer de vloeistof goed uit de naald stroomt, verplaatst u de micro-injectieschuif naar de ontleedbare scoop en plaatst u druppels halocarbonolie van 1-2 μL op de agarpad voor plaatsing van de wormen.
- Breng 20-30 jongvolwassen Strongyloides over naar een 2% NGM-plaat zonder bacteriën gedurende ten minste 5 minuten om overtollige oppervlaktebacteriën te verwijderen en selecteer enkele wormen voor micro-injectie. Voeg indien nodig meer wormen toe aan de NGM-plaat tijdens het injecteren.
7. Micro-injecteren van Strongyloides
- Gebruik een kleine hoeveelheid halocarbon-olie op een wormpluk om een Strongyloides jongvolwassen vrouwtje met 1-4 eieren in haar geslachtsklier te selecteren uit de 2% NGM-plaat zonder bacteriën.
- Breng de worm over in een kleine druppel olie op de agarpad. Gebruik de wormprikker voorzichtig zodat deze niet wordt opgerold en de geslachtsklier zichtbaar en gemakkelijk toegankelijk is. Let op de richting van de geslachtsklier (figuur 3G).
- Plaats de worm in het gezichtsveld van de microinjectiemicroscoop. Zorg ervoor dat de geslachtsklier zich aan dezelfde kant als de naald bevindt en zo is geplaatst dat de naald onder een lichte hoek contact maakt met de gonade (figuur 3H,I).
- Breng de punt van de naald naar de zijkant van de worm in hetzelfde brandpuntsvlak. Richt op de geslachtsklierarm in het midden van de worm. Gebruik de microinjector om de naald voorzichtig in de geslachtsklier te steken (video 2).
- Oefen onmiddellijk druk uit op de naald om de hele geslachtsklierarm voorzichtig te vullen met de DNA-oplossing. Bepaal met het oog wanneer er voldoende vocht is geïnjecteerd (video 2).
OPMERKING: Het kan tot 2 s duren om de geslachtsklier te vullen. - Verwijder de naald en controleer of de wond sluit.
OPMERKING: De worm is te beschadigd om nakomelingen te produceren als de geslachtsklier door de lichaamswand steekt (Aanvullende video S1). - Herhaal dit met de andere arm van de geslachtsklier als deze zichtbaar is.
- Wanneer u klaar bent met injecteren, controleert u snel of de naald niet verstopt is door druk uit te oefenen met de punt van de naald op het agar-kussen. Breng de dia met de geïnjecteerde worm over naar de ontleedmicroscoop.
- Om de geïnjecteerde worm te herstellen, plaatst u eerst een paar druppels BU op de worm om deze van de agarpad te laten drijven.
- Verzamel een kleine hoeveelheid HB101-bacteriën op een wormpluk. Raak de worm aan met de aanhangende bacteriën op de wormprikker om deze uit de vloeistof te verwijderen.
- Breng de worm voorzichtig over op de herstelplaat , een 2% NGM-plaat met een HB101-gazon.
OPMERKING: De worm moet binnen enkele minuten beginnen te kruipen. - Nadat een paar vrouwtjes zijn geïnjecteerd, voegt u enkele niet-geïnjecteerde mannetjes toe vanaf de bronplaat.
OPMERKING: Een minimum van één mannetje voor vijf vrouwtjes is een goede basislijn; een overmaat aan mannetjes heeft de voorkeur. - Herhaal alle stappen totdat er voldoende vrouwtjes zijn geïnjecteerd voor het experiment.
- Laat de volwassenen minstens 1 uur na de injectie op de herstelplaat liggen om de wormen te laten herstellen en paren.
8. Herstel en kweken van geïnjecteerde Strongyloides
- Verzamel 's nachts uitwerpselen van niet-geïnfecteerde gastheerdieren, met hetzelfde protocol als voor geïnfecteerde dieren.
- Meng de ongemoeide uitwerpselen met een kleine hoeveelheid houtskool (uitwerpselen/houtskoolverhouding van ongeveer 2 op 1 voor deze platen).
- Giet een kleine hoeveelheid van het fecale-houtskoolmengsel in een petrischaaltje van 6 cm bekleed met vochtig filterpapier. Zorg ervoor dat het mengsel het deksel van het gerecht niet raakt.
- Overspoel de herstelplaat met BU. Breng met behulp van een pipet op 3 μL de wormen over op de ontlasting in de fecaal-houtskoolplaat. Plaats de wormen direct op de uitwerpselen, niet op de houtskool.
- Controleer of de volwassenen zich op de fecale-houtskoolplaat bevinden met behulp van een ontleedbare scoop.
