Summary
Este artigo descreve um ensaio bem estabelecido e reprodutível de manchas de lectina para toda a preparação da retina do montagem e os protocolos necessários para a medição quantitativa dos parâmetros vasculares frequentemente alterados em retinopatias proliferativas e não proliferativas.
Abstract
Retinopatias são um grupo heterogêneo de doenças que afetam o tecido neurossensorial do olho. Caracterizam-se pela neurodegeneração, gliose e uma mudança progressiva na função e estrutura vascular. Embora o início das retinopatias seja caracterizado por distúrbios sutis na percepção visual, as modificações no plexo vascular são os primeiros sinais detectados pelos médicos. A ausência ou presença de neovascularização determina se a retinopatia é classificada como não proliferativa (NPDR) ou proliferativa (PDR). Nesse sentido, vários modelos animais tentaram imitar características vasculares específicas de cada estágio para determinar os mecanismos subjacentes envolvidos em alterações de endotélio, morte neuronal e outros eventos que ocorrem na retina. Neste artigo, forneceremos uma descrição completa dos procedimentos necessários para a medição dos parâmetros vasculares da retina em adultos e camundongos de nascimento precoce no dia do pós-natal (P)17. Detalharemos os protocolos para a realização de coloração vascular de retina com Isolectina GSA-IB4 em montagens inteiras para visualização microscópica posterior. As principais etapas para o processamento de imagens com o software Image J Fiji também são fornecidas, portanto, os leitores poderão medir a densidade, diâmetro e tortuosidade do vaso, ramificações vasculares, bem como áreas avasculares e neovasculares. Essas ferramentas são altamente úteis para avaliar e quantificar alterações vasculares em retinopatias não proliferativas e proliferativas.
Introduction
Os olhos são nutridos por dois sistemas arterio-venosos: a vasculatura choroidal, uma rede vascular externa que irriga epitélio pigmentado da retina e fotorreceptores; e a vasculatura neuro-retina que irrigam a camada de células gânglios e a camada nuclear interna da retina1. A vasculatura da retina é uma rede organizada de vasos que fornecem nutrientes e oxigênio para as células da retina e colhem resíduos para garantir a transdução adequada da sinalização visual. Esta vasculatura tem algumas características distintas, incluindo: a falta de inervação autônoma, a regulação do tom vascular por mecanismos intrínsecos de retina e a posse de uma complexa barreira retina-sangue2. Portanto, a vasculatura da retina tem sido o foco de muitos pesquisadores que estudaram extensivamente não só a vasculogênese durante o desenvolvimento, mas também as alterações e a angiogênese patológica que esses vasos sofrem em doenças3. As alterações vasculares mais comuns observadas nas retinopatias são dilatação de vasos, neovascularização, perda de arborização vascular e deformação dos vasos principais da retina, o que os torna mais ziggaggy4,5,6. Uma ou mais das alterações descritas são os primeiros sinais a serem detectados pelos médicos. A visualização vascular fornece um método de triagem rápido, não invasivo e barato7. O extenso estudo das alterações observadas na árvore vascular determinará se a retinopatia não é proliferativa ou proliferativa e o tratamento posterior. As retinopatias não proliferativas podem manifestar-se com morfologia vascular aberrante, diminuição da densidade vascular, capilares acelulares, pericítes de morte, edema macular, entre outros. Além disso, as retinopatias proliferativas também desenvolvem maior permeabilidade vascular, remodelagem extracelular e formação de tufos vasculares em direção à cavidade vítrea que facilmente quebra ou induz o descolamento da retina8.
Uma vez detectada, a retinopatia pode ser monitorada através de suas alterações vasculares9,10. A progressão da patologia pode ser acompanhada pelas mudanças estruturais dos vasos, que definem claramente os estágios da doença11. A quantificação de alterações vasculares nesses modelos permitiu correlacionar alterações de vasos e morte neuronal e testar terapias farmacológicas para pacientes em diferentes fases da doença.
À luz das afirmações acima, consideramos que o reconhecimento e quantificação das alterações vasculares são fundamentais nos estudos de retinopatias. Neste trabalho, mostraremos como medir diferentes parâmetros vasculares. Para isso, empregaremos dois modelos animais. Um deles é o modelo de retinopatia induzido pelo oxigênio12, que imita a Retinopatia da Prematuridade e alguns aspectos da Retinopatia Diabética Proliferativa13,14. Neste modelo, mediremos áreas avasculares, áreas neovasculares e a dilatação e tortuosidade dos principais vasos. Em nosso laboratório, foi desenvolvido um modelo de camundongos da Síndrome Metabólica (MetS), que induz uma retinopatia não proliferativa15. Aqui, vamos avaliar a densidade vascular e ramificações.
