Summary
우리는 돼지 이종성 심장 이식 모델에서 전체 심장 동종이식편에 치료제를 전달하기 위한 규범발열 ex vivo sanguinous perfusion system을 활용하기 위한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
심장 이식은 말기 심부전의 황금 표준 치료법입니다. 그러나, 이용가능한 공여자 심장의 수 및 원발성 이식편 기능장애 및 이식편 거부와 같은 합병증에 의해 제한되는 채로 남아있다. 심장 이식에서 생체외 관류 장치의 최근 임상 사용은 기능을 향상시키고 해로운 수용자 반응을 피하기 위해 치료 적 개입으로 심장 동종 이식편을 치료할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 전체 동종이식편에 대한 치료적 전달을 위한 번역적, 대규모의 동물 모델을 확립하는 것은 심장 이식에서 새로운 치료 접근법을 시험하는 데 필수적이다. 복강 내 위치에서의 돼지, 이질적 심장 이식 모델은 이식편 거부의 새로운 개입 및 면역병리학의 효과를 평가하기 위한 우수한 모델로서 작용한다. 이 모델은 또한 이식편이 수용자의 순환을 유지할 필요가 없다는 점을 감안할 때 돼지에게 장기간 생존을 제공합니다. 이 프로토콜의 목적은 이식 전에 전체 심장 동종이식편에 대한 치료학의 생체외 전달을 달성하기 위한 재현 가능하고 강력한 접근법을 제공하고, 생체외 관류 심장의 생존 이종물질 이식을 수행하기 위한 기술적 세부사항을 제공하는 것이다.
Introduction
심부전은 미국에서 약 6 백만 명의 성인에게 영향을 미치는 상태이며 2030 년까지 8 백만 명의 성인으로 증가 할 것으로 예상됩니다1. 심장 이식은 말기 심부전의 황금 표준 치료법입니다. 그러나 한계와 합병증이없는 것은 아닙니다. 이용 가능한 공여자 심장의 수, 원발성 이식편 기능 장애, 심장의 거부, 및 장기 면역 억제의 부작용2에 의해 제한된다. 이러한 한계는 동종 이식 실패를 경험할 수 있고 정상적인 기대 수명을 달성하기 위해 후속 재 이식이 필요한 젊은 수혜자에게 특히 중요합니다.
이러한 한계를 극복하기위한 이상적인 개입은 동종 이식편의 생존력을 향상시키고 "심장 보호"를 부여 할 수있는 수용자에게 이식하기 전에 전체 심장 동종 이식편을 치료제로 치료할 것입니다. 이러한 개입은 허혈성 모욕, 동종 이식편 거부, 심장 동종 이식편 혈관병증의 발생을 최소화하고 심지어 한계 동종 이식편을 복구하기 위해 예방적으로 주어질 것입니다. 이러한 유형의 중재를 개발하기위한 번역 연구는 심장 이식의 장기 감시를 허용하기 위해 심장 이식의 대규모 동물 모델을 필요로합니다. 복강내 위치에서의 돼지, 이질적 심장 이식 모델은 이러한 목적에 이상적인 것으로 입증되었다. 이 위치에서의 심장 이식은 새로운 치료법의 효과를 테스트하고 이식편 거부의 면역 병리학을 평가할 수있게합니다. 추가적으로, 헤테로토픽 모델은 수용자의 더 나은 전체 생존, 심폐 우회에 대한 요구가 없고, 수용자의 순환을 유지하기 위한 이식편의 요건이 없기 때문에 동위원소 모델에 비해 유리하다3.
유전자, 세포, 또는 면역요법과 같은 심장에 대한 치료적 개입의 효과적인 전달은 임상 적용에 대한 상당한 장벽이다4,5. 생체외 관류 장치에 의해 도입된 기술은 이식편이 지속적으로 관류될 수 있게 하여, 비작동하지만 대사적으로 활성인 상태(6,7,8,9)로 유지한다. 이것은 전신 전달10,11,12,13의 잠재적 인 부작용을 최소화하면서 고급 치료제로 전심을 치료할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 치료 전달을 위해 생체외 관류 장치를 활용하는 또 다른 이점은 이들이 전통적인 냉정전기 저장 방법을 사용하여 실현 가능하지 않은 장기간에 걸쳐 관상동맥 순환에 약물을 투여할 수 있다는 것이다. 이것은 이식편(14)에 대한 치료제의 보다 전세계적인 전달을 허용한다. 여기에 제시된 프로토콜을 사용하여, 우리는 아데노바이러스 벡터15를 사용하여 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 전체 돼지 심장 이식편에 성공적으로 전달하였다. 이 프로토콜의 목적은 이식 전에 전체 심장 동종이식편에 대한 치료의 전달을 달성하기 위한 재현 가능하고 강력한 접근법을 제공하는 것이다.
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Protocol
참고 : 두 마리의 암컷 유카탄 돼지가 선택되며, 하나는 심장 이식 기증자로 지정되고 다른 하나는 수령인으로 지정됩니다. 6-8 개월 된 돼지는 체중이 약 30kg이며 호환 가능한 혈액형을 갖는 것이 좋습니다. 프로토콜의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 돼지의 주거 및 치료 절차는 듀크 대학 의료 센터의 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 수행됩니다.
1. 생체외 관류 장치의 제조
- 제조업체의 지침에 따라 사용할 생체외 관류 장치 및 세포 보호기 장치를 준비하십시오.
- 페이싱 박스와 제세동기가 준비되도록 하고 설치해 두십시오.
- 전체 혈액 수(CBC), 기본 대사 패널(BMP) 및 동맥 혈액 가스(ABG)를 검사할 수 있는 POC(Point-of-care) 검사 장치를 준비하십시오.
- 제조업체의 관류 용액에 아직 존재하지 않는 경우 제조업체가 제공 한 관류 프라이밍 용액에 다음 약물을 추가하십시오 : 25 % 알부민 100 mL, 200 mg / 100 mL 시프로 플록사신 10 mL, 세파졸린 나트륨 1 g, 멀티 비타민 주사 5 mL 바이알 2 개, 메틸 프레드니솔론 250 mg, 헤파린 10,000 IU 및 인슐린 50 IU.
