Summary
本文介绍了一种成熟且可重复的凝集素染色测定，用于整个支架视网膜制剂，以及定量测量增殖性和非增殖性视网膜病变中经常改变的血管参数所需的方案。
Abstract
视网膜病变是一组影响眼睛神经感觉组织的异质性疾病。它们的特征是神经变性，胶质病和血管功能和结构的进行性变化。虽然视网膜病变的发病以视觉感知的微妙障碍为特征，但血管丛中的修饰是临床医生检测到的第一个迹象。新生血管形成的缺失或存在决定了视网膜病变是被归类为非增殖性 （NPDR） 还是增殖性 （PDR）。从这个意义上说，一些动物模型试图模仿每个阶段的特定血管特征，以确定内皮改变，神经元死亡和视网膜中发生的其他事件所涉及的潜在机制。在本文中，我们将提供在产后一天测量成人和早产小鼠视网膜血管参数所需的程序的完整描述（P）17。我们将详细介绍在整个支架中使用Isolectin GSA-IB4进行视网膜血管染色的方案，以便以后进行显微镜观察。还提供了使用Image J Fiji软件进行图像处理的关键步骤，因此，读者将能够测量血管密度，直径和曲折度，血管分支以及缺血和新生血管区域。这些工具对于评估和量化非增殖性和增殖性视网膜病变中的血管改变非常有帮助。
Introduction
眼睛由两个动脉 - 静脉系统滋养：脉络膜脉管系统，一种灌溉视网膜色素上皮和光感受器的外部血管网络;以及灌溉神经节细胞层和视网膜内核层的神经视网膜脉管系统1。视网膜脉管系统是一个有组织的血管网络，将营养物质和氧气输送到视网膜细胞并收集废物，以确保适当的视觉信号转导。这种脉管系统具有一些明显的特征，包括：缺乏自主神经支配，通过内在视网膜机制调节血管张力以及拥有复杂的视网膜 - 血液屏障2。因此，视网膜脉管系统一直是许多研究人员关注的焦点，他们不仅广泛研究了发育过程中的血管生成，还研究了这些血管在疾病中经历的改变和病理血管生成3。在视网膜病变中观察到的最常见的血管变化是血管扩张，新生血管形成，血管乔木化丧失和视网膜主血管变形，这使它们更加之字形4，5，6。所描述的一种或多种改变是临床医生最早发现的体征。血管可视化提供了一种快速、无创且价格低廉的筛查方法7。对在血管树中观察到的改变的广泛研究将确定视网膜病变是非增殖性的还是增殖性的，并进一步治疗。非增殖性视网膜病变可表现为血管形态异常，血管密度降低，无细胞毛细血管，包细胞死亡，黄斑水肿等。此外，增殖性视网膜病变还会导致血管通透性增加、细胞外重塑以及向玻璃体腔形成血管簇，这些簇容易分解或诱导视网膜脱离8。
一旦检测到，可以通过其血管变化来监测视网膜病变9，10。病理学的进展可以通过血管的结构变化来跟踪，这清楚地定义了疾病的阶段11。这些模型中血管改变的量化允许将血管变化和神经元死亡相关联，并测试疾病不同阶段患者的药物治疗。
鉴于上述陈述，我们认为血管改变的识别和定量是视网膜病变研究的基础。在这项工作中，我们将展示如何测量不同的血管参数。为此，我们将采用两种动物模型。其中之一是氧气诱导的视网膜病变小鼠模型12，它模仿早产儿视网膜病变和增殖性糖尿病视网膜病变的某些方面13，14。在这个模型中，我们将测量缺血区，新生血管区域以及主血管的扩张和弯曲。在我们的实验室中，已经开发了代谢综合征（MetS）小鼠模型，该模型可诱导非增殖性视网膜病变15。在这里，我们将评估血管密度和分支。
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Protocol
C57BL / 6J小鼠根据ARVO声明在眼科和视力研究中使用动物的指南进行处理。实验程序由科尔多瓦国立大学化学科学学院的机构动物护理和使用委员会（CICUAL）设计和批准（Res. HCD 1216/18）。
1. 缓冲液和试剂的制备