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Protocol
Os camundongos C57BL/6J foram manuseados de acordo com as diretrizes da Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão. Os procedimentos experimentais foram desenhados e aprovados pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (CICUAL) da Faculdade de Ciências Químicas da Universidade Nacional de Córdoba (Res. HCD 1216/18).
1. Preparação de soluções tampão e reagentes
- Preparação de 1x salina tampão fosfato (PBS): Adicionar 8 g de cloreto de sódio (NaCl), 0,2 g de cloreto de potássio (KCl), 14,4 g de dissódio-hidrogênio-1 dihidrato fosfato (Na2HPO4 2H2O) e 0,24 g de fosfato de potássio-dihidrogênio (KH2PO4) a 800 mL de água destilada. Mexa a solução até a dissolução completa dos sais. Ajuste o pH para 7,4 com ácido cloreto (HCl) e ajuste o volume para 1 L com água destilada adicional. Filtre a solução e armazene-a a 4 °C.
- Preparação de 4% paraformaldeído (PFA): Adicionar 40 g de PFA sólido a 800 mL de PBS recém-preparado. Mexa a solução em uma placa de aquecimento a uma temperatura constante de 60 °C. Adicione 1 M de hidróxido de sódio (NaOH) até que o PFA esteja completamente dissolvido, verificando se o pH é mantido em uma faixa de 7,2-7,4. Cubra o volume para 1.000 mL com PBS e misture. Desligue a placa de aquecimento e filtre a solução quando sua temperatura estiver abaixo de 35 °C. Armazene a solução a 4 °C por até 3 dias.
ATENÇÃO: O PFA é prejudicial se engolido ou se inalado e é provavelmente um composto mutagênico. Use luvas e máscara facial durante todo o processo e trabalhe em uma cabine de segurança. - Preparação de 1x Soro fisiológico tris-tampão (TBS): Adicionar 6,1 g de Tris e 9 g de NaCl a 800 mL de água destilada. Mexa a solução até a dissolução completa dos sais. Ajuste o pH para 7,4 com HCl e ajuste o volume para 1 L com água destilada adicional. Filtre a solução e armazene-a a 4 °C.
- Preparação de TBS- 0,1% Triton X-100: Adicione 0,1 mL de TritonX-100 a 100 mL de TBS. Misture suavemente e armazene-o a 4 °C por até 1 semana.
NOTA: Como Triton é um detergente muito denso, corte ligeiramente o terminal da ponta para melhor pipetação. - Preparação de TBS-5%-Bovine Serum Albumin (BSA) -0,1% Triton-X-100: Pese 5 g de BSA e adicione TBS- solução triton X-100 de 0,1% até um volume final de 100 mL. Mexa delicadamente. Alíquota e loja a -20 °C por até 2 meses.
- Isolectina GSA-IB4 Alexa fluor-488 conjugado (Isolectina GSA-IB4): Peso 36,75 mg de dihidrato de cloreto de cálcio (CaCl2·2H2O) e adicioná-lo a 500 mL de PBS recém-preparado. Mexa a solução com uma barra de mexida. Pipeta 500 μL da solução de CaCl2/PBS e adicioná-lo ao frasco contendo 500 μg de isolectina liofilizada GSA-IB4 em pó. Misture suavemente e aliquot a solução em tubos de 0,5 mL. Armazene-os a -20 °C protegidos contra a luz.
- Poli (álcool vinil) em glicerol/Tris: Pesar 2,4 g de Poly (álcool vinil), adicionar 6 g de glicerol e mexer suavemente. Em seguida, adicione 6 mL de água e continue mexendo por várias horas em temperatura ambiente. Adicione 12 mL de solução pré-aquecida de 0,2 M Tris (pH: 8,5) e aqueça a uma temperatura constante de 50 °C por 10 minutos e misture ocasionalmente. Por fim, centrifufique a solução a 5.000 x g por 15 min para esclarecimentos.
NOTA: Deixe a solução esfriar à temperatura ambiente, aliquot-la e armazená-la a -20 °C.
2. Mancha de lectina fluorescente
- Após o sacrifício de camundongos por inalação de dióxido de carbono (CO2), enuclear os olhos com tesoura16. Fixar os olhos enucleados com PFA de 4% recém-preparado para 1 h em temperatura ambiente (RT).
