Summary
Apresentamos um protocolo para a utilização de um sistema de perfusão normal ex vivo sanguinous para a entrega de terapêutica a um aoentrato cardíaco inteiro em um modelo de transplante de coração heterotópico porcina.
Abstract
Transplante cardíaco é o tratamento padrão ouro para insuficiência cardíaca em estágio final. No entanto, permanece limitado pelo número de corações doadores disponíveis e complicações, como disfunção primária do enxerto e rejeição do enxerto. O recente uso clínico de um dispositivo de perfusão ex vivo em transplante cardíaco introduz uma oportunidade única para o tratamento de a lotoxeris cardíacos com intervenções terapêuticas para melhorar a função e evitar respostas deletérios do receptor. Estabelecer um modelo translacional e animal grande para entrega terapêutica a todo o aoenxerto é essencial para testar novas abordagens terapêuticas no transplante cardíaco. O modelo de transplante de coração suíno e heterotópico na posição intraabdominal serve como um excelente modelo para avaliar os efeitos de novas intervenções e a imunopatologia da rejeição do enxerto. Este modelo também oferece sobrevida a longo prazo para o suíno, uma vez que o enxerto não é necessário para manter a circulação do receptor. O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem reprodutível e robusta para alcançar a entrega ex vivo de um terapêutico a toda a alusão cardíaca antes do transplante e fornecer detalhes técnicos para realizar um transplante heterotópico de sobrevivência do coração ex vivo perfumado.
Introduction
A insuficiência cardíaca é uma condição que afeta cerca de 6 milhões de adultos nos Estados Unidos e deve aumentar para 8 milhões de adultos até o ano de 20301. Transplante cardíaco é o tratamento padrão ouro para insuficiência cardíaca em estágio final. No entanto, não é sem suas limitações e complicações. Permanece limitado pelo número de corações doadores disponíveis, disfunção do enxerto primário, rejeição do coração e os efeitos colaterais da imunossupressão de longo prazo2. Essas limitações são particularmente importantes em jovens receptores que podem sofrer falha de aoenxerto e requerem posterior reco transplante para alcançar a expectativa de vida normal.
Uma intervenção ideal para superar essas limitações trataria a loenxertos cardíacos inteiros com terapêutica antes da implantação no receptor que pode melhorar a viabilidade do aoenxerto e conferir "cardioproteção". Tais intervenções seriam dadas profilaticamente para minimizar a incidência de insultos isquêmicos, rejeição de aloenxerto, vasculopatia de aloenxerto cardíaco e até mesmo reparar aloenxertos marginais. Estudos translacionais para o desenvolvimento desses tipos de intervenções requerem um modelo animal de transplante cardíaco para permitir a vigilância a longo prazo do enxerto cardíaco. O modelo de transplante de coração suíno e heterotópico na posição intraabdominal tem se mostrado ideal para este fim. O transplante de coração nesta posição permite testar os efeitos de novas terapias e avaliar a imunopatologia da rejeição do enxerto. Além disso, o modelo heterotópico é vantajoso sobre o modelo ortotópico devido à melhor sobrevida geral do receptor, sem necessidade de bypass cardiopulmonar e sem necessidade do enxerto para manter a circulação do receptor3.
A efetiva entrega de intervenções terapêuticas ao coração, como gene, celular ou imunoterapia, é uma barreira significativa para a aplicação clínica 4,5. A tecnologia introduzida pelos dispositivos de perfusão ex vivo permite que os enxertos sejam continuamente perfundidos, mantendo-os em um estado não trabalhador, mas metabolicamente ativo 6,7,8,9. Isso oferece uma oportunidade única para tratar um coração inteiro com terapêutica avançada, minimizando os potenciais efeitos colaterais do parto sistêmico 10,11,12,13. Outra vantagem de utilizar dispositivos de perfusão ex vivo para entrega terapêutica é que eles permitem a administração de medicamentos para a circulação coronariana por períodos prolongados que não são viáveis usando métodos tradicionais de armazenamento estático frio. Isso permite uma entrega mais global da terapêutica ao enxerto14. Usando o protocolo aqui apresentado, entregamos com sucesso o gene luciferase de vagalume a um enxerto cardíaco porcino inteiro usando vetores adenovirais15. O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem reprodutível e robusta para a realização da entrega de um terapêutico para toda a alusão cardíaca antes do transplante.
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Protocol
NOTA: São selecionados dois suínos yucatán fêmeas, com um designado para ser o doador de enxerto cardíaco e o outro o receptor. Recomenda-se suínos de 6 a 8 meses, pesando aproximadamente 30 kg e com tipos sanguíneos compatíveis. A visão geral do protocolo é demonstrada na Figura 1. Os procedimentos de moradia e tratamento dos suínos são realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Duke University Medical Center.
1. Preparação do dispositivo de perfusão ex vivo
- Prepare o dispositivo de perfusão ex vivo e um dispositivo de poupança celular para uso de acordo com as diretrizes do fabricante.
- Tenha uma caixa de ritmo e desfibrilador disponíveis e configure-os.
- Tenha um dispositivo de teste ponto de cuidado (POC) disponível para verificar uma contagem completa de sangue (CBC), painel metabólico básico (BMP) e gás arterial (ABG).
