Summary
Presentiamo un protocollo per l'utilizzo di un sistema di perfusione sanguigna normotermica ex vivo per la somministrazione di terapie a un intero allotrapianto cardiaco in un modello di trapianto di cuore eterotopico suino.
Abstract
Il trapianto cardiaco è il trattamento gold standard per l'insufficienza cardiaca allo stadio terminale. Tuttavia, rimane limitato dal numero di cuori donatori disponibili e complicazioni come la disfunzione primaria dell'innesto e il rigetto dell'innesto. Il recente uso clinico di un dispositivo di perfusione ex vivo nel trapianto cardiaco introduce un'opportunità unica per il trattamento di alloinnesti cardiaci con interventi terapeutici per migliorare la funzione ed evitare risposte deleterie del ricevente. Stabilire un modello traslazionale di grandi animali per la somministrazione terapeutica all'intero allotrapianto è essenziale per testare nuovi approcci terapeutici nel trapianto cardiaco. Il modello di trapianto di cuore sucino ed eterotopico in posizione intraaddominale funge da modello eccellente per valutare gli effetti di nuovi interventi e l'immunopatologia del rigetto del trapianto. Questo modello offre inoltre una sopravvivenza a lungo termine per il maiale, dato che l'innesto non è necessario per mantenere la circolazione del ricevente. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire un approccio riproducibile e robusto per ottenere la consegna ex vivo di un allotrapianto terapeutico all'intero allotrapianto cardiaco prima del trapianto e fornire dettagli tecnici per eseguire un trapianto eterotopico di sopravvivenza del cuore perfuso ex vivo .
Introduction
L'insufficienza cardiaca è una condizione che colpisce circa 6 milioni di adulti negli Stati Uniti e si prevede che aumenterà a 8 milioni di adulti entro l'anno 20301. Il trapianto cardiaco è il trattamento gold standard per l'insufficienza cardiaca allo stadio terminale. Tuttavia, non è privo di limiti e complicazioni. Rimane limitato dal numero di cuori donatori disponibili, dalla disfunzione primaria dell'innesto, dal rigetto del cuore e dagli effetti collaterali dell'immunosoppressione a lungo termine2. Queste limitazioni sono particolarmente importanti nei giovani riceventi che possono sperimentare il fallimento dell'allotrapianto e richiedono un successivo ripropianto per raggiungere la normale aspettativa di vita.
Un intervento ideale per superare queste limitazioni tratterebbe interi alloinnesti cardiaci con terapie prima dell'impianto nel ricevente che possono migliorare la vitalità dell'alloinnesto e conferire "cardioprotezione". Tali interventi sarebbero somministrati in modo profilattico per ridurre al minimo l'incidenza di insulti ischemici, rigetto dell'allotrapianto, vasculopatia dell'allotrapianto cardiaco e persino riparare alloinnesti marginali. Gli studi traslazionali per lo sviluppo di questi tipi di interventi richiedono un modello animale di trapianto cardiaco di grandi dimensioni per consentire la sorveglianza a lungo termine dell'innesto cardiaco. Il modello di trapianto di cuore sucino ed eterotopico in posizione intraaddominale si è dimostrato ideale per questo scopo. Il trapianto di cuore in questa posizione consente di testare gli effetti di nuove terapie e valutare l'immunopatologia del rigetto del trapianto. Inoltre, il modello eterotopico è vantaggioso rispetto al modello ortotopico a causa della migliore sopravvivenza globale del ricevente, nessun requisito per il bypass cardiopolmonare e nessun requisito dell'innesto per mantenere la circolazione del ricevente3.
L'erogazione efficace di interventi terapeutici al cuore, come la terapia genica, cellulare o immuno-terapeutica, è una barriera significativa all'applicazione clinica 4,5. La tecnologia introdotta dai dispositivi di perfusione ex vivo consente di perfusare continuamente gli innesti, mantenendoli in uno stato non funzionante ma metabolicamente attivo 6,7,8,9. Ciò offre un'opportunità unica per trattare un intero cuore con terapie avanzate riducendo al minimo i potenziali effetti collaterali del parto sistemico 10,11,12,13. Un altro vantaggio dell'utilizzo di dispositivi di perfusione ex vivo per la somministrazione terapeutica è che consentono la somministrazione di farmaci alla circolazione coronarica per periodi prolungati che non sono fattibili utilizzando i tradizionali metodi di conservazione statica a freddo. Ciò consente una consegna più globale delle terapie all'innesto14. Utilizzando il protocollo qui presentato, abbiamo consegnato con successo il gene della lucciola luciferasi a un intero innesto cardiaco suino utilizzando vettori adenovirali15. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire un approccio riproducibile e robusto per ottenere la consegna di un impianto terapeutico all'intero allotrapianto cardiaco prima del trapianto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Vengono selezionate due femmine di suini dello Yucatan, con uno designato come donatore di innesto cardiaco e l'altro come ricevente. Si raccomandano suini di età compresa tra 6 e 8 mesi, di peso di circa 30 kg e con gruppi sanguigni compatibili. La panoramica del protocollo è illustrata nella Figura 1. L'alloggiamento e le procedure di trattamento per i suini vengono eseguiti in conformità con le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali del Duke University Medical Center.
1. Preparazione del dispositivo di perfusione ex vivo
- Preparare il dispositivo di perfusione ex vivo e un dispositivo di risparmio cellulare per l'uso secondo le linee guida del produttore.
- Avere a disposizione una scatola di stimolazione e un defibrillatore e configurarli.
- Avere a disposizione un dispositivo di test point-of-care (POC) per controllare un esame emocromocitometrico completo (CBC), un pannello metabolico di base (BMP) e un gas ematico arterioso (ABG).
- Aggiungere i seguenti farmaci alla soluzione di adescamento perfusione fornita dal produttore, se non già presente nella soluzione di perfusione del produttore: 100 mL di albumina al 25%, 10 mL di 200 mg / 100 mL di ciprofloxacina, 1 g di cefazolina sodica, due flaconcini da 5 ml di iniezione multivitaminica, 250 mg di metilprednisolone, 10.000 UI di eparina e 50 UI di insulina.
