Summary
我们提出了一种方案，用于利用正常温离 体 血灌注系统在猪异位心脏移植模型中将治疗药物递送到整个心脏同种异体移植物。
Abstract
心脏移植是终末期心力衰竭的黄金标准治疗。然而，它仍然受到可用供体心脏数量和并发症（如原发性移植物功能障碍和移植物排斥反应）的限制。最近在心脏移植中临床上使用 离体 灌注装置为通过治疗干预治疗心脏同种异体移植物提供了独特的机会，以改善功能并避免有害的受体反应。建立一个转化的大动物模型，用于治疗性地递送到整个同种异体移植物，对于测试心脏移植中的新治疗方法至关重要。腹内位置的猪异位心脏移植模型是评估新干预措施效果和移植物排斥反应免疫病理学的优秀模型。该模型还为猪提供了长期存活，因为不需要移植物来维持受体的循环。该方案的目的是提供一种可重复和稳健的方法，用于在移植前实现对整个心脏同种异体移植物的治疗 性离体 递送，并提供技术细节以对 离体 灌注的心脏进行生存异位移植。
Introduction
心力衰竭是一种影响美国约600万成年人的疾病，预计到2030年将增加到800万成年人1。心脏移植是终末期心力衰竭的黄金标准治疗。但是，它并非没有局限性和复杂性。它仍然受到可用供体心脏数量，原发性移植物功能障碍，心脏排斥反应以及长期免疫抑制的副作用的限制 2.这些限制在可能经历同种异体移植失败并需要随后重新移植以达到正常预期寿命的年轻受者中尤为重要。
克服这些限制的理想干预措施是在植入受体之前用治疗方法治疗整个心脏同种异体移植物，这可以提高同种异体移植物的生存能力并赋予“心脏保护”。这种干预将预防性地进行，以尽量减少缺血性损伤、同种异体移植物排斥反应、心脏同种异体移植血管病变甚至修复边缘同种异体移植物的发生率。开发这些类型的干预措施的转化研究需要心脏移植的大型动物模型，以便对心脏移植物进行长期监测。位于腹内位置的猪异位心脏移植模型已被证明是实现这一目的的理想选择。心脏移植在这个位置允许测试新疗法的效果，并评估移植物排斥反应的免疫病理学。此外，异位模型优于原位模型，因为受者的总生存率更高，不需要体外循环，也不需要移植物来维持受体的循环3.
向心脏有效提供治疗性干预措施，如基因、细胞或免疫疗法，是临床应用的重要障碍4，5。 离体 灌注装置引入的技术允许移植物持续灌注，使其保持在非工作但代谢活性状态6，7，8，9。这提供了一个独特的机会，用先进的治疗方法治疗整个心脏，同时最大限度地减少全身递送的潜在副作用10，11，12，13。利用 离体 灌注装置进行治疗性递送的另一个优点是，它们允许在较长的时间内向冠状动脉循环施用药物，而使用传统的冷静态储存方法则不可行。这允许将疗法更多地全球递送到移植物14。使用这里介绍的方案，我们成功地使用腺病毒载体15将萤火虫荧光素酶基因递送到整个猪心脏移植物中。该方案的目的是提供一种可重复且稳健的方法，用于在移植前将治疗性地递送到整个心脏同种异体移植物。
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Protocol
注意：选择两头雌性尤卡坦猪，其中一头被指定为心脏移植供体，另一头被指定为受体。建议6-8个月大的猪，体重约30公斤，血型相容。该协议的概述如图 1所示。猪的住房和处理程序是根据杜克大学医学中心动物护理和使用委员会的指导方针进行的。
1. 离体灌注装置的制备
- 准备 离体 灌注装置和细胞保护装置，以便根据制造商的指南使用。
- 有一个起搏盒和除颤器可用并设置它们。
- 有一个床旁 （POC） 检测设备可用于检查全血细胞计数 （CBC）、基础代谢检查 （BMP） 和动脉血气 （ABG）。
- 如果制造商的灌注溶液中尚不存在，则将以下药物添加到制造商提供的灌注启动溶液中：100 mL 25%白蛋白，10 mL 200 mg / 100 mL环丙沙星，1 g头孢唑啉钠，两个5 mL多种维生素注射液，250mg甲基泼尼松龙，10，000 IU肝素和50 IU胰岛素。
- 对 离体 装置启动溶液进行POC测试，以确保电解质水平在正常生理范围内。如果没有，请相应地给予葡萄糖酸钙、葡萄糖和/或碳酸氢钠，以补充任何亚治疗电解质或葡萄糖水平。
- 要添加含有添加的药物的启动溶液，请加注溶液并使将溶液输送到 离体 灌注装置的管路脱气。
注意：请跳至第6节，了解有关启动 离体 灌注装置的说明。
2. 供体猪的麻醉开始和静脉通路