- Adicione os seguintes medicamentos à solução de escoramento de perfusão fornecida pelo fabricante, se ainda não estiver presente na solução de perfusão do fabricante: 100 mL de 25% de albumina, 10 mL de 200 mg/100 mL ciprofloxacina, 1 g de sódio cefazolina, dois frascos de 5 mL de injeção multivitamina, 250 mg de metilprednisolona, 10.000 UI de heparina, e 50 UI de insulina.
- Realize testes POC da solução de escoramento de dispositivos ex vivo para garantir que os níveis de eletrólitos estejam dentro da faixa fisiológica normal. Se não, administre gluconato de cálcio, dextrose e/ou bicarbonato de sódio em conformidade para complementar quaisquer níveis de eletrólito ou glicose subterapêutica.
- Para adicionar a solução de escorva com os medicamentos adicionados, espete a solução e desa arejada da linha entregando a solução para o dispositivo de perfusão ex vivo .
NOTA: Pule para a seção 6 para obter instruções sobre como preparar o dispositivo de perfusão ex vivo .
2. Iniciação da anestesia e acesso iv no suíno doador
- Depois de jejuar o porco por 8-12 h, premeditá-lo com cetamina (5-33 mg/kg, intramuscular) e midazolam (0,2-0,5 mg/kg, intramuscular) e administrar isoflurane (1-4%) usando uma máscara facial.
- Coloque o porco em posição supina e entubada com um tubo endotraqueal (ETT) (5,5-6,5 mm de diâmetro interno) para proteger as vias aéreas. Segure o ETT amarrando-o ao focinho do porco. Posicione as extremidades usando laços pesados presos à mesa.
- Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento enquanto estiver sob anestesia.
- Coloque um cateter intravenoso (IV) (20-22 G) em uma veia de ouvido.
- Iniciar os fluidos IV de manutenção (solução lactated ringer a 10 mL·; kg·h)-1).
- Administrar a buprenorfina intramuscular (IM) 0,005-0,01 mg/kg para analgesia.
3. Sinais vitais e configurações da linha central
- Inicie a ventilação mecânica a um volume de maré de 10 mL· (kg·min) -1 e uma taxa de 10-15 respirações por minuto com isoflurano (1-3%) mantidos durante todo o procedimento de tal forma que os reflexos estão ausentes e a frequência cardíaca (>60 bpm, <100 bpm) e pressão arterial (pressão arterial sistólica >90 mmHg, <130 mmHg) permanecem dentro da faixa fisiológica.
NOTA: A adição de um paralítico é opcional. - Monitore continuamente a saturação de oxigênio e as frequências cardíacas durante toda a cirurgia.
4. Sternotomia mediana do porco doador
- Palpate o esterno do manúbrio ao xifoide. Marque a linha média usando um marcador cirúrgico estéril. Raspe qualquer cabelo do local com um cortador de cabelo e esterilize a área usando 4% de clorexidina para um total de 3 rodadas de esterilização. Aplique uma cortina cirúrgica estéril ao redor do local cirúrgico imediato.
NOTA: Os cirurgiões devem lavar as mãos e os braços com uma lavagem à base de álcool ou iodo e vestir vestidos e luvas estéreis. - Use uma lâmina nº 10 para fazer uma incisão do manúbrio até o xifoide, medindo 20-30 cm, dependendo do tamanho do porco.
- Use eletrocauteria para dividir o peitoral maior do esterno para o xiphoide, tomando cuidado para fazer isso ao longo da linha média do esterno. Uma vez até o esterno, marque a linha média e comece a esternotomia a partir do xiphoide dividindo-o com uma tesoura pesada.
- Estenda a cefaleia de esternotomia com uma tesoura pesada. Após cada corte, separe sem rodeios o coração do esterno usando varreduras de dedos. Desta forma, complete a esternotomia através do manúbrio.
- Após completar a esternotomia, realize a hemostasia aplicando eletrocauteria nas bordas ósseas cortadas.
- Coloque um retratedor severo e abra-o para otimizar a exposição do campo cirúrgico. Identifique e remova o timo com eletrocauteria. Digite o pericárdio longitudinalmente do diafragma até a aorta. Crie um berço pericárdial usando tamanho 5-6: 2-0, suturas de seda.
5. Parada cardíaca e cardiectomia do porco doador
- Divida totalmente o tecido entre a aorta e a artéria pulmonar (PA) e visualize a localização do arco aórtico e do tronco braquiocefálico para facilitar a colocação adequada do grampo transversal aórtico.
NOTA: A aorta ascendente é muito mais curta no porco versus humano. - Liberte circunferencialmente a veia cava superior (SVC) usando tesoura e dissecção contundente. Passe dois, tamanho: 0, laços de seda ao redor do SVC.
- Liberte circunferencialmente a veia cava inferior (IVC) usando tesoura e dissecção sem cortes. Da mesma forma, passe duas gravatas de seda 0 ao redor do IVC.
- Aplique um ponto U, tamanho: 4-0, sutura de polipropileno na aorta ascendente.
- Aplique uma bolsa-string, tamanho: 4-0, sutura de polipropileno no átrio direito (RA).
- Administre um bolus de heparina IV usando uma dose inicial de 300 U/kg.
- Insira uma cânula raiz aórtica pediátrica de 4-Fr, fixada pelo ponto U previamente colocado. Deso arejar a cânula e fixá-la no lugar com um torniquete Rummel.
- Conecte a cânula raiz aórtica à tubulação de cardioplegia depois que a tubulação tiver sido lavada com cardioplegia del Nido. Lave com a quantidade necessária para remover quaisquer bolhas de ar dentro da tubulação.