- Eseguire test POC della soluzione di adescamento del dispositivo ex vivo per garantire che i livelli di elettroliti rientrino nel normale intervallo fisiologico. In caso contrario, somministrare gluconato di calcio, destrosio e/ o bicarbonato di sodio di conseguenza per integrare qualsiasi elettrolita subterapeutico o livelli di glucosio.
- Per aggiungere la soluzione di adescamento con i farmaci aggiunti, picchiare la soluzione e de-aerare la linea che fornisce la soluzione al dispositivo di perfusione ex vivo .
NOTA: andare al paragrafo 6 per le istruzioni sull'adescamento del dispositivo di perfusione ex vivo .
2. Inizio dell'anestesia e dell'accesso iv nel suino donatore
- Dopo aver digiunato il maiale per 8-12 ore, premedicarlo con ketamina (5-33 mg / kg, intramuscolare) e midazolam (0,2-0,5 mg / kg, intramuscolare) e somministrare isoflurano (1-4%) usando una maschera facciale.
- Posizionare il maiale in posizione supina e intubare con un tubo endotracheale (ETT) (diametro interno 5,5-6,5 mm) per proteggere le vie aeree. Fissare l'ETT legandolo al muso del maiale. Posizionare le estremità utilizzando legami pesanti attaccati al tavolo.
- Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Posizionare un catetere endovenoso (IV) (20-22 G) in una vena dell'orecchio.
- Iniziare il mantenimento dei fluidi IV (Soluzione di Ringer lattato a 10 ml·( kg·h)-1).
- Somministrare Buprenorfina intramuscolare (IM) 0,005-0,01 mg/kg per l'analgesia.
3. Segni vitali e impostazioni della linea centrale
- Avviare la ventilazione meccanica a un volume di marea di 10 ml· (kg·min) -1 e una frequenza di 10-15 respiri al minuto con isoflurano (1-3%) mantenuta durante tutta la procedura in modo tale che i riflessi siano assenti e la frequenza cardiaca (>60 bpm, <100 bpm) e la pressione sanguigna (pressione arteriosa sistolica >90 mmHg, <130 mmHg) rimangano all'interno dell'intervallo fisiologico.
NOTA: l'aggiunta di un paralitico è facoltativa. - Monitorare continuamente la saturazione di ossigeno e la frequenza cardiaca durante l'intervento chirurgico.
4. Sternotomia mediana del suino donatore
- Palpare lo sterno dal manubrio allo xifoide. Segna la linea mediana usando un marcatore chirurgico sterile. Rasare tutti i capelli dal sito con un tagliacapelli e sterilizzare l'area utilizzando il 4% di clorexidina per un totale di 3 cicli di sterilizzazione. Applicare un telo chirurgico sterile attorno al sito chirurgico immediato.
NOTA: i chirurghi devono lavarsi le mani e le braccia con un lavaggio a base di alcol o iodio e indossare camici e guanti sterili. - Utilizzare una lama n. 10 per praticare un'incisione dal manubrio fino allo xifoide, che misura 20-30 cm, a seconda delle dimensioni del maiale.
- Usa l'elettrocauterizzazione per dividere il pettorale maggiore dallo sterno allo xifoide, facendo attenzione a farlo lungo la linea mediana dello sterno. Una volta scesi allo sterno, segna la linea mediana e inizia la sternotomia dallo xifoide dividendolo con forbici pesanti.
- Estendere la sternotomia cefalade con forbici pesanti. Dopo ogni taglio, separare senza mezzi termini il cuore dallo sterno usando le spazzate delle dita. In questo modo, completare la sternotomia attraverso il manubrio.
- Dopo aver completato la sternotomia, ottenere l'emostasi applicando l'elettrocauterizzazione ai bordi ossei tagliati.
- Posizionare un riavvolgitore sternale e aprirlo per ottimizzare l'esposizione del campo chirurgico. Identificare e rimuovere il timo con l'elettrocauterizzazione. Immettere il pericardio longitudinalmente dal diaframma all'aorta. Creare una culla pericardica utilizzando 5-6 dimensioni: 2-0, suture di seta.
5. Arresto cardiaco e cardiectomia del maiale donatore
- Dividere completamente il tessuto tra l'aorta e l'arteria polmonare (PA) e visualizzare la posizione dell'arco aortico e del tronco brachiocefalico per facilitare il corretto posizionamento del cross-clamp aortico.
NOTA: L'aorta ascendente è molto più corta nel maiale rispetto all'uomo. - Liberare circonferenzialmente la vena cava superiore (SVC) usando forbici e dissezione smussata. Passa due, taglia: 0, cravatte di seta attorno all'SVC.
- Liberare circonferenzialmente la vena cava inferiore (IVC) usando forbici e dissezione smussata. Allo stesso modo, passa due cravatte di seta 0 intorno all'IVC.
- Applicare un punto a U, dimensione: 4-0, sutura in polipropilene all'aorta ascendente.
- Applicare un cordoncino, dimensioni: 4-0, sutura in polipropilene all'atrio destro (RA).
- Somministrare un bolo di eparina IV utilizzando una dose iniziale di 300 U/kg.
- Inserire una cannula pediatrica della radice aortica 4-Fr, fissata dal punto U precedentemente posizionato. De-air la cannula e fissarla in posizione con un laccio emostatico Rummel.
- Collegare la cannula della radice aortica al tubo cardioplegico dopo che il tubo è stato lavato con cardioplegia del Nido. Lavare con la quantità necessaria per rimuovere eventuali bolle d'aria all'interno del tubo.
NOTA: La comunicazione con il team di perfusione è fondamentale a questo punto per eseguire correttamente l'arresto cardiaco.- Assicurarsi che i perfusionisti abbiano installato i dispositivi monouso del salvacelle in modo sterile, innescato il dispositivo come raccomandato dal produttore (vedere paragrafo 6) e siano pronti a elaborare il sangue raccolto.
- Confermare che la cardiotomia del risparmiatore cellulare (contenitore di plastica attaccato al dispositivo di risparmio cellulare in cui il sangue viene conservato dopo il lavaggio) sia pronta con 10.000 U di eparina e che la cardiotomia sia collegata all'aspirazione, per non superare -150 mmHg di pressione.
NOTA: Questo per evitare l'emolisi dei globuli rossi.