- 생체외 장치 프라이밍 용액의 POC 테스트를 수행하여 전해질 수준이 정상 생리학적 범위 내에 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 글루콘산 칼슘, 덱스트로스 및/또는 중탄산나트륨을 적절하게 투여하여 하위 치료 전해질 또는 포도당 수준을 보충하십시오.
- 추가 된 약물로 프라이밍 용액을 추가하려면 용액을 스파이크하고 용액을 생체외 관류 장치로 전달하는 라인을 탈공하십시오.
참고: 생체 외 관류 장치 프라이밍에 대한 지침은 섹션 6으로 건너뜁니다.
2. 기증자 돼지의 마취 및 IV 접근 개시
- 돼지를 8-12 시간 동안 금식 한 후 케타민 (5-33 mg / kg, 근육 내)과 미다 졸람 (0.2-0.5 mg / kg, 근육 내)으로 미리 치료하고 얼굴 마스크를 사용하여 이소 플루란 (1-4 %)을 투여하십시오.
- 돼지를 수핀 위치에 놓고 기관내 튜브 (ETT) (5.5-6.5 mm 내부 직경)로 삽관하여기도를 보호하십시오. ETT를 돼지의 주둥이에 묶어 고정하십시오. 테이블에 부착 된 무거운 넥타이를 사용하여 사지를 배치하십시오.
- 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 바르십시오.
- 정맥 내 (IV) 카테터 (20-22 G)를 귀 정맥에 놓습니다.
- 유지 보수 IV 유체 개시 (10 mL에서 수유 링거의 용액 ·( kg·h)-1).
- 진통제를 위해 근육 내 (IM) Buprenorphine 0.005-0.01 mg / kg을 투여하십시오.
3. 바이탈 사인 및 중앙 라인 설정
- 갯벌 부피 10mL· (kg·분) -1 및 이소플루란으로 분당 10-15회 호흡 속도(1-3%)가 시술 내내 유지되어 반사가 없도록 하고 심박수(>60 bpm, <100 bpm) 및 혈압(수축기 혈압>90 mmHg, <130 mmHg)은 생리적 범위 내에 남아 있다.
참고 : 중풍병의 추가는 선택 사항입니다. - 수술 내내 산소 포화도와 심박수를 지속적으로 모니터링합니다.
4. 기증자 돼지의 중간 흉골 절제술
- manubrium에서 xiphoid까지 흉골을 촉지하십시오. 멸균 수술 마커를 사용하여 중간선을 표시하십시오. 머리카락을 깎는 사람으로 부위의 머리카락을 면도하고 4 % 클로르헥시딘을 사용하여 총 3 라운드의 살균을 위해 그 부위를 살균하십시오. 즉시 수술 부위 주위에 멸균 수술 드레이프를 적용하십시오.
참고 : 외과 의사는 알코올 또는 요오드 기반 세척으로 손과 팔을 씻고 멸균 가운과 장갑을 착용해야합니다. - 10 번 블레이드를 사용하여 돼지의 크기에 따라 20-30cm 크기의 xiphoid까지 manubrium에서 절개하십시오.
- 전기 소작술을 사용하여 흉골에서 xiphoid로 가슴 주요를 나누고, 흉골의 중간 선을 따라이 작업을 조심하십시오. 일단 흉골까지 내려 가면 중간 선을 채점하고 무거운 가위로 나누어 xiphoid에서 흉골 절제술을 시작하십시오.
- 무거운 가위로 흉골 절제술 두개골을 확장하십시오. 각 절단 후, 손가락 스윕을 사용하여 흉골에서 심장을 무뚝뚝하게 분리하십시오. 이런 식으로 manubrium을 통해 흉골 절제술을 완료하십시오.
- 흉골 절제술을 완료 한 후, 절단 된 뼈 가장자리에 전기 소작술을 적용하여 지혈을 달성하십시오.
- 흉골 리트랙터를 놓고 열어 수술 현장의 노출을 최적화하십시오. 전기 소작술로 흉선을 확인하고 제거하십시오. 횡격막에서 대동맥까지 세로 심낭을 입력하십시오. 5-6 사이즈를 사용하여 심낭 요람을 만듭니다 : 2-0, 실크 봉합사.
5. 기증자 돼지의 심장 마비 및 심장 절제술
- 대동맥과 폐동맥 (PA) 사이의 조직을 완전히 분할하고 대동맥 아치와 상완 줄기의 위치를 시각화하여 대동맥 크로스 클램프의 적절한 배치를 용이하게합니다.
참고 : 상승하는 대동맥은 돼지 대 인간에서 훨씬 짧습니다. - 가위와 무딘 해부를 사용하여 우수한 베나 카바 (SVC)를 원주적으로 해방시킵니다. SVC 주위에 두 개의 크기 : 0, 실크 넥타이를 통과하십시오.
- 가위와 무딘 해부를 사용하여 열등한 정맥 카바 (IVC)를 원주적으로 해방시킵니다. 마찬가지로 IVC 주위에 두 개의 0 실크 타이를 전달하십시오.
- U 스티치, 크기 : 4-0, 폴리 프로필렌 봉합사를 오름차순 대동맥에 적용하십시오.
- 지갑 끈, 크기 : 4-0, 폴리 프로필렌 봉합사를 오른쪽 아트리움 (RA)에 적용하십시오.
- 300 U / kg의 초기 용량을 사용하여 헤파린 IV의 볼루스를 투여하십시오.
- 이전에 배치 된 U-stitch에 의해 고정 된 소아 4-Fr 대동맥 뿌리 캐뉼라를 삽입하십시오. 캐뉼라를 비우고 럼멜 지혈대로 제자리에 고정하십시오.
- 튜브가 del Nido 심흉막으로 플러시 된 후 대동맥 뿌리 캐뉼라를 심흉막 튜브에 연결하십시오. 튜브 내의 기포를 제거하기 위해 필요한 양으로 플러시하십시오.