NOTA: A comunicação com a equipe de perfusão é fundamental neste momento para executar corretamente a parada cardíaca.- Certifique-se de que os perfusionistas instalaram os descartáveis do protetor de células de forma estéril, preparou o dispositivo conforme recomendado pelo fabricante (ver seção 6) e estão prontos para processar o sangue coletado.
- Confirme que a cardiotomia do protetor celular (recipiente plástico ligado ao dispositivo de poupança celular onde o sangue é armazenado após a lavagem) está pronta com 10.000 U de heparina e que a cardiotomia está ligada à sucção, não excedendo -150 mmHg de pressão.
NOTA: Isto é para evitar hemólise de glóbulos vermelhos.
- Crie uma atriotomia direita dentro da corda de bolsa previamente colocada, insira uma cânula venosa de 24 Fr no RA e fixe com um torniquete Rummel.
- Conecte a cânula venosa a uma linha de sucção estéril conectada à cardiotomia do protetor celular e colete aproximadamente 1-1,3 L de sangue. Em seguida, aplique o grampo cruzado aórtico, assegurando cuidadosamente que o grampo oclui completamente a aorta ascendente. Administre 500 mL de cardioplegia Del Nido na raiz a uma pressão de 100-150 mmHg usando um saco de pressão.
NOTA: O coração vai branqueá e prenderá. - Coloque lama de gelo estéril no coração.
- Uma vez que a cardioplegia é entregue, remova a cânula raiz aórtica e a cânula venosa RA e amarre as suturas de corda da bolsa para baixo.
- Divida o seguinte: o IVC, o SVC apenas proximal à veia azygos, a aorta ao nível do arco apenas distal à artéria Innominada, o PA principal na bifurcação, e a veia azygous esquerda quando entra no seio coronário.
NOTA: Os porcos têm uma veia azygous esquerda que drena para o seio coronário. - Identifique as veias pulmonares e liga-as com tamanho: 2-0, laços de seda ou clipes de grande porte. Deixe uma veia pulmonar aberta para a inserção da ventilação lv.
- Retire o coração do peito e coloque-o em um recipiente com lama de gelo estéril.
- Mova o coração para o backtable para preparar o enxerto para colocação no dispositivo de perfusão ex vivo .
6. Lavar o sangue do doador e preparar o dispositivo de perfusão ex vivo
NOTA: Esta etapa é necessária para remover quaisquer componentes do soro do doador que possam neutralizar a entrega do terapêutico quando ele for introduzido no perfusado. Realize esta etapa durante a expiração do coração doador para minimizar o tempo isquêmico de aoenxerto.
- Complete um prime de poupança de células e ciclo de lavagem.
- Instale os componentes descartáveis no dispositivo de acordo com as instruções do fabricante.
- Prime o dispositivo de salvamento de células espiando Plasmalyte A e selecionando a função principal no dispositivo. Adicione tanto Plasmalyte A quanto o volume de sangue coletado do porco doador de forma 1:1.
NOTA: Uma vez que o dispositivo complete o ciclo de escoramento, ele está pronto para a adição de sangue. Veja as seções 5.9-5.11 para como adicionar o sangue do porco doador. - Uma vez que o sangue esteja no dispositivo, selecione o ciclo de lavagem no dispositivo de economia de células.
NOTA: Durante este processo, o sangue é centrifuzado enquanto o Plasmalyte A é introduzido para lavar o sangue. Este passo concentra e lava o sangue.
- Transfira o sangue lavado em um saco de coleta de sangue para transferência para o dispositivo ex vivo .
- Adicione o sangue lavado ao dispositivo de perfusão ex vivo de acordo com as diretrizes do fabricante.
- Prepare uma solução de epinefrina injetando 0,25 mg de epinefrina e 30 UI de insulina em 500 mL de 5% de dextrose na água durante a espinheiro da máquina ex vivo . Espetar a solução e desarvar a linha entregando a solução para o dispositivo ex vivo .
- Adicione 10.000 U de heparina ao dispositivo de perfusão ex vivo .
- Adicione 5% de albumina para reconstituir o sangue.
NOTA: O volume de 5% de albumina adicionado ao dispositivo é igual à quantidade de plasma removido pelo dispositivo de economia de células. Isso é feito para ajudar a alcançar uma pressão oncótica fisiológica e hematócrito. - Ligue a bomba para fluir a 1-1,5 L/min para preparar o circuito com o prime claro, drogas e sangue administrado no reservatório. Depois de ligar o fluxo da bomba e circular o prime através do módulo de perfusão, certifique-se de que as linhas do circuito estão livres de ar.
NOTA: O volume final da solução de manutenção é de 1000 mL, além do volume de sangue lavado. - Obtenha uma linha de base perfusada química POC e lactato usando o dispositivo de teste POC. Reponha eletrólitos conforme necessário.
- Adicione dextrose suficiente para manter um nível mínimo de glicose de 100 mg/dL.
- Adicione bicarbonato de sódio suficiente para manter uma meta mínima de pH de 7,4.
NOTA: É importante que o bicarbonato de sódio adicionado não possa ser removido do perfusato. O excesso de sódio contribuirá para que o coração se torne edematoso e deve ser evitado. É preciso ter cuidado ao tratar o déficit base, pois o coração começará a corrigir o déficit base após a reanimação. - Adicione gluconato de cálcio suficiente para manter um nível mínimo de cálcio ionizado de 0,8 mmol/L.