- Om de wormen te kweken, plaatst u de plaat in een bevochtigde kamer, d.w.z. een plastic doos met een nauwsluitend deksel bekleed met vochtige papieren handdoeken.
OPMERKING: Na 2 dagen zal er een mix van larvale stadia zijn. Na 5 dagen hebben de meeste larven zich ontwikkeld tot iL3's; een paar jongere larven zullen overblijven. Na 7 dagen moeten alle larven iL3s zijn.
9. Verzamelen en screenen van F 1 larven om transgenen/knock-outs te herstellen
- Verzamel met behulp van een Baermann-opstelling de larven van de kleinschalige fecale-houtskoolkweekplaten na injectie. Om zoveel mogelijk larven te krijgen, wacht u minstens 2 uur voordat u de wormen uit het Baermann-apparaat herstelt.
- Concentreer de larven in een centrifugebuis van 15 ml zoals in stappen 4.10-4.14 en breng de larven over naar een klein horlogeglas met BU.
- Als de larven worden gebruikt voor gedragsexperimenten, gebruik dan 2% NGM-platen met een dik gazon van HB101 voor screening.
- Breng 20-30 larven over naar het HB101-gazon.
OPMERKING: De bacteriën zullen de beweging van de larven vertragen. - Identificeer onder een fluorescentieontledende microscoop de larven die het transgen van belang tot expressie brengen. Gebruik een wormenpluk om de transgene larven te selecteren en verplaats ze naar een klein horlogeglas met BU.
- Gebruik een nieuwe HB101-plaat om nog een kleine partij larven te screenen. Wanneer voldoende larven zijn verzameld voor experimenteel gebruik, behandel dan de HB101-platen en de overtollige wormen met verdund jodium (50% Lugol's jodium verdund in water) en gooi ze weg als biologisch gevaarlijk afval. U kunt ook de overtollige wormen doden met behulp van geconcentreerde kennelreiniger die alkylbenzylammoniumchloriden bevat.
- Gebruik de wormen onmiddellijk of laat ze een nacht in een ondiep horlogeglas in een kleine hoeveelheid BU.
OPMERKING: Wormen kunnen hypoxisch worden als de vloeistof te diep is. Het is mogelijk dat het 's nachts achterlaten van larven in BU bepaald gedrag kan beïnvloeden; gebruik daarom larven voor gedragsexperimenten binnen 6 uur.
- Breng 20-30 larven over naar het HB101-gazon.
- Als de larven worden gebruikt voor microscopie en niet voor gedragstests, immobiliseer dan de wormen door nicotineverlamming omkeerbaar voor screening.
- Scoor met een scheermesje een rooster op de plastic bodem van een 10 cm chemotaxisplaat12 om het gemakkelijker te maken om de locatie van de wormen op de plaat bij te houden.
- Laat ~3 μL larven in BU in een vierkant op het rooster vallen. Vul zoveel vakjes als nodig is. Gebruik niet degenen in de buurt van de randen van de plaat, omdat de larven naar de zijkanten van de plaat kunnen kruipen.
- Voeg 15-20 μL druppels van 1% nicotine in water toe aan de wormdruppels.
OPMERKING: Na 4 minuten zijn de wormen verlamd. - Screen de wormen met een fluorescentie ontleedmicroscoop.
- Gebruik een wormprikker om de transgene larven over te brengen in een klein horlogeglas met 1-2 ml BU.
OPMERKING: De larven worden enkele uren verlamd en kunnen gemakkelijk op microscoopglaasjes worden gemonteerd voor microscopie. Als ze 's nachts in BU worden achtergelaten, zullen de iL3's herstellen en kunnen ze worden gebruikt voor sommige testen of infectie van de gastheer van zoogdieren. Nicotineverlamming en de nachtelijke incubatie in BU kunnen echter bepaald gedrag beïnvloeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als het experiment succesvol was, zullen de F1-larven het transgen en/of mutant fenotype van belang tot expressie brengen (figuur 4). Transformatiesnelheden zijn echter zeer variabel en zijn afhankelijk van de constructies, de gezondheid van de wormen, de kweekomstandigheden na injectie en de vaardigheid van de experimentator. Over het algemeen zal een succesvol experiment > 15 F1 larven per geïnjecteerd vrouwtje opleveren en een transformatiesnelheid van >3% voor fluorescerende markers. Als het totale aantal levende nakomelingen gemiddeld minder dan 10 larven / vrouw is, dan is het mogelijk dat het construct giftig is en de getransformeerde larven niet overleven. Het vinden van grote aantallen fluorescerende eieren, maar geen fluorescerende larven, is een andere aanwijzing dat het injectiemengsel giftig kan zijn. Bij het voor het eerst leren van de techniek wordt aanbevolen om een constructie te gebruiken die goed tot expressie komt, zoals act-2::mRFPmars, die robuuste expressie in lichaamswandspier13 stimuleert (figuur 4).
