Summary
Vi presenterar ett protokoll för att använda ett normotermt ex vivo sanguinöst perfusionssystem för leverans av terapier till en hel hjärtalograft i en svin heterotopisk hjärttransplantationsmodell.
Abstract
Hjärttransplantation är guldstandardbehandlingen för hjärtsvikt i slutstadiet. Det är dock fortfarande begränsat av antalet tillgängliga donatorhjärtan och komplikationer som primär transplantatdysfunktion och transplantatavstötning. Den senaste kliniska användningen av en ex vivo-perfusionsanordning vid hjärttransplantation introducerar en unik möjlighet att behandla hjärtalografter med terapeutiska ingrepp för att förbättra funktionen och undvika skadliga mottagarsvar. Att etablera en translationell, stordjursmodell för terapeutisk leverans till hela allograften är avgörande för att testa nya terapeutiska metoder vid hjärttransplantation. Den svin, heterotopiska hjärttransplantationsmodellen i intraabdominal position fungerar som en utmärkt modell för att bedöma effekterna av nya ingrepp och immunopatologin för transplantatavstötning. Denna modell erbjuder dessutom långsiktig överlevnad för grisen, eftersom transplantatet inte krävs för att upprätthålla mottagarens cirkulation. Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla ett reproducerbart och robust tillvägagångssätt för att uppnå ex vivo-leverans av en terapeutisk till hela hjärtalograften före transplantation och tillhandahålla tekniska detaljer för att utföra en överlevnad heterotopisk transplantation av ex vivo perfuserat hjärta.
Introduction
Hjärtsvikt är ett tillstånd som drabbar uppskattningsvis 6 miljoner vuxna i USA och beräknas öka till 8 miljoner vuxna år 20301. Hjärttransplantation är guldstandardbehandlingen för hjärtsvikt i slutstadiet. Det är dock inte utan dess begränsningar och komplikationer. Det förblir begränsat av antalet tillgängliga donatorhjärtan, primär transplantatdysfunktion, avstötning av hjärtat och biverkningarna av långvarig immunsuppression2. Dessa begränsningar är särskilt viktiga för unga mottagare som kan uppleva allograft misslyckande och kräva efterföljande omtransplantation för att uppnå normal livslängd.
Ett idealiskt ingripande för att övervinna dessa begränsningar skulle behandla hela hjärtalografter med terapier före implantation i mottagaren som kan förbättra allograftens livskraft och ge "hjärtskydd". Sådana ingrepp skulle ges profylaktiskt för att minimera förekomsten av ischemiska förolämpningar, allograftavstötning, hjärt-allograft vaskulopati och till och med reparera marginella allografter. Translationella studier för att utveckla dessa typer av interventioner kräver en stordjursmodell för hjärttransplantation för att möjliggöra långsiktig övervakning av hjärttransplantatet. Den sviniska, heterotopiska hjärttransplantationsmodellen i intraabdominal position har visat sig vara idealisk för detta ändamål. Hjärttransplantation i denna position möjliggör testning av effekterna av nya terapier och bedömning av immunopatologin för transplantatavstötning. Dessutom är den heterotopiska modellen fördelaktig jämfört med den ortotopiska modellen på grund av bättre total överlevnad hos mottagaren, inget krav på kardiopulmonell bypass och inget krav på transplantatet för att upprätthålla mottagarens cirkulation3.
Effektiv leverans av terapeutiska ingrepp till hjärtat, såsom gen-, cell- eller immunterapi, är ett betydande hinder för klinisk tillämpning 4,5. Tekniken som introduceras av ex vivo-perfusionsanordningar gör att transplantat kontinuerligt kan perfuseras och bibehålla dem i ett icke-fungerande men metaboliskt aktivt tillstånd 6,7,8,9. Detta ger en unik möjlighet att behandla ett helt hjärta med avancerade terapier samtidigt som de potentiella biverkningarna av systemisk leverans 10,11,12,13 minimeras. En annan fördel med att använda ex vivo-perfusionsanordningar för terapeutisk leverans är att de möjliggör administrering av läkemedel till kranskärlscirkulationen under längre perioder som inte är möjliga med traditionella kalla statiska lagringsmetoder. Detta möjliggör mer global leverans av terapierna till transplantatet14. Med hjälp av protokollet som presenteras här levererade vi framgångsrikt firefly luciferas-genen till ett helt svinhjärttransplantat med adenovirala vektorer15. Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla ett reproducerbart och robust tillvägagångssätt för att uppnå leverans av en terapeutisk till hela hjärtalograften före transplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Två kvinnliga Yucatan-grisar väljs ut, varav den ena är utsedd att vara hjärttransplantatdonator och den andra mottagaren. Grisar i åldern 6-8 månader, som väger ca 30 kg och har kompatibla blodtyper rekommenderas. Översikten över protokollet visas i figur 1. Bostäder och behandlingsförfaranden för grisarna utförs i enlighet med riktlinjerna från Animal Care and Use Committee of Duke University Medical Center.
1. Beredning av ex vivo-perfusionsanordningen
- Förbered ex vivo-perfusionsenheten och en cellsparande enhet för användning enligt tillverkarens riktlinjer.
- Ha en napplåda och hjärtstartare tillgänglig och ställ in dem.
- Ha en patientpunkt (POC) testanordning tillgänglig för att kontrollera ett fullständigt blodtal (CBC), grundläggande metabolisk panel (BMP) och arteriell blodgas (ABG).
- Tillsätt följande läkemedel till perfusionsprimeringslösningen som tillhandahålls av tillverkaren, om den inte redan finns i tillverkarens perfusionslösning: 100 ml 25% albumin, 10 ml 200 mg/100 ml ciprofloxacin, 1 g cefazolinnatrium, två 5 ml injektionsflaskor med multivitamininjektion, 250 mg metylprednisolon, 10 000 IE heparin och 50 IE insulin.