- Afina a temperatura em 37 °C.
- Ajuste a vazão do gás para 150 mL/min e ajuste conforme necessário para alcançar um nível fisiológico de pCO2 .
- Defina a meta média de pressão arterial (MAP) para 60-70 mmHg.
- Abaixe o fluxo da bomba para 0,6 L/min.
7. Preparação instável do coração doador e reanimação do coração
- Oversew o SVC. Coloque quatro penhorados, tamanho: 4-0, suturas de polipropileno em uma forma simples de colchão horizontal ao redor do interior da aorta distal, 5 mm abaixo da borda de corte e amarrá-los para baixo.
- Enquanto segura o 4, tamanho: 4-0, suturas aórticas penhoradas, insira o conector aórtico na aorta e amarre uma fita umbilical ao redor da aorta para fixar o conector.
- Coloque um tamanho: 4-0, bolsa de polipropileno-string em torno da borda de corte distal do PA principal. Insira a cânula pa e amarre as extremidades da corda da bolsa para fixar a cânula.
- Leve o enxerto preparado do backtable para o dispositivo de perfusão ex vivo e conecte o conector aórtico ao dispositivo. Certifique-se de desararar o conector aorta/aórtico antes de fixar o coração no dispositivo.
- Inicie o relógio de perfusão, mantenha o fluxo da bomba em torno de 0,6 L/min e diminua o ponto de temperatura para 34 °C.
- Inicie os gotejamentos de epinefrina e manutenção de acordo com as recomendações do fabricante.
- Conecte a cânula PA ao conector PA no dispositivo e fixe-a com uma gravata.
- Coloque o ventrículo esquerdo (LV) dreno através da veia pulmonar desamanal no átrio esquerdo e através da válvula mitral na LV. Fixar a ventilação no lugar com um único ponto para ancorá-la adequadamente.
- Coloque dois condutores de ritmo cardíaco na parede livre de LV.
- Verifique lactato, ABG, CBC e BMP a cada hora. Administrar potássio, 50% dextrose e cálcio conforme necessário para manter os níveis fisiológicos normais.
NOTA: A amostragem mais frequente de lactato pode ser apropriada durante a estabilização precoce para estabelecer perfusão adequada com base no lactato. - Se for necessário ritmo, defina o ritmo ventricular em 80 batidas por minuto a 10 mA (o ritmo atrial normalmente não é utilizado).
- Se for necessária a desfibrilação, comece em 10 J após a temperatura no dispositivo atingir 34 °C. Não exceda 50 J.
NOTA: O fluxo médio total da meta é de 600 mL/min, e o fluxo coronário médio é de 400 mL/min.
8. Administrar o terapêutico
- Desenhe o terapêutico em uma seringa de forma estéril.
- Desarme a porta cardioplegia usando uma seringa estéril de 3 mL para extrair sangue através da porta. Administre o terapêutico na porta cardioplegia (ou equivalente) de tal forma que o terapêutico seja introduzido diretamente na raiz aórtica.
- Lave a porta com o volume de sangue coletado na etapa 8.2 ao desarmar a porta; tenha cuidado para não lavar nenhum ar com ele.
NOTA: Isto é para garantir que a terapêutica seja administrada na raiz aórtica do coração.
NOTA: Esta seção foi descrita anteriormente em detalhes em Bishawi et al. para introduzir vetores virais para expressão luciferase15. - Perfunda o enxerto no dispositivo por 2 h após a introdução do terapêutico.
9. Preparação do receptor e laparotomia com exposição vascular
- Uma vez que o alusão cardíaca é fixado ao dispositivo e o terapêutico é introduzido no circuito, inicie a indução da anestesia e preparação pré-operatória, conforme descrito na seção 2 para o porco receptor.
- Iniciar a infusão dos medicamentos de imunossupressão: ciclosporina 50 mg/kg total como uma infusão de gotejamento lento durante todo o procedimento e metilprednisolona 1 g iv bolus.
- Aplicar antibióticos: enrofloxacina IM (5 mg/kg) e cefazolina 1 g IV bolus.
- Insira um cateter Foley na bexiga.
NOTA: Descomprimir os auxílios da bexiga com a obtenção de uma exposição ideal da aorta infrarenal e do IVC. - Marque a linha abdominal do meio do abdômen para o púbis usando um marcador cirúrgico estéril. Raspe qualquer cabelo do local com um cortador de cabelo e esterilize a área usando 4% de clorexidina para um total de 3 rodadas de esterilização. Aplique uma cortina cirúrgica estéril ao redor do local cirúrgico imediato.
NOTA: Os cirurgiões devem lavar as mãos e os braços com uma lavagem à base de álcool ou iodo e vestir vestidos e luvas estéreis. - Use uma lâmina de 10 para incisionar a pele (incisão de 20-30 cm) e mude para eletrocauteria para dissecar até a fáscia.
- Use dois grampos Kocher para levantar a fáscia e o peritônio e faça cuidadosamente uma pequena incisão (1 cm) na cavidade peritoneal usando uma tesoura Metzenbaum.
- Estenda a abertura peritoneal para toda a extensão da incisão usando eletrocauteria, colocando um dedo por baixo para proteger as vísceras subjacentes. Coloque um retraínte Balfour para otimizar a exposição. Retraia o intestino delgado cranialmente e com toalhas molhadas.
- Abra o espaço retroperitoneal inferior aos rins com cuidado direcionado para identificar os ureteres e evitar lesões.