- Creare un'atriotomia destra all'interno del cordoncino della borsa precedentemente posizionato, inserire una cannula venosa da 24 Fr nell'AR e fissare con un laccio emostatico rummel.
- Collegare la cannula venosa a una linea di aspirazione sterile collegata alla cardiotomia del risparmiatore cellulare e raccogliere circa 1-1,3 L di sangue. Quindi, applicare il morsetto trasversale aortico, assicurandosi attentamente che il morsetto occluda completamente l'aorta ascendente. Somministrare 500 ml di cardioplegia Del Nido nella radice ad una pressione di 100-150 mmHg utilizzando un sacchetto a pressione.
NOTA: Il cuore si sbollenterà e arresterà. - Metti la granita di ghiaccio sterile sul cuore.
- Una volta che la cardioplegia viene erogata, rimuovere la cannula della radice aortica e la cannula venosa RA e legare le suture a cordone di borsa verso il basso.
- Dividi quanto segue: l'IVC, l'SVC appena prossimale alla vena azygos, l'aorta a livello dell'arco appena distale all'arteria innominata, il PA principale alla biforcazione e la vena azigote sinistra mentre entra nel seno coronarico.
NOTA: I maiali hanno una vena azigote sinistra che drena nel seno coronarico. - Identificare le vene polmonari e legarle con dimensioni: 2-0, cravatte di seta o clip di grandi dimensioni. Lasciare aperta una vena polmonare per l'inserimento dello sfiato LV.
- Rimuovere il cuore dal petto e metterlo in un contenitore con granita di ghiaccio sterile.
- Spostare il cuore sul retro per preparare l'innesto per il posizionamento sul dispositivo di perfusione ex vivo .
6. Lavaggio del sangue del donatore e innesco del dispositivo di perfusione ex vivo
NOTA: Questo passaggio è necessario per rimuovere tutti i componenti dal siero del donatore che potrebbero neutralizzare la consegna del terapeutico quando viene introdotto nel perfusato. Eseguire questo passaggio durante l'espianto del cuore donatore per ridurre al minimo il tempo ischemico dell'allotrapianto.
- Completare un ciclo di risparmio cellulare e di lavaggio.
- Installare i componenti monouso nel dispositivo secondo le istruzioni del produttore.
- Innescare il dispositivo di risparmio cellulare facendo picchiare il plasmalita A e selezionando la funzione principale sul dispositivo. Aggiungere tanto plasmalita A quanto il volume di sangue raccolto dal maiale donatore in modo 1:1.
NOTA: Una volta che il dispositivo completa il ciclo di innesco, è pronto per l'aggiunta di sangue. Vedere paragrafi 5.9-5.11 per informazioni su come aggiungere il sangue del maiale donatore. - Una volta che il sangue è nel dispositivo, selezionare il ciclo di lavaggio sul dispositivo di risparmio cellulare.
NOTA: Durante questo processo, il sangue viene centrifugato mentre il plasmalita A viene introdotto per lavare il sangue. Questo passaggio concentra e lava il sangue.
- Trasferire il sangue lavato in una sacca per la raccolta del sangue per il trasferimento al dispositivo ex vivo .
- Aggiungere il sangue lavato al dispositivo di perfusione ex vivo secondo le linee guida del produttore.
- Preparare una soluzione di epinefrina iniettando 0,25 mg di epinefrina e 30 UI di insulina in 500 ml di destrosio al 5% in acqua durante l'adescamento della macchina ex vivo . Spike la soluzione e de-air la linea che fornisce la soluzione al dispositivo ex vivo .
- Aggiungere 10.000 U di eparina al dispositivo di perfusione ex vivo .
- Aggiungere il 5% di albumina per ricostituire il sangue.
NOTA: il volume del 5% di albumina aggiunto al dispositivo è uguale alla quantità di plasma rimosso dal dispositivo di risparmio cellulare. Questo viene fatto per aiutare a raggiungere una pressione oncotica fisiologica e un ematocrito. - Accendere la pompa per fluire a 1-1,5 L / min per innescare il circuito con il primo chiaro, i farmaci e il sangue somministrati nel serbatoio. Dopo aver acceso il flusso della pompa e fatto circolare il primo attraverso il modulo di perfusione, assicurarsi che le linee del circuito siano prive di aria.
NOTA: il volume della soluzione di manutenzione finale è di 1000 ml in aggiunta al volume di sangue lavato. - Ottenere una linea di base perfusare la chimica POC e il lattato utilizzando il dispositivo di test POC. Ricostituire gli elettroliti secondo necessità.
- Aggiungere abbastanza destrosio per mantenere un livello minimo di glucosio di 100 mg / dL.
- Aggiungere abbastanza bicarbonato di sodio per mantenere un obiettivo di pH minimo di 7,4.
NOTA: È importante sottolineare che il bicarbonato di sodio aggiunto non può essere rimosso dal perfusato. I livelli di sodio in eccesso contribuiranno a rendere il cuore edematoso e devono essere evitati. È necessario prestare attenzione quando si tratta il deficit di base, poiché il cuore inizierà a correggere il deficit di base dopo la rianimazione. - Aggiungere abbastanza gluconato di calcio per mantenere un livello minimo di calcio ionizzato di 0,8 mmol / L.
- Impostare la temperatura a 37 °C.
- Impostare la portata del gas a 150 ml/min e regolare secondo necessità per raggiungere un livello fisiologico di pCO2 .
- Impostare il target di pressione arteriosa media (MAP) su 60-70 mmHg.
- Abbassare il flusso della pompa a 0,6 L/min.
7. Preparazione backtable del cuore donatore e rianimazione del cuore
- Oversew l'SVC. Posizionare quattro suture in polipropilene in pegno, dimensioni: 4-0, suture in polipropilene in un semplice materasso orizzontale intorno all'interno dell'aorta distale, 5 mm sotto il bordo tagliato e legarle.
- Mentre si tiene in mano il 4, dimensione: 4-0, suture aortiche impegnate, inserire il connettore aortico nell'aorta e legare un nastro ombelicale attorno all'aorta per fissare il connettore.
- Posizionare una dimensione: 4-0, cordoncino in polipropilene attorno al bordo di taglio distale del PA principale. Inserire la cannula PA e legare le estremità del cordoncino per fissare la cannula.