Bij het genereren van mutanten door CRISPR/Cas9-gemedieerde gerichte mutagenese wordt het gebruik van een reparatiesjabloon met een act-2::mRFPmars of act-2::GFP-transgen 13 aanbevolen, zodat potentiële mutanten kunnen worden geïdentificeerd op basis van fluorescentie 9,14,15. Het is belangrijk op te merken dat omdat Strongyloides transgenen uit extrachromosomale arrays tot expressie brengen, fluorescerend F1-nageslacht mRFPmars of GFP van de array alleen kan uitdrukken of mRFPmars of GFP kan uitdrukken van zowel de array als een geïntegreerd transgen 3,9,16. Het is mogelijk om larven te identificeren die meer kans hebben op geïntegreerde transgenen op basis van het patroon van fluorescerende expressie: "fragmentarische" expressie in de lichaamswandspier (figuur 4A) komt vaker voor wanneer het transgen niet in het genoom is geïntegreerd, terwijl consistente expressie in de hele lichaamswandspier (figuur 4B ) geeft vaak, maar niet altijd, aan dat het transgen in het genoom is geïntegreerd. Expressiepatronen alleen kunnen echter niet worden gebruikt om mutanten definitief te identificeren - sommige wormen met consistente expressie in de lichaamswandspier hebben mogelijk geen integratiegebeurtenissen. Bovendien kunnen expressiepatronen geen onderscheid maken tussen mutanten die homozygoot zijn en mutanten die heterozygoot of mozaïek zijn. Elke worm moet dus PCR-gegenotypeerd zijn 9,14,15. Bij het verstoren van genen die gemakkelijk zichtbare fenotypen opleveren, is het misschien niet nodig om een reparatiesjabloon te gebruiken. Verstoring van het Strongyloides unc-22-gen resulteert bijvoorbeeld in een dominant "twitcher" fenotype, met percentages van heterozygote of homozygote verstoringen boven 10%9.
Figuur 4: Transgene Strongyloides stercoralislarven . (A, B) S. stercoralislarven die een act-2::mRFPmars transgen tot expressie brengen, dat tot expressie komt in de lichaamswandspier13. Het transgen werd opgenomen in een reparatiesjabloon voor CRISPR/Cas9-gemedieerde verstoring van de Ss-unc-22 locus9. (A) Een S. stercoralislarve met een onvolledig, of "fragmentarisch", act-2::mRFPmars expressiepatroon dat kan wijzen op expressie van een extrachromosomale array. (B) Een S. stercoralis iL3 die het meer complete act-2::mRFPmars-expressiepatroon tot uitdrukking brengt dat kan wijzen op genverstoring en integratie van het reparatiesjabloon. Voor A, B tonen panelen differentieel interferentiecontrast (links), fluorescerend (midden) en samengevoegde (rechts) afbeeldingen. Schaalstaven = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Demonstratie van het naaldbreekproces om een bruikbare naald te maken. De punt van de naald wordt tegen de rand van een glasscherf (voorwerp uiterst links) getikt. Wanneer vloeistof tevoorschijn komt, wordt de naald teruggetrokken en naar beneden op de agar verplaatst. De naaldpunt komt tot een scherpe punt en vloeistof stroomt matig snel. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: Demonstratie van een succesvolle injectie. De achterste arm van de geslachtsklier is zichtbaar als een lichtgrijze structuur aan de rechterkant. De punt van de naald en de geslachtsklier moeten zich in hetzelfde brandpuntsvlak bevinden. Als de naald over of onder de worm of langs het lichaam glijdt zonder te vangen, past u de positie aan. De punt van de naald zal de lichaamswand enigszins inspringen. Een snelle tik op de naaldhouder die aan de micromanipulator is bevestigd, duwt de punt zachtjes door de lichaamswand en in de geslachtsklier. Zodra de naald zich in de geslachtsklier bevindt, oefent u druk uit en injecteert u de DNA-oplossing. De vloeistof moet de geslachtsklier zichtbaar overspoelen. Als de wond sluit wanneer de punt van de naald wordt verwijderd, zal de worm waarschijnlijk overleven. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullend materiaal: Strongyloides stamonderhoud. Dit protocol schetst de onderhoudsprocedure voor S. stercoralis bij gerbils en S. ratti bij ratten. Het omvat de infectieuze dosis die wordt gebruikt voor elke nematode en gastheer. Gastheren worden geïnfecteerd via subcutane injecties onder anesthesie. De progressie van infecties van doorgankelijkheid naar pieklarve output naar verlies van doorgankelijkheid wordt beschreven voor elke combinatie nematode-gastheer. Het protocol dat wordt gebruikt om besmette uitwerpselen te verzamelen en de fecale-houtskoolteeltplaten te maken, wordt ook beschreven. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S1: Een afbeelding van een micro-injectiedia bestaande uit een gedroogd agar-pad op een deklip met een kleine glasscherf voor het breken van de micro-injectienaald. De agar-omtrek en de scherfomtrek worden hier voor de duidelijkheid toegevoegd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende film S1: Demonstratie van een injectie die resulteert in een beschadigde geslachtsklier. De voorste arm van de geslachtsklier is scherp. Het uitoefenen van lichte druk laat zien dat de oplossing in de naald nog steeds vrij naar buiten stroomt. De punt van de naald bevindt zich in hetzelfde brandpuntsvlak als de geslachtsklier en is gericht op een lichte hoek. Zodra de punt van de naald is ingebracht, wordt de oplossing in de worm geïnjecteerd en vult de geslachtsklier. Wanneer de naald echter wordt verwijderd, steekt een stuk van de gonade door de wond in de nagelriem. Materiaal stroomt zichtbaar naar buiten. Het is onwaarschijnlijk dat deze worm zal overleven. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit micro-injectieprotocol beschrijft de methoden voor het introduceren van constructen voor transgenese en CRISPR/Cas9-gemedieerde mutagenese in S. stercoralis en S. ratti. Voor zowel S. stercoralis als S. ratti zijn de overleving na injectie en de snelheid van transgenese of mutagenese onderhevig aan verschillende variabelen die kunnen worden verfijnd.
De eerste kritische overweging voor succesvolle transgenese is hoe plasmidetransgenen worden geconstrueerd. Eerdere studies hebben aangetoond dat expressie van exogene transgenen in Strongyloides het gebruik van Strongyloides 5'-promotors en 3' UTR-elementen 3,13,19 vereist. Net als C. elegans constructen, gebruiken Strongyloides constructen over het algemeen een gen-specifieke promotor en een gemeenschappelijke 3' UTR, zoals die van het Ss-era-1 gen13. Codon-optimalisatie van het coderende gebied kan ook belangrijk zijn voor expressie in Strongyloides. Onlangs werd de Wild Worm Codon Adaptor ontwikkeld, een webgebaseerde app die codon-codeersequenties optimaliseert voor Strongyloides en andere nematoden,20. Ten slotte is aangetoond dat introns, hoewel niet rigoureus getest in Strongyloides, de expressie van exogene transgenen in zowel C. elegans21 als de insect-geassocieerde nematode Pristionchus pacificus22 verhogen en wordt aangenomen dat ze ook de expressie in Strongyloides verhogen. De Wild Worm Codon Adaptor heeft opties voor het opnemen van maximaal drie introns in de gemodificeerdereeks 20.
De samenstelling en afgifte van de micro-injectiemix beïnvloeden de transgenesesnelheid en de overleving van het F1-nageslacht . BU-zoutoplossing wordt routinematig gebruikt als verdunningsmiddel voor mengsels, hoewel het gebruik van ddH2O ook een optie is. De concentraties en/of verhouding van componenten in de mix kunnen worden aangepast om de transformatiesnelheid te verbeteren. Hogere concentraties van de plasmiden van belang kunnen de snelheid van transgenese verhogen, maar resulteren vaak in minder totale nakomelingen. Als er geen transgene expressie wordt waargenomen of alleen dode transgene eieren worden gevonden, is het mogelijk dat de transgenen giftig zijn, of dat iets in de plasmidevoorraden de dood van de transgenen veroorzaakt. In het laatste geval kan het maken van nieuwe plasmidevoorraden met behulp van een andere methode (bijvoorbeeld met behulp van een andere miniprepkit) voldoende zijn voor het verkrijgen van transgenen. Het toevoegen van lipofectamine aan de micro-injectiemix kan ook de snelheid van transgenese verbeteren23.
De vorm van de micro-injectienaald die de mix aflevert, heeft ook invloed op de overlevings- en transgenesesnelheden (figuur 3A-F, video 1, video 2 en aanvullende video S1). De naald moet scherp genoeg zijn om de nagelriem te penetreren en smal genoeg om geen overmatige schade te veroorzaken. Het wordt aanbevolen om naalden vlak voor gebruik te trekken, omdat naalden die langer dan een dag zijn opgeslagen, puin kunnen ophopen en verstopt kunnen raken tijdens micro-injecties. Het herstellen van geïnjecteerde vrouwtjes van het micro-injectiekussen zonder ze te beschadigen, kan met een paar verschillende methoden worden bereikt. Een techniek is om de wormen van het injectiekussen te laten drijven in een druppel BU en vervolgens HB101 op een wormenpluk te gebruiken om de wormen te verzamelen. Andere technieken voor herstel zijn het drijven van de wormen in BU en het verzamelen ervan met behulp van een pipetpunt of een kleine verfkwast of gewoon met alleen een wormenpluk om de wormen naar een herstelplaat te verplaatsen.