NOTA: A fixação também pode ser realizada incubando os olhos em 4% PFA durante a noite (ON) a 4 °C. Os camundongos foram sacrificados de acordo com as diretrizes da Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (CICUAL) da Faculdade de Ciências Químicas da Universidade Nacional de Córdoba (Res. HCD 1216/18). - Sob o microscópio dissecando, remova as córneas com tesouras cortando ao longo do limbus e dissecando toda a retina. Descarte o segmento anterior do olho e, em seguida, separe a retina do RPE-Choroid.
NOTA: Certifique-se de remover os detritos restantes e os vasos hialoides da retina com fórceps. - Coloque as retinas em tubos de 200 μL. Em seguida, bloqueie e permeabilize as retinas em 100 μL de solução salina tamponada tris (TBS) contendo 5% de Albumina de soro bovino (BSA) e 0,1% Triton-X-100 durante 6h a 4 °C com agitação suave no agitador.
NOTA: Esta etapa pode ser realizada por 2 h na RT. - Em seguida, inverta o tubo para colocar a retina na tampa e remova a solução de bloqueio com uma pipeta.
- Adicione 100 μL da solução contendo 0,01 μg/μL de Isolectina GSA-IB4 (GSA-IB4). Enrole os tubos com papel alumínio para proteger as amostras da luz. Incubar as retinas com a solução de lectina ON a 4 °C ou por 2 h no RT com agitação suave no agitador.
- Lave a retina com 100 μL de TBS contendo 0,1% Triton-X-100 por 20 min com agitação suave no agitador. Para uma lavagem adequada, coloque a retina na tampa do tubo invertendo-a. Volte o tubo para sua posição de pé e remova o meio restante no recipiente. Repita este passo três vezes.
- Coloque a retina em um slide e adicione uma gota de PBS. Sob o microscópio dissecando, realize quatro cortes igualmente distantes das bordas da retina em direção ao nervo óptico.
- Para desdobrar as pétalas da retina, use fórceps ou pequenos pedaços de papel filtro. Certifique-se de que o lado fotorreceptor está virado para baixo.
- Remova o PBS restante do slide com papel filtro. Em seguida, adicione um meio de montagem (poly(álcool vinil) em glicerol/tris) e cubralip. Deixe secar por 1h no RT.
- Armazene slides a 4 °C protegidos contra a luz.
NOTA: As retinas também podem ser armazenadas em PBS a 4 °C até a visualização da microscopia confocal.
3. Visualização de microscopia confocal e aquisição de microfotografia
- Antes da visualização, incubar os slides por 10 minutos em RT cobertos de luz.
- No microscópio confocal, coloque o slide na placa de frente para baixo.
- Concentre o plexo superior da vasculatura da retina e selecione uma área para iniciar a aquisição da imagem.
- Definir parâmetros gerais de laser no software: Comprimento de onda: 488 nm; Intensidade laser; HV; Deslocamento; Ganhar.
NOTA: A intensidade do laser, PMT, Offset e ganho podem variar dependendo das condições e do uso da lâmpada. As configurações ideais fornecem uma imagem clara dos vasos evitando a saturação na sensibilidade do tubo fotomultiplier para ter uma relação linear com o sinal de fluorescência. - Definir outros parâmetros de aquisição: Modo; Tamanho; Objetivo, sem zoom; Nada de Kalman. Tamanho do passo.
NOTA: Condições idênticas de aquisição devem ser utilizadas para a imagem do controle e amostras experimentais. - Coloque as coordenadas no eixo x e y: Escaneie a retina em foco 2x. Se a área mostrar vasos, selecione-o clicando duas vezes na área, a fim de marcá-la para posterior aquisição de imagens.
NOTA: É altamente recomendável selecionar a área da retina seguindo o plexo vascular superior, pois a fluorescência de vasos maiores é maior. - Mova-se na grade para uma praça vizinha, concentre a retina e selecione a área se ela corresponder. Repita esta etapa até que a área selecionada compor toda a retina.
- Selecione uma área e defina as coordenadas no eixo z para definir a extensão da espessura para digitalizar. Para isso, visualize a retina em foco 2x; com o micrômetro, vá até a parte superior da retina e clique em Definir na posição Iniciar. Em seguida, mova-se para a parte inferior da retina e clique em Definir na posição Final.
- Repita o passo 3.8 em cada área selecionada na grade.