- Prelevare l'innesto preparato dal backtable al dispositivo di perfusione ex vivo e collegare il connettore aortico al dispositivo. Assicurarsi di rimuovere l'aorta/connettore aortico prima di fissare il cuore al dispositivo.
- Avviare l'orologio di perfusione, mantenere il flusso della pompa intorno a 0,6 L/min e ridurre il set point di temperatura a 34 °C.
- Avviare l'epinefrina e le gocce di manutenzione secondo le raccomandazioni del produttore.
- Collegare la cannula PA al connettore PA sul dispositivo e fissarla con una cravatta.
- Posizionare il drenaggio dello sfiato del ventricolo sinistro (LV) attraverso la vena polmonare slegata nell'atrio sinistro e attraverso la valvola mitrale nel LV. Fissare lo sfiato in posizione con un singolo punto per ancorarlo correttamente.
- Posizionare due cavi di stimolazione cardiaca sulla parete libera da BT.
- Controllare lattato, ABG, CBC e BMP ogni ora. Somministrare potassio, destrosio al 50% e calcio secondo necessità per mantenere normali livelli fisiologici.
NOTA: Un campionamento più frequente del lattato può essere appropriato durante la stabilizzazione precoce per stabilire un'adeguata perfusione a base di lattato. - Se è necessaria la stimolazione, impostare il ritmo ventricolare a 80 battiti al minuto a 10 mA (la stimolazione atriale in genere non viene utilizzata).
- Se è necessaria la defibrillazione, iniziare a 10 J dopo che la temperatura sul dispositivo ha raggiunto i 34 °C. Non superare i 50 J.
NOTA: il flusso medio totale obiettivo è di 600 ml / min e il flusso coronarico medio è di 400 ml / min.
8. Somministrazione del terapeutico
- Aspirare la terapia in una siringa in modo sterile.
- De-air la porta cardioplegia utilizzando una siringa sterile da 3 ml per prelevare il sangue attraverso la porta. Somministrare il terapeutico nella porta cardioplegia (o equivalente) in modo tale che il terapeutico venga introdotto direttamente nella radice aortica.
- Lavare la porta con il volume di sangue raccolto prelevato al punto 8.2 durante la de-airing della porta; fare attenzione a non sciacquare aria con esso.
NOTA: Questo per garantire che la terapia venga somministrata nella radice aortica del cuore.
NOTA: Questa sezione è stata precedentemente descritta in dettaglio in Bishawi et al. introdurre vettori virali per l'espressione della luciferasi15. - Perfondere l'innesto sul dispositivo per 2 ore dopo l'introduzione della terapia.
9. Preparazione del ricevente e laparotomia con esposizione vascolare
- Una volta che l'allotrapianto cardiaco è fissato al dispositivo e la terapia è stata introdotta nel circuito, iniziare l'induzione dell'anestesia e la preparazione preoperatoria come descritto nel paragrafo 2 per il maiale ricevente.
- Iniziare l'infusione dei farmaci immunosoppressivi: ciclosporina 50 mg / kg totale come infusione a goccia lenta durante la procedura e metilprednisolone 1 g IV bolo.
- Somministrare antibiotici: enrofloxacina IM (5 mg/kg) e cefazolina 1 g iv bolo.
- Inserire un catetere Foley nella vescica.
NOTA: La decompressione della vescica aiuta ad ottenere un'esposizione ottimale dell'aorta infrarenale e dell'IVC. - Segna la linea mediana addominale dal medio addome al pube usando un marcatore chirurgico sterile. Rasare tutti i capelli dal sito con un tagliacapelli e sterilizzare l'area utilizzando il 4% di clorexidina per un totale di 3 cicli di sterilizzazione. Applicare un telo chirurgico sterile attorno al sito chirurgico immediato.
NOTA: i chirurghi devono lavarsi le mani e le braccia con un lavaggio a base di alcol o iodio e indossare camici e guanti sterili. - Utilizzare una lama da 10 per incidere la pelle (incisione di 20-30 cm) e passare all'elettrocauterizzazione per sezionare fino alla fascia.
- Utilizzare due morsetti Kocher per sollevare la fascia e il peritoneo e fare con cura una piccola incisione (1 cm) nella cavità peritoneale usando le forbici Metzenbaum.
- Estendere l'apertura peritoneale per tutta la lunghezza dell'incisione utilizzando l'elettrocauterizzazione, posizionando un dito sotto per proteggere i visceri sottostanti. Posizionare un riavvolgitore Balfour per ottimizzare l'esposizione. Ritrarre l'intestino tenue cranicamente e con asciugamani bagnati.
- Aprire lo spazio retroperitoneale inferiore ai reni con cura diretta verso l'identificazione degli ureteri ed evitare lesioni.
- Portare la dissezione fino all'aorta addominale e all'IVC. Ligate i linfatici con clip medie e grandi.
- Seziona i vasi circonferenzialmente ed esponi un segmento abbastanza grande da adattare un grande morsetto Satinsky attorno a ciascuna nave. Fare attenzione ad evitare l'interruzione dei rami arteriosi lombari, che si staccano dalla parte posteriore dell'aorta. Posizionare due anelli del vaso attorno all'aorta e all'IVC alle estremità prossimali e distali dell'esposizione.
10. Arresto finale e rimozione del cuore dal dispositivo di perfusione ex vivo
- Al termine delle 2 ore di perfusione ex vivo , collegare la macchina riscaldante-raffreddatrice al dispositivo ex vivo . Impostare la temperatura del dispositivo di raffreddamento del riscaldatore a 34 °C.
- In modo sterile e privo di aria, collegare la linea di erogazione cardioplegia de-aired al dispositivo ex vivo presso la porta di accesso aortica.
- Spegnere il set point di temperatura sul dispositivo ex vivo.
- Ridurre la temperatura del riscaldatore-raffreddatore a 24 °C e diminuire il flusso della pompa per mantenere map tra 60 e 70 mmHg (in genere una variazione del flusso della pompa da 1 L / min a 0,9 L / min).
- Una volta che la lettura della temperatura sul dispositivo di perfusione ex vivo raggiunge i 24-26 °C, ridurre ulteriormente la temperatura del riscaldatore-raffreddatore a 14 °C e diminuire ulteriormente la portata della pompa di 100 ml/min.