참고 : 관류 팀과의 의사 소통은이 시점에서 심장 마비를 올바르게 실행하는 데 중요합니다.- 관류 학자가 세포 보호기 일회용품을 멸균 방식으로 설치하고, 제조업체가 권장하는대로 장치를 프라이밍하고(섹션 6 참조), 수집된 혈액을 처리할 준비가 되었는지 확인합니다.
- 세포 보호기 심장 절제술 (세척 후 혈액이 저장되는 세포 보호기 장치에 부착 된 플라스틱 용기)이 10,000 U의 헤파린으로 준비되었는지, 심근 절제술이 -150 mmHg의 압력을 초과하지 않도록 흡입에 연결되어 있는지 확인하십시오.
참고 : 이것은 적혈구의 용혈을 피하기위한 것입니다.
- 이전에 배치 된 지갑 끈 내에 오른쪽 동맥 절제술을 만들고, RA에 24 Fr 정맥 캐뉼라를 삽입하고, Rummel 지혈대로 고정하십시오.
- 정맥 캐뉼라를 세포 보호기 심장 절제술에 연결된 멸균 흡입 라인에 연결하고 약 1-1.3L의 혈액을 수집하십시오. 그런 다음 대동맥 크로스 클램프를 적용하여 클램프가 오름차순 대동맥을 완전히 막도록주의 깊게 확인하십시오. 압력 백을 사용하여 500 mL의 Del Nido 심장 흉막을 100-150 mmHg의 압력으로 뿌리에 투여하십시오.
참고 : 심장이 붉어지고 체포 될 것입니다. - 멸균 된 얼음 슬러시를 심장에 두십시오.
- 심흉막이 전달되면 대동맥 뿌리 캐뉼라와 RA 정맥 캐뉼라를 제거하고 지갑 끈 봉합사를 묶습니다.
- IVC, SVC는 azygos 정맥에 바로 근접한 SVC, Innominate 동맥에 원위 떨어진 아치 수준의 대동맥, 분기의 주요 PA 및 관상 동맥 부비동에 들어갈 때 왼쪽 접합 정맥을 나눕니다.
참고 : 돼지는 관상 동맥 부비동으로 배수되는 왼쪽 접합 정맥을 가지고 있습니다. - 폐정맥을 확인하고 2-0, 실크 타이 또는 대형 클립과 같은 크기로 ligate하십시오. LV 통풍구의 삽입을 위해 하나의 폐정맥을 열어 두십시오.
- 가슴에서 심장을 제거하고 멸균 된 얼음 슬러시가있는 용기에 넣으십시오.
- 심장을 백테이블로 이동시켜 생체외 관류 장치 상에 배치하기 위한 이식편을 준비한다.
6. 공여체 혈액을 세척하고 생체외 관류 장치를 프라이밍
참고: 이 단계는 퍼퓨세이트에 도입될 때 치료제의 전달을 중화시킬 수 있는 임의의 성분을 공여체 혈청으로부터 제거하기 위해 필요하다. 동종이식편 허혈 시간을 최소화하기 위해 공여체 심장의 삼출 동안 이 단계를 수행하십시오.
- 셀 세이버 프라임 및 세척 사이클을 완료하십시오.
- 제조업체의 지침에 따라 일회용 구성 요소를 장치에 설치하십시오.
- 플라스마lyte A를 스파이킹하고 장치에서 주요 기능을 선택하여 세포 보호기 장치를 프라임. 기증자 돼지로부터 수집 된 혈액의 양만큼 Plasmalyte A를 1 : 1 방식으로 추가하십시오.
참고 : 장치가 프라이밍 사이클을 완료하면 혈액을 추가 할 준비가됩니다. 기증자 돼지의 혈액을 추가하는 방법에 대해서는 섹션 5.9-5.11을 참조하십시오. - 혈액이 장치에 있으면 세포 보호기 장치에서 세척주기 를 선택하십시오.
참고 :이 과정에서 혈액을 원심 분리하고 혈장 용해물 A가 도입되어 혈액을 씻습니다. 이 단계는 혈액을 농축하고 씻어냅니다.
- 세척된 혈액을 혈액 수집 백으로 옮겨 생체외 장치로 옮긴다.
- 세척된 혈액을 제조업체의 지침에 따라 생체외 관류 장치에 첨가한다.
- 생체외 기계의 프라이밍 동안 물에 5% 덱스트로스 500 mL에 에피네프린 0.25 mg과 인슐린 30 IU를 주입하여 에피네프린 용액을 준비한다. 용액을 스파이크하고 용액을 생체외 장치에 전달하는 라인을 탈공한다.
- 10,000 U의 헤파린을 생체외 관류 장치에 첨가한다.
- 혈액을 재구성하기 위해 5 % 알부민을 첨가하십시오.
참고: 장치에 추가된 5% 알부민의 부피는 셀 세이버 장치에 의해 제거된 플라즈마의 양과 같습니다. 이것은 생리 학적 종양성 압력과 헤마토크릿을 달성하는 데 도움이됩니다. - 펌프를 켜서 1-1.5 L / min으로 흐르게하여 저장소로 투여 된 투명 프라임, 약물 및 혈액으로 회로를 프라이밍하십시오. 펌프 흐름을 켜고 관류 모듈을 통해 프라임을 순환시킨 후 회로 라인에 공기가 없는지 확인하십시오.
참고: 최종 유지 보수 용액 부피는 세척된 혈액의 부피 이외에 1000 mL이다. - POC 시험 장치를 사용하여 기준선 퍼퓨세이트 POC 화학 및 락테이트를 수득한다. 필요에 따라 전해질을 보충하십시오.
- 100 mg / dL의 최소 포도당 수준을 유지하기에 충분한 덱스트로스를 첨가하십시오.
- 최소 pH 목표 7.4를 유지하기 위해 중탄산나트륨 을 충분히 첨가하십시오.
참고 : 중요한 것은 첨가 된 중탄산 나트륨을 향수에서 제거 할 수 없다는 것입니다. 과도한 나트륨 수치는 심장이 부종이되는 데 기여할 것이며 피해야합니다. 심장이 재생기시 기본 결핍을 교정하기 시작하므로 기본 결핍을 치료할 때주의해야합니다. - 0.8mmol/L의 최소 이온화 칼슘 수준을 유지하기 위해 글루콘산 칼슘을 충분히 첨가하십시오.