NOTA: Para verificar a área digitalizada em profundidade, pressione Ir na posição Iniciar. Se os vasos ainda estiverem visualizados, reajuste a posição movendo o micrômetro e clique em Definir. Repita o processo na posição Final. - Inicialize a digitalização automatizada.
- Uma vez que o processo de digitalização termine, abra a imagem.
- Selecione o formato Série para gravar a imagem como um Mosaico e salve-a com a extensão preferida. Finalmente, a imagem costurada será mostrada na tela.
4. Processamento de imagens
- No software ImageJ FIJI, vá para a Barra de Menu e clique em Arquivo > Aberto. Selecione a imagem para processar. Na janela Opções de Importação de Formatos Biológicos , selecione os metadados de Exibição OME-XML e clique em OK.
NOTA: Imagens com nome semelhante devem ser salvas em pastas separadas. - Na janela OME Metadata , procure as informações do tamanho do pixel, nomeadas como PhysicalSizeX, PhysicalSizeY e PhysicalSizeZ. Copie esses dados.
- Para calibração de imagem, vá até a Barra de Menu e selecione Propriedades > de imagem. Copie as informações da imagem na etapa 4.2 e clique em OK. A imagem abre como uma janela com várias fotos, onde cada uma representa as microfotografias adquiridas em um eixo z.
- Atribua uma lut preferencial à imagem, a fim de enviar uma cor para o rótulo fluorescente. Para fazer isso, vá até a Barra de Menu e clique no ícone LUT .
- Para visualizar todas as pilhas em uma única imagem, vá até a Barra de Menu e selecione Image > Stacks > Z Project.
- Na janela Projeção Z exibida, selecione todas as pilhas onde os vasos são visualizados. No Tipo de Projeção, escolha intensidade média e clique em OK.
NOTA: O resultado da soma das pilhas será mostrado em uma nova imagem chamada AVG (nome da imagem). - Ajuste o brilho e o contraste na imagem resultante para reduzir o fundo e destacar os vasos. Vá até a Barra de Menu e clique em Imagem> Ajuste> Brilho/Contraste. Nas janelas B e C mova as barras até que uma melhor intensidade seja observada. Clique em Aplicar e salvar as alterações.
- Copiar os parâmetros selecionados para brilho/contraste; estes devem ser idênticos para todas as imagens.
- Antes da quantificação da imagem, defina os parâmetros que serão medidos. Na barra de menu, vá para Analisar > definir medidas. Nos procedimentos aqui descritos, será necessário obter Área e Perímetro (isso também é necessário para medir distâncias). Clique em OK.
- Baixe o plugin necessário para quantificação da densidade do vaso17 e siga as instruções de instalações fornecidas pelo plugin.
- Continue com a quantificação de um parâmetro vascular específico.
5. Quantificação de áreas avasculares
- Na Barra de Menu, escolha a Ferramenta varinha. Selecione a área de retina que não tem vasos.
NOTA: Áreas maiores ou menores podem ser selecionadas dependendo da tolerância. Para ajustar a tolerância, clique duas vezes no ícone da ferramenta varinha. Modo empregado: Legacy. - Pressione a letra T no teclado para gravar a área selecionada no ROI Manager. Repita as etapas 5.1 e 5.2 com todas as áreas avasculares da retina.
- Clique em Measure no gerenciador de ROI para obter as informações da área avascular. O programa exibirá uma nova janela com as informações necessárias. Copie os dados em outro programa ou salve o arquivo.
NOTA: Em algumas imagens, pode-se preferir selecionar as áreas avasculares manualmente. Neste caso, escolha a ferramenta Seleção de Polígono, desenhe distâncias curtas ao redor da área avascular e clique na imagem quando uma nova distância está prestes a começar. Feche a área selecionada clicando no primeiro ponto. - Repita as etapas 5.1, 5.2 e 5.3 para medir a área total da retina.
- Calcule a área avascular da retina como a soma de todas as áreas avasculares medidas divididas pela área total da retina.
6. Quantificação de áreas neovasculares
- Na Barra de Menu, escolha a ferramenta Varinha.
- Amplie a imagem para visualizar melhor os neovexes. Selecione os neovessels um a um com a ferramenta varinha.
NOTA: Ajuste a tolerância não superior a 20 para garantir a seleção de um único neovessel. Esse nível de tolerância deve permanecer constante durante todas as quantificações de imagem. - Pressione a letra T no teclado para gravar a área selecionada no ROI Manager. Repita as etapas 6.1 e 6.2 com todas as áreas neovasculares da retina.