Als er geen nakomelingen werden verkregen van de micro-geïnjecteerde vrouwtjes, suggereert dit dat ofwel de geïnjecteerde vrouwtjes beschadigd waren in het micro-injectieproces of dat de kweekomstandigheden na injectie suboptimaal waren. Er zijn een aantal verschillende post-injectie kweekomstandigheden die kunnen worden geprobeerd. De hierboven beschreven kleinschalige fecale houtskoolculturen ondersteunen over het algemeen een betere wormoverleving dan NGM-platen met HB101. Het kan echter moeilijk zijn om de overleving van de geïnjecteerde wormen en de ontwikkeling van de F1-larven op fecale houtskoolplaten te volgen, en eieren zijn niet zichtbaar op deze platen. Een voordeel van het kweken van wormen op NGM-platen met HB101 in plaats van fecale houtskoolplaten is om zorgvuldige observatie van het leggen van eieren en de ontwikkeling van larven mogelijk te maken, wat nuttig kan zijn voor het oplossen van problemen. V12-platen met HB101 kunnen ook worden gebruikt om overleving24 te vergroten. Ten slotte kan een chemotaxisplaat12 met een enkele ratten fecale pellet worden gebruikt voor S. ratti na injectie kweken. De mannetjes en geïnjecteerde vrouwtjes worden rechtstreeks overgebracht naar de fecale pellet van de rat. In 5-7 dagen worden wormen verzameld uit de agar en uitwerpselen met behulp van een Baermann-apparaat, zoals hierboven beschreven.
Om Strongyloides-volwassenen voor micro-injectie te verkrijgen, kunnen vers bereide fecale-houtskoolplaten worden geïncubeerd bij 25 °C gedurende 24 uur of 20 °C gedurende 48 uur. Strongyloides-volwassenen die gedurende 24 uur bij 25 °C worden gefokt, zijn jong genoeg om een groot aantalnakomelingen 25 te produceren. Als de vrouwtjes echter te jong zijn, overleven ze mogelijk het micro-injectieproces niet. Volwassenen verzameld uit fecale houtskoolplaten die gedurende ~ 48 uur bij 20 ° C zijn geïncubeerd, hebben meer kans om het micro-injectieproces te tolereren. Omdat deze volwassenen echter ouder zijn dan volwassenen verkregen uit een incubatie van 24 uur bij 25 °C, zijn ze niet zo vruchtbaar en kunnen ze een lagere transformatiesnelheid hebben. Beginners kunnen er de voorkeur aan geven om met oudere volwassenen te beginnen en vervolgens over te schakelen naar iets jongere volwassenen naarmate de vaardigheden verbeteren.
Net als C. elegans kunnen Strongyloides-soorten transgenen uit extrachromosomale arrays en genoomgeïntegreerde constructies in de F1-generatie tot expressie brengen. In tegenstelling tot C. elegans zullen Strongyloides-soorten alleen genoomgeïntegreerde transgenen tot expressie brengen in de F2 en volgende generaties, hoewel de extrachromosomale arrays nog steeds detecteerbaar zijn door PCR13. De F1 transgene larven die extrachromosomale arrays tot expressie brengen, kunnen worden gebruikt voor experimenten die geen genoomintegratie of grote aantallen transgene wormen vereisen. Genoomintegratie kan nodig zijn voor experimenten die het taggen van endogene genen vereisen of het testen van grote aantallen wormen in populatiegebaseerde testen. Er zijn twee methoden voor genoomintegratie van transgenen in Strongyloides: piggyBac transposon-gemedieerde integratie17 en CRISPR/Cas9-gemedieerde integratie9. piggyBac transposon-gemedieerde integratie maakt gebruik van de piggyBac transposase om lading naar TTAA-locaties in het genoom te richten26. Omdat het TTAA-motief vrij gebruikelijk is in het AT-rijke genoom van Strongyloides-soorten , vindt de integratie vaak plaats op meer dan één plaats in het genoom. Crispr/Cas9-gemedieerde integratie kan daarentegen worden gebruikt om transgenen te integreren op een specifieke doellocatie9.