- 空腹猪8-12小时后，用氯胺酮（5-33mg / kg，肌内注射）和咪达唑仑（0.2-0.5mg / kg，肌内注射）预处理，并使用面罩施用异氟醚（1-4%）。
- 将猪置于仰卧位，并用气管插管（ETT）（内径5.5-6.5mm）插管以保护气道。通过将ETT绑在猪的鼻子上来保护它。使用绑在桌子上的重系带放置四肢。
- 在眼睛上涂抹兽医软膏，以防止麻醉时干燥。
- 将静脉注射（IV）导管（20-22G）放入耳静脉。
- 启动维持静脉输液（乳酸林格氏溶液在10 mL·（千克·h）-1）。
- 肌内注射丁丙诺啡0.005-0.01mg / kg用于镇痛。
3. 生命体征和中央管路设置
- 在潮气量为 10 mL·（公斤·分）-1 和每分钟 10-15 次呼吸的速率，异氟醚 （1-3%）在整个手术过程中保持，使得反射消失，心率 （>60 bpm，<100 bpm）和血压（收缩压 >90 mmHg，<130 mmHg）保持在生理范围内。
注意：添加麻痹剂是可选的。 - 在整个手术过程中持续监测血氧饱和度和心率。
4. 供体猪的正中胸骨切开术
- 触诊胸骨，从马努巴到剑突。使用无菌手术标记物标记中线。用理发器从现场剃掉任何头发，并使用4%氯己定对该区域进行消毒，总共进行3轮灭菌。在手术部位周围涂抹无菌手术布。
注意：外科医生必须用含酒精或碘的洗涤剂洗手和手臂，并穿上无菌的长袍和手套。 - 使用10号刀片从牛皮向下到剑突做一个切口，测量20-30厘米，具体取决于猪的大小。
- 使用电烙术将胸大肌从胸骨向下划分到剑突，小心地沿着胸骨的中线进行。一旦下降到胸骨，划中线，并通过用沉重的剪刀将其分开，从xiphoid开始胸骨切开术。
- 用重剪刀延长胸骨切开术头颅。每次切开后，用手指扫过钝地将心脏与胸骨分开。以这种方式，通过牛皮完成胸骨切开术。
- 完成胸骨切开术后，通过在切割的骨头边缘应用电烙术来实现止血。
- 放置胸骨牵开器并打开它以优化手术区域的暴露。用电烙术识别并取出胸腺。从隔膜纵向进入心包至主动脉。使用5-6尺寸创建心包摇篮：2-0，丝线。
5.供体猪的心脏骤停和心脏开腹手术
- 在主动脉和肺动脉（PA）之间完全分割组织，并可视化主动脉弓和头臂躯干的位置，以促进主动脉交叉钳的正确放置。
注意：与人类相比，猪的上升主动脉要短得多。 - 使用剪刀和钝性解剖环周释放上腔静脉（SVC）。通过二，尺寸：0，丝带周围SVC。
- 使用剪刀和钝性解剖环周释放下腔静脉（IVC）。同样，在IVC周围传递两个0丝绸领带。
- 将U型缝合线，尺寸：4-0，聚丙烯缝合线到上升主动脉。
- 将钱包串，尺寸：4-0，聚丙烯缝合到右心房（RA）。
- 使用300 U / kg的初始剂量进行肝素IV推注。
- 插入儿科4-Fr主动脉根套管，由先前放置的U形缝合固定。将套管放气，并用拉梅尔止血带将其固定到位。
- 在主动脉根管被 del Nido 心脏麻痹冲洗后，将主动脉根插管连接到心脏麻痹管。用必要的量冲洗以除去管内的任何气泡。
注意：在这一点上，与灌注团队的沟通对于正确执行心脏骤停至关重要。- 确保灌注师以无菌方式安装了一次性电池，按照制造商的建议为设备起了底漆（见第6节），并准备好处理收集的血液。
- 确认细胞保护器心脏切开术（连接到细胞保护器装置的塑料容器，洗涤后储存血液）已准备好10，000 U肝素，并且心脏切开术连接到抽吸，不超过-150 mmHg的压力。
注意：这是为了避免红细胞溶血。
- 在先前放置的钱包内进行右心房切开术，将24 Fr静脉插管插入RA，并用拉梅尔止血带固定。
- 将静脉插管连接到连接到细胞储蓄器心脏切开术的无菌抽吸管，并收集约1-1.3L血液。然后，应用主动脉交叉夹，小心地确保夹子完全遮挡上升的主动脉。使用压力袋以100-150 mmHg的压力将500 mL Del Nido心脏麻痹施入根部。
注意：心脏会变白并停止。 - 将无菌冰泥放在心脏上。
- 心脏麻痹排出后，取下主动脉根插管和RA静脉插管，并将钱包线缝合线绑紧。
- 分为以下部分：IVC，SVC刚好在合子静脉的近端，弓水平端的主动脉刚好远端的肌腱，分叉处的主PA，左合子静脉进入冠状窦。
注意：猪有一个左合子静脉，流入冠状窦。 - 识别肺静脉并用大小进行连接：2-0，丝带或大尺寸夹子。保持一条肺静脉开放，以便插入左心室通气孔。
- 将心脏从胸部取出，放入装有无菌冰泥的容器中。
- 将心脏移动到后桌以准备移植物以放置在 离体 灌注装置上。
6. 清洗供体血液并启动 离体 灌注装置