- 制备1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）：将8克氯化钠（NaCl），0.2克氯化钾（KCl），14.4克磷酸氢二钠二水合物（Na2HPO4 2H2O）和0.24克磷酸钾（KH2PO4）加入800毫升蒸馏水中。搅拌溶液，直到盐完全溶解。用氯化物酸（HCl）将pH值调节至7.4，并用额外的蒸馏水将体积调节至1L。过滤溶液并将其储存在4°C。
- 制备4%多聚甲醛（PFA）：将40克固体PFA加入800毫升新鲜制备的PBS中。在恒温60°C的加热板中搅拌溶液。 加入1M氢氧化钠（NaOH），直到PFA完全溶解，检查pH值是否保持在7.2-7.4的范围内。用 PBS 将容量充至 1，000 mL 并混合。关闭加热板，当溶液温度低于35°C时过滤溶液。 将溶液在4°C下储存长达3天。
注意：吞咽或吸入PFA是有害的，可能是一种致突变化合物。在整个过程中使用手套和口罩，并在安全舱内工作。 - 制备1x Tris缓冲盐水（TBS）：将6.1gTris和9gNaCl加入800mL蒸馏水中。搅拌溶液，直到盐完全溶解。用HCl调节pH至7.4，并用额外的蒸馏水将体积调节至1升。过滤溶液并将其储存在4°C。
- TBS-0.1%Triton X-100的制备：加入0.1毫升TritonX-100至100毫升TBS。轻轻混合并将其储存在4°C下长达1周。
注意：由于Triton是一种非常致密的洗涤剂，因此请稍微切开吸头的末端，以便更好地移液。 - TBS-5%-牛血清白蛋白（BSA）-0.1%Triton-X-100的制备：称取5gBSA，加入TBS-0.1%triton X-100溶液至最终体积为100 mL。轻轻搅拌。等分试样并在-20°C下储存长达2个月。
- 异凝集素GSA-IB4 Alexa fluor-488偶联物（Isolectin GSA-IB4）：重量为36.75mg氯化钙二水合物（CaCl2·2H2 O），并将其添加到500 mL新鲜制备的PBS中。用搅拌棒搅拌溶液。移取500μLCaCl2 / PBS溶液，并将其加入含有500μg冻干异凝素GSA-IB4粉末的小瓶中。轻轻混合并将溶液等分到0.5mL管中。将它们储存在-20°C，避光。
- 甘油/Tris中的聚乙烯醇：称取2.4克聚乙烯醇，加入6克甘油，轻轻搅拌。然后，加入6毫升水，并在室温下继续搅拌数小时。加入12mL预热的0.2M Tris溶液（pH：8.5），并在50°C的恒温下加热10分钟，偶尔混合。最后，将溶液以5，000× g 离心15分钟进行澄清。
注意：让溶液在室温下冷却，等分并储存在-20°C。
2. 荧光凝集素染色
- 在小鼠通过吸入二氧化碳（CO2）处死后，用剪刀修饰眼睛16。用新鲜制备的4%PFA在室温（RT）下固定去核的眼睛1小时。
注意：固定也可以通过在4°C下将眼睛在4%PFA中孵育过夜（ON）来进行。 根据ARVO关于在眼科和视力研究中使用动物的声明以及科尔多瓦国立大学化学科学学院机构动物护理和使用委员会（CICUAL）的指南（Res. HCD 1216/18），处死小鼠。 - 在解剖显微镜下，用剪刀沿着边缘切除角膜，并解剖整个视网膜。丢弃眼睛的前段，然后将视网膜与RPE-脉络膜分开。
注意：确保用镊子将剩余的碎屑和舌骨血管从视网膜中取出。 - 将视网膜置于200μL管中。然后，在100μL含有5%牛血清白蛋白（BSA）和0.1%Triton-X-100的Tris缓冲盐水（TBS）溶液中阻断和透化视网膜，在4°C下6小时内在摇摇杯中轻轻搅拌。
注意：此步骤可以在室温下执行2小时。 - 然后，倒置管子将视网膜置于盖子中，并用移液管取出阻塞溶液。
- 加入100μL含有0.01μg/ μL异凝集素GSA-IB4（GSA-IB4）的溶液。用铝箔包裹管子，以保护样品免受光照。用凝集素溶液ON在4°C或在室温下孵育视网膜2小时，并在摇摇杯中轻轻搅拌。