- Una volta che la temperatura raggiunge i 14-16 °C, staccare la cannula PA dalla porta PA, avviare l'erogazione dell'anterogrado del Nido (500 ml), chiudere la valvola della linea AO, arrestare la pompa e bloccare rapidamente la linea di sfiato AO.
NOTA: la pressione di mandata cardioplegia deve essere titolata per mantenere una pressione media di mandata di 45-65 mmHg come visualizzato sul monitor del dispositivo ex vivo . - Rimuovere il cuore dal dispositivo di perfusione ex vivo scollegando la cannula PA e il connettore aortico e tagliando i fili di stimolazione.
- Metti il cuore in un secchio pieno di granita di ghiaccio sterile.
- Sul retro, sovrascrivere la vena polmonare / atriotomia sinistra in cui era stata inserita la presa d'aria LV. Tagliare (1 o 2 mm) l'aspetto distale dell'aorta e PA in cui l'attaccamento alle cannule può aver schiacciato il tessuto.
NOTA: Il cuore è ora pronto per l'impianto eterotopico intraaddominale.
11. Impianto eterotopico dell'innesto cardiaco
- Prima di posizionare i morsetti Satinsky, somministrare 300 U/kg di eparina per via endovenosa al maiale ricevente.
- Posizionare un morsetto Satinsky sull'IVC e creare una venotomia longitudinale di ~ 1,5 cm utilizzando una lama a 11 e le forbici di Pott.
- Anastomosi l'innesto PA all'IVC infra-renale del ricevente in modo end-to-side utilizzando una corsa, dimensione: 4-0, sutura in polipropilene. Eseguire prima la parte interna dell'anastomosi e rinforzare se necessario con suture interrotte prima di completare la parte esterna dell'anastomosi.
NOTA: L'anastomosi da PA a IVC viene eseguita per prima e l'anastomosi da aorta a aorta viene eseguita per ultima per ridurre la durata dell'occlusione aortica. - Posiziona un morsetto Satinsky sull'aorta e crea un'aortotomia longitudinale di ~ 1,5 cm usando una lama a 11 e le forbici di Pott.
NOTA: ottenere un ABG prima del posizionamento del morsetto. Ricontrollarlo immediatamente dopo il rilascio del morsetto e di nuovo 15-30 minuti dopo per valutare eventuali cambiamenti nell'iperkaliemia, nell'iperlattatemia o nell'acidemia indicativi di danno ischemico nel ricevente. - Anastomosi l'aorta dell'innesto all'aorta infra-renale del ricevente in modo end-to-side utilizzando una corsa, dimensione: 4-0, sutura in polipropilene. Eseguire prima la parte interna dell'anastomosi e rinforzare se necessario con suture interrotte prima di completare la parte esterna dell'anastomosi.
- Rimuovere i morsetti Satinsky per riperfondere il cuore; in primo luogo, rimuovere il morsetto IVC seguito dal morsetto aortico.
- Posizionare un angiocato da 18 G nell'apice LV dell'innesto per de-air. Al termine, rimuovere l'angiocate e chiudere il sito con una sutura impegnata.
- Controllare attentamente le anastomosi per eventuali emorragie.
- Posiziona con attenzione il cuore nel giusto spazio retroperitoneale, in modo tale che non ci sia tensione sulle anastomosi e nessun attorcigliamento dei vasi. Sostituire l'intestino tenue.
12. Chiusura della laparotomia
- Chiudere la fascia con looped, dimensione: 0, sutura Maxon in modo lineare partendo da entrambe le estremità dell'incisione e legando nel mezzo. Fare attenzione ad evitare qualsiasi lesione all'intestino.
- Chiudere lo strato dermico profondo con dimensioni: 2-0, Vicryl in modo da correre e la pelle con dimensioni: 4-0, Monocryl in modo da correre.
- Pulire l'incisione cutanea e applicare la colla cutanea.
13. Trattamento postchirurgico ed eutanasia
- Dopo il completamento dell'intervento chirurgico, spegnere il flusso di isoflurano e monitorare il maiale per il ritorno del tono muscolare e dei riflessi neuromuscolari (riflesso corneale, ritiro a stimoli dolorosi, deglutizione).
- Dopo aver confermato il ripristino di queste funzioni, disattivare la ventilazione meccanica e osservare per la respirazione spontanea. Se c'è respirazione spontanea, rimuovere il tubo endotracheale; in caso contrario, ricollegare il tubo endotracheale alla ventilazione meccanica.
- Trasferire il maiale dal tavolo operatorio in un recinto isolato dove i suoi segni vitali (temperatura rettale, pressione sanguigna, frequenza cardiaca) possono essere attentamente monitorati. Utilizzare una lampada riscaldante per riscaldare il maiale secondo necessità. Fornire un bolo fluido IV di 250 ml di soluzione di Ringer lattato nel contesto dell'ipotensione (pressione arteriosa sistolica < 100mmHg). Continuare a monitorare il maiale fino a quando non è in grado di mantenere la reclinazione sternale e i segni vitali sono completamente normalizzati.
NOTA: L'animale non viene lasciato incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza. Inoltre, l'animale non viene restituito alla compagnia di altri animali fino a quando non viene completamente recuperato. - Per la gestione del dolore, somministrare una dose una tantum di buprenorfina (rilascio prolungato) iniezione sottocutanea 0,12 mg/kg per 72 ore di analgesia.
- Alla fine del periodo sperimentale, eutanasizzare il maiale per l'espianto del cuore nativo (toracico) e del cuore allotrapianto (addominale).
- Preparare il suino come descritto nelle sezioni 2 e 3 per la procedura. Preparare due sacchetti di del Nido e due linee di cardioplegia per arrestare ogni cuore.
- Esporre il cuore toracico come descritto nel paragrafo 4. Una volta completato, procedere all'esecuzione di una laparotomia come descritto nel paragrafo 9.
- Una volta esposte le anasto-aortiche e PA-IVC, posizionare un morsetto Satinsky sull'aorta ricevente e un altro sull'IVC ricevente per isolare l'allotrapianto dalla circolazione sistemica.