注意：此步骤对于从供体血清中去除任何成分是必要的，当将治疗药物引入灌注物时，这些成分可能会中和治疗药物的递送。在供体心脏外植期间执行此步骤，以尽量减少同种异体移植物缺血时间。
- 完成细胞保护剂启动和洗涤循环。
- 按照制造商的说明将一次性组件安装到设备中。
- 通过刺激等离子体A并选择设备上的 素数函数来启动 电池保护程序设备。以1：1的方式添加与从供体猪收集的血液量一样多的血浆A。
注意：一旦设备完成启动周期，就可以添加血液了。请参阅5.9-5.11节，了解如何添加供体猪的血液。 - 一旦血液进入设备，在细胞保护器设备上选择 洗涤周期 。
注意：在此过程中，血液被离心，同时引入血浆A来洗涤血液。此步骤浓缩并清洗血液。
- 将洗净的血液转移到血液收集袋中，以转移到 离体 装置中。
- 根据制造商的指南，将洗过的血液添加到 离体 灌注装置中。
- 在 离体 机启动期间，通过将0.25mg肾上腺素和30IU胰岛素注入500mL 5%葡萄糖中的水中来制备肾上腺素溶液。加注溶液，并将将溶液输送到 离体 设备的管路脱气。
- 向 离体 灌注装置中加入10，000 U肝素。
- 加入5%白蛋白以重建血液。
注意：添加到装置中的5%白蛋白的体积等于细胞保护装置去除的血浆量。这样做是为了帮助实现生理性肿瘤压和血细胞比容。 - 打开泵以1-1.5 L / min的速度流动，以将清澈的素数，药物和血液注入储液器。打开泵流并通过灌注模块循环素数后，确保回路的管路无气。
注意：除了洗涤后的血液体积外，最终的维持溶液体积为1000 mL。 - 使用POC测试设备获得基线灌注物POC化学和乳酸盐。根据需要补充电解质。
- 加入足够的 葡萄糖 以维持100 mg / dL的最低葡萄糖水平。
- 加入足够的 碳酸氢钠 以保持7.4的最低pH值目标。
注意：重要的是，添加的碳酸氢钠不能从灌注液中除去。过量的钠水平会导致心脏变得水肿，必须避免。治疗碱基缺陷时需要小心，因为心脏将在恢复后开始纠正基础缺陷。 - 加入足够的 葡萄糖酸钙 以维持0.8 mmol/L的最低离子钙水平。
- 将 温度 设置为 37°C。
- 将 气体流速 设置为 150 mL/min ，并根据需要进行调整以达到生理 pCO2 水平。
- 将 平均动脉压 （MAP） 目标设定为 60-70 mmHg。
- 将 泵流量 调低至 0.6 L/min。
7.供体心脏的后桌准备和心脏的复活
- 越过 SVC。将四个承诺的，尺寸：4-0，聚丙烯缝合线以简单的水平床垫方式放在远端主动脉内侧周围，切缘下方5毫米处，并将它们绑紧。
- 在举起4，尺寸：4-0时，承诺主动脉缝合线，将主动脉连接器插入主动脉，并在主动脉周围系上脐带以固定连接器。
- 放置一个尺寸：4-0，聚丙烯钱包串围绕主PA的远端切边。插入 PA 插管并系紧钱包的两端以固定套管。
- 将准备好的移植物从背桌带到 离体 灌注装置，并将主动脉连接器连接到装置。在将心脏固定到设备上之前，请务必对主动脉/主动脉接头进行脱气。
- 启动灌注时钟，将 泵流量 保持在 0.6 L/min左右，并将 温度 设定点降低到 34°C。
- 根据制造商的建议启动肾上腺素和维护滴注。
- 将 PA 插管连接到设备上的 PA 连接器，并用领带固定。
- 将左心室（LV）通气管通过未绑带的肺静脉进入左心房，穿过二尖瓣进入左心室。
- 将两个心脏起搏导线放在左心室自由壁上。
- 每小时检查一次乳酸、动脉血气、血细胞计数和 BMP。根据需要给予钾、50% 葡萄糖和钙，以维持正常的生理水平。
注意：在早期稳定期间，更频繁的乳酸取样可能是合适的，以建立基于乳酸盐的充分灌注。 - 如果需要起搏，将心室搏速设置为每分钟 80 次，10 mA（通常不使用心房起搏）。
- 如果需要除颤，请在设备上的温度达到34°C后从 10 J开始，不要超过50 J。
注意：目标总平均流量为 600 mL/min，冠状动脉平均流量为 400 mL/min。
8. 管理治疗
- 以无菌方式将治疗剂吸入注射器中。
- 使用无菌 3 mL 注射器将血液吸入心脏麻痹端口，使心脏麻痹端口脱气。将治疗剂施用于心脏麻痹端口（或等效物），使得治疗药物直接引入主动脉根部。
- 当端口脱气时，用步骤8.2中收集的血液量冲洗端口;注意不要用它冲洗任何空气。
注意：这是为了确保将治疗药物施用于心脏的主动脉根部。