Het CRISPR/Cas9-systeem kan ook worden gebruikt om gerichte gen knock-outs 9,27 te genereren. Vanwege de AT-rijkdom van het Strongyloides-genoom is het vinden van bruikbare Cas9-doellocaties met de optimale 5'-N18GGNGG-3'-sequentie voor nematoden28 een uitdaging. Vaak zijn er slechts één of twee sites in een gen voor targeting. De voorkeursmethode omvat de integratie van een reparatiesjabloon met een transgen met een fluorescerende marker door homologiegerichte reparatie in de genomische locus, wat resulteert in volledige verstoring van het gen. Potentiële knock-outs kunnen worden geïdentificeerd door expressie van het transgen 9,14,15,29. Transgene expressie alleen is echter niet indicatief voor genotype, omdat expressie van arrays versus geïntegreerde transgenen vaak niet te onderscheiden is. De F1 transgene larven hebben dus post-hoc genotypering nodig om homozygote knock-outs te identificeren9. Bij afwezigheid van een reparatiesjabloon treedt mutagenese van de doellocus op met hoge frequentie op, maar kan resulteren in grote deleties9.
Hoewel het genereren van transgene of mutante F1-larven relatief eenvoudig is in S. stercoralis, is het genereren van stabiele lijnen uiterst moeilijk vanwege de behoefte aan gastheerpassage. In het laboratorium is de Mongoolse gerbil een tolerante gastheer voor S. stercoralis, maar heeft een hoge dosis wormen nodig om een infectie vast te stellen die in staat is om voldoende F2-larven te produceren om lijn30 vast te stellen. Slechts ongeveer 6% van de infectieuze larven worden parasitaire vrouwtjes30. Bovendien, als de transgene larven array-expressie hebben zonder genoomintegratie, zullen ze niet het transgen-expresserende nageslacht produceren dat nodig is om een tweede gerbil-gastheer te infecteren. Om de kans te vergroten dat voldoende aantallen genoomgeïntegreerde larven reproductieve parasitaire volwassenen worden, wordt een minimum van 400-500 transgene larven in het initiële entmateriaal aanbevolen. Het kan mogelijk zijn om het aantal larven dat nodig is om een patentinfectie vast te stellen te verminderen door de gerbils te behandelen met prednison30. Niettemin is het waarschijnlijk moeilijk om voldoende geïntegreerde transgene of mutante wormen te verzamelen om met succes een stabiele lijn van S. stercoralis vast te stellen. Het is echter meestal haalbaar om voldoende aantallen transgene S. stercoralis F1-larven te verzamelen voor enkelvoudige wormtests14,15.
Strongyloides ratti heeft het duidelijke voordeel van de grotere haalbaarheid van het genereren van stabiele transgene of knock-out lijnen17,31. S. ratti vrijlevende volwassen vrouwtjes zijn minder tolerant voor het micro-injectieproces dan S. stercoralis vrijlevende volwassen vrouwtjes; S. ratti-vrouwtjes produceren over het algemeen minder algemene larven dan S. stercoralis-vrouwtjes, en de transformatiesnelheid is ook lager31. Er zijn echter slechts enkele transgene of knock-out F1-larven nodig om een stabiele lijn van S. ratti vast te stellen. Omdat S. ratti een natuurlijke parasiet van ratten is, zijn slechts enkele S. ratti-infectieuze larven voldoende om een patentinfectie vast te stellen32. Het is dus over het algemeen mogelijk om voldoende aantallen transgene of mutante larven te verzamelen om een stabiele lijn vast te stellen. Omdat Strongyloides-soorten na de F1-generatie geen extrachromosomale arrays tot expressie zullen brengen, kunnen alleen genoomgeïntegreerde F1-larven een stabiele transgene lijn13 produceren. Het is over het algemeen onmogelijk om wormen met geïntegreerde transgenen te identificeren voorafgaand aan genotypering, dus het protocol is om alle transgene F1-larven te verzamelen en ze in een rat te injecteren. Een klein percentage van deze larven zal de gewenste integratiegebeurtenis hebben; deze larven vormen de basis voor de stabiele lijn. Omdat de piggyBac-methode vaak resulteert in meer dan één integratiegebeurtenis in een individuele worm, kan bijna 100% overdracht van het transgen worden bereikt na een paar rondes transgene larven door een rat17.