- 온도를 37°C로 설정합니다.
- 가스 유량을 150 mL/min으로 설정하고 생리학적 pCO2 수준을 달성하기 위해 필요에 따라 조정하십시오.
- 평균 동맥압(MAP) 대상을 60-70mmHg로 설정합니다.
- 펌프 유량을 0.6L/분으로 낮춥니다.
7. 기증자 심장의 백테이블 준비 및 심장 재생
- SVC를 오버바느질합니다. 4 개의 약속 된 크기 : 4-0, 폴리 프로필렌 봉합사를 원위 대동맥 안쪽 주위에 간단한 수평 매트리스 방식으로 놓고 절단 가장자리 아래 5mm를 놓고 묶습니다.
- 4, 크기 : 4-0, 약속 된 대동맥 봉합사를 들고 대동맥 커넥터를 대동맥에 삽입하고 대동맥 주위에 탯줄 테이프를 묶어 커넥터를 고정하십시오.
- 사이즈: 4-0, 폴리프로필렌 지갑-스트링을 메인 PA의 원위 컷 가장자리 주위에 놓습니다. PA 캐뉼라를 삽입하고 지갑 끈의 끝을 묶어 캐뉼라를 고정하십시오.
- 준비된 이식편을 백테이블에서 생체외 관류 장치로 가져 와서 대동맥 커넥터를 장치에 연결하십시오. 심장을 장치에 고정하기 전에 대동맥/대동맥 커넥터를 공기에서 분리하십시오.
- 관류 클럭을 시작하고 펌프 흐름을 약 0.6L/min으로 유지하며 온도 설정점을 34°C로 낮춥니다.
- 에피네프린을 시작하고 제조업체의 권장 사항에 따라 유지 보수 드립을 시작하십시오.
- PA 캐뉼라를 장치의 PA 커넥터에 연결하고 타이로 고정하십시오.
- 묶이지 않은 폐정맥을 통해 좌심실(LV) 통풍구 배수구를 왼쪽 심방으로 넣고 승모판 판막을 가로질러 LV에 넣습니다. 통풍구를 단일 스티치로 제자리에 고정시켜 적절하게 고정시킵니다.
- 두 개의 심장 간격 리드를 LV 자유 벽에 놓습니다.
- 매시간 젖산염, ABG, CBC 및 BMP를 확인하십시오. 칼륨, 50 % 덱스트로스 및 칼슘을 필요에 따라 투여하여 정상적인 생리 학적 수준을 유지하십시오.
참고: 더 빈번한 젖산 샘플링은 젖산염을 기반으로 적절한 관류를 확립하기 위해 초기 안정화 중에 적절할 수 있습니다. - 간격이 필요한 경우 심실 속도를 10mA에서 분당 80비트로 설정합니다(심방 간격은 일반적으로 사용되지 않음).
- 제세동이 필요한 경우 장치의 온도가 34°C에 도달한 후 10J에서 시작하십시오. 50J를 초과하지 마십시오.
참고: 목표 총 평균 유량은 600mL/min이고 평균 관상동맥 유량은 400mL/분입니다.
8. 치료학적 투여
- 무균 방식으로 주사기에 치료법을 그립니다.
- 멸균된 3 mL 주사기를 사용하여 심흉막 포트를 탈공기하여 포트를 통해 혈액을 채취한다. 치료가 대동맥 뿌리에 직접 도입되도록 심흉통 포트 (또는 이와 동등한 것)로 치료를 투여하십시오.
- 상기 포트를 탈방영할 때 상기 단계 8.2에서 인입된 혈액의 부피를 갖는 플러시포트; 공기가 플러시되지 않도록주의하십시오.
참고 : 이것은 치료가 심장의 대동맥 뿌리에 투여되도록하기위한 것입니다.
참고 :이 섹션은 이전에 Bishawi et al .에서 자세히 설명되었습니다. 루시퍼라제 발현15를 위한 바이러스 벡터를 도입한다. - 치료학을 도입한 후 2시간 동안 장치 상에 이식편을 관류시킨다.
9. 혈관 노출을 통한 수용자 및 개복술의 준비
- 일단 심장 동종이식편이 장치에 고정되고 치료가 회로 내로 도입되면, 수용자 돼지에 대한 섹션 2에 설명된 바와 같이 마취 및 수술 전 제제의 유도를 시작한다.
- 면역 억제 약물의 주입을 시작하십시오 : 사이클로스포린 50 mg / kg 절차 전반에 걸쳐 느린 점적 주입으로 총 및 메틸 프레드니솔론 1 g IV 볼루스.
- 항생제 투여: 엔로플록사신 IM (5 mg/kg) 및 세파졸린 1 g IV 볼루스.
- 폴리 카테터를 방광에 삽입하십시오.
참고: 방광을 감압하면 적외선 대동맥과 IVC의 최적 노출을 얻을 수 있습니다. - 멸균 수술 마커를 사용하여 중복부에서 치골까지 복부 중간 선을 표시하십시오. 머리카락을 깎는 사람으로 부위의 머리카락을 면도하고 4 % 클로르헥시딘을 사용하여 총 3 라운드의 살균을 위해 그 부위를 살균하십시오. 즉시 수술 부위 주위에 멸균 수술 드레이프를 적용하십시오.
참고 : 외과 의사는 알코올 또는 요오드 기반 세척으로 손과 팔을 씻고 멸균 가운과 장갑을 착용해야합니다. - 10 개의 칼날을 사용하여 피부 (20-30cm 절개)를 절개하고 전기 소작으로 전환하여 근막까지 해부하십시오.
- 두 개의 Kocher 클램프를 사용하여 근막과 복막을 들어 올리고 Metzenbaum 가위를 사용하여 복강에 작은 절개 (1cm)를 조심스럽게 만듭니다.