注：本节在Bishawi 等人 中已有详细描述。引入荧光素酶表达的病毒载体15。 - 引入治疗后，在设备上灌注移植物2小时。
9. 接受者的准备和剖腹手术与血管暴露
- 一旦心脏同种异体移植物固定到装置上并将治疗药物引入回路，就开始诱导麻醉和术前准备，如第2节所述，为接受者猪。
- 开始输注免疫抑制药物：环孢菌素50mg / kg，作为整个过程中的缓慢滴注和甲基泼尼松龙1g静脉推注。
- 给予抗生素：恩诺沙星IM（5mg / kg）和头孢唑啉1g静脉推注。
- 将弗利导管插入膀胱。
注意：膀胱减压有助于获得肾下主动脉和IVC的最佳暴露。 - 使用无菌手术标志物标记从中腹部到耻骨的腹部中线。用理发器从现场剃掉任何头发，并使用4%氯己定对该区域进行消毒，总共进行3轮灭菌。在手术部位周围涂抹无菌手术布。
注意：外科医生必须用含酒精或碘的洗涤剂洗手和手臂，并穿上无菌的长袍和手套。 - 使用10刀片切开皮肤（20-30厘米切口），然后切换到电烙术解剖到筋膜。
- 使用两个Kocher夹抬起筋膜和腹膜，并使用美辰鲍姆剪刀小心地在腹膜腔内做一个小切口（1厘米）。
- 使用电烙术将腹膜开口延长至切口的整个长度，将手指放在下面以保护下面的内脏。放置一个巴尔福收紧器以优化曝光。用湿毛巾颅缩回小肠。
- 打开肾脏下方的腹膜后间隙，小心识别输尿管并避免损伤。
- 将解剖带到腹主动脉和IVC。用中大夹子连接淋巴管。
- 圆周剖开血管，露出足够大的节段，以便在每个血管周围安装一个大的Satinsky夹子。注意避免腰动脉分支的破坏，这些分支从主动脉后部脱落。在暴露的近端和远端围绕主动脉和IVC放置两个血管环。
10.最终阻止并从 离体 灌注装置中取出心脏
- 在 离体 灌注2小时结束时，将加热器 - 冷却器连接到 离体 装置。将加热器冷却温度设置为34°C。
- 以无菌和无气的方式，将脱气的心脏麻痹输送管连接到主动脉通道端口的 离体 装置。
- 将离体设备上的温度设定点关闭。
- 将 加热器-冷却器 温度降至 24 °C ，并减少 泵流量 ，以将 MAP 保持在 60 至 70 mmHg 之间（通常泵流量从 1 L/min 降至 0.9 L/min）。
- 一旦 离体 灌注装置上的温度读数达到 24-26°C，将加热器 - 冷却器温度进一步降低至 14°C ，并将泵流量进一步降低100 mL / min。
- 一旦温度达到 14-16°C，从PA端口上拆下PA插管，开始输送顺行德尔尼多（500 mL），关闭AO管路阀，停止泵，并快速夹紧AO排气管路。
注意：需要滴定心脏停吸输送压力，以保持 离体 设备监视器上显示的平均输送压力为45-65 mmHg。 - 通过断开PA插管和主动脉接头并切断起搏线，从 离体 灌注装置中取出心脏。
- 将心脏放入装满无菌冰泥的桶中。
- 在后座上，将肺静脉/左心房切开术中插入左心室通气孔的位置翻开。修剪主动脉和PA的远端（1或2毫米），其中连接到套管可能已经压碎了组织。
注意：心脏现在已准备好进行腹内异位植入。
11. 心脏移植物的异位植入
- 在放置萨廷斯基夹具之前，向受体猪施用300 U / kg静脉注射肝素。
- 将缎面夹放在IVC上，并使用11刀片和Pott剪刀创建约1.5厘米的纵向静脉切开术。
- 使用运行方式将移植物PA吻合到受体的肾下IVC，尺寸：4-0，聚丙烯缝合线。首先进行吻合口的内部，并在完成吻合术的外部之前，根据需要用中断的缝合线加固。
注意：首先进行PA至IVC吻合术，最后进行主动脉至主动脉吻合术以缩短主动脉闭塞的持续时间。 - 将Satinsky夹在主动脉上，并使用11刀片和Pott剪刀创建约1.5厘米的纵向主动脉切开术。
注：在放置夹具之前获取 ABG。钳夹释放后立即重新检查，15-30分钟后再次检查，以评估高钾血症，高乳酸血症或酸血症的任何变化，表明受体缺血性损伤。 - 使用跑步将移植主动脉吻合到受体的肾下主动脉，使用运行方式，尺寸：4-0，聚丙烯缝合线。首先进行吻合口的内部，并在完成吻合术的外部之前，根据需要用中断的缝合线加固。
- 取下萨丁斯基夹子以重新注入心脏;首先，取下IVC夹，然后取下主动脉夹。
- 将18 G血管导管放入移植物的左心室顶端以脱气。完成后，取出血管导管并用承诺的缝合线关闭该部位。
- 仔细检查吻合口是否有任何出血。
- 小心地将心脏置于右侧腹膜后空间，使得吻合口上没有张力，血管没有扭结。更换小肠。
12. 剖腹手术的闭合