- Clique em Medir no gerenciador de ROI para obter os dados da área. O programa exibirá uma nova janela com as informações necessárias. Copie os dados em outro programa ou salve o arquivo.
- Repita as etapas 6.1, 6.2 e 6.3 para quantificar a área total da retina.
- Calcule a área neovascular da retina como a soma de todas as áreas dos neovessels medidos divididas pela área total da retina.
7. Quantificação do diâmetro do vaso
- Na barra de menu, selecione a ferramenta linha reta.
- Amplie a imagem para visualizar melhor a parede do vaso. Realize três linhas transversais para o navio principal antes do primeiro ramo. Isso deve ser feito desenhando uma linha do limite de uma parede do vaso para o oposto.
NOTA: A linha deve ser perfeitamente perpendicular ao vaso da parede para evitar erros de quantificação. - Pressione a letra T no teclado para gravar a área selecionada no ROI Manager. Repita as etapas 7.1 e 7.2 em todos os vasos que precisam ser quantificados.
- Clique em Medir no gerenciador de ROI para obter os dados de distância. O programa exibirá uma nova janela com as informações necessárias. Copie os dados em outro programa ou salve o arquivo.
8. Quantificação da tortuosidade do vaso
- Na barra de menu, clique no ícone de ferramenta de linha reta com o botão direito do mouse e selecione Linha Segmentada ou Linha à Mão Livre. Desenhe uma linha dentro do vaso do nervo óptico até a primeira ramificação do vaso após a forma vascular.
NOTA: A linha deve seguir a forma vascular para evitar erros de quantificação. - Pressione a letra T no teclado para gravar a área selecionada no ROI Manager.
- Na barra de menu, selecione a ferramenta linha reta. Desenhe uma linha do nervo óptico até a primeira ramificação do vaso.
- Pressione a letra T no teclado para gravar a área selecionada no ROI Manager.
- Clique em Medir no Gerenciador de ROI para obter os dados de distâncias. O programa exibirá uma nova janela com as informações necessárias. Copie os dados em outro programa ou salve o arquivo.
- Calcular o índice de tortuosidade da seguinte forma: distância obtida com linha segmentada dividida pela distância obtida com linha reta.
9. Quantificação de ramificações vasculares
- Com a Ferramenta Oval da Barra de Menus, defina uma área aplicada igualmente a todas as condições experimentais. A área selecionada deve ser um círculo concêntrico desenhado em torno do nervo óptico.
- Pressione a letra T no teclado para gravar a área selecionada no ROI Manager.
NOTA: Neste caso, é recomendável salvar o ROI, pois a quantificação é lenta e o ROI idêntico deve ser usado em todas as imagens. Para fazer isso, no ROI Manager clique em MAIS > Salvar. - Manualmente, conte o número de ramos primários decorrentes de vasos principais dentro da área de seleção.
- Repita as etapas 9.2 e 9.3 em áreas vizinhas, mantendo os critérios ópticos de nervos-periferia.
10. Quantificação da densidade vascular
- Transforme a imagem no modo de 8 bits.
- Vá para Plugins na Barra de Menu, selecione Análise de Vasos > Densidade Vascular.
- Defina uma área com a ferramenta Quadrado da Barra de Menu, onde a densidade do vaso precisa ser medida. Clique em OK.
- O programa exibirá uma nova janela com as informações necessárias. Copie os dados em outro programa ou salve o arquivo.
- Repetir as etapas 10.2, 10.3 e 10.4 nas áreas vizinhas, mantendo o ROI, mas colocando-o nove vezes abrangendo a periferia e o centro de toda a retina.
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Representative Results
Como descrito na seção de protocolo, a partir de um único ensaio de coloração fluorescente você pode obter a morfologia vascular e avaliar vários parâmetros de interesse quantitativamente. A busca de uma alteração específica dependerá do tipo de retinopatia estudada. Neste artigo, áreas avasculares e neovasculares, tortuosidade e dilatação foram avaliadas em um modelo de rato de retinopatia proliferativa, enquanto o ramificação vascular e a densidade foram analisados em um modelo de camundongos MetS, o que induz uma retinopatia não proliferativa.