- Inserire una cannula pediatrica della radice aortica 4-Fr nella radice aortica dell'allotrapianto e collegare una linea di cardioplegia al catetere. Somministrare 500 ml di cardioplegia del Nido nella radice ad una pressione di 100-150 mmHg utilizzando un sacchetto a pressione. Dopo l'inizio dell'infusione, utilizzare le forbici Metzenbaum per praticare un'incisione di 2 cm a livello dell'anastomosi PA-IVC per sfogare l'allotrapianto.
- Una volta arrestato l'alloinnesto, procedere all'espianto dell'alloinnesto utilizzando le forbici Metzenbaum per l'accisa a livello dell'anastomosi aorto-aortica e il resto dell'anastomosi PA-IVC. Non rimuovere nessuno dei morsetti Satinsky.
- Procedere con la rimozione del cuore toracico come descritto nel paragrafo 5.
NOTA: L'unica differenza significativa è che le vene polmonari non hanno bisogno di essere accuratamente legate e possono invece essere grossolanamente sezionate usando le forbici di Metzenbaum durante l'esecuzione della cardiectomia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Questo gruppo è sopravvissuto con successo a 9 maiali tra 5 e 35 giorni dopo il protocollo presentato qui, a seconda del disegno dello studio. Su 10 suini che hanno subito questo protocollo, solo 1 è morto prematuramente per complicazioni chirurgiche, producendo un tasso di sopravvivenza del 90%. Dimostrato nella Figura 2 è un diagramma della configurazione di un cuore eterotopico trapiantato in posizione intraaddominale in un maiale. Quando si determina il sito per l'anastomosi dell'alloinnesto, selezionare un sito che riduca al minimo qualsiasi tensione o attorcigliamento sull'anastomosi. Ciò garantisce che le anastomosi guariscano correttamente e che l'allotrapianto riceva una perfusione e un drenaggio ottimali del sangue.
Un'immagine rappresentativa di un alloinnesto cardiaco perfuso su un dispositivo di perfusione normotermico ex vivo è mostrata nella Figura 3. La Figura 4 delinea i parametri rappresentativi di perfusione acquisiti durante un esperimento di successo (portata circolatoria, pressione aortica, frequenza cardiaca, temperatura, saturazione mista di ossigeno venoso ed ematocrito). L'incapacità di raggiungere i valori dei parametri qui dimostrati può portare a una compromissione della funzione dell'allotrapianto dopo il trapianto. La Figura 5 mostra un'immagine di un cuore eterotopico intraaddominale in situ 35 giorni dopo il successo del trapianto. I risultati rappresentativi dell'efficacia dell'uso del protocollo qui presentato per la somministrazione terapeutica sono stati precedentemente dimostrati da questo gruppo15. Gli alloinnesti cardiaci (n = 3) sono stati perfusi con perfusato trattato con un vettore adenovirale che trasporta il transgene per la luciferasi. L'espressione genica si è dimostrata globale e robusta all'interno degli alloinnesti 5 giorni dopo il trattamento e il trapianto. La Figura 6 mostra un atlante dell'attività della proteina luciferasi misurata e presentata come variazione media dell'attività da ciascuna regione dell'allotrapianto cardiaco espiantato rispetto al cuore toracico dei riceventi.
Figura 1: Schema di protocollo per la somministrazione terapeutica a un intero allotrapianto cardiaco mediante perfusione sanguigna normotermica ex vivo . (A) Il cuore e il sangue sono prelevati dal maiale donatore. (B) Il sangue viene lavato utilizzando un dispositivo di risparmio cellulare per rimuovere eventuali componenti neutralizzanti terapeutici dal siero del donatore. (C) L'alloinnesto cardiaco è montato sul dispositivo di perfusione normotermico ex vivo e perfuso per 2 ore. (D) Subito dopo il montaggio dell'alloinnesto, la terapia di interesse viene aggiunta al perfusato. (E) Dopo il periodo di perfusione ex vivo assegnato, l'allotrapianto viene trapiantato nel suino ricevente in posizione eterotopica intraaddominale. Questa cifra è stata modificata da15. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Modello di cuore eterotopico suino in posizione intraaddominale. Diagramma del modello cardiaco eterotopico in cui l'allotrapianto viene trapiantato in posizione intraaddominale mentre il cuore nativo del ricevente rimane nella sua posizione naturale. L'arteria polmonare dell'allotrapianto è anastomosa alla vena cava inferiore infra-renale, mentre l'aorta dell'allotrapianto è anastomosa all'aorta infra-renale del ricevente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Allotrapianto cardiaco su dispositivo di perfusione ex vivo . L'allotrapianto cardiaco montato su un dispositivo di perfusione normotermico ex vivo dove viene perfuso con perfusato terapeutico per 2 ore prima dell'impianto nel ricevente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Parametri rappresentativi di perfusione ex vivo. (A) Portate circolatorie misurate dall'arteria polmonare (blu), dall'aorta (verde) e dalle arterie coronarie (rosso). (B) Misure rappresentative della pressione aortica: pressione media (blu), pressione sistolica (rosso), pressione diastolica (verde). (C) Frequenza cardiaca di un allotrapianto cardiaco durante la perfusione ex vivo . (D) Temperatura registrata dell'allotrapianto cardiaco durante la perfusione ex vivo . (E) dimostri i valori di SvO2 misurati dal perfusato durante il periodo di perfusione. (F) Valori di ematocrito misurati dal perfusato durante il periodo di perfusione. Abbreviazioni: hct = ematocrito; SvO2 = saturazione mista di ossigeno venoso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Allotrapianto cardiaco trapiantato nel ricevente. Un allotrapianto cardiaco il giorno 35 postoperatorio trattato con terapeutico al momento dell'impianto. Il donatore è stato selezionato per essere una perfetta corrispondenza SLA con il ricevente. Abbreviazione: SLA = Antigene leucocitario suino. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Attività della luciferasi dopo trasduzione di alloinnesti cardiaci. Sono presentati i risultati di tre alloinnesti cardiaci che sono stati trasdotti con vettori adenovirali portatori di un transgene luciferasi. Dimostrato è il cambiamento medio di piega nell'attività della proteina luciferasi in ogni area dell'allotrapianto cardiaco. Questa cifra è stata modificata da Bishawi et al. 15. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La somministrazione di terapie durante la perfusione ex vivo nel trapianto cardiaco offre una strategia per modificare l'allotrapianto e potenzialmente migliorare i risultati del trapianto. Il protocollo qui presentato incorpora lo stoccaggio di perfusione sanguigna normotermica ex vivo all'avanguardia e offre un potenziale promettente per testare la consegna isolata di cellule, geni o immunoterapie all'allotrapianto 11,12,13. Ad oggi, le tecniche di somministrazione cardiaca per queste terapie putative per le malattie cardiovascolari e l'insufficienza cardiaca allo stadio terminale si sono basate sulla somministrazione sistemica, sulla perfusione intracoronarica tramite cateterizzazione e sulle iniezioni intramiocardiche dirette, che hanno ottenuto scarsi risultati in termini di consegna miocardica 5,16. In precedenza avevamo dimostrato un'espressione robusta e globale di un gene reporter a interi alloinnesti cardiaci quando un vettore virale veniva somministrato nel perfusato durante la perfusione ex vivo prima del trapianto15. Ciò è particolarmente importante nel contesto del trapianto cardiaco, dove l'espressione globale e l'effetto della terapia dovrebbero raggiungere tutte le aree dell'allotrapianto per ottenere la desiderata "cardioprotezione" dell'intero allotrapianto. Questo protocollo raggiunge questo obiettivo in un modo che non è stato precedentemente raggiunto utilizzando le vie di somministrazione tradizionalmente descritte per le terapie.