- 用100μL含有0.1%Triton-X-100的TBS洗涤视网膜20分钟，在摇摇杯中轻轻搅拌。为了正确清洗，将视网膜倒置在管帽中。将管子放回其站立位置，并取出容器中剩余的介质。重复此步骤三次。
- 将视网膜放入载玻片中，然后添加一滴PBS。在解剖显微镜下，从视网膜边缘向视神经进行四次等距离的切口。
- 要展开视网膜的花瓣，请使用镊子或小块滤纸。确保感光器侧朝下。
- 用滤纸取出幻灯片的剩余 PBS。然后，加入安装介质（甘油/Tris中的聚乙烯醇）和盖玻片。在室温下晾干1小时。
- 将载玻片存放在4°C，避光。
注意：视网膜也可以储存在4°C的PBS中，直到共聚焦显微镜可视化。
3. 共聚焦显微镜可视化和显微照片采集
- 在可视化之前，将载玻片在光照覆盖的RT下孵育10分钟。
- 在共聚焦显微镜下，将载玻片面朝下放在板中。
- 聚焦视网膜脉管系统的上神经丛，然后选择一个区域开始图像采集。
- 在软件中设置一般激光参数：波长：488nm;激光强度;高压;偏移;获得。
注：激光强度、PMT、偏移和增益可能因条件和灯泡的使用情况而异。最佳设置提供了血管的清晰图像，避免了光电倍增管灵敏度的饱和，从而与荧光信号呈线性关系。 - 设置其他采集参数：模式;尺寸;客观，无缩放;没有卡尔曼;步长。
注：必须使用相同的采集条件对照和实验样品进行成像。 - 以 x 轴和 y 轴设置坐标：扫描聚焦 2 倍的视网膜。如果该区域显示船只，请通过单击该区域的两倍来选择它，以便将其标记为以后的图像采集。
注意：强烈建议通过跟随上血管丛来选择视网膜区域，因为较大血管的荧光更高。 - 在网格中移动到相邻正方形，聚焦视网膜，然后选择相对应的区域。重复此步骤，直到所选区域包含整个视网膜。
- 选择一个区域并设置 z 轴坐标以定义要扫描的厚度范围。为此，将视网膜对焦2倍;使用千分尺，转到视网膜的顶部，然后单击"开始"位置的" 设置 "。然后，移动到视网膜的底部，然后单击" 设置 "在"结束"位置。
- 在网格中选择的每个区域重复步骤 3.8。
注：要验证扫描区域的深度，请按"开始"位置的" 转到 "。如果船只仍然可视化，请通过移动千分尺重新调整位置，然后单击" 设置"。在"结束"位置重复该过程。 - 初始化自动扫描。
- 扫描过程完成后，打开图像。
- 选择 系列 格式以将图像录制为马赛克，并使用首选扩展名保存。最后，拼接的图像将显示在屏幕上。
4. 图像处理
- 在ImageJ FIJI软件中，转到 菜单栏 ，然后单击 "文件>打开"。选择要处理的图像。在 "生物格式导入选项" 窗口中，选择" 显示 OME-XML 元数据 "，然后单击" 确定"。
注意：具有相似名称的图像应保存在单独的文件夹中。 - 在 "OME 元数据" 窗口中，搜索名为 PhysicalSizeX、PhysicalSizeY 和 PhysicalSizeZ 的像素大小信息。复制此数据。
- 对于图像校准，请转到 菜单栏 ，然后选择 图像>属性。复制步骤 4.2 中的图像信息，然后单击 "确定"。图像将作为包含多张照片的窗口打开，其中每张照片都表示在 z 轴上拍摄的缩微照片。
- 为图像指定首选的色谱，以便将颜色委托给荧光标签。为此，请转到 菜单栏 ，然后单击 LUT 图标。
- 要在单个图像中可视化所有堆栈，请转到 菜单栏 ，然后选择 "图像>堆栈> Z Project"。
- 在显示的 Z 投影 窗口中，选择可视化船只的所有堆栈。在投影类型中，选择 平均强度 ，然后单击 确定。
注意：堆栈总和的结果将显示在名为 AVG（映像名称）的新映像中。 - 调整生成的图像中的亮度和对比度，以减少背景并突出显示容器。转到 菜单栏 ，然后单击 图像>调整>亮度/对比度。在 B 和 C 窗口中，移动条形，直到观察到更好的强度。单击 应用 并保存更改。