- Utför POC-testning av ex vivo-enhetens grundlösning för att säkerställa att elektrolytnivåerna ligger inom det normala fysiologiska området. Om inte, administrera kalciumglukonat, dextros och/eller natriumbikarbonat i enlighet med detta för att komplettera eventuella subterapeutiska elektrolyt- eller glukosnivåer.
- För att tillsätta priminglösningen med de tillsatta medicinerna, spika lösningen och lufta linjen som levererar lösningen till ex vivo-perfusionsanordningen .
OBS: Gå till avsnitt 6 för instruktioner om grundning av ex vivo-perfusionsenheten .
2. Initiering av anestesi och IV-åtkomst hos donatorgrisen
- Efter att ha fastat grisen i 8-12 timmar, premedicinera den med ketamin (5-33 mg / kg, intramuskulär) och midazolam (0,2-0,5 mg / kg, intramuskulär) och administrera isofluran (1-4%) med ansiktsmask.
- Placera grisen i ryggläge och intubera med ett endotrakealt rör (ETT) (5,5-6,5 mm innerdiameter) för att skydda luftvägarna. Säkra ETT genom att binda det till grisens nos. Placera extremiteterna med tunga band fästa vid bordet.
- Applicera veterinärsalva på ögonen för att förhindra torrhet under anestesi.
- Placera en intravenös (IV) kateter (20-22 G) i en öronven.
- Initiera underhålls IV-vätskor (Laktat Ringers lösning vid 10 ml ·( kg·h)-1).
- Administrera intramuskulärt (IM) Buprenorfin 0,005-0,01 mg/kg för analgesi.
3. Vitala tecken och centrala linjeinställningar
- Starta mekanisk ventilation vid en tidvattenvolym på 10 ml· (kg·min) -1 och en hastighet på 10-15 andetag per minut med isofluran (1-3%) upprätthålls under hela proceduren så att reflexer saknas och hjärtfrekvensen (>60 slag per minut, <100 slag per minut) och blodtrycket (systoliskt blodtryck >90 mmHg, <130 mmHg) förblir inom det fysiologiska intervallet.
OBS: Tillägget av en paralytisk är valfritt. - Övervaka kontinuerligt syremättnad och hjärtfrekvenser under hela operationen.
4. Median sternotomi hos donatorgrisen
- Palpera bröstbenet från manubrium till xiphoid. Markera mittlinjen med en steril kirurgisk markör. Raka allt hår från platsen med en hårklippare och sterilisera området med 4% klorhexidin för totalt 3 omgångar sterilisering. Applicera ett sterilt kirurgiskt draperi runt det omedelbara kirurgiska stället.
OBS: Kirurger måste tvätta händer och armar med en alkohol- eller jodbaserad tvätt och ta på sig sterila klänningar och handskar. - Använd ett blad nr 10 för att göra ett snitt från manubrium ner till xiphoid, som mäter 20-30 cm, beroende på grisens storlek.
- Använd elektrokauteri för att dela pectoralis major ner från bröstbenet till xiphoid, var noga med att göra detta längs bröstbenets mittlinje. En gång ner till bröstbenet, gör mittlinjen och börja sternotomi från xiphoid genom att dela den med tung sax.
- Förläng sternotomicephaladen med tung sax. Efter varje snitt, separera hjärtat från bröstbenet med hjälp av finger svep. På detta sätt, slutför sternotomi genom manubrium.
- Efter avslutad sternotomi, uppnå hemostas genom att applicera elektrokauteri på de skurna benkanterna.
- Placera en sternal retractor och öppna den för att optimera exponeringen av det kirurgiska fältet. Identifiera och ta bort tymus med elektrokauteri. Gå in i perikardiet i längdriktningen från membranet till aortan. Skapa en perikardiell vagga med 5-6 storlek: 2-0, silkesuturer.
5. Hjärtstillestånd och kardektomi hos donatorgrisen
- Dela vävnaden helt mellan aortan och lungartären (PA) och visualisera placeringen av aortabågen och den brachiocephaliska stammen för att underlätta korrekt placering av aorta-tvärklämman.
OBS: Den stigande aortan är mycket kortare hos grisen kontra människan. - Frigör omkretsen den överlägsna vena cava (SVC) med sax och trubbig dissektion. Passera två, storlek: 0, sidenband runt SVC.
- Frigör omkretsen den underlägsna vena cava (IVC) med sax och trubbig dissektion. På samma sätt passera två 0 sidenband runt IVC.
- Applicera en U-söm, storlek: 4-0, polypropen sutur på den stigande aortan.
- Applicera en handväska, storlek: 4-0, polypropen sutur till höger atrium (RA).
- Administrera en bolus av heparin IV med en initial dos på 300 U/kg.
- Sätt i en pediatrisk 4-Fr aorta rotkanyl, säkrad av den tidigare placerade U-sömmen. Lufta kanylen och säkra den på plats med en Rummel-turnering.
- Anslut aortarotskabulen till kardioplegislangen efter att slangen har spolats med del Nido-kardioplegi. Spola med den nödvändiga mängden för att ta bort eventuella luftbubblor i slangen.
OBS: Kommunikation med perfusionsteamet är avgörande vid denna tidpunkt för att korrekt utföra hjärtstoppet.- Se till att perfusionisten/perfusionisterna har installerat engångsartiklarna för cellsparare på ett sterilt sätt, grundat enheten enligt tillverkarens rekommendationer (se avsnitt 6) och är redo att bearbeta det uppsamlade blodet.