- Leve a dissecção até a aorta abdominal e IVC. Ligate os linfáticos com clipes médios e grandes.
- Disseque os vasos circunferencialmente e exponha um segmento grande o suficiente para caber um grande grampo satinsky em torno de cada vaso. Tome cuidado para evitar o rompimento de ramos arteriais lombares, que saem da parte posterior da aorta. Coloque dois loops de vaso ao redor da aorta e IVC nas extremidades proximal e distal da exposição.
10. Prisão final e remoção do coração do dispositivo de perfusão ex vivo
- No final das 2h de perfusão ex vivo , conecte a máquina aquecedora-refrigerador ao dispositivo ex vivo . Coloque a temperatura mais fria do aquecedor a 34 °C.
- De forma estéril e sem ar, conecte a linha de entrega de cardioplegia desordenada ao dispositivo ex vivo na porta de acesso à aoórtica.
- Desligue o ponto de configuração de temperatura do dispositivo ex vivo.
- Reduza a temperatura do aquecedor-refrigerador para 24 °C e diminua o fluxo da bomba para manter o MAP entre 60 e 70 mmHg (tipicamente uma mudança no fluxo da bomba de 1 L/min para 0,9 L/min).
- Uma vez que a leitura de temperatura no dispositivo de perfusão ex vivo atinja 24-26 °C, reduza a temperatura do aquecedor-refrigerador ainda mais para 14 °C e diminua ainda mais o fluxo da bomba em 100 mL/min.
- Uma vez que a temperatura atinja 14-16 °C, retire a cânula pa da porta PA, inicie a entrega de antegrade del Nido (500 mL), feche a válvula da linha AO, pare a bomba e aperte rapidamente a linha de ventilação AO.
NOTA: A pressão de entrega de cardioplegia precisa ser titulada para manter uma pressão média de entrega de 45-65 mmHg, como mostrado no monitor do dispositivo ex vivo . - Remova o coração do dispositivo de perfusão ex vivo desconectando a cânula pa e o conector aórtico e cortando os fios de ritmo.
- Coloque o coração em um balde cheio de lama de gelo estéril.
- Na linha de trás, sobresaque a veia pulmonar/atriotomia esquerda onde a ventilação lv tinha sido inserida. Corte (1 ou 2 mm) do aspecto distal da aorta e pa onde a fixação às cânulas pode ter esmagado o tecido.
NOTA: O coração está pronto para implantação intraabdominal e heterotópica.
11. Implantação heterotópica do enxerto cardíaco
- Antes de colocar os grampos de Satinsky, administre 300 U/kg de heparina intravenosa ao porco receptor.
- Coloque um grampo satinsky no IVC e crie uma venotomia longitudinal medindo ~1,5 cm usando uma lâmina de 11 lâminas e a tesoura de Pott.
- Anastomose o enxerto PA ao IVC infra-renal do receptor de forma de ponta a ponta usando uma corrida, tamanho: 4-0, sutura de polipropileno. Realize a parte interna da anastomose primeiro e reforce conforme necessário com suturas interrompidas antes de completar a parte externa da anastomose.
NOTA: A anastomose PA para IVC é realizada primeiro, e a anastomose aorta-à-aorta é feita por último para reduzir a duração da oclusão aórtica. - Coloque um grampo satinsky na aorta e crie uma aortotomia longitudinal medindo ~1,5 cm usando uma lâmina de 11 e a tesoura de Pott.
NOTA: Obtenha um ABG antes da colocação do grampo. Verifique-o imediatamente após a liberação do grampo e novamente 15-30 minutos depois para avaliar quaisquer alterações na hipercalemia, hiperlacatiemia ou acidemia indicativa de lesão isquêmica no receptor. - Anastomose a aorta do enxerto à aorta infra-renal do receptor de forma de ponta a ponta usando uma corrida, tamanho: 4-0, sutura de polipropileno. Realize a parte interna da anastomose primeiro e reforce conforme necessário com suturas interrompidas antes de completar a parte externa da anastomose.
- Remova os grampos de Satinsky para reperfar o coração; primeiro, remova o grampo IVC seguido do grampo aórtico.
- Coloque um angiocato de 18 G no ápice lv do enxerto para desatar. Quando feito, remova o angiocato e feche o local com uma sutura penhorada.
- Verifique cuidadosamente os anastomoses para qualquer sangramento.
- Coloque cuidadosamente o coração no espaço retroperitoneal direito, de tal forma que não haja tensão nos anastomoses e nenhuma torção dos vasos. Substitua o intestino delgado.
12. Encerramento da laparotomia
- Feche a fáscia com looped, tamanho: 0, sutura Maxon em uma forma de corrida a partir de ambas as extremidades da incisão e amarrando no meio. Tome cuidado para evitar qualquer lesão no intestino.
- Feche a camada dérmica profunda com tamanho: 2-0, Vicryl em uma forma de corrida e a pele com tamanho: 4-0, Monocril em uma forma de corrida.
- Limpe a incisão da pele e aplique cola na pele.
13. Tratamento pós-cirúrgico e eutanásia
- Após a conclusão da cirurgia, desligue o fluxo de isoflurano e monitore o porco para retorno do tom muscular e reflexos neuromusculares (reflexo córnea, retirada a estímulos dolorosos, engolindo).
- Após confirmar a restauração dessas funções, desligue a ventilação mecânica e observe para respirar espontâneo. Se houver respiração espontânea, remova o tubo endotraqueal; se não houver, reconecte o tubo endotraqueal à ventilação mecânica.