- 用环状闭合筋膜，尺寸：0，Maxon缝合线从切口的两端开始，在中间绑扎。注意避免对肠道造成任何伤害。
- 关闭真皮深层层，大小为：2-0，Vicryl以跑步方式，皮肤尺寸为：4-0，单丙烯以跑步方式关闭。
- 清洁皮肤切口并涂抹皮肤胶水。
13. 术后治疗和安乐死
- 手术完成后，关闭异氟醚流并监测猪的肌肉张力和神经肌肉反射（角膜反射，退出疼痛刺激，吞咽）的恢复。
- 确认恢复这些功能后，关闭机械通气并观察自主呼吸。如果有自主呼吸，取出气管插管;如果没有，将气管插管重新连接到机械通气。
- 将猪从手术台转移到隔离的围栏，在那里可以密切监测其生命体征（直肠温度，血压，心率）。必要时使用加热灯加热猪。在低血压（收缩压< 100mmHg）的情况下，静脉推注 250 mL 乳酸林格氏溶液。继续监测猪，直到它能保持胸骨卧位，生命体征完全正常化。
注意：在动物恢复足够的意识之前，它不会无人看管。此外，在完全康复之前，该动物不会归还给其他动物的陪伴。 - 对于疼痛管理，给予一次性剂量的丁丙诺啡（缓释）皮下注射0.12mg / kg，镇痛72小时。
- 在实验期结束时，对猪实施安乐死，以植入本地（胸部）心脏和同种异体移植（腹部）心脏。
- 按照第2节和第3节所述准备猪。准备两袋del Nido和两条心脏麻痹线，以阻止每颗心脏。
- 如第 4 节所述，暴露胸心。完成后，继续执行第9节中所述的剖腹手术。
- 一旦主动脉主动脉和PA-IVC吻合口暴露，在受体主动脉上放置一个Satinsky夹，在受体IVC上放置另一个夹子，以将同种异体移植物与体循环分离。
- 将儿科4-Fr主动脉根套管插入同种异体移植物的主动脉根部，并将心脏麻痹线连接到导管。使用压力袋以100-150 mmHg的压力将500 mL del Nido心脏麻痹施入根部。输液开始后，使用美辰鲍姆剪刀在PA-IVC吻合术的水平上做一个2厘米的切口，以排出同种异体移植物。
- 一旦同种异体移植物被逮捕，继续使用Metzenbaum剪刀在主动脉 - 主动脉吻合术的水平和PA-IVC吻合术的其余部分切除同种异体移植物。不要取下任何缎面夹子。
- 继续切除胸心，如第5节所述。
注意：唯一显着的区别是肺静脉不需要仔细结扎，而是可以在进行心脏开腹手术时使用Metzenbaum剪刀进行严重解剖。
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Representative Results
根据研究设计，该小组在本文介绍的方案后5至35天内成功地存活了9头猪。在接受该方案的10头猪中，只有1头因手术并发症过早死亡，存活率为90%。 图2 所示为在猪腹内位置移植的异位心脏的配置图。在确定同种异体移植物的吻合部位时，选择一个可以最大限度地减少吻合上任何紧张或扭结的部位。这确保了吻合口正确愈合，并且同种异体移植物得到最佳的血液灌注和引流。
在正常体温 离体 灌注装置上灌注的心脏同种异体移植物的代表性图像如图 3所示。 图4 概述了在成功实验期间获得的代表性灌注参数（循环流速，主动脉压，心率，温度，混合静脉血氧饱和度和血细胞比容）。无法达到此处演示的参数值可能导致移植后同种异体移植功能受损。 图5 显示了移植成功后35天腹内异位心脏 原位 的图像。使用此处提供的方案进行治疗递送的有效性的代表性结果先前由该组15证明。心脏同种异体移植物（n = 3）用用携带转基因的荧光素酶的腺病毒载体处理的灌注物灌注。在治疗和移植后5天，基因表达被证明是全局的和强大的同种异体移植物。 图6 显示了与受体的胸心相比，测量并表示为来自外植心脏同种异体移植物的每个区域的活性的平均折叠变化的荧光素酶活性图谱。
图1：使用正常温离体血灌注向整个心脏同种异体移植物进行治疗递送的方案示意图。（B）使用细胞保护装置洗涤血液，以从供体血清中除去任何治疗性中和成分。（C）将心脏同种异体移植物安装到正常体外灌注装置上并灌注2小时（D）在同种异体移植物安装后不久，将感兴趣的治疗剂添加到灌注液中。（E）在分配的离体灌注期后，将同种异体移植物移植到受者猪的腹内异位位置。这一数字已从15个修改而来。请点击此处查看此图的大图。
图2：腹内位置的猪异位心脏模型。 异位心脏模型的示意图，其中同种异体移植物移植在腹内位置，而受体的本地心脏保持在其自然位置。同种异体移植物的肺动脉吻合到肾下腔静脉，而同种异体移植物的主动脉与受体的肾下主动脉吻合。 请点击此处查看此图的大图。