- 전기 소작술을 사용하여 절개의 전체 길이에 대한 복막 개구부를 연장하고 손가락 아래에 손가락을 배치하여 기본 내장을 보호하십시오. 노출을 최적화하기 위해 Balfour 리트랙터를 배치합니다. 젖은 수건으로 작은 창자를 두개골로 수축시킵니다.
- 신장보다 열등한 후복막 공간을 열고 요관을 확인하고 부상을 피하십시오.
- 해부를 복부 대동맥과 IVC로 운반하십시오. 중간 및 대형 클립으로 림프원을 Ligate하십시오.
- 선박을 원주적으로 해부하고 각 선박 주위에 큰 Satinsky 클램프에 맞도록 충분히 큰 세그먼트를 노출시킵니다. 대동맥의 후부 부분에서 나오는 요추 동맥 가지의 붕괴를 피하기 위해주의하십시오. 대동맥 주위에 두 개의 혈관 루프를 배치하고 IVC를 노출의 근위 및 원위 말단에 놓습니다.
10. 최종 정지 및 생체외 관류 장치로부터 심장 제거
- 생체외 관류의 2 시간이 끝나면 히터 쿨러 기계를 생체 외 장치에 연결하십시오. 히터 냉각기 온도를 34°C로 설정합니다.
- 멸균 및 무공기 방식으로, 탈방영된 심흉막 전달 라인을 대동맥 접근 포트의 생체외 장치에 연결한다.
- ex vivo 장치의 온도 설정점을 끕니다.
- 히터 냉각기 온도를 24°C로 낮추고 펌프 흐름을 줄여 MAP를 60~70mmHg(일반적으로 펌프 유량이 1L/min에서 0.9L/min으로 변경)로 유지합니다.
- 생체외 관류 장치의 온도 판독값이 24-26°C에 도달하면 히터 냉각기 온도를 14°C로 더 낮추고 펌프 흐름을 100mL/min만큼 더 줄입니다.
- 온도가 14-16 °C에 도달하면 PA 포트에서 PA 캐뉼라를 분리하고 전치 델 니도 (500 mL)의 전달을 시작하고 AO 라인 밸브를 닫고 펌프를 중지하고 AO 벤트 라인을 신속하게 클램프합니다.
참고: 심폐막 전달 압력은 생체외 장치 모니터에 표시된 대로 45-65mmHg의 평균 전달 압력을 유지하기 위해 적정해야 합니다. - PA 캐뉼라와 대동맥 커넥터를 분리하고 페이싱 와이어를 절단하여 생체외 관류 장치로부터 심장을 제거한다.
- 멸균 된 얼음 슬러시로 가득 찬 양동이에 심장을 넣으십시오.
- 뒷테이블에서 LV 통풍구가 삽입 된 폐정맥 / 왼쪽 동맥 절제술을 오버 바느질하십시오. 대동맥 및 PA의 원위 측면의 트림 (1 또는 2 mm)은 캐뉼라에 부착되어 조직을 분쇄했을 수 있습니다.
참고 : 심장은 이제 복부 내, 이질성 이식을위한 준비가되어 있습니다.
11. 심장 이식편의 이종국소 이식
- Satinsky 클램프를 배치하기 전에 수령인 돼지에게 IV 헤파린 300 U / kg을 투여하십시오.
- IVC에 Satinsky 클램프를 놓고 11 블레이드와 Pott의 가위를 사용하여 ~ 1.5cm 크기의 세로 정맥 절제술을 만듭니다.
- 이식된 PA를 수용자의 적외선 IVC에 항진시켜 종단-대측 방식으로 실행, 크기: 4-0, 폴리프로필렌 봉합사를 사용한다. 해부학의 안쪽 부분을 먼저 수행하고 문합술의 바깥 부분을 완료하기 전에 중단 된 봉합사로 필요에 따라 강화하십시오.
참고 : PA to IVC 해부학이 먼저 수행되고 대동맥 대 대동맥 해부학은 대동맥 폐색의 지속 기간을 줄이기 위해 마지막으로 수행됩니다. - 대동맥에 Satinsky 클램프를 놓고 11 블레이드와 Pott의 가위를 사용하여 ~ 1.5cm 크기의 세로 대동맥 절제술을 만듭니다.
주: 클램프 배치 전에 ABG를 구하십시오. 클램프 방출 직후에 다시 확인하고 15-30 분 후에 다시 검사하여 수용자의 허혈성 손상을 나타내는 고칼륨 혈증, 고 락트 혈증 또는 산혈증의 변화를 평가하십시오. - 이식된 대동맥을 수용자의 적외선-신장 대동맥에 항진시켜 말단 투 사이드 방식으로 달리기, 크기: 4-0, 폴리프로필렌 봉합사. 해부학의 안쪽 부분을 먼저 수행하고 문합술의 바깥 부분을 완료하기 전에 중단 된 봉합사로 필요에 따라 강화하십시오.
- 심장을 재관류하기 위해 Satinsky 클램프를 제거하십시오. 먼저 IVC 클램프를 제거한 다음 대동맥 클램프를 제거하십시오.
- 18 G 혈관을 이식편의 LV 정점에 넣고 탈공기시킨다. 완료되면 혈관을 제거하고 약속 된 봉합사로 사이트를 닫으십시오.
- 조심스럽게 해부학에 출혈이 있는지 확인하십시오.
- 조심스럽게 심장을 오른쪽 복막 공간에 배치하여 해부학에 긴장이없고 혈관의 꼬임이 없도록하십시오. 작은 장을 교체하십시오.
12. 개복술의 폐쇄
- 루프, 크기 : 0, Maxon 봉합사의 양쪽 끝에서 시작하여 중간에 묶는 방식으로 근막을 닫습니다. 장에 부상을 입지 않도록주의하십시오.
- 크기로 깊은 피부 층을 닫으십시오 : 2-0, 달리기 패션의 Vicryl 및 크기 : 4-0, 달리기 방식으로 Monocryl.
- 피부 절개를 닦고 피부 접착제를 바르십시오.
13. 수술 후 치료 및 안락사
- 수술 완료 후 이소 플루란 흐름을 끄고 돼지가 근육 톤과 신경 근육 반사 (각막 반사, 고통스러운 자극으로의 철수, 삼키는 것)의 복귀를 모니터링합니다.