- Transfira o porco da mesa de operação para um recinto isolado onde seus sinais vitais (temperatura retatal, pressão arterial, frequência cardíaca) podem ser monitorados de perto. Use uma lâmpada de aquecimento para aquecer o porco conforme necessário. Forneça um bolus de fluido IV de 250 mL da solução de Lactated Ringer no ajuste da hipotensão (pressão arterial sistólica < 100mmHg). Continue monitorando o porco até que ele possa manter a recumbência severa e sinais vitais são totalmente normalizados.
NOTA: O animal não fica sozinho até recuperar a consciência suficiente. Além disso, o animal não é devolvido à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. - Para o tratamento da dor, administre uma dose única de buprenorfina (liberação sustentada) injeção subcutânea 0,12 mg/kg para 72 h de analgesia.
- Ao final do período experimental, eutanize o porco para explantação do coração nativo (torácico) e do coração aoentox (abdominal).
- Prepare o porco conforme descrito nas seções 2 e 3 para o procedimento. Prepare dois sacos de del Nido e duas linhas de cardioplegia para prender cada coração.
- Exponha o coração torácico como descrito na seção 4. Uma vez concluída, prossiga para realizar uma laparotomia como descrito na seção 9.
- Uma vez expostos os anastomoses aórticos e PA-IVC, coloque um grampo de Satinsky na aorta do receptor e outro no IVC receptor para isolar o alusorto da circulação sistêmica.
- Insira uma cânula de raiz aórtica pediátrica 4-Fr na raiz aórtica do aerógrafo e conecte uma linha de cardioplegia ao cateter. Administre 500 mL de cardioplegia del Nido na raiz a uma pressão de 100-150 mmHg usando um saco de pressão. Após o início da infusão, use a tesoura Metzenbaum para fazer uma incisão de 2 cm ao nível da anastomose PA-IVC para desabafar o aloenxerto.
- Uma vez que o aerógrafo é preso, proceda a explantar o alusão usando tesouras Metzenbaum para extirpa ao nível da anastomose aórtica e o restante da anastomose PA-IVC. Não remova nenhum dos grampos de Satinsky.
- Prossiga com a remoção do coração torácico como descrito na seção 5.
NOTA: A única diferença significativa é que as veias pulmonares não precisam ser cuidadosamente ligadas e podem ser grosseiramente dissecadas usando tesouras Metzenbaum ao realizar a cardiectomia.
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Representative Results
Esse grupo sobreviveu com sucesso a 9 suínos entre 5 e 35 dias após o protocolo apresentado aqui, dependendo do desenho do estudo. Dos 10 suínos submetidos a este protocolo, apenas 1 morreu prematuramente por complicações cirúrgicas, gerando uma taxa de sobrevivência de 90%. Demonstrado na Figura 2 é um diagrama da configuração de um coração heterotópico transplantado na posição intraabdominal em um porco. Ao determinar o local para anastomose do alusão, selecione um site que minimize qualquer tensão ou torção na anastomose. Isso garante que as anastomoses se curem adequadamente e que o aenergrafado receba perfusão e drenagem ideal de sangue.
Uma imagem representativa de um artorgrafo cardíaco sendo perfundido em um dispositivo de perfusão ex vivo normoérmico é mostrada na Figura 3. A Figura 4 descreve parâmetros representativos de perfusão adquiridos durante um experimento bem sucedido (taxa de fluxo circulatório, pressão aórtica, frequência cardíaca, temperatura, saturação de oxigênio venoso misto e hematócrito). A incapacidade de alcançar os valores dos parâmetros aqui demonstrados pode levar à função de aléxico comprometido após o transplante. A Figura 5 demonstra uma imagem de um coração heterotópico intraabdominal in situ 35 dias após o sucesso do transplante. Os resultados representativos da eficácia do uso do protocolo aqui apresentado para entrega terapêutica foram previamente demonstrados por este grupo15. Os alusores cardíacos (n = 3) foram perfusados com perfusato tratado com vetor adenoviral que transportava o transgene para luciferase. A expressão genética provou ser global e robusta dentro dos aoenxertos 5 dias após o tratamento e transplante. A Figura 6 mostra um atlas de atividade proteica luciferase medido e apresentado como variação média da atividade de cada região do alusão cardíaca explantada em comparação com o coração torácico dos receptores.