图3： 离体 灌注装置上的心脏同种异体移植。 心脏同种异体移植物安装在正常体温 离体 灌注装置上，在那里它与治疗性灌注的灌注的灌注物一起灌注2小时，然后植入受体。 请点击此处查看此图的大图。
图4：代表性 的离体 灌注参数 （A）从肺动脉（蓝色），主动脉（绿色）和冠状动脉（红色）测量的循环流速。（B）代表性主动脉压力测量值：平均压力（蓝色）、收缩压（红色）、舒张压（绿色）。（C） 离体 灌注期间心脏同种异体移植物的心率。（D）记录 离体 灌注期间心脏同种异体移植物的温度。（E）显示灌注期间从灌注液中测量的SvO2 的值。（F）灌注期间从灌注液中测量的血细胞比容值。缩写：hct = 血细胞比容;SvO2 = 混合静脉血氧饱和度。 请点击此处查看此图的大图。
图5：在受体中移植的心脏同种异体移植物。 术后第35天的心脏同种异体移植物在植入时接受治疗。捐赠者被选中与接收者完美匹配。缩写：SLA = 猪白细胞抗原。 请点击此处查看此图的大图。
图6：心脏同种异体移植物转导后的荧光素酶活性。 介绍的是三种心脏同种异体移植物的结果，这些移植物是用携带荧光素酶转导的腺病毒载体转导的。证明是心脏同种异体移植物每个区域萤光素酶蛋白活性的平均折叠变化。这个数字是从比沙维 等人修改而来的。15. 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在心脏移植中离体灌注期间提供治疗药物提供了一种改变同种异体移植物并可能改善移植结果的策略。这里介绍的方案结合了最先进的正常体温离体血灌注储存，并为测试细胞，基因或免疫疗法向同种异体移植物11，12，13的分离递送提供了有希望的潜力。迄今为止，这些心血管疾病和终末期心力衰竭推定疗法的心脏输送技术依赖于全身给药，通过导管插入的冠状动脉内灌注和直接心肌注射，所有这些都在心肌输送方面取得了较差的结果5，16。我们之前已经证明了在移植前的离体灌注期间将病毒载体施用于灌注物时，报告基因对整个心脏同种异体移植物的稳健和全局表达15。这在心脏移植的背景下尤其重要，其中治疗的整体表达和效果应到达同种异体移植物的所有区域，以实现整个同种异体移植物所需的“心脏保护”。该协议以以前未使用传统描述的治疗给药途径实现的方式实现这一点。
该协议中提供了几个关键步骤需要强调。（1）必须采取一切预防措施，以尽量减少从捐赠者那里获得心脏期间的失血量。至少需要从供体获得1 L血液，灌注装置才能达到足够的流速。（2）对于使用正常体温 离体 血灌注的治疗性递送，有必要在将供体血液添加到灌注液之前清洗供体血液，以除去供体血清中可能对治疗药物向心脏的递送产生负面影响的任何中和成分。（3）尽量减少对供体的心脏解剖，直到心脏停搏后，以避免致命的心律失常。（4）当将治疗药物引入灌注装置时，重要的是通过最靠近主动脉根部的端口引入它，并始终冲洗端口以确保悬浮液的完全输送。这是为了最大限度地减少治疗剂对回路内氧合器或管子的任何潜在损失，并确保移植物接受尽可能高的治疗浓度。（5）最后，在选择移植物植入部位时，至关重要的是，该位置应尽量减少吻合口上张力的可能性，并且血管/吻合口不会扭结。
还建议猪事先进行猪白细胞抗原（SLA）型（即猪主要组织相容性复合物MHC），以选择SLA单倍型之间的适当匹配/不匹配程度，这些单倍型包括细胞表面I类（SLA-1，SLA-2和SLA-3）和/或II类（DR和DQ）抗原，基于研究者的需要（如前所述，SH进行的SLA分型，对分型引物面板稍作修改）17，18.例如，确保猪在所有SLA抗原上匹配可以最大限度地降低同种异体移植排斥的风险，而使用所有SLA抗原不匹配的猪可以最大限度地提高同种异体异体排斥反应的发生率。
该模型的局限性在于，虽然它允许研究对心脏移植物的免疫学影响，但它不允许在干预后对移植物支持心血管系统的能力进行全面评估。为了实现这一目标，移植物需要原位植入。然而，大型动物模型中的原位移植具有较高的相关死亡率，并且需要体外循环3.该模型的另一个局限性是限制使用 离体 灌注装置以对移植物进行有效的基因递送。随着这些设备在器官移植领域变得越来越可用，预计可及性将得到改善。此外，非商业设备可能是用于实验目的的一种选择。
心脏移植提供了一个独特的环境，在植入受体之前，可以通过 离体 灌注将治疗药物引入同种异体移植物。使用 离体 灌注装置允许移植物从供体到受体的运输时间比使用传统冷静态储存的安全时间长得多6.这种延长的灌注期使治疗药物的有效分离递送成为可能。该模型是治疗药物的临床前动物试验和变革性临床疗法之间的转化步骤。