- Bekräfta att cellsparkardiotomin (plastbehållare fäst vid cellsparenheten där blod lagras efter tvätt) är klar med 10 000 U heparin och att kardiotomin är ansluten till sug, för att inte överstiga -150 mmHg tryck.
OBS: Detta för att undvika hemolys av röda blodkroppar.
- Skapa en höger atriotomi inom den tidigare placerade plånbokssträngen, sätt in en 24 Fr venös kanyl i RA och säkra med en Rummel-turnering.
- Anslut den venösa kanylen till en steril sugledning ansluten till cellsparkardiotomin och samla cirka 1-1,3 liter blod. Applicera sedan aorta-tvärklämman och se försiktigt till att klämman helt täcker den stigande aortan. Administrera 500 ml Del Nido-kardioplegi i roten vid ett tryck av 100-150 mmHg med hjälp av en tryckpåse.
NOTERA: Hjärtat kommer att blanchera och gripa. - Placera steril isslussh på hjärtat.
- När kardioplegi har levererats, ta bort aortarotkanylen och RA venös kanyl och binda ner snörpsträngssuturerna.
- Dela upp följande: IVC, SVC bara proximal till azygosvenen, aortan vid bågens nivå bara distal till Innominatartären, huvud-PA vid bifurkationen och den vänstra azygot venen när den kommer in i koronar sinus.
OBS: Grisar har en vänster azygot ven som rinner ut i koronar sinus. - Identifiera lungvenerna och ligate dem med storlek: 2-0, silkeband eller stora klipp. Lämna en lungven öppen för införande av LV-ventilen.
- Ta bort hjärtat från bröstet och placera det i en behållare med steril isslussh.
- Flytta hjärtat till bakbordet för att förbereda transplantatet för placering på ex vivo-perfusionsanordningen .
6. Tvätta givarblodet och grunda ex vivo-perfusionsanordningen
OBS: Detta steg är nödvändigt för att ta bort alla komponenter från donatorserumet som kan neutralisera leveransen av terapin när den introduceras till perfusatet. Utför detta steg under explantationen av donatorhjärtat för att minimera allograft ischemisk tid.
- Slutför en cellsparande prime och tvättcykel.
- Installera engångskomponenterna i enheten enligt tillverkarens instruktioner.
- Primera cellspararenheten genom att spika Plasmalyte A och välja prime-funktionen på enheten. Tillsätt lika mycket Plasmalyte A som volymen blod som samlats in från donatorgrisen på ett 1:1-sätt.
OBS: När enheten har slutfört grundningscykeln är den redo för tillsats av blod. Se avsnitt 5.9-5.11 för hur man tillsätter blodet från donatorgrisen. - När blodet är i enheten väljer du tvättcykeln på cellsparenheten.
OBS: Under denna process centrifugeras blodet medan Plasmalyte A införs för att tvätta blodet. Detta steg koncentrerar och tvättar blodet.
- Överför det tvättade blodet till en bloduppsamlingspåse för överföring till ex vivo-enheten .
- Tillsätt det tvättade blodet till ex vivo-perfusionsenheten enligt tillverkarens riktlinjer.
- Förbered en adrenalinlösning genom att injicera 0,25 mg adrenalin och 30 IE insulin i 500 ml 5% dextros i vatten under grundningen av ex vivo-maskinen . Spika lösningen och lufta linjen som levererar lösningen till ex vivo-enheten .
- Tillsätt 10 000 U heparin till ex vivo-perfusionsanordningen .
- Tillsätt 5% albumin för att rekonstituera blodet.
OBS: Volymen på 5% albumin som läggs till enheten är lika med mängden plasma som tas bort av cellspararanordningen. Detta görs för att uppnå ett fysiologiskt onkotiskt tryck och hematokrit. - Slå på pumpen för att flöda vid 1-1,5 l / min för att primera kretsen med klarprimtal, läkemedel och blod som administreras i behållaren. Efter att ha slagit på pumpflödet och cirkulerat primtalet genom perfusionsmodulen, se till att kretsens linjer är luftfria.
OBS: Den slutliga underhållslösningens volym är 1000 ml utöver volymen tvättat blod. - Få en baslinjeperfusat POC-kemi och laktat med hjälp av POC-testanordningen. Fyll på elektrolyter efter behov.
- Tillsätt tillräckligt med dextros för att bibehålla en lägsta glukosnivå på 100 mg / dL.
- Tillsätt tillräckligt med natriumbikarbonat för att upprätthålla ett lägsta pH-mål på 7,4.
OBS: Viktigt är att tillsatt natriumbikarbonat inte kan avlägsnas från perfusatet. Överskott av natriumnivåer kommer att bidra till att hjärtat blir edematöst och måste undvikas. Försiktighet måste iakttas vid behandling av basunderskottet, eftersom hjärtat kommer att börja korrigera basunderskottet vid reanimation. - Tillsätt tillräckligt med kalciumglukonat för att bibehålla en lägsta joniserad kalciumnivå på 0,8 mmol / L.
- Ställ in temperaturen på 37 °C.
- Ställ in gasflödet på 150 ml/min och justera efter behov för att uppnå en fysiologisk pCO2-nivå .
- Ställ in målet för genomsnittligt arteriellt tryck (MAP) till 60-70 mmHg.
- Sänk pumpflödet till 0,6 l/min.
7. Backtable förberedelse av donatorhjärtat och reanimering av hjärtat
- Oversew the SVC. Placera fyra pantsatta, storlek: 4-0, polypropensuturer i ett enkelt horisontellt madrasssätt runt insidan av den distala aortan, 5 mm under skärkanten och binda dem.
- Medan du håller upp 4, storlek: 4-0, pantsatta aorta suturer, sätt in aortakontakten i aortan och knyt en naveltejp runt aortan för att säkra kontakten.