Samenvattend kan de hier beschreven techniek worden gebruikt om transgene of knock-out S. stercoralis en S. ratti te genereren. Dit maakt een breed scala aan potentiële experimenten mogelijk, waaronder maar niet beperkt tot de celspecifieke expressie van transgenen, het genereren van mutanten en het endogene labelen van eiwitten om ruimtelijke en temporele functies te bepalen 14,15,29,33,34,35. Op de lange termijn kan de kennis die is opgedaan met het gebruik van transgene Strongyloides worden gebruikt om nieuwe strategieën te ontwikkelen om menselijke infecties met S. stercoralis en andere intestinale parasitaire nematoden te bestrijden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
pPV540 en pPV402 waren vriendelijke geschenken van Dr. James Lok aan de Universiteit van Pennsylvania. Wij danken Astra Bryant voor de nuttige reacties op het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door een Burroughs-Wellcome Fund Investigators in de Pathogenesis of Disease Award, een Howard Hughes Medical Institute Faculty Scholar Award en National Institutes of Health R01 DC017959 (E.A.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | nicotine for paralyzing worms |
| 3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth) | VWR | 470121-790 | C-clamp to secure setup to bench top |
| Agarose LE | Phenix | RBA-500 | agarose for slides |
| Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh | Ebonex | n/a | charcoal for fecal-charcoal cultures |
| Bone char, granules, 10 x 28 mesh | Reade | bonechar10x28 | charcoal for fecal-cultures (alternative to the above) |
| Coarse micromanipulator | Narishige | MMN-1 | coarse micromanipulator |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Fisher | 07-200-385 | microfilter column |
| Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness | Brain Research Lab | 4860-1 | coverslips (48 x 60 mm) |
| Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter | VWR | 82050-918 | 10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures) |
| Eisco retort base w/ rod | Fisher | 12-000-101 | stand for Baermann apparatus |
| Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips | VWR | 89009-310 | for filling microinjection needles |
| Fisherbrand absorbent underpads | Fisher | 14-206-62 | bench paper (for prepping) |
| Fisherbrand Cast-Iron Rings | Fisher | 14-050CQ | Baermann o-ring |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for mixing) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (for catch bucket/water bucket) |
| Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers | Fisher | 14-955-111F | Plastic beaker (x2) (to make holder) |
| Gorilla epoxie in syringe | McMaster-Carr | 7541A51 | glue (to attach tubing) |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | halocarbon oil |
| High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD | McMaster-Carr | 3038K24 | tubing (for funnel) |
| KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Baermann funnel |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors | Fisher | 15-235-101 | bench paper (for prepping) |
| Leica stereomicroscope with fluorescence | Leica | M165 FC | GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms |
| microINJECTOR brass straight arm needle-holder | Tritech | MINJ-4 | microinjection needle holder |
| microINJECTOR system | Tritech | MINJ-1 | microinjection system |
| Mongolian Gerbils | Charles River Laboratories | 213-Mongolian Gerbil | gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks |
| Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz | VWR | 11216-776 | Whirl-Pak sample bags |
| Nylon tulle (mesh) | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | nylon mesh for Baermann holder |
| Platinum wire, 36 Gauge, per inch | Thomas Scientific | 1233S72 | platinum/iridium wire for worm picks |
| Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W) | VWR | 62505-007 | wood sticks (for mixing samples) |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN miniprep kit |
| Rats-Long Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE Long Evans | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks |
| Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Office Depot | 452369 | plastic boxes for humidified chamber |
| Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches | Newco | 999589 | techboard |
| Stainless steel raised wire floor | Ancare | R20SSRWF | wire cage bottoms |
| StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000 | Office Depot | 9587303 | spoons |
| Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm | Carolina (Science) | 741012 | watch glasses (small, round) |
| Stereomicroscope | Motic | K-400 LED | dissecting prep scope |
| Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite | Grainger | 53GN16 | plastic boxes for humidified chamber |
| Sutter P-30 micropipette puller | Sutter | P-30/P | needle puller with platinum/iridium filament |
| Syracuse watch glasses | Fisher | S34826 | watch glasses (large, round) |
| Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps | Fisher | 05-769-2Q | funnel clamps (2x) |
| Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator | Narishige | MM0-4 | fine micromanipulator |
| United Mohr pinchcock clamps | Fisher | S99422 | Pinch clamps (2x) |
| Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter) | Tritech Research | T3308P | 6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures) |
| VWR light-duty tissue wipers | VWR | 82003-820 | lining for Baermann holder |
| watch glass, square, 1-5/8 in | Carolina (Science) | 742300 | watch glasses (small, square) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter | Fisher | 09-805B | filter paper (for 6 cm Petri dishes) |
| Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter | Fisher | 09-805D | filter paper (for 10 cm Petri dishes) |
| World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in | Fisher | 50-821-813 | glass capillaries for microinjection needles |
| X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade | Office Depot | 238816 | X-Acto knives without blades to hold worm picks |
| Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n/a | inverted microscope |
References
- Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165 (2013).
- Buonfrate, D., et al. The global prevalence of Strongyloides stercoralis infection. Pathogens. 9 (6), 468 (2020).
- Castelletto, M. L., Gang, S. S., Hallem, E. A. Recent advances in functional genomics for parasitic nematodes of mammals. Journal of Experimental Biology. 223, Pt Suppl 1 206482 (2020).