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Disclosures
保罗·莱茨伯格受雇于跨媒体公司，卡梅隆·米兰从跨媒体公司获得了一笔财务礼物，用于资助异位心脏移植手术。米歇尔·门迪奥拉·普拉由T32HL007101支持。其他作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
我们要感谢杜克大学大型动物外科核心和杜克大学灌注服务公司在这些手术过程中的帮助。我们还要感谢保罗·莱兹伯格和跨媒体公司的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Looped Maxon suture | Covidien | GMM-341L | Used to close fascia of the laparotomy incision |
| 0 Silk ties | Medtronic, Inc | S346 | |
| 18 G Angiocath | BD | 381144 | Used to de-air the left ventricle of the donor heart after implantation |
| 20 Fr LV vent | Medtronic, Inc | 12002 | |
| 2-0 Silk sutures | Ethicon, Inc. | SA11G | |
| 2-0 Silk ties | Ethicon, Inc. | SA65H | |
| 2-0 Vicryl suture | Ethicon, Inc. | J259H | |
| 24 Fr venous cannula | Medtronic, Inc | 68124 | |
| 3-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8522 | |
| 4-0 Monocryl suture | Ethicon, Inc. | Y469G | |
| 4-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8521 | |
| Animal hair cutting clipper | Wahl | 8786-452 | |
| Aortic clamp | V. Mueller | CH6201 | |
| Army Navy retractor | V. Mueller | SU3660 | |
| ATF 40, Cell saver disposable set | Fresenius Kabi | 9108494 | Cell saver device insert |
| Balfour retractor | V. Mueller | SU3042 | Used as an abdominal wall retractor |
| C.A.T.S cell saver | Fresenius Kabi | ES0019 | Cell saver device used to wash donor blood |
| Cardiac defibrillator | Zoll | M Series | Cardiac defibrillator |
| Castro needle holder | V. Mueller | CH8589 | |
| CG4 iStat cartridges | Abbott | 03P85-25 | POC testing |
| CG8 iStat cartridges | Abbott | 03P88-25 | POC testing |
| DeBakey forceps | V. Mueller | CH5902 | |
| Electrocautery disposable pencil | Covidien | E2450H | |
| Gerald forceps | V. Mueller | NL1451 | |