- 复制为 亮度/对比度选择的参数;对于所有图像，这些图像必须相同。
- 在图像量化之前，定义要测量的参数。在 菜单栏中，转到 分析>设置测量值。在此处描述的过程中，有必要获取面积和周长（最终也需要测量距离）。单击 "确定"。
- 下载容器密度量化所需的插件17，并按照插件提供的安装说明进行操作。
- 继续定量特定的血管参数。
5. 缺血区的定量
- 在 菜单栏中，选择 "魔杖工具"。选择没有血管的视网膜区域。
注意：根据公差，可以选择更大或更小的区域。要调整公差，请单击魔杖工具图标两次。采用的模式：旧版。 - 按键盘上的 T 字母以在 ROI 管理器中记录所选区域。对视网膜的所有缺血区域重复步骤5.1和5.2。
- 单击 ROI 管理器中的 "测量 "以获取缺血区域信息。程序将显示一个新窗口，其中包含所需的信息。在另一个程序中复制数据或保存文件。
注意：在某些图像中，人们可能更喜欢手动选择缺血区域。在这种情况下，请选择"多边形选择"工具，在缺血区域周围绘制短距离，然后在新距离即将开始时单击图像。通过单击第一个点关闭所选区域。 - 重复步骤5.1，5.2和5.3以测量视网膜的总面积。
- 计算视网膜的缺血面积，即测量的所有缺血区的总和除以视网膜的总面积。
6. 新生血管区域的定量
- 在菜单栏中，选择 "魔杖"工具。
- 放大图像以更好地可视化新血管。使用魔杖工具逐个选择新卫星。
注：调整公差不高于20，以确保选择单个新血管。在所有图像量化过程中，该公差水平必须保持不变。 - 按键盘上的 T 字母以在 ROI 管理器中记录所选区域。对视网膜的所有新生血管区域重复步骤6.1和6.2。
- 单击 ROI 管理器中的 测量 以获取面积数据。程序将显示一个新窗口，其中包含所需的信息。在另一个程序中复制数据或保存文件。
- 重复步骤6.1，6.2和6.3以量化视网膜的总面积。
- 计算视网膜的新生血管面积，即测量的所有新血管区域的总和除以视网膜的总面积。
7. 容器直径的定量
- 在 菜单栏中，选择直线 工具。
- 放大图像以更好地可视化容器壁。在第一个分支之前对主容器执行三条横向线。这必须通过从容器的一面墙的边界到相反的边界画一条线来完成。
注意：该线必须完全垂直于壁容器，以避免量化误差。 - 按键盘上的 T 字母以在 ROI 管理器中记录所选区域。对所有需要量化的容器重复步骤 7.1 和 7.2。
- 单击 ROI 管理器中的 测量 以获取距离数据。程序将显示一个新窗口，其中包含所需的信息。在另一个程序中复制数据或保存文件。
8. 船舶曲折度的量化
- 在 菜单栏中，用鼠标右键单击直线 工具 图标，然后选择 "分割线 "或" 手绘线"。从视神经在血管内画一条线，直到血管形状之后的第一个血管分支。
注意：该线必须遵循血管形状，以避免定量误差。 - 按键盘上的 T 字母以在 ROI 管理器中记录所选区域。
- 在 菜单栏中，选择直线 工具。从视神经开始画一条线，直到第一个血管分支。
- 按键盘上的 T 字母以在 ROI 管理器中记录所选区域。
- 单击 ROI 管理器中的 测量 以获取距离数据。程序将显示一个新窗口，其中包含所需的信息。在另一个程序中复制数据或保存文件。
- 曲率指数计算如下：用分段线得到的距离除以用直线得到的距离。
9. 血管分支的定量
- 使用菜单栏的椭圆工具，定义一个同样适用于所有实验条件的区域。所选区域必须是围绕视神经绘制的同心圆。
- 按键盘上的 T 字母以在 ROI 管理器中记录所选区域。
注意：在这种情况下，建议保存ROI，因为量化速度很慢，并且必须在所有图像中使用相同的ROI。为此，请在 ROI 管理器中单击"更多" >保存"。 - 手动计算选择区域内主船产生的主要分支数量。
- 在邻近区域重复步骤 9.2 和 9.3，维持视神经-周边标准。