- Placera en storlek: 4-0, polypropylenväska-sträng runt den distala skärkanten på huvud-PA. Sätt i PA-kanylen och knyt ner ändarna på snöret för att säkra kanylen.
- Ta det förberedda transplantatet från bakbordet till ex vivo-perfusionsanordningen och anslut aortakontakten till enheten. Var noga med att lufta aorta/ aortakontakten innan du säkrar hjärtat till enheten.
- Starta perfusionsklockan, håll pumpflödet runt 0,6 l/min och sänk börvärdet för temperaturen till 34 °C.
- Starta epinefrin och underhållsdroppar enligt tillverkarens rekommendationer.
- Anslut PA-kanylen till PA-kontakten på enheten och säkra den med slips.
- Placera vänster ventrikel (LV) ventilationsavlopp genom den obundna lungvenen i vänster förmak och över mitralventilen i LV. Säkra ventilen på plats med en enda söm för att förankra den ordentligt.
- Placera två hjärtpacingledningar på LV-friväggen.
- Kontrollera laktat, ABG, CBC och BMP varje timme. Administrera kalium, 50% dextros och kalcium efter behov för att upprätthålla normala fysiologiska nivåer.
OBS: Mer frekvent laktatprovtagning kan vara lämpligt under tidig stabilisering för att fastställa adekvat perfusion baserat på laktat. - Om pacing krävs, ställ in ventrikelhastigheten på 80 slag per minut vid 10 mA (förmakspacing används vanligtvis inte).
- Om defibrillering krävs, börja vid 10 J efter att temperaturen på enheten har nått 34 °C. Överstiga inte 50 J.
OBS: Målets totala medelflöde är 600 ml/min och det genomsnittliga koronarflödet är 400 ml/min.
8. Administrera den terapeutiska
- Dra upp den terapeutiska i en spruta på ett sterilt sätt.
- Lufta kardioplegiporten med hjälp av en steril 3 ml spruta för att dra blod genom porten. Administrera den terapeutiska i kardioplegiporten (eller motsvarande) så att den terapeutiska införs direkt i aortaroten.
- Spola porten med volymen uppsamlat blod som dras i steg 8.2 vid avluftning av porten; var försiktig så att du inte spolar någon luft med den.
OBS: Detta är för att säkerställa att den terapeutiska administreras i hjärtats aorta rot.
OBS: Detta avsnitt har tidigare beskrivits i detalj i Bishawi et al. att införa virala vektorer för luciferasuttryck15. - Perfuse transplantatet på enheten i 2 timmar efter införandet av terapeutiska.
9. Beredning av mottagaren och laparotomi med vaskulär exponering
- När hjärt-allograften är fäst vid enheten och terapin har införts i kretsen, börja induktionen av anestesi och preoperativ beredning enligt beskrivningen i avsnitt 2 för mottagargrisen.
- Initiera infusion av immunsuppressionsmedicinerna: cyklosporin 50 mg/kg totalt som en långsam droppinfusion under hela proceduren och metylprednisolon 1 g IV bolus.
- Administrera antibiotika: enrofloxacin IM (5 mg/kg) och cefazolin 1 g IV bolus.
- Sätt in en Foley-kateter i urinblåsan.
OBS: Dekomprimering av urinblåsan hjälper till att få en optimal exponering av infraröd aorta och IVC. - Markera bukens mittlinje från mitten av buken till pubis med en steril kirurgisk markör. Raka allt hår från platsen med en hårklippare och sterilisera området med 4% klorhexidin för totalt 3 omgångar sterilisering. Applicera ett sterilt kirurgiskt draperi runt det omedelbara kirurgiska stället.
OBS: Kirurger måste tvätta händer och armar med en alkohol- eller jodbaserad tvätt och ta på sig sterila klänningar och handskar. - Använd ett 10-blad för att snitta huden (20-30 cm snitt) och byt till elektrokauteri för att dissekera ner till fascian.
- Använd två Kocher-klämmor för att lyfta fascian och bukhinnan och gör försiktigt ett litet snitt (1 cm) i bukhålan med Metzenbaum sax.
- Förläng bukhinnans öppning under snittets hela längd med hjälp av elektrokauteri och placera ett finger under för att skydda det underliggande inälvorna. Placera en Balfour-retraktor för att optimera exponeringen. Dra tillbaka tunntarmen kranialt och med våta handdukar.
- Öppna det retroperitoneala utrymmet sämre än njurarna med försiktighet riktad mot att identifiera urinledarna och undvika skador.
- Bär dissektionen ner till bukaorta och IVC. Ligate lymfatikerna med medelstora och stora klipp.
- Dissekera kärlen omkretsriktat och exponera ett tillräckligt stort segment för att passa en stor Satinsky-klämma runt varje kärl. Var noga med att undvika störningar i ländryggsartärgrenarna, som kommer från den bakre delen av aortan. Placera två kärlslingor runt aortan och IVC vid exponeringens proximala och distala ändar.
10. Slutlig arrestering och avlägsnande av hjärtat från ex vivo-perfusionsanordningen
- I slutet av 2 timmars ex vivo-perfusion , anslut värmekylaren till ex vivo-enheten . Ställ in värmaren svalare temperatur på 34 °C.
- På ett sterilt och luftfritt sätt ansluter du den luftade kardioplegileveranslinjen till ex vivo-enheten vid aortaåtkomstporten.
- Stäng av temperaturbörvärdet på ex vivo-enheten.
- Sänk temperaturen på värmaren och kylaren till 24 °C och minska pumpflödet för att bibehålla MAP mellan 60 och 70 mmHg (vanligtvis en förändring av pumpflödet från 1 l/min ner till 0,9 l/min).
- När temperaturavläsningen på ex vivo-perfusionsanordningen når 24-26 °C, sänk temperaturen mellan värmaren och kylaren ytterligare till 14 °C och minska pumpflödet ytterligare med 100 ml/min.