Figura 1: Esquema de protocolo para parto terapêutico a um alóxerto cardíaco inteiro utilizando perfusão normotermia ex vivo sanguinous. (A) O coração e o sangue são adquiridos do porco doador. (B) O sangue é lavado usando um dispositivo de poupança celular para remover quaisquer componentes de neutralização terapêutica do soro doador. (C) O arprodutor cardíaco é montado no dispositivo de perfusão ex vivo normoérmico e perfusado por 2 h. (D) Logo após a montagem do aerógrafo, a terapêutica de interesse é adicionada ao perfusato. (E) Após o período de perfusão ex vivo atribuído, o aoenergrafado é transplantado para o suíno receptor na posição intraabdominal, heterotópica. Este número foi modificado de15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Modelo de coração heterotópico suíno na posição intraabdominal. Diagrama do modelo de coração heterotópico onde o aléxica é transplantado na posição intraabdominal enquanto o coração nativo do receptor permanece em sua localização natural. A artéria pulmonar do aoentrato é anastomosada para a infra-renal inferior vena cava, enquanto a aorta do aoenxerto é anastomosada à aorta infra-renal do receptor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Aoenxerto cardíaco no dispositivo de perfusão ex vivo . O alusão cardíaca montado em um dispositivo de perfusão normoérmico, ex vivo , onde é perfusado com perfusato infundido terapêutico por 2h antes da implantação no receptor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Parâmetros de perfusão ex vivo representativos. (A) Taxas de fluxo circulatório medida a partir da artéria pulmonar (azul), da aorta (verde) e das artérias coronárias (vermelha). (B) Medidas representativas de pressão aórtica: pressão média (azul), pressão sistólica (vermelha), pressão diastólica (verde). (C) Frequência cardíaca de um aoenerxerto cardíaco durante a perfusão ex vivo . (D) Temperatura registrada do alusão cardíaca durante a perfusão ex vivo . (E) demonstra os valores de SvO2 medidos a partir do perfusado durante o período de perfusão. (F) Valores hematócritos medidos a partir do perfusato durante o período de perfusão. Abreviaturas: hct = hematócrito; SvO2 = saturação de oxigênio venoso misto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Aoenxerto cardíaco transplantado no receptor. Alusão cardíaca no pós-operatório 35 tratado com terapêutica no momento da implantação. O doador foi selecionado para ser uma combinação perfeita de SLA com o destinatário. Abreviação: SLA = Antígeno de Leucócito suíno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Atividade da luciferase após a transdução de a loentores cardíacos. Apresentados são os resultados de três alusores cardíacos que foram transduzidos com vetores adenovirais portadores de transgene luciferase. Demonstrado é a variação média da atividade proteica da luciferase em cada área do arxerto cardíaco. Este número foi modificado de Bishawi et al. 15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A entrega de terapêutica durante a ex vivo perfusão em transplante cardíaco oferece uma estratégia para modificar o aoenxerto e potencialmente melhorar os resultados do transplante. O protocolo aqui apresentado incorpora o armazenamento de perfusão normoérmico de última geração e oferece potencial promissor para testar a entrega isolada de células, genes ou imunoterápicos ao alusão 11,12,13. Até o momento, as técnicas de parto cardíaco para essas terapias putativas para doenças cardiovasculares e insuficiência cardíaca em estágio terminal têm se apoiado na administração sistêmica, perfusão intracoronária via cateterismo e injeções intramocárdias diretas, todas as quais alcançaram resultados ruins em termos de parto miocárdio 5,16. Anteriormente, demonstramos uma expressão robusta e global de um gene repórter a a alloenerxertos cardíacos inteiros quando um vetor viral foi administrado no perfusato durante a perfusão ex vivo antes do transplante15. Isso é particularmente importante no contexto do transplante cardíaco, onde a expressão global e o efeito do terapêutico devem atingir todas as áreas do aoenxerto para alcançar a "cardioproteção" desejada de todo o alusão. Este protocolo consegue isso de forma que não tenha sido alcançada anteriormente utilizando rotas tradicionalmente descritas de administração para terapêutica.
Há várias etapas críticas apresentadas neste protocolo para destacar. (1) Todas as precauções devem ser tomadas para minimizar a perda de sangue durante a aquisição do coração do doador. Pelo menos 1 L de sangue precisa ser obtido do doador para o dispositivo de perfusão para atingir taxas de fluxo adequadas. (2) Para a entrega terapêutica utilizando perfusão normotermia ex vivo sanguinous, é necessário lavar o sangue do doador antes de adicioná-lo ao perfusato para remover quaisquer componentes neutralizantes no soro doador que possam afetar negativamente a entrega do terapêutico ao coração. (3) Minimizar a dissecção do coração no doador até depois da parada cardioplégica para evitar arritmias fatais. (4) Ao introduzir o terapêutico ao dispositivo de perfusão, é importante introduzi-lo através da porta mais próxima da raiz aórtica e sempre lavar a porta para garantir a entrega completa da suspensão. Isto é para minimizar qualquer perda potencial do terapêutico para o oxigenador ou tubo dentro do circuito e garantir que o enxerto esteja recebendo o mais alto de uma concentração terapêutica possível. (5) Por fim, ao selecionar o local para implantação do enxerto, é fundamental que o local minimize o potencial de tensão na anastomose e que não haja torção dos vasos/anastomoses sanguíneos.
Recomenda-se também que os suínos sejam suinos leucócitos (SLA) (ou seja, complexo de histocompatibilidade maior porcina, MHC) de antemão para selecionar o grau apropriado de correspondência/incompatibilidade entre os haplotipos SLA que compõem os antígenos de superfície celular I (SLA-1, SLA-2 e SLA-3) e/ou classe II (DR e DQ) com base nas necessidades do pesquisador (SLA-typing realizadas por SH como descrito anteriormente com modificações feitas nos painéis de digitação)17, 18 anos. Por exemplo, garantir que os porcos correspondam em todos os antígenos SLA minimiza o risco de rejeição de aoenergrafos, enquanto o uso de porcos com incompatibilidade em todos os antígenos SLA maximiza a incidência de rejeição de a alloentores.