- 이러한 기능의 복원을 확인한 후 기계 환기를 끄고 자발적인 호흡을 관찰하십시오. 자발적인 호흡이있는 경우, 기관 내 튜브를 제거; 그렇지 않은 경우 기관내 튜브를 기계적 환기에 다시 연결하십시오.
- 돼지를 수술대에서 격리 된 인클로저로 옮겨 생체 신호 (직장 온도, 혈압, 심박수)를 면밀히 모니터링 할 수 있습니다. 필요에 따라 난방 램프를 사용하여 돼지를 따뜻하게하십시오. 저혈압 (수축기 혈압 < 100mmHg)의 설정에서 수유 링거 용액 250mL의 IV 유체 볼러스를 제공하십시오. 흉골 잔해를 유지하고 활력 징후가 완전히 정상화 될 때까지 돼지를 계속 모니터링하십시오.
참고 : 동물은 충분한 의식을 회복 할 때까지 방치되지 않습니다. 또한, 동물은 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사로 반환되지 않습니다. - 통증 관리를 위해, 진통의 72 시간 동안 buprenorphine (지속 방출) 피하 주사 0.12 mg / kg의 일회성 복용량을 투여하십시오.
- 실험 기간이 끝나면 돼지를 안락사시켜 토착 (흉부) 심장과 동종 이식 (복부) 심장을 삼키십시오.
- 절차를 위해 섹션 2 및 3에 설명 된대로 돼지를 준비하십시오. 각 심장을 체포하기 위해 델 니도 (del Nido) 두 봉지와 두 개의 심장 흉막 라인을 준비하십시오.
- 섹션 4에 설명된 대로 흉부를 노출시킨다. 완료되면 섹션 9에 설명 된대로 개복술을 수행하십시오.
- 대동맥 대동맥 및 PA-IVC 해부학이 노출되면 수용자 대동맥에 Satinsky 클램프를 놓고 수용자 IVC에 다른 클램프를 배치하여 동종 이식편을 전신 순환에서 분리하십시오.
- 소아 4-Fr 대동맥 뿌리 캐뉼라를 동종 이식편의 대동맥 뿌리에 삽입하고 심장 흉막 라인을 카테터에 연결하십시오. 압력 백을 사용하여 500 mL의 del Nido 심흉막을 뿌리에 100-150 mmHg의 압력으로 투여하십시오. 주입이 시작된 후, Metzenbaum 가위를 사용하여 PA-IVC 해부학 수준에서 2cm 절개하여 동종 이식편을 배출하십시오.
- 일단 동종이식편이 정지되면, Metzenbaum 가위를 사용하여 대동맥 대동맥 해부학 및 PA-IVC 아나스토마증의 나머지 부분에서 절제하여 동종 이식편을 explanting하십시오. Satinsky 클램프를 제거하지 마십시오.
- 섹션 5에 설명 된대로 흉부 심장 제거를 진행하십시오.
참고 : 유일한 중요한 차이점은 폐정맥을 조심스럽게 결찰 할 필요가 없으며 대신 카디엔 절제술을 수행 할 때 Metzenbaum 가위를 사용하여 심하게 해부 할 수 있다는 것입니다.
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Representative Results
이 그룹은 연구 설계에 따라 여기에 제시된 프로토콜 이후 5 일에서 35 일 사이에 9 마리의 돼지를 성공적으로 생존했습니다. 이 프로토콜을 시행 한 10 마리의 돼지 중 1 마리 만이 수술 합병증으로 조기에 사망하여 90 %의 생존율을 보였습니다. 도 2 에서 입증된 것은 돼지에서 복강내 위치에 이식된 이종이소 심장의 구성을 나타낸 도면이다. 동종 이식편의 해부학 부위를 결정할 때, 문합에 대한 긴장이나 꼬임을 최소화하는 부위를 선택하십시오. 이것은 해부학이 적절하게 치유되고 동종 이식편이 혈액의 최적 관류 및 배수를 받도록 보장합니다.
정상 발열 생체외 관류 장치 상에 관류되는 심장 동종이식편의 대표적인 이미지가 도 3에 도시되어 있다. 그림 4 는 성공적인 실험 중에 획득한 대표적인 관류 파라미터(순환 유량, 대동맥압, 심박수, 온도, 혼합 정맥 산소 포화도 및 헤마토크릿)를 개략적으로 보여줍니다. 여기에서 입증된 파라미터 값을 달성하지 못하는 것은 이식 후 동종이식편 기능 저하를 야기할 수 있다. 도 5 는 성공적인 이식 후 35일 후에 계내에서 복강 내 이종성 심장의 이미지를 도시한다. 치료 전달을 위해 여기에 제시된 프로토콜을 사용하는 효과의 대표적인 결과는 이전에 이 그룹15에 의해 입증되었다. 심장 동종이식편(n=3)을 루시페라아제에 대한 전이유전자를 운반하는 아데노바이러스 벡터로 처리된 퍼퓨세이트로 관류시켰다. 유전자 발현은 치료 및 이식 5일 후에 동종이식편 내에서 전지구적이고 강력한 것으로 입증되었다. 도 6 은 수용자의 흉부 심장과 비교하여 외식된 심장 동종이식편의 각 영역으로부터의 활성의 평균 배변화로서 측정되고 제시되는 루시퍼라아제 단백질 활성을 나타낸다.