- När temperaturen når 14-16 °C, lossa PA-kanylen från PA-porten, starta leveransen av antegrade del Nido (500 ml), stäng AO-ledningsventilen, stoppa pumpen och kläm snabbt fast AO-ventilationsledningen.
OBS: Kardioplegi leveranstryck måste titreras för att upprätthålla ett genomsnittligt leveranstryck på 45-65 mmHg som visas på ex vivo-enhetens bildskärm. - Ta bort hjärtat från ex vivo-perfusionsanordningen genom att koppla bort PA-kanylen och aortakontakten och klippa pacingtrådarna.
- Placera hjärtat i en hink fylld med steril isslam.
- På bakbordet, överse lungvenen/vänster atriotomi där LV-ventilen hade satts in. Trim (1 eller 2 mm) av den distala aspekten av aortan och PA där fastsättning på kanylerna kan ha krossat vävnaden.
OBS: Hjärtat är nu redo för intraabdominal, heterotopisk implantation.
11. Heterotopisk implantation av hjärttransplantatet
- Innan du placerar Satinsky-klämmorna, administrera 300 U/kg IV-heparin till mottagargrisen.
- Placera en Satinsky-klämma på IVC och skapa en längsgående venotomi som mäter ~ 1,5 cm med en 11-bladig och Potts sax.
- Anastomos transplantatet PA till mottagarens infra-renala IVC på ett end-to-side-sätt med hjälp av en löpande storlek: 4-0, polypropensutur. Utför den inre delen av anastomosen först och förstärk vid behov med avbrutna suturer innan du slutför den yttre delen av anastomosen.
OBS: PA till IVC anastomos utförs först, och aorta-till-aorta anastomos görs sist för att minska varaktigheten av aorta ocklusion. - Placera en Satinsky-klämma på aortan och skapa en längsgående aortotomi som mäter ~ 1,5 cm med en 11-bladig och Potts sax.
OBS: Skaffa en ABG före klämplacering. Kontrollera det omedelbart efter klämfrisättning och igen 15-30 minuter senare för att bedöma eventuella förändringar i hyperkalemi, hyperlaktatemi eller acidemi som indikerar ischemisk skada hos mottagaren. - Anastomos transplantataorta till mottagarens infra-renala aorta på ett end-to-side-sätt med hjälp av en löpande storlek: 4-0, polypropensutur. Utför den inre delen av anastomosen först och förstärk vid behov med avbrutna suturer innan du slutför den yttre delen av anastomosen.
- Ta bort Satinsky-klämmorna för att reperfuse hjärtat; Ta först bort IVC-klämman följt av aortaklämman.
- Placera en 18 G angiokat i LV-toppen av transplantatet för att lufta. När du är klar, ta bort angiocatth och stäng platsen med en pantsatt sutur.
- Kontrollera noggrant anastomoserna för blödning.
- Placera försiktigt hjärtat i rätt retroperitonealt utrymme, så att det inte finns någon spänning på anastomoserna och ingen kinking av kärlen. Byt ut tunntarmen.
12. Stängning av laparotomi
- Stäng fascian med loopad, storlek: 0, Maxon sutur på ett löpande sätt med början från båda ändarna av snittet och bindning i mitten. Var försiktig för att undvika skador på tarmen.
- Stäng det djupa dermala lagret med storlek: 2-0, Vicryl på ett löpande sätt och huden med storlek: 4-0, Monocryl på ett löpande sätt.
- Rengör hudsnittet och applicera hudlim.
13. Posturgisk behandling och eutanasi
- Efter avslutad operation, stäng av isofluranflödet och övervaka grisen för återkomst av muskelton och neuromuskulära reflexer (hornhinnereflex, tillbakadragande till smärtsamma stimuli, sväljning).
- Efter att ha bekräftat restaureringen av dessa funktioner, stäng av mekanisk ventilation och observera för spontan andning. Om det finns spontan andning, ta bort endotrakealröret; om det inte finns, anslut endotrakealröret till mekanisk ventilation.
- Överför grisen från operationsbordet till ett isolerat hölje där dess vitala tecken (rektal temperatur, blodtryck, hjärtfrekvens) kan övervakas noggrant. Använd en värmelampa för att värma grisen efter behov. Ge en IV-vätskebolus på 250 ml laktat Ringers lösning vid inställning av hypotoni (systoliskt blodtryck < 100 mmHg). Fortsätt att övervaka grisen tills den kan upprätthålla sternal recumbency och vitala tecken är helt normaliserade.
NOTERA: Djuret lämnas inte utan uppsikt förrän det har återfått tillräckligt medvetande. Dessutom returneras inte djuret till andra djurs företag förrän det är helt återställt. - För smärtlindring, administrera en engångsdos av subkutan injektion med buprenorfin (fördröjd frisättning) 0,12 mg/kg för 72 timmar analgesi.
- I slutet av experimentperioden, avliva grisen för explantation av det inhemska (thorax) hjärtat och allograft (buk) hjärtat.
- Förbered grisen enligt beskrivningen i avsnitten 2 och 3 för proceduren. Förbered två påsar del Nido och två kardioplegilinjer för att arrestera varje hjärta.
- Exponera brösthjärtat enligt beskrivningen i avsnitt 4. När du är klar, fortsätt att utföra en laparotomi enligt beskrivningen i avsnitt 9.
- När aorto-aorta- och PA-IVC-anastomoserna exponeras, placera en Satinsky-klämma på mottagarens aorta och en annan på mottagaren IVC för att isolera allograften från den systemiska cirkulationen.