10. 血管密度的定量
- 将图像转换为 8 位模式。
- 转到菜单栏中的插件，选择血管分析>血管密度。
- 使用菜单栏的"正方形"工具定义一个区域，其中需要测量容器密度。单击"确定"。
- 程序将显示一个新窗口，其中包含所需的信息。在另一个程序中复制数据或保存文件。
- 在邻近区域重复步骤 10.2、10.3 和 10.4，保持 ROI，但将其放置九次，包括整个视网膜的外围和中心。
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Representative Results
如方案部分所述，从单个荧光染色测定中，您可以获得血管形态并定量评估感兴趣的几个参数。特定改变的搜索将取决于所研究的视网膜病变的类型。本文在增殖性视网膜病变小鼠模型中评估了缺血和新生血管区域、曲折性和扩张，而在MetS小鼠模型中分析了血管分支和密度，该模型诱导了非增殖性视网膜病变。
在第一个实验示例中，采用了氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型，该模型类似于早产儿视网膜病变和糖尿病视网膜病变增殖期的一些特征。在该模型中，从产后日（P）7到P1218，产仔与哺乳母亲一起在高氧室中维持。在P12处进行玻璃体内注射，以确定药物作为抗血管生成（称为治疗的病症）的有效性。将小鼠处死在P17，这是最大新血管形成的时间点19。使用用载体注射的小鼠作为对照。将两个样品固定并用Isolectin GSA-IB4一起染色。共聚焦采集后，使用ImageJ FIJI软件分析图像，如上所述。将拼接模块集成到共聚焦显微镜后，整个支架被观察为独特的图像（图1）。在P17处，可以观察到舌骨脉管系统，这是宫内生活中必不可少的瞬态血管系统（图1，白色箭头）20。
由于高氧室中过量的氧气供应，OIR小鼠会阻止生理血管发育并在视网膜中产生无血管区域。然后，将缺血区域定义为缺乏视网膜血管的区域（图2）。从获得的图像中，缺血区域可以量化为无血管区域的总和除以视网膜的总面积。机械损坏的区域也显示没有船只。要识别受损区域，请使用Hoechst染色分析神经元层的完整性。
视网膜的缺血区域避免供氧，因此，形成强烈的促血管生成反应，诱导新生血管形成16。Neovessels是小口径血管，起源于先前存在的血管上丛血管。它们的结构是杂乱无章的，因此，新血管以簇状体生长向玻璃体腔21。我们通过量化视网膜的新生血管面积除以视网膜的总面积来计算新血管簇占据的面积（图3）。由于新卫星的形状和大小是可变的，因此偶尔它们看起来类似于碎片和伪影。为了区分新血管，请验证簇是否从成熟的容器中生长。
血管扩张和曲折是另外两种常见的改变，它们对血管生物学有负面影响，因为它们产生湍流性血液循环。为了分析膨胀，我们测量了第一分支之前的三个高度的主血管直径22，23 （图4）。研究人员必须定义一个预定的距离来测量容器直径，以减少结果之间的差异。理想情况下，距视神经最远的点应在300μm左右。我们建议进行分析，然后平均每种情况至少抽取六只小鼠。
关于曲折性，我们测量主血管根据其形状覆盖的距离相对于视神经和第一个分支点之间的直线距离24 （图5）。正如我们在图像中看到的，主船的性存在异质性。为了获得具有代表性的结果，必须对每种情况进行不少于六只小鼠的定量。
在MetS模型中分析了最新的参数，血管分支和密度，表现出非增殖性视网膜病变。在MetS中，脂质和碳水化合物紊乱都与视网膜周细胞和内皮细胞功能障碍和死亡有关，导致无细胞毛细血管形成或血管分支减少25。在我们的模型中，ApoE-KO小鼠被加入到饮用水中的果糖喂养，浓度为10%w / v。控制动物刚刚收到自来水。经过4个月的饮食后，处死小鼠，并按照前面指示处理视网膜。为了测量血管分支，我们通过绘制同心圆来定义定量区域，然后逐个计算主中央血管产生的初级分支（图6）。