도 1: normothermic ex vivo sanguinous perfusion을 사용하여 전체 심장 동종이식편에 대한 치료 전달을 위한 프로토콜 개략도 . (A) 심장 및 혈액은 공여자 돼지로부터 조달된다. (b) 혈액은 공여체 혈청으로부터 임의의 치료 중화 성분을 제거하기 위해 세포 보호기 장치를 사용하여 세척된다. (C) 심장 동종이식편은 규범발열 생체외 관류 장치 상에 장착되고 2시간 동안 관류된다. (D) 동종이식편이 장착된 직후, 관심있는 치료요법이 퍼퓨세이트에 첨가된다. (e) 할당된 생체외 관류 기간 후에, 동종이식편은 복강내, 헤테로토픽 위치에서 수용자 돼지 내로 이식된다. 이 수치는15에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 복강 내 위치에서의 돼지 이질성 심장 모델. 동종이식편이 복강 내 위치에 이식되는 이질적 토픽 심장 모델의 다이어그램으로, 수용자의 본래의 심장이 자연 위치에 남아 있습니다. 동종 이식편의 폐 동맥은 적외선 신장 열등한 정맥 카바에 해부학 화되는 반면, 동종 이식편의 대동맥은 수용자의 적외선 신장 대동맥으로 해부학 화됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 생체외 관류 장치 상의 심장 동종이식편. 심장 동종이식편은 수용자 내로 이식되기 전에 2 시간 동안 치료학적으로 주입된 퍼퓨세이트로 관류되는 규범발열체, 생체외 관류 장치에 장착된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 대표적인 생체외 관류 파라미터. (A) 폐동맥(청색), 대동맥(녹색) 및 관상동맥(적색)으로부터 측정된 순환 유량. (B) 대표적인 대동맥 압력 측정: 평균 압력 (파란색), 수축기 압력 (빨간색), 이완기 압력 (녹색). (c) 생체외 관류 동안 심장 동종이식편의 심박수. (d) 생체외 관류 동안 심장 동종이식편의 기록된 온도. (e) 관류 기간 동안 퍼퓨세이트로부터 측정된 SvO2의 값을 입증한다. (f) 관류 기간 동안 퍼퓨세이트로부터 측정된 헤마토크릿 값. 약어: hct = 헤마토크릿; SvO2 = 혼합 정맥 산소 포화도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 수용자에 이식된 심장 동종이식편. 수술 후 35일째에 심장 동종이식편을 이식시에 치료적으로 치료하였다. 기증자는 수령인과 완벽한 SLA 매치로 선정되었습니다. 약어: SLA = 돼지 백혈구 항원. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 심장 동종이식편의 형질도입 후의 루시퍼라제 활성. 루시퍼라제 전이유전자를 운반하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 세 개의 심장 동종이식편의 결과가 제시된다. 입증된 것은 심장 동종이식편의 각 영역에서 루시퍼라제 단백질 활성의 평균 배 변화이다. 이 수치는 Bishawi et al.에서 수정되었습니다. 15. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
심장 이식에서 생체외 관류 동안 치료제의 전달은 동종이식편을 수정하고 잠재적으로 이식 결과를 개선시키는 전략을 제공한다. 여기에 제시된 프로토콜은 최첨단 normothermic ex vivo sanguinous perfusion 저장소를 통합하고 동종 이식편11,12,13에 대한 세포, 유전자 또는 면역 요법의 분리 된 전달을 테스트 할 수있는 유망한 잠재력을 제공합니다. 현재까지 심혈관 질환 및 말기 심부전증에 대한 이러한 추정 요법에 대한 심장 전달 기술은 전신 투여, 카테터 삽입을 통한 관상 동맥 내 관류 및 직접 심근 주사에 의존해 왔으며, 이들 모두는 심근 전달 측면에서 좋지 않은 결과를 달성했습니다 5,16. 우리는 이전에 이식 15 전에 바이러스 벡터가 생체외 관류 동안 퍼퓨세이트 내로 투여되었을 때 전체 심장 동종이식편에 대한 리포터 유전자의 강력하고 세계적인 발현을 입증하였다15. 이것은 심장 이식의 맥락에서 특히 중요하며, 여기서 치료의 글로벌 발현 및 효과는 전체 동종이식편의 원하는 "심장 보호"를 달성하기 위해 동종 이식편의 모든 영역에 도달해야합니다. 이 프로토콜은 치료제에 대해 전통적으로 기술된 투여 경로를 사용하여 이전에 달성되지 않은 방식으로 이를 달성한다.
이 프로토콜에는 강조하기 위해 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. (1) 기증자로부터 심장을 조달하는 동안 혈액 손실을 최소화하기 위해 모든 예방 조치를 취해야합니다. 적절한 유속을 달성하기 위해 관류 장치를 위해 기증자로부터 적어도 1L의 혈액을 얻을 필요가 있습니다. (2) normothermic ex vivo sanguinous perfusion을 이용한 치료 전달을 위해, 심장으로의 치료 전달에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 공여체 혈청의 중화 성분을 제거하기 위해 퍼퓨세이트에 첨가하기 전에 기증자 혈액을 세척할 필요가 있다. (3) 치명적인 부정맥을 피하기 위해 심흉막 정지 후까지 기증자의 심장 해부를 최소화하십시오. (4) 관류 장치에 치료법을 도입 할 때, 대동맥 뿌리에 가장 가까운 포트를 통해 도입하고 현탁액의 완전한 전달을 보장하기 위해 항상 포트를 플러시하는 것이 중요합니다. 이는 회로 내의 옥시게네이터 또는 튜빙에 대한 치료학의 임의의 잠재적인 손실을 최소화하고 이식편이 가능한 한 높은 치료 농도를 수용하도록 보장하기 위함이다. (5) 마지막으로, 이식 이식 부위를 선택할 때, 그 위치가 해부학의 긴장 가능성을 최소화하고 혈관 / 해부학의 꼬임이 없도록하는 것이 중요합니다.
또한, 돼지는 돼지 백혈구 항원 (SLA) 유형 (즉, 돼지 주조직 적합성 복합체, MHC)을 미리 선택하여 세포 표면 클래스 I (SLA-1, SLA-2 및 SLA-3) 및 / 또는 클래스 II (DR 및 DQ) 항원을 포함하는 SLA 일배체형에 걸쳐 적절한 정도의 일치 / 불일치를 선택하는 것이 좋습니다 (SLA 타이핑 프라이머 패널에 대한 약간의 수정으로 이전에 설명 된 바와 같이 SH에 의해 수행 된 SLA 타이핑)17, 18. 예를 들어, 모든 SLA 항원에 걸쳐 돼지가 일치하는지 확인하면 동종 이식편 거부의 위험이 최소화되는 반면, 모든 SLA 항원에 걸쳐 불일치가있는 돼지를 사용하면 동종 이식편 거부의 발생률이 극대화됩니다.