Ci sono diversi passaggi critici presentati in questo protocollo da evidenziare. (1) Ogni precauzione deve essere presa per ridurre al minimo la perdita di sangue durante l'approvvigionamento del cuore dal donatore. Almeno 1 L di sangue deve essere raggiunto dal donatore affinché il dispositivo di perfusione raggiunga portate adeguate. (2) Per la somministrazione terapeutica utilizzando la perfusione sanguigna normotermica ex vivo , è necessario lavare il sangue del donatore prima di aggiungerlo al perfusato per rimuovere eventuali componenti neutralizzanti nel siero del donatore che possono influire negativamente sulla consegna del terapeutico al cuore. (3) Ridurre al minimo la dissezione del cuore nel donatore fino a dopo l'arresto cardioplegico per evitare aritmie fatali. (4) Quando si introduce la terapia nel dispositivo di perfusione, è importante introdurla attraverso la porta più vicina alla radice aortica e lavare sempre la porta per garantire la consegna completa della sospensione. Questo per ridurre al minimo qualsiasi potenziale perdita della terapia per l'ossigenatore o il tubo all'interno del circuito e garantire che l'innesto riceva la massima concentrazione terapeutica possibile. (5) Infine, quando si seleziona il sito per l'impianto dell'innesto, è fondamentale che la posizione riduca al minimo il potenziale di tensione sull'anastomosi e che non vi sia alcun attorcigliamento dei vasi sanguigni / anastomosi.
Si raccomanda inoltre che i suini siano preventivamente di tipo Antigene leucocitario suino (SLA) (cioè complesso di istocompatibilità maggiore suino, MHC) per selezionare il grado appropriato di corrispondenza/mancata corrispondenza tra gli aplotipi SLA comprendenti gli antigeni di classe I (SLA-1, SLA-2 e SLA-3) e/o di classe II (DR e DQ) appropriati in base alle esigenze dello sperimentatore (tipizzazione SLA eseguita da SH come precedentemente descritto con lievi modifiche apportate ai pannelli di primer di tipizzazione)17, 18. Ad esempio, garantire che i suini corrispondano a tutti gli antigeni SLA riduce al minimo il rischio di rigetto dell'allotrapianto, mentre l'utilizzo di suini con mancata corrispondenza tra tutti gli antigeni SLA massimizza l'incidenza del rigetto dell'allotrapianto.
Un limite di questo modello è che mentre consente lo studio degli effetti immunologici sull'innesto cardiaco, non consente una valutazione completa della capacità dell'innesto di supportare il sistema cardiovascolare a seguito di un intervento. Per raggiungere questo obiettivo, l'innesto dovrebbe essere impiantato ortotopicamente. Tuttavia, il trapianto ortotopico in modelli di animali di grandi dimensioni ha una maggiore mortalità associata e richiede il bypass cardiopolmonare3. Un'altra limitazione di questo modello è l'accesso limitato a un dispositivo di perfusione ex vivo per condurre un'efficace consegna genica all'innesto. Man mano che questi dispositivi diventano più disponibili nel campo del trapianto di organi, l'accesso dovrebbe migliorare. Inoltre, un dispositivo non commerciale può essere un'opzione per scopi sperimentali.