从获得的图像中，血管密度被量化为血管占用的面积除以ROI的面积（0.015 mm2的平方，见 图7中的展平），其位于每个显微照片的不同位置，如协议部分所述。避免量化具有机械损伤的区域（图7，白色箭头）。如果有两个以上的区域有穿刺，则必须丢弃视网膜。
图1：用Isolectin GSA-IB4标记的整个视网膜的血管染色： P17 OIR小鼠视网膜注射载体或在P12下治疗的代表性共聚焦图像。根据协议，使用Isolectin GSA-IB4 Alexa 488在整个视网膜上进行荧光染色。需要无血管区 （AV） 和新生血管区 （NV）。比例尺：500 μm。白色箭头显示残余的舌骨脉管系统。黄色箭头显示共聚焦图像采集过程中不完整的扫描区域。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：缺血区的定量： （A）P17处整个视网膜的代表性图像，显示OIR载体和OIR治疗小鼠的GSA-IB4血管染色。血管闭塞区域以黄色表示。比例尺：500μm.（B）AV面积（%）量化为中央缺血区与整个视网膜面积的比值。采用双尾不成对 t检验进行统计学比较。数据以均值±SEM <表示。在检查的生存时间内，每种情况至少使用了六只动物。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：新生血管区域的定量： （A）P17处整个视网膜的代表性图像，显示OIR载体和OIR治疗小鼠的GSA-IB4血管染色。新生血管形成的区域以白色表示。比例尺：500μm.（B）NV面积（%）被量化为新血管占据的面积与整个视网膜面积的比率。采用双尾不成对 t检验进行统计学比较。数据以均值±SEM <表示。在检查的生存时间内，每种情况至少使用了六只动物。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：血管扩张的定量： （A）P17处整个视网膜的代表性图像显示OIR载体和OIR治疗小鼠的GSA-IB4血管染色。左图：选择用于量化的投资回报率。右侧面板：ROI的缩放，显示在主容器中执行的直线，以测量容器直径。三条线被横向追踪到船只并取平均值。比例尺：100μm.（B）血管直径（%）被量化为在视网膜主要血管中测量的平均直径。采用双尾不成对 t检验进行统计学比较。以均值表示的数据±SEM. *p < 0.05。在检查的生存时间内，每种情况至少使用了六只动物。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：曲率指数的测定： （A）P17处整个视网膜的代表性图像，显示OIR载体和OIR治疗小鼠的GSA-IB4血管染色。左图：选择用于量化的投资回报率。中心面板：缩放ROI，显示从视神经到第一分支点的主血管中追踪的分段线。右面板：ROI的缩放，显示从视神经到第一个分支点的主血管中追踪的直线。比例尺：100μm.（B）通过将分割线的距离除以直线的距离来获得曲率指数。采用双尾不成对 t检验进行统计学比较。以均值表示的数据±SEM. ns，不显著。在检查的生存时间内，每种情况至少使用了六只动物。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：血管分支的定量： （A）整个坐骑视网膜的代表性图像显示ApoE-KO和ApoE-KO +果糖喂养小鼠中的Isolectin GSA-IB4血管染色。圆形定量区域以黄色定义。比例尺：100 μm，100倍放大倍率。（B）分支的数量被量化为从主血管到外围的视神经的主要分支的数量。采用双尾不成对 t检验进行统计学比较。以均值表示的数据±SEM. ns，不显著。每种情况至少雇用了六只动物。 请点击此处查看此图的放大版本。