- Evans, T. C., et al. Transformation and microinjection. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2006).
- Lok, J. B., Unnasch, T. R., et al. Transgenesis in animal parasitic nematodes: Strongyloides spp. and Brugia spp. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2013).
- Shao, H. G., Li, X. S., Lok, J. B. Heritable genetic transformation of Strongyloides stercoralis by microinjection of plasmid DNA constructs into the male germline. International Journal for Parasitology. 47 (9), 511-515 (2017).
- Schafer, T. W., Skopic, A.
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Gang, S. S., et al. Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode. PLoS Pathogens. 13 (10), 1006675 (2017).
- Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: a model for translational research on parasitic nematode biology. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2007).
- Hawdon, J. M., Schad, G. A. Long-term storage of hookworm infective larvae in buffered saline solution maintains larval responsiveness to host signals. Proceedings of the Helminthological Society of Washington (USA). 58 (1), 140-142 (1991).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Junio, A. B., et al. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR. Experimental Parasitology. 118 (2), 253-265 (2008).
- Gang, S. S., et al. Chemosensory mechanisms of host seeking and infectivity in skin-penetrating nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (30), 17913-17923 (2020).
- Bryant, A. S., et al. A critical role for thermosensation in host seeking by skin-penetrating nematodes. Current Biology. 28 (14), 2338-2347 (2018).
- Lok, J. B. Nucleic acid transfection and transgenesis in parasitic nematodes. Parasitology. 139 (5), 574-588 (2012).
- Shao, H., et al. Transposon-mediated chromosomal integration of transgenes in the parasitic nematode Strongyloides ratti and establishment of stable transgenic lines. PLoS Pathogens. 8 (8), 1002871 (2012).
- Lok, J. piggyBac: a vehicle for integrative DNA transformation of parasitic nematodes. Mobile Genetic Elements. 3 (2), 24417 (2013).
- Li, X., et al. Successful transgenesis of the parasitic nematode Strongyloides stercoralis requires endogenous non-coding control elements. International Journal for Parasitology. 36 (6), 671-679 (2006).
- Bryant, A. S., Hallem, E. A. The Wild Worm Codon Adapter: a web tool for automated codon adaptation of transgenes for expression in non-Caenorhabditis nematodes. G3. 3 (7), (2021).
- Crane, M., et al. In vivo measurements reveal a single 5'-intron is sufficient to increase protein expression level in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 9192 (2019).
- Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
- Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems. Scientific Reports. 9 (1), 483 (2019).
- Dulovic, A., Puller, V., Streit, A. Optimizing culture conditions for free-living stages of the nematode parasite Strongyloides ratti. Experimental Parasitology. 168, 25-30 (2016).
- Harvey, S. C., Gemmill, A. W., Read, A. F., Viney, M. E. The control of morph development in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 267 (1457), 2057-2063 (2000).
- Kim, A., Pyykko, I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Molecular and Cellular Biochemistry. 354 (1-2), 301-309 (2011).
- Lok, J. B., Shao, H., Massey, H. C., Li, X. Transgenesis in Strongyloides and related parasitic nematodes: historical perspectives, current functional genomic applications and progress towards gene disruption and editing. Parasitology. 144 (3), 327-342 (2017).
- Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).
- Cheong, M. C., et al. Identification of a nuclear receptor/coactivator developmental signaling pathway in the nematode parasite Strongyloides stercoralis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (8), 2021864118 (2021).
- Nolan, T. J., Megyeri, Z., Bhopale, V. M., Schad, G. A. Strongyloides stercoralis: the first rodent model for uncomplicated and hyperinfective strongyloidiasis, the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Journal of Infectious Diseases. 168 (6), 1479-1484 (1993).
- Li, X., et al. Transgenesis in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Molecular and Biochemical Parasitology. 179 (2), 114-119 (2011).
- Viney, M. E. Exploiting the life cycle of Strongyloides ratti. Parasitology Today. 15 (6), 231-235 (1999).
- Stoltzfus, J. D., Massey, H. C., Nolan, T. J., Griffith, S. D., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis age-1: a potential regulator of infective larval development in a parasitic nematode. PLoS ONE. 7 (6), 38587 (2012).
- Castelletto, M. L., Massey, H. C., Lok, J. B. Morphogenesis of Strongyloides stercoralis infective larvae requires the DAF-16 ortholog FKTF-1. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000370 (2009).
- Douglas, B., et al. Transgenic expression of a T cell epitope in Strongyloides ratti reveals that helminth-specific CD4+ T cells constitute both Th2 and Treg populations. PLoS Pathogens. 17 (7), 1009709 (2021).