No primeiro exemplo experimental, foi empregado o modelo de rato de Retinopatia Induzida por Oxigênio (OIR), que se assemelha à Retinopatia da Prematuridade e algumas características do estágio proliferativo da Retinopatia Diabética. Nesse modelo, as ninhadas são mantidas com sua mãe amamentando em uma câmara hiperxica do dia pós-natal (P)7 a P1218. Injeções intravitreal foram realizadas em P12 para determinar a eficácia de uma droga como antiangiogênica (condição denominada tratamento). Os camundongos foram sacrificados em P17, o ponto de tempo da formação máxima de neovexões19. Ratos injetados com veículo foram empregados como controle. Ambas as amostras foram fixadas e manchadas com Isolectina GSA-IB4 juntas. Após a aquisição confocal, as imagens foram analisadas com o software ImageJ FIJI, conforme indicado acima. Com o módulo de costura integrado ao Microscópio Confocal, toda a montagem foi observada como uma imagem única (Figura 1). Em P17, é possível observar a vasculatura hialoide, um sistema vascular transitório essencial durante a vida intrauterina (Figura 1, setas brancas)20.
Como consequência do excesso de oxigênio na câmara hiperóxica, os camundongos OIR prendem o desenvolvimento vascular fisiológico e geram áreas avasculares na retina. Em seguida, as áreas avasculares são definidas como as zonas que carecem de vasos sanguíneos da retina (Figura 2). A partir das imagens adquiridas, as áreas avasculares podem ser quantificadas como a soma das regiões sem vasos divididos pela área total da retina. Áreas com danos mecânicos também mostram ausência de embarcações. Para identificar áreas danificadas, analise a integridade das camadas neuronais com a mancha de Hoechst.
As áreas avasculares da retina evitam a entrega de oxigênio e, portanto, uma forte resposta pró-angiogênica é definida, induzindo a neovascularização16. Neovessels são embarcações de pequeno calibre que se originam de um vaso pré-existente do plexo vascular superior. Sua estrutura é desorganizada, portanto, os neovexes crescem como tufos em direção à cavidade vítrea21. Calculamos a área ocupada pelos tufos dos neovexes quantificando a área neovascular da retina dividida pela área total da retina (Figura 3). Como a forma e o tamanho dos neovexes são variáveis, ocasionalmente eles podem se parecer com detritos e artefatos. Para distinguir neovexes, verifique se o tufo cresce de um vaso maduro.
A dilatação vascular e a tortuosidade são outras duas alterações frequentes, que têm efeitos negativos na biologia vascular, pois produzem circulação sanguínea turbulenta. Para a análise da dilatação, medimos o diâmetro dos vasos principais em três alturas antes do primeiro ramo22,23 (Figura 4). Os pesquisadores devem definir uma distância predeterminada para medir o diâmetro do vaso, a fim de reduzir a variabilidade entre os resultados. Idealmente, o ponto mais distante do nervo óptico deve ser em torno de 300 μm. Sugerimos a realização da análise e, posteriormente, tomar uma média de pelo menos seis ratos por condição.
Quanto à tortuosidade, medimos a distância percorrida pelos principais vasos seguindo sua forma no que diz respeito à distância reta entre o nervo óptico e o primeiro ponto de ramificação24 (Figura 5). Como podemos ver na imagem, há heterogeneidade na sinuosidade dos principais vasos. Para obter um resultado representativo, não é necessário quantificar não menos que seis camundongos por condição.
Os parâmetros mais recentes, ramificação vascular e densidade, foram analisados no modelo MetS que apresenta retinopatia não proliferativa. No MetS, tanto lipídios quanto desarranjos de carboidratos estão associados a pericítes de retina e disfunção endotelial e morte, levando à formação de capilares acelulares ou uma diminuição da ramificação vascular25. Em nosso modelo, os camundongos ApoE-KO foram alimentados com frutose adicionados à água potável, com uma concentração de 10% c/v. Os animais de controle acabaram de receber água da torneira. Após 4 meses de dieta, os camundongos foram sacrificados, e as retinas processadas como indicado anteriormente. Para a medição da ramificação vascular, definimos a área de quantificação desenhando um círculo concêntrico, e então contamos, um a um, os ramos primários decorrentes de um vaso central principal (Figura 6).
A partir das imagens adquiridas, a densidade vascular foi quantificada como área ocupada por vasos divididos pela área do ROI (um quadrado de 0,015 mm2, ver achatado na Figura 7), que foi posicionado em diferentes locais em cada microfotógrafo, como foi explicado na seção de protocolo. Evite quantificar áreas com danos mecânicos (Figura 7, setas brancas). Se houver mais de duas áreas com punções, a retina deve ser descartada.