图7：血管密度的量化： （A）整个坐骑视网膜的代表性图像显示ApoE-KO和ApoE-KO +果糖喂养小鼠的Isolectin GSA-IB4血管染色。0.015 mm2 定量面积的平方用黄色定义。比例尺：100 μm，100倍放大倍率。（B）血管密度量化为血管面积与总ROI面积的比值，在每个显微照片的不同位置放置九次。白色箭头显示有机械损坏的区域。采用双尾不成对 t检验进行统计学比较。以均值表示的数据±SEM. ns，不显著。每种情况至少雇用了六只动物。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
视网膜病变的动物模型是研究血管发育、重塑或病理性血管生成的有力工具。这些研究在该领域的成功依赖于易于访问的组织，从而可以执行各种技术，从而提供来自 体内 和 死后 小鼠的数据26，27。此外， 在体内 研究和临床分析之间发现了很大的相关性，为这些模型提供了可靠的可追溯性和可靠性28。在本文中，我们简单而稳健地描述了在视网膜血管疾病小鼠模型中表征血管网络的步骤。在文献中，读者将找到其他可能的参数来衡量和并行方法来量化这里选择的参数。编译的协议比其他协议有许多好处，因为它们是可重复的，并且它们只需要一个免费的软件来执行分析（Image J Fiji）。
此外，这些协议很容易由对程序没有广泛知识的学生执行，并且大多数测量不需要额外的插件（血管密度除外）。
样品提取和荧光染色技术简单明了29。使用新鲜视网膜非常重要，尽管它们可以与细菌生长抑制剂一起储存在PBS的4°C下。由于组织薄而柔软，因此旧样品在孵育期间或在安装前展开样品时经常分解。此外，过度固定4%PFA会使视网膜过度僵硬和变脆，但这不会影响凝集素染色。Isolectin GSA-IB4染色允许可视化每一层的完整血管网络，包括新血管和增殖的内皮细胞。其他标记物，如CD 31，需要用浓缩抗体孵育样品，并且它们具有更多的背景。另一方面，在血管造影中，荧光染料倾向于扩散出血管，这增加了血管口径和曲率定量的变异性。Isolectin GSA-IB4的一个缺点是它也可以标记小胶质细胞30。在进行玻璃体内注射或其他诱导过度浸润的实验程序时应小心，因为小胶质细胞可以形成团聚物。
图像采集可以使用任何共聚焦显微镜进行。使用电动板耦合到包含拼接模块的软件，将在单个图像中提供整个安装的视网膜的完整可视化。选择视网膜区域时，请确保包括样品的所有极端，否则照片将不完整（图1，黄色箭头）。例如，这在OIR的小鼠模型中不是很相关，因为血管改变在视神经附近。而在OIR的大鼠模型中，这种错误可能导致不准确的定量，因为缺血和新生血管区域位于边缘附近。另一种可能性是拍摄单独的视网膜显微照片。用户以后可以使用适当的软件将它们组织为拼图。不建议使用落射荧光显微镜，特别是在分析分支时，因为血管在整个视网膜厚度中发芽，并且某些血管不会仅在z层中检测到。
在使用ImageJ FIJI进行图像处理期间，建议在所有图像量化之前不要更新软件，以便在软件中保持相同的条件。图像的校准（以微米为单位的像素大小分配）是一个关键步骤，因为这些协议意味着距离和面积的量化。当熟悉该程序时，用户可以探索除魔杖工具外的其他工具，以选择新生血管和缺血区域。多边形选择工具对于测量在安装步骤中被切成两部分的缺血区域特别有用。其他研究人员已经创建了特定的插件，以根据这些结构的荧光强度自动选择新血管。这些方法更快，更省力，但建议在定量之前检查是否选择了小的不那么有光泽的新血管31。新血管的区域将比周围的正常血管发出更强烈的荧光。魔棒工具选择颜色相似的区域，容差确定所选像素的颜色相似程度。如果新血管的强度与正常血管相似，则可以向下调整耐受性，以增加对细微强度差异的敏感性。虽然每个样品中的新血管选择将使用相同的阈值进行，但一些新血管的特征是荧光强度较小。在这种情况下，需要较低的公差才能正确选择。