- Sätt in en pediatrisk 4-Fr aortarotkanyl i allograftens aortarot och anslut en kardioplegilinje till katetern. Administrera 500 ml del Nido-kardioplegi i roten vid ett tryck av 100-150 mmHg med hjälp av en tryckpåse. Efter infusionen, använd Metzenbaum sax för att göra ett 2 cm snitt vid nivån av PA-IVC-anastomosen för att ventilera allograften.
- När allograften har arresterats, fortsätt att explantera allograften genom att använda Metzenbaum sax för att skära ut på nivån av aorto-aorta-anastomosen och resten av PA-IVC-anastomosen. Ta inte bort någon av Satinsky-klämmorna.
- Fortsätt med avlägsnandet av brösthjärtat enligt beskrivningen i avsnitt 5.
OBS: Den enda signifikanta skillnaden är att lungvenerna inte behöver ligeras noggrant och istället kan dissekeras grovt med Metzenbaum sax när du utför cardiectomy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna grupp har framgångsrikt överlevt 9 grisar mellan 5 och 35 dagar efter protokollet som presenteras här, beroende på studiedesignen. Av 10 grisar som har genomgått detta protokoll dog endast 1 för tidigt från kirurgiska komplikationer, vilket gav en överlevnad på 90%. Demonstrerat i figur 2 är ett diagram över konfigurationen av ett heterotopiskt hjärta transplanterat i intraabdominal position hos en gris. När du bestämmer platsen för anastomos av allograften, välj en plats som minimerar eventuell spänning eller kinking på anastomosen. Detta säkerställer att anastomoserna läker ordentligt och att allograften får optimal perfusion och dränering av blod.
En representativ bild av en hjärt-allograft som perfuseras på en normoterm ex vivo-perfusionsanordning visas i figur 3. Figur 4 beskriver representativa perfusionsparametrar som förvärvats under ett framgångsrikt experiment (cirkulationsflödeshastighet, aortatryck, hjärtfrekvens, temperatur, blandad venös syremättnad och hematokrit). Oförmåga att uppnå de parametervärden som visas här kan leda till komprometterad allograftfunktion efter transplantation. Figur 5 visar en bild av ett intraabdominalt heterotopiskt hjärta in situ 35 dagar efter framgångsrik transplantation. Representativa resultat av effektiviteten av att använda det protokoll som presenteras här för terapeutisk leverans visades tidigare av denna grupp15. Hjärt-allografterna (n = 3) perfuserades med perfusat behandlat med en adenoviral vektor som bär transgenen för luciferas. Genuttrycket visade sig vara globalt och robust inom allografterna 5 dagar efter behandling och transplantation. Figur 6 visar en atlas över luciferasproteinaktivitet mätt och presenterad som genomsnittlig vikförändring i aktivitet från varje region av den explanterade hjärtalograften i jämförelse med mottagarnas brösthjärta.
Figur 1: Protokollschema för terapeutisk leverans till en hel hjärtalograft med normoterm ex vivo sanguinös perfusion. (B) Blodet tvättas med hjälp av en cellsparande anordning för att avlägsna eventuella terapeutiska neutraliserande komponenter från donatorserumet. (C) Hjärtalograften monteras på den normoterma ex vivo-perfusionsanordningen och perfuseras i 2 h. (D) Strax efter att allograften är monterad tillsätts den terapeutiska av intresse till perfusatet. (E) Efter den tilldelade ex vivo-perfusionsperioden transplanteras allograften till mottagarsvinet i den intraabdominala, heterotopiska positionen. Denna siffra har ändrats från15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Porcin heterotopisk hjärtmodell i intraabdominal position. Diagram över den heterotopiska hjärtmodellen där allograften transplanteras i intraabdominal position medan mottagarens ursprungliga hjärta förblir på sin naturliga plats. Allograftens lungartär är anastomoserad till den infra-renala underlägsna vena cava, medan allograftens aorta är anastomoserad till mottagarens infra-renala aorta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Hjärtalograft på ex vivo perfusionsenhet. Hjärtalograften monterad på en normoterm, ex vivo perfusionsanordning där den perfuseras med terapeutiskt infunderat perfusat i 2 timmar före implantation i mottagaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
(A) Cirkulationsflödeshastigheter uppmätta från lungartären (blå), aortan (grön) och kranskärlen (röd). B) Representativa mätningar av aortatryck: medeltryck (blått), systoliskt tryck (rött), diastoliskt tryck (grönt). (C) Hjärtfrekvensen hos en hjärtalograft under ex vivo-perfusion. (D) Registrerad temperatur på hjärtalograften under ex vivo-perfusion. (E) visar värdena för SvO2 mätt från perfusatet under perfusionsperioden. F) Hematokritvärden uppmätta från perfusatet under perfusionsperioden. Förkortningar: hct = hematokrit; SvO2 = blandad venös syremättnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Hjärtalograft transplanterad i mottagaren. En hjärt-allograft på postoperativ dag 35 behandlad med terapeutisk vid implantationstillfället. Givaren valdes ut för att vara en perfekt SLA-matchning med mottagaren. Förkortning: SLA = Svinleukocyter antigen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Luciferasaktivitet efter transduktion av hjärtalografter. Presenteras är resultaten av tre hjärt-allografter som transducerades med adenovirala vektorer som bär en luciferastransgen. Demonstrerad är den genomsnittliga vikförändringen i luciferasproteinaktivitet i varje område av hjärtalograften. Denna siffra har modifierats från Bishawi et al. 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Leverans av terapier under ex vivo-perfusion vid hjärttransplantation erbjuder en strategi för att modifiera allograften och potentiellt förbättra transplantationsresultaten. Protokollet som presenteras här innehåller den senaste normotermiska ex vivo sanguinous perfusionslagringen och erbjuder lovande potential att testa isolerad leverans av cell-, gen- eller immunterapier till allograft 11,12,13. Hittills har hjärtleveranstekniker för dessa förmodade terapier för hjärt-kärlsjukdom och hjärtsvikt i slutstadiet förlitat sig på systemisk administrering, intrakoronär perfusion via kateterisering och direkta intramyokardiella injektioner, som alla har uppnått dåliga resultat när det gäller hjärtinfarkt 5,16. Vi hade tidigare visat robust och globalt uttryck av en reportergen till hela hjärtalografter när en viral vektor administrerades i perfusatet under ex vivo perfusion före transplantation15. Detta är särskilt viktigt i samband med hjärttransplantation, där det globala uttrycket och effekten av det terapeutiska bör nå alla områden av allograften för att uppnå önskad "hjärtskydd" av hela allograften. Detta protokoll uppnår detta på ett sätt som inte tidigare har uppnåtts med hjälp av traditionellt beskrivna administreringsvägar för terapier.