Figura 1: Coloração vascular de retinas inteiras rotuladas com Isolectina GSA-IB4: Imagens confocal representativas de retinas de camundongos P17 OIR injetadas com veículo ou tratamento em P12. A coloração fluorescente foi realizada em retinas de montagem inteira com Isolectina GSA-IB4 Alexa 488 de acordo com o protocolo. São indicadas áreas avasculares (AV) e áreas neovasculares (NV). Barra de escala: 500 μm. Flechas brancas mostram a vasculatura higalóide remanescente. As setas amarelas mostram áreas de varredura incompletas durante a aquisição de imagens confocal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Quantificação de áreas avasculares: (A) Imagens representativas de retinas de montagem inteira em P17 mostrando manchas vasculares GSA-IB4 em camundongos com tratamento de OIR e OIR. As áreas com vaso-obliteração são indicadas em amarelo. Barra de escala: 500 μm. (B) A área de AV (%) foi quantificada como a razão da área avascular central para toda a área da retina. O teste t não-de duas caudas foi utilizado para comparação estatística. Dados apresentados como média ± SEM. *** p < 0,001. Pelo menos seis animais foram empregados para cada condição no tempo de sobrevivência examinado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação de áreas neovasculares: (A) Imagens representativas de retinas inteiras de montagem em P17 mostrando manchas vasculares GSA-IB4 em camundongos com over e oir-tratamento. As áreas com neovascularização são indicadas em branco. Barra de escala: 500 μm. (B) A área de NV (%) foi quantificada como a razão da área ocupada por neovessels para toda a área da retina. O teste t não-de duas caudas foi utilizado para comparação estatística. Dados apresentados como média ± SEM. *** p < 0,001. Pelo menos seis animais foram empregados para cada condição no tempo de sobrevivência examinado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Quantificação da dilatação vascular: (A) Imagens representativas de retinas de montagem inteira em P17 mostrando coloração vascular GSA-IB4 em camundongos com tratamento de OIR e OIR. Painéis esquerdos: ROIs selecionados para quantificação. Painéis certos: zoom dos ROIs, mostrando linhas retas realizadas em um vaso principal para medir o diâmetro do vaso. Três linhas foram rastreadas transversalmente até a nave e médias. Barra de escala: 100 μm. (B) O diâmetro do vaso (%) foi quantificado como o diâmetro médio medido nos principais vasos da retina. O teste t não-de duas caudas foi utilizado para comparação estatística. Dados apresentados como média ± MEI. *p < 0,05. Pelo menos seis animais foram empregados para cada condição no tempo de sobrevivência examinado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Determinação do índice de tortuosidade: (A) Imagens representativas de retinas de montagem inteira em P17 mostrando coloração vascular GSA-IB4 em camundongos com over e tratamento de OIR. Painéis esquerdos: ROIs selecionados para quantificação. Painéis centrais: zoom dos ROIs, mostrando linhas segmentadas traçadas em um vaso principal do nervo óptico até o primeiro ponto de ramificação. Painéis direito: zoom dos ROIs, mostrando linhas retas traçadas em um vaso principal do nervo óptico até o primeiro ponto de ramificação. Barra de escala: 100 μm. (B) O índice de tortuosidade foi obtido dividindo a distância da linha segmentada à distância da linha reta. O teste t não-de duas caudas foi utilizado para comparação estatística. Os dados apresentados como média ± SEM. ns, não significativas. Pelo menos seis animais foram empregados para cada condição no tempo de sobrevivência examinado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Quantificação de ramificações vasculares: (A) Imagens representativas de retinas de montagem inteira mostrando manchas vasculares Isolectina GSA-IB4 em camundongos alimentados com ApoE-KO e ApoE-KO + frutose. As áreas de quantificação circular foram definidas em amarelo. Barra de escala: 100 μm, ampliação de 100x. (B) O número de ramos foi quantificado como o número de ramos primários de um vaso principal, desde o nervo óptico até a periferia. O teste t não-de duas caudas foi utilizado para comparação estatística. Os dados apresentados como média ± SEM. ns, não significativas. Pelo menos seis animais foram empregados para cada condição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Quantificação da densidade vascular: (A) Imagens representativas de retinas de montagem inteira mostrando manchas vasculares Isolectina GSA-IB4 em camundongos alimentados com ApoE-KO e ApoE-KO + frutose. A área de quantificação quadrada de 0,015 mm2 foi definida em amarelo. Barra de escala: 100 μm, ampliação de 100x. (B) A densidade vascular foi quantificada como a razão da área vascular para a área total do ROI, que foi posicionada nove vezes em diferentes locais em cada microfotografia. Setas brancas mostram áreas com danos mecânicos. O teste t não-de duas caudas foi utilizado para comparação estatística. Os dados apresentados como média ± SEM. ns, não significativas. Pelo menos seis animais foram empregados para cada condição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Modelos animais de retinopatias são ferramentas poderosas para estudar o desenvolvimento vascular, remodelação ou angiogênese patológica. O sucesso desses estudos no campo conta com o fácil acesso ao tecido que permite realizar uma ampla variedade de técnicas, fornecendo dados de camundongos in vivo e pós-morte26,27. Além disso, grande correlação tem sido encontrada entre estudos in vivo e análises clínicas, proporcionando sólida rastreabilidade e confiabilidade a esses modelos28. Neste artigo, apresentamos uma descrição simples e robusta das etapas para caracterizar a rede vascular em modelos de camundongos de doenças vasculares da retina. Na literatura, os leitores encontrarão outros parâmetros possíveis para medir e abordagens paralelas para quantificar os selecionados aqui. Os protocolos compilados têm muitos benefícios em relação aos outros porque são reprodutíveis, e eles apenas exigem um software livre para realizar a análise (Image J Fiji).