Uma limitação desse modelo é que, embora permita o estudo dos efeitos imunológicos no enxerto cardíaco, não permite uma avaliação completa da capacidade do enxerto de apoiar o sistema cardiovascular após uma intervenção. Para isso, o enxerto precisaria ser implantado ortotopicamente. No entanto, o transplante ortotópico em modelos de animais grandes tem maior mortalidade associada e requer bypass cardiopulmonar3. Outra limitação deste modelo é o acesso limitado a um dispositivo de perfusão ex vivo para realizar uma entrega genética eficaz ao enxerto. À medida que esses dispositivos se tornam mais disponíveis no campo do transplante de órgãos, espera-se que o acesso melhore. Além disso, um dispositivo não comercial pode ser uma opção para fins experimentais.
O transplante cardíaco oferece um ambiente único onde a terapêutica pode ser introduzida no arproduto via perfusão ex vivo antes da implantação no receptor. O uso de um dispositivo de perfusão ex vivo permite que enxertos estejam em trânsito do doador para o receptor por períodos muito mais longos do que o que é seguro usando o armazenamento estático frio tradicional6. Este período prolongado de perfusão permite uma efetiva entrega isolada de terapêuticas. Este modelo serve como um passo translacional entre testes pré-clínicos em animais de terapêutica e terapias clínicas transformadoras.
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Disclosures
Paul Lezberg é empregado da TransMedics, Inc. Carmelo Milano recebeu um presente financeiro da TransMedics, Inc. para financiar cirurgias heterotópicas de transplante de coração. Michelle Mendiola Pla é apoiada pela T32HL007101. Os outros autores não têm conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Duke Large Animal Surgical Core e ao Duke Perfusion Services por sua assistência durante estes procedimentos. Também gostaríamos de agradecer a Paul Lezberg e à TransMedics, Inc. pelo apoio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Looped Maxon suture | Covidien | GMM-341L | Used to close fascia of the laparotomy incision |
| 0 Silk ties | Medtronic, Inc | S346 | |
| 18 G Angiocath | BD | 381144 | Used to de-air the left ventricle of the donor heart after implantation |
| 20 Fr LV vent | Medtronic, Inc | 12002 | |
| 2-0 Silk sutures | Ethicon, Inc. | SA11G | |
| 2-0 Silk ties | Ethicon, Inc. | SA65H | |
| 2-0 Vicryl suture | Ethicon, Inc. | J259H | |
| 24 Fr venous cannula | Medtronic, Inc | 68124 | |
| 3-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8522 | |
| 4-0 Monocryl suture | Ethicon, Inc. | Y469G | |
| 4-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8521 | |
| Animal hair cutting clipper | Wahl | 8786-452 | |
| Aortic clamp | V. Mueller | CH6201 | |
| Army Navy retractor | V. Mueller | SU3660 | |
| ATF 40, Cell saver disposable set | Fresenius Kabi | 9108494 | Cell saver device insert |
| Balfour retractor | V. Mueller | SU3042 | Used as an abdominal wall retractor |
| C.A.T.S cell saver | Fresenius Kabi | ES0019 | Cell saver device used to wash donor blood |
| Cardiac defibrillator | Zoll | M Series | Cardiac defibrillator |
| Castro needle holder | V. Mueller | CH8589 | |
| CG4 iStat cartridges | Abbott | 03P85-25 | POC testing |
| CG8 iStat cartridges | Abbott | 03P88-25 | POC testing |
| DeBakey forceps | V. Mueller | CH5902 | |
| Electrocautery disposable pencil | Covidien | E2450H | |
| Gerald forceps | V. Mueller | NL1451 | |
| Hemotherm 400CE Dual Reservoir Cooler/Heater | Cincinnati Sub-Zero | 86022 | Heater cooler used to regulate perfusion temperature on the ex vivo perfusion device |
| iSTAT 1 | Abbott | 04P75-03 | POC testing device |
| Kocher clamp | V. Mueller | SU2790 | |
| Large clip applier | Sklar | 50-4300 | |
| Large clips | Teleflex | 4200 | |
| Large soft pledgets | Covidien | 8886867901 | |
| Medium clip applier | Sklar | 50-4335 | |
| Medium clips | Teleflex | 2200 | |
| Metzenbaum scissor | V. Mueller | CH2006-001 | |
| No. 10 scalpel blade | Swann-Mortan | 301 | Used for skin incision |
| No. 11 scalpel blade | Kiato Plus | 18111 | Used for vascular incision |
| OCS device with base | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device | |
| OCS disposable | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device insert with perfusion kits | |
| Pacing cable | Remington Medical | FL-601-97 | |
| Pediatric cardioplegia catheter (4Fr) | Medtronic, Inc | 10218 | Used to deliver cardioplegia to the donor aortic root |
| Pediatric Foley catheter | Teleflex | RSH170003080 | Placed pre-op to decompress the recipient's bladder |
| Potts scissors | V. Mueller | CH13038 | |
| Pressure bag x2 (1,000 mL) | Novaplus | V4010H | Used to deliver cardioplegia at a set pressure |
| Satinsky clamp | V. Mueller | CH7305 | Vascular clamp used for creating anastomoses between donor heart and recipient vessels |
| Scissors | Felco | FELCO 200A-50 | Used to perform sternotomy |
| Small hard pledgets | Covidien | 8886867701 | |
| Sternal retractor | V. Mueller | CH6950-007 | |
| Temporary cardiac pacing wires | Ethicon, Inc. | TPW32 | |
| Temporary dual chamber pacemaker | Medtronic, Inc | 5388 | Cardiac pacing device |
| Tourniquet kit | Medtronic, Inc | 79005 | Rummel tourniquets |
| Umbilical tape | Covidien | 8886861903 | |
| Vessel loops | Covidien | 31145686 |
References
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