Det finns flera kritiska steg som presenteras i detta protokoll för att markera. (1) Alla försiktighetsåtgärder måste vidtas för att minimera blodförlusten under tillvaratagandet av hjärtat från givaren. Minst 1 liter blod måste uppnås från givaren för att perfusionsanordningen ska uppnå tillräckliga flödeshastigheter. (2) För terapeutisk leverans med normoterm ex vivo sanguinös perfusion är det nödvändigt att tvätta givarblodet innan det tillsätts till perfusatet för att avlägsna eventuella neutraliserande komponenter i givarserumet som kan påverka leveransen av terapin till hjärtat negativt. (3) Minimera dissektion av hjärtat hos givaren tills efter kardioplegisk arrestering för att undvika dödliga arytmier. (4) När läkemedlet introduceras i perfusionsanordningen är det viktigt att införa det genom porten närmast aortaroten och spola alltid porten för att säkerställa fullständig leverans av suspensionen. Detta för att minimera eventuell förlust av det terapeutiska till oxygenatorn eller slangen i kretsen och säkerställa att transplantatet får en så hög terapeutisk koncentration som möjligt. (5) Slutligen, när du väljer platsen för transplantatimplantation, är det viktigt att platsen minimerar risken för spänning på anastomosen och att det inte finns någon kinking av blodkärlen / anastomoserna.
Det rekommenderas också att svinen är av typen Swine Leukocyte Antigen (SLA) (dvs. svinhuvud histokompatibilitetskomplex, MHC) i förväg för att välja lämplig grad av matchning/bristande överensstämmelse mellan SLA-haplotyper som omfattar antigener av cellytan i klass I (SLA-1, SLA-2 och SLA-3) och/eller klass II (DR och DQ) baserat på prövarens behov (SLA-typning utförd av SH som tidigare beskrivits med smärre ändringar gjorda på skrivprimerpanelerna)17. 18. Att till exempel se till att grisar matchar över alla SLA-antigener minimerar risken för allograftavstötning, medan användning av grisar med felaktig matchning över alla SLA-antigener maximerar förekomsten av allograftavstötning.
En begränsning med denna modell är att även om den möjliggör studier av de immunologiska effekterna på hjärttransplantatet, tillåter den inte en fullständig bedömning av transplantatets förmåga att stödja hjärt-kärlsystemet efter ett ingrepp. För att uppnå detta skulle transplantatet behöva implanteras ortotopiskt. Ortotopisk transplantation i stordjursmodeller har dock högre associerad dödlighet och kräver kardiopulmonell bypass3. En annan begränsning av denna modell är begränsad tillgång till en ex vivo-perfusionsanordning för att genomföra effektiv genleverans till transplantatet. I takt med att dessa enheter blir mer tillgängliga inom organtransplantation förväntas tillgången förbättras. Dessutom kan en icke-kommersiell produkt vara ett alternativ för experimentella ändamål.
Hjärttransplantation erbjuder en unik miljö där terapier kan introduceras till allograften via ex vivo perfusion före implantation i mottagaren. Användningen av en ex vivo-perfusionsanordning gör det möjligt för transplantat att överföras från givaren till mottagaren under perioder som är mycket längre än vad som är säkert med traditionell kall statisk lagring6. Denna förlängda perfusionsperiod möjliggör effektiv isolerad leverans av terapier. Denna modell fungerar som ett translationellt steg mellan preklinisk djurförsök av terapier och transformativa kliniska terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Carmelo Milano fick en ekonomisk gåva från TransMedics, Inc. Michelle Mendiola Pla stöds av T32HL007101. De andra författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Vi vill tacka Duke Large Animal Surgical Core och Duke Perfusion Services för deras hjälp under dessa procedurer. Vi vill också tacka Paul Lezberg och TransMedics, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Looped Maxon suture | Covidien | GMM-341L | Used to close fascia of the laparotomy incision |
| 0 Silk ties | Medtronic, Inc | S346 | |
| 18 G Angiocath | BD | 381144 | Used to de-air the left ventricle of the donor heart after implantation |
| 20 Fr LV vent | Medtronic, Inc | 12002 | |
| 2-0 Silk sutures | Ethicon, Inc. | SA11G | |
| 2-0 Silk ties | Ethicon, Inc. | SA65H | |
| 2-0 Vicryl suture | Ethicon, Inc. | J259H | |
| 24 Fr venous cannula | Medtronic, Inc | 68124 | |
| 3-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8522 | |
| 4-0 Monocryl suture | Ethicon, Inc. | Y469G | |
| 4-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8521 | |
| Animal hair cutting clipper | Wahl | 8786-452 | |
| Aortic clamp | V. Mueller | CH6201 | |
| Army Navy retractor | V. Mueller | SU3660 | |
| ATF 40, Cell saver disposable set | Fresenius Kabi | 9108494 | Cell saver device insert |
| Balfour retractor | V. Mueller | SU3042 | Used as an abdominal wall retractor |
| C.A.T.S cell saver | Fresenius Kabi | ES0019 | Cell saver device used to wash donor blood |
| Cardiac defibrillator | Zoll | M Series | Cardiac defibrillator |
| Castro needle holder | V. Mueller | CH8589 | |