曲率和膨胀度是距离的测量值。对维管束树的全面研究有助于选择相同类型（动脉或静脉）和口径的血管。我们测量了三个高度的血管膨胀，如图 4所示。直线选择相对于船壁的角度是另一个需要考虑的相关点。这应该尽可能接近90°，以避免可能的错误。绘制直线时，用户可以使用缩放工具接近感兴趣的船只。
如果需要，还可以在两个或多个不同高度的定量区域中测量血管分支。在这种情况下，研究人员应保留所分析的视网膜区域（视神经的中央，中层或外周侧）。尽管在几种视网膜病变的动物模型中分支发生了变化，但此处介绍的与MetS相关的视网膜病变的早期阶段仍未显示此类变化15。对于中层和深部神经丛以及血管萌发的视网膜毛细血管的广泛研究，3D计算方法提供了血管形态和网络细微变化的宝贵数据32。最后，血管密度由血管占用的面积相对于所选ROI的总面积确定。此参数的测量需要使用插件和 ImageJ FIJI 的实际版本，其中必须提供自动阈值和几何到距离地图工具。尽管有这些额外的步骤，该插件易于使用，可重复且可靠。对于血管密度的测量，选择0.015 mm2 的ROI，以便对视网膜不同区域的荧光强度进行十次测量。这个尺寸使我们能够覆盖整个照片，从而获得更具代表性的平均值及其在每个视网膜中的偏差。
总体而言，尽管这些方法集合不是自动化的，并且需要手动选择参数，但它们能够提供视网膜的定量和严格的数据。上述血管测量方案的主要局限性在于分析同一图像时检查者之间的变异性。为了最大限度地减少这种偏倚，重要的是要预先确定血管壁边界，缺血区域和新血管的识别以及受损组织的排除标准。关于血管弯曲度，需要在视神经旁边商定一个起点。对于初学者用户，强烈建议对两名或多名审查员收集的数据进行平均。在训练有素的用户中，只要量化标准的一致性保持不变，在各种参数的测量中没有发现显着差异。同样，额外的参数可以添加到列出的方案中，这取决于在视网膜病变中检测到的血管改变。在非增殖性视网膜病变中，无细胞毛细血管数，迁移的周细胞，周细胞/内皮细胞数的比率和血液视网膜屏障通透性的测量是视网膜脉管系统中最早改变的参数33，34，35。对于慢性模型和轻度视网膜病变，建议包括这些额外的测量值。测量的大量参数将为脉管系统中发生的事件提供更忠实的景观。总之，在本文中，我们展示了经典的，完善的和可重复的技术，以量化临床实践中考虑的一些最相关的参数。
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Disclosures
作者声明，该研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢CEMINCO（Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba，CONICET-UNC，Córdoba，阿根廷）的Carlos Mas，María Pilar Crespo和Cecilia Sampedro在共聚焦显微镜方面的协助，Soledad Miró和Victoria Blanco的专门动物护理以及Laura Gatica的组织学援助。我们还感谢Victor Diaz（FCQ机构传播副秘书）的视频制作和编辑，以及Paul Hobson对手稿的批判性阅读和语言修订。
本文由科尔多瓦国立大学（SECyT-UNC）Consolidar 2018-2021，Científica y Tecnológica（FONCyT），2015年第1314号（全部为M.C.S.）资助的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
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