| Hemotherm 400CE Dual Reservoir Cooler/Heater | Cincinnati Sub-Zero | 86022 | Heater cooler used to regulate perfusion temperature on the ex vivo perfusion device |
| iSTAT 1 | Abbott | 04P75-03 | POC testing device |
| Kocher clamp | V. Mueller | SU2790 | |
| Large clip applier | Sklar | 50-4300 | |
| Large clips | Teleflex | 4200 | |
| Large soft pledgets | Covidien | 8886867901 | |
| Medium clip applier | Sklar | 50-4335 | |
| Medium clips | Teleflex | 2200 | |
| Metzenbaum scissor | V. Mueller | CH2006-001 | |
| No. 10 scalpel blade | Swann-Mortan | 301 | Used for skin incision |
| No. 11 scalpel blade | Kiato Plus | 18111 | Used for vascular incision |
| OCS device with base | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device | |
| OCS disposable | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device insert with perfusion kits | |
| Pacing cable | Remington Medical | FL-601-97 | |
| Pediatric cardioplegia catheter (4Fr) | Medtronic, Inc | 10218 | Used to deliver cardioplegia to the donor aortic root |
| Pediatric Foley catheter | Teleflex | RSH170003080 | Placed pre-op to decompress the recipient's bladder |
| Potts scissors | V. Mueller | CH13038 | |
| Pressure bag x2 (1,000 mL) | Novaplus | V4010H | Used to deliver cardioplegia at a set pressure |
| Satinsky clamp | V. Mueller | CH7305 | Vascular clamp used for creating anastomoses between donor heart and recipient vessels |
| Scissors | Felco | FELCO 200A-50 | Used to perform sternotomy |
| Small hard pledgets | Covidien | 8886867701 | |
| Sternal retractor | V. Mueller | CH6950-007 | |
| Temporary cardiac pacing wires | Ethicon, Inc. | TPW32 | |
| Temporary dual chamber pacemaker | Medtronic, Inc | 5388 | Cardiac pacing device |
| Tourniquet kit | Medtronic, Inc | 79005 | Rummel tourniquets |
| Umbilical tape | Covidien | 8886861903 | |
| Vessel loops | Covidien | 31145686 |
References
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