| CG4 iStat cartridges | Abbott | 03P85-25 | POC testing |
| CG8 iStat cartridges | Abbott | 03P88-25 | POC testing |
| DeBakey forceps | V. Mueller | CH5902 | |
| Electrocautery disposable pencil | Covidien | E2450H | |
| Gerald forceps | V. Mueller | NL1451 | |
| Hemotherm 400CE Dual Reservoir Cooler/Heater | Cincinnati Sub-Zero | 86022 | Heater cooler used to regulate perfusion temperature on the ex vivo perfusion device |
| iSTAT 1 | Abbott | 04P75-03 | POC testing device |
| Kocher clamp | V. Mueller | SU2790 | |
| Large clip applier | Sklar | 50-4300 | |
| Large clips | Teleflex | 4200 | |
| Large soft pledgets | Covidien | 8886867901 | |
| Medium clip applier | Sklar | 50-4335 | |
| Medium clips | Teleflex | 2200 | |
| Metzenbaum scissor | V. Mueller | CH2006-001 | |
| No. 10 scalpel blade | Swann-Mortan | 301 | Used for skin incision |
| No. 11 scalpel blade | Kiato Plus | 18111 | Used for vascular incision |
| OCS device with base | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device | |
| OCS disposable | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device insert with perfusion kits | |
| Pacing cable | Remington Medical | FL-601-97 | |
| Pediatric cardioplegia catheter (4Fr) | Medtronic, Inc | 10218 | Used to deliver cardioplegia to the donor aortic root |
| Pediatric Foley catheter | Teleflex | RSH170003080 | Placed pre-op to decompress the recipient's bladder |
| Potts scissors | V. Mueller | CH13038 | |
| Pressure bag x2 (1,000 mL) | Novaplus | V4010H | Used to deliver cardioplegia at a set pressure |
| Satinsky clamp | V. Mueller | CH7305 | Vascular clamp used for creating anastomoses between donor heart and recipient vessels |
| Scissors | Felco | FELCO 200A-50 | Used to perform sternotomy |
| Small hard pledgets | Covidien | 8886867701 | |
| Sternal retractor | V. Mueller | CH6950-007 | |
| Temporary cardiac pacing wires | Ethicon, Inc. | TPW32 | |
| Temporary dual chamber pacemaker | Medtronic, Inc | 5388 | Cardiac pacing device |
| Tourniquet kit | Medtronic, Inc | 79005 | Rummel tourniquets |
| Umbilical tape | Covidien | 8886861903 | |
| Vessel loops | Covidien | 31145686 |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
- Stehlik, J., Kobashigawa, J., Hunt, S. A., Reichenspurner, H., Kirklin, J. K. Honoring 50 years of clinical heart transplantation in circulation: in-depth state-of-the-art review. Circulation. 137 (1), 71-87 (2018).
- Kadner, A., Chen, R. H., Adams, D. H. Heterotopic heart transplantation: experimental development and clinical experience. European Journal of Cardiothorac Surgery. 17 (4), 474-481 (2000).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84, 85-106 (2015).
- Sahoo, S., Kariya, T., Ishikawa, K. Targeted delivery of therapeutic agents to the heart. Nature Reviews. Cardiology. 18 (6), 389-399 (2021).
- Stamp, N. L., et al. Successful heart transplant after ten hours out-of-body time using the TransMedics Organ Care System. Heart, Lung & Circulation. 24 (6), 611-613 (2015).
- Ragalie, W. S., Ardehali, A. Current status of normothermic ex-vivo perfusion of cardiac allografts. Current Opinion in Organ Transplantation. 25 (3), 237-240 (2020).
- Koerner, M. M., et al. Normothermic ex vivo allograft blood perfusion in clinical heart transplantation. Heart Surgery Forum. 17 (3), 141-145 (2014).
- Rosenbaum, D. H., et al. Perfusion preservation versus static preservation for cardiac transplantation: effects on myocardial function and metabolism. Journal of Heart and Lung Transplantation. 27 (1), 93-99 (2008).
- Cullen, P. P., Tsui, S. S., Caplice, N. M., Hinchion, J. A. A state-of-the-art review of the current role of cardioprotective techniques in cardiac transplantation. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 32 (5), 683-694 (2021).
- Rurik, J. G., Aghajanian, H., Epstein, J. A. Immune cells and immunotherapy for cardiac injury and repair. Circulation Research. 128 (11), 1766-1779 (2021).
- Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation. Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).
- Kieserman, J. M., Myers, V. D., Dubey, P., Cheung, J. Y., Feldman, A. M. Current landscape of heart failure gene therapy. Journal of the American Heart Association. 8 (10), 012239 (2019).
- Perin, E. C. Stem cell and gene therapy for cardiovascular disease. Perin, E. C., Miller, L. W., Taylor, D. A., Wilkerson, J. T. , Academic Press. 279-287 (2016).
- Bishawi, M., et al. A normothermic ex vivo organ perfusion delivery method for cardiac transplantation gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 8029 (2019).
- Hulot, J. S., Ishikawa, K., Hajjar, R. J. Gene therapy for the treatment of heart failure: promise postponed. European Heart Journal. 37 (21), 1651-1658 (2016).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class I genes in outbred pig populations. Animal Genetics. 40 (4), 468-478 (2009).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class II genes in outbred pig populations. Animal Genetics. 41 (4), 428-432 (2010).