이 모델의 한계는 심장 이식편에 대한 면역학적 효과에 대한 연구를 허용하지만, 개입 후 심혈관계를 지원하는 이식편의 능력에 대한 완전한 평가를 허용하지 않는다는 것이다. 이를 달성하기 위해, 이식편은 정형외적으로 이식될 필요가 있을 것이다. 그러나, 대형 동물 모델에서의 동위원소 이식은 더 높은 관련 사망률을 가지며 심폐 우회가 필요하다3. 이 모델의 또 다른 한계는 이식편으로의 효과적인 유전자 전달을 수행하기 위해 생체외 관류 장치에 대한 제한된 접근이다. 이러한 장치가 장기 이식 분야에서 더 많이 이용 가능해짐에 따라 접근성이 향상 될 것으로 예상됩니다. 또한, 비상업적 장치는 실험 목적을 위한 옵션일 수 있다.
심장 이식은 수용자에게 이식하기 전에 생체외 관류를 통해 동종이식편에 치료제를 도입할 수 있는 독특한 환경을 제공합니다. 생체외 관류 장치의 사용은 이식편이 전통적인 냉정전기 저장소(6)를 사용하여 안전한 것보다 훨씬 더 긴 기간 동안 공여자로부터 수용자에게로 수송될 수 있게 한다. 이러한 연장된 관류 기간은 치료제의 효과적인 단리된 전달을 가능하게 한다. 이 모델은 치료제의 전임상 동물 테스트와 변형 임상 요법 사이의 번역 단계 역할을합니다.
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Disclosures
Paul Lezberg는 TransMedics, Inc. Carmelo Milano가 TransMedics, Inc.로부터 이종 심장 이식 수술에 자금을 지원하기 위해 재정적 인 선물을 받았습니다. Michelle Mendiola Pla는 T32HL007101에 의해 지원됩니다. 다른 저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 듀크 대형 동물 외과 코어와 듀크 관류 서비스 (Duke Perfusion Services)가 이러한 과정에서 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 또한 Paul Lezberg와 TransMedics, Inc.의 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Looped Maxon suture | Covidien | GMM-341L | Used to close fascia of the laparotomy incision |
| 0 Silk ties | Medtronic, Inc | S346 | |
| 18 G Angiocath | BD | 381144 | Used to de-air the left ventricle of the donor heart after implantation |
| 20 Fr LV vent | Medtronic, Inc | 12002 | |
| 2-0 Silk sutures | Ethicon, Inc. | SA11G | |
| 2-0 Silk ties | Ethicon, Inc. | SA65H | |
| 2-0 Vicryl suture | Ethicon, Inc. | J259H | |
| 24 Fr venous cannula | Medtronic, Inc | 68124 | |
| 3-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8522 | |
| 4-0 Monocryl suture | Ethicon, Inc. | Y469G | |
| 4-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8521 | |
| Animal hair cutting clipper | Wahl | 8786-452 | |
| Aortic clamp | V. Mueller | CH6201 | |
| Army Navy retractor | V. Mueller | SU3660 | |
| ATF 40, Cell saver disposable set | Fresenius Kabi | 9108494 | Cell saver device insert |
| Balfour retractor | V. Mueller | SU3042 | Used as an abdominal wall retractor |
| C.A.T.S cell saver | Fresenius Kabi | ES0019 | Cell saver device used to wash donor blood |
| Cardiac defibrillator | Zoll | M Series | Cardiac defibrillator |
| Castro needle holder | V. Mueller | CH8589 | |
| CG4 iStat cartridges | Abbott | 03P85-25 | POC testing |
| CG8 iStat cartridges | Abbott | 03P88-25 | POC testing |
| DeBakey forceps | V. Mueller | CH5902 | |
| Electrocautery disposable pencil | Covidien | E2450H | |
| Gerald forceps | V. Mueller | NL1451 | |
| Hemotherm 400CE Dual Reservoir Cooler/Heater | Cincinnati Sub-Zero | 86022 | Heater cooler used to regulate perfusion temperature on the ex vivo perfusion device |
| iSTAT 1 | Abbott | 04P75-03 | POC testing device |
| Kocher clamp | V. Mueller | SU2790 | |
| Large clip applier | Sklar | 50-4300 | |
| Large clips | Teleflex | 4200 | |
| Large soft pledgets | Covidien | 8886867901 | |
| Medium clip applier | Sklar | 50-4335 | |
| Medium clips | Teleflex | 2200 | |
| Metzenbaum scissor | V. Mueller | CH2006-001 | |
| No. 10 scalpel blade | Swann-Mortan | 301 | Used for skin incision |
| No. 11 scalpel blade | Kiato Plus | 18111 | Used for vascular incision |
| OCS device with base | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device | |
| OCS disposable | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device insert with perfusion kits | |
| Pacing cable | Remington Medical | FL-601-97 | |
| Pediatric cardioplegia catheter (4Fr) | Medtronic, Inc | 10218 | Used to deliver cardioplegia to the donor aortic root |
| Pediatric Foley catheter | Teleflex | RSH170003080 | Placed pre-op to decompress the recipient's bladder |
| Potts scissors | V. Mueller | CH13038 | |
| Pressure bag x2 (1,000 mL) | Novaplus | V4010H | Used to deliver cardioplegia at a set pressure |
| Satinsky clamp | V. Mueller | CH7305 | Vascular clamp used for creating anastomoses between donor heart and recipient vessels |
| Scissors | Felco | FELCO 200A-50 | Used to perform sternotomy |
| Small hard pledgets | Covidien | 8886867701 | |
| Sternal retractor | V. Mueller | CH6950-007 | |
| Temporary cardiac pacing wires | Ethicon, Inc. | TPW32 | |
| Temporary dual chamber pacemaker | Medtronic, Inc | 5388 | Cardiac pacing device |
| Tourniquet kit | Medtronic, Inc | 79005 | Rummel tourniquets |
| Umbilical tape | Covidien | 8886861903 | |
| Vessel loops | Covidien | 31145686 |
References
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