Il trapianto cardiaco offre un ambiente unico in cui le terapie possono essere introdotte nell'allotrapianto tramite perfusione ex vivo prima dell'impianto nel ricevente. L'uso di un dispositivo di perfusione ex vivo consente agli innesti di essere in transito dal donatore al ricevente per periodi molto più lunghi di quelli sicuri utilizzando la tradizionale conservazione statica a freddo6. Questo periodo di perfusione prolungato consente un'efficace somministrazione isolata di terapie. Questo modello funge da passaggio traslazionale tra la sperimentazione animale preclinica delle terapie e le terapie cliniche trasformative.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Paul Lezberg è impiegato da TransMedics, Inc. Carmelo Milano ha ricevuto un dono finanziario da TransMedics, Inc. per finanziare interventi chirurgici di trapianto di cuore eterotopico. Michelle Mendiola Pla è supportato da T32HL007101. Gli altri autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Duke Large Animal Surgical Core e Duke Perfusion Services per la loro assistenza durante queste procedure. Vorremmo anche ringraziare Paul Lezberg e TransMedics, Inc. per il supporto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Looped Maxon suture | Covidien | GMM-341L | Used to close fascia of the laparotomy incision |
| 0 Silk ties | Medtronic, Inc | S346 | |
| 18 G Angiocath | BD | 381144 | Used to de-air the left ventricle of the donor heart after implantation |
| 20 Fr LV vent | Medtronic, Inc | 12002 | |
| 2-0 Silk sutures | Ethicon, Inc. | SA11G | |
| 2-0 Silk ties | Ethicon, Inc. | SA65H | |
| 2-0 Vicryl suture | Ethicon, Inc. | J259H | |
| 24 Fr venous cannula | Medtronic, Inc | 68124 | |
| 3-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8522 | |
| 4-0 Monocryl suture | Ethicon, Inc. | Y469G | |
| 4-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8521 | |
| Animal hair cutting clipper | Wahl | 8786-452 | |
| Aortic clamp | V. Mueller | CH6201 | |
| Army Navy retractor | V. Mueller | SU3660 | |
| ATF 40, Cell saver disposable set | Fresenius Kabi | 9108494 | Cell saver device insert |
| Balfour retractor | V. Mueller | SU3042 | Used as an abdominal wall retractor |
| C.A.T.S cell saver | Fresenius Kabi | ES0019 | Cell saver device used to wash donor blood |
| Cardiac defibrillator | Zoll | M Series | Cardiac defibrillator |
| Castro needle holder | V. Mueller | CH8589 | |
| CG4 iStat cartridges | Abbott | 03P85-25 | POC testing |
| CG8 iStat cartridges | Abbott | 03P88-25 | POC testing |
| DeBakey forceps | V. Mueller | CH5902 | |
| Electrocautery disposable pencil | Covidien | E2450H | |
| Gerald forceps | V. Mueller | NL1451 | |
| Hemotherm 400CE Dual Reservoir Cooler/Heater | Cincinnati Sub-Zero | 86022 | Heater cooler used to regulate perfusion temperature on the ex vivo perfusion device |
| iSTAT 1 | Abbott | 04P75-03 | POC testing device |
| Kocher clamp | V. Mueller | SU2790 | |
| Large clip applier | Sklar | 50-4300 | |
| Large clips | Teleflex | 4200 | |
| Large soft pledgets | Covidien | 8886867901 | |
| Medium clip applier | Sklar | 50-4335 | |
| Medium clips | Teleflex | 2200 | |
| Metzenbaum scissor | V. Mueller | CH2006-001 | |
| No. 10 scalpel blade | Swann-Mortan | 301 | Used for skin incision |
| No. 11 scalpel blade | Kiato Plus | 18111 | Used for vascular incision |
| OCS device with base | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device | |
| OCS disposable | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device insert with perfusion kits | |
| Pacing cable | Remington Medical | FL-601-97 | |
| Pediatric cardioplegia catheter (4Fr) | Medtronic, Inc | 10218 | Used to deliver cardioplegia to the donor aortic root |
| Pediatric Foley catheter | Teleflex | RSH170003080 | Placed pre-op to decompress the recipient's bladder |
| Potts scissors | V. Mueller | CH13038 | |
| Pressure bag x2 (1,000 mL) | Novaplus | V4010H | Used to deliver cardioplegia at a set pressure |
| Satinsky clamp | V. Mueller | CH7305 | Vascular clamp used for creating anastomoses between donor heart and recipient vessels |
| Scissors | Felco | FELCO 200A-50 | Used to perform sternotomy |
| Small hard pledgets | Covidien | 8886867701 | |
| Sternal retractor | V. Mueller | CH6950-007 | |
| Temporary cardiac pacing wires | Ethicon, Inc. | TPW32 | |
| Temporary dual chamber pacemaker | Medtronic, Inc | 5388 | Cardiac pacing device |
| Tourniquet kit | Medtronic, Inc | 79005 | Rummel tourniquets |
| Umbilical tape | Covidien | 8886861903 | |
| Vessel loops | Covidien | 31145686 |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
- Stehlik, J., Kobashigawa, J., Hunt, S. A., Reichenspurner, H., Kirklin, J. K. Honoring 50 years of clinical heart transplantation in circulation: in-depth state-of-the-art review. Circulation. 137 (1), 71-87 (2018).
- Kadner, A., Chen, R. H., Adams, D. H. Heterotopic heart transplantation: experimental development and clinical experience. European Journal of Cardiothorac Surgery. 17 (4), 474-481 (2000).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84, 85-106 (2015).
- Sahoo, S., Kariya, T., Ishikawa, K. Targeted delivery of therapeutic agents to the heart. Nature Reviews. Cardiology. 18 (6), 389-399 (2021).
- Stamp, N. L., et al. Successful heart transplant after ten hours out-of-body time using the TransMedics Organ Care System. Heart, Lung & Circulation. 24 (6), 611-613 (2015).
- Ragalie, W. S., Ardehali, A. Current status of normothermic ex-vivo perfusion of cardiac allografts. Current Opinion in Organ Transplantation. 25 (3), 237-240 (2020).
- Koerner, M. M., et al. Normothermic ex vivo allograft blood perfusion in clinical heart transplantation. Heart Surgery Forum. 17 (3), 141-145 (2014).
- Rosenbaum, D. H., et al. Perfusion preservation versus static preservation for cardiac transplantation: effects on myocardial function and metabolism. Journal of Heart and Lung Transplantation. 27 (1), 93-99 (2008).
- Cullen, P. P., Tsui, S. S., Caplice, N. M., Hinchion, J. A. A state-of-the-art review of the current role of cardioprotective techniques in cardiac transplantation. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 32 (5), 683-694 (2021).
- Rurik, J. G., Aghajanian, H., Epstein, J. A. Immune cells and immunotherapy for cardiac injury and repair. Circulation Research. 128 (11), 1766-1779 (2021).
- Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation. Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).
- Kieserman, J. M., Myers, V. D., Dubey, P., Cheung, J. Y., Feldman, A. M. Current landscape of heart failure gene therapy. Journal of the American Heart Association. 8 (10), 012239 (2019).
- Perin, E. C. Stem cell and gene therapy for cardiovascular disease. Perin, E. C., Miller, L. W., Taylor, D. A., Wilkerson, J. T. , Academic Press. 279-287 (2016).
- Bishawi, M., et al. A normothermic ex vivo organ perfusion delivery method for cardiac transplantation gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 8029 (2019).
- Hulot, J. S., Ishikawa, K., Hajjar, R. J. Gene therapy for the treatment of heart failure: promise postponed. European Heart Journal. 37 (21), 1651-1658 (2016).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class I genes in outbred pig populations. Animal Genetics. 40 (4), 468-478 (2009).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class II genes in outbred pig populations. Animal Genetics. 41 (4), 428-432 (2010).