Além disso, esses protocolos são fáceis de serem realizados por alunos que não possuem amplo conhecimento sobre o programa e a maioria das medidas não precisa de plugins adicionais (exceto de densidade vascular).
A técnica de coloração de extração e fluorescência da amostra é simples e breve29. É muito importante trabalhar com retinas frescas, embora possam ser armazenadas a 4 °C em PBS com inibidores de crescimento bacteriano. Como o tecido é fino e macio, então amostras antigas frequentemente quebram durante a incubação ou ao desdobrar a amostra antes de montar. Além disso, a fixação excessiva com 4% de PFA torna a retina excessivamente rígida e frágil, mas isso não afeta a coloração de lectina. A coloração de Isolectina GSA-IB4 permite visualizar a rede vascular completa em cada camada, incluindo neovessels e células endoteliais proliferantes. Outros marcadores, como o CD 31, requer a incubação da amostra com anticorpos concentrados e eles têm mais fundo. Por outro lado, na angiografia, o corante fluorescente tende a difundir para fora dos vasos, o que aumenta a variabilidade no calibre do vaso e quantificação da tortuosidade. Uma desvantagem do Isolectin GSA-IB4 é que ele também pode rotular células microgliais30. Deve-se tomar cuidado ao realizar injeções intravitais ou outros procedimentos experimentais que induzam a infiltração excessiva porque as células microgliais podem formar aglomerações.
A aquisição de imagens poderia ser realizada com qualquer microscópio confocal. O uso de um casal de placas motorizadas em um software que inclui o módulo Stitching fornecerá visualização completa de toda a retina montada em uma única imagem. Ao selecionar a área da retina, certifique-se de que todos os extremos da amostra estão incluídos, caso contrário, a foto estará incompleta (Figura 1, setas amarelas). Isso não é muito relevante no modelo de camundongos de OIR, como exemplo, porque alterações vasculares estão próximas do nervo óptico. Enquanto no modelo de rato de OIR, esse erro pode levar a quantificação imprecisa, já que as áreas avasculares e neovasculares estão ao lado do limbus. Outra possibilidade é fazer microfotogramas individuais de retina. O usuário pode organizá-los mais tarde como um quebra-cabeça com um software adequado. Não é recomendável usar microscópio de epifluorescência, especialmente quando se analisa ramificações, pois os vasos brotam por toda a espessura da retina e alguns vasos não serão detectados em uma pilha de z somente z.
Durante o processamento de imagens com imageJ FIJI, recomenda-se não atualizar o software até que todas as imagens sejam quantificadas, a fim de manter condições idênticas no software. A calibração das imagens (atribuição do tamanho do pixel em mícrons) é um passo crítico, pois esses protocolos implicam a quantificação de distâncias e áreas. Quando familiarizado com o programa, o usuário pode explorar outras ferramentas para selecionar o neovascular e a área avascular, além da ferramenta varinha. A ferramenta de seleção de polígonos é particularmente útil para medir áreas avasculares que foram cortadas em duas partes na etapa de montagem. Outros pesquisadores criaram plugins específicos para automatizar a seleção de neovessels com base na intensidade de fluorescência dessas estruturas. Esses métodos são mais rápidos e menos trabalhosos, embora seja recomendável verificar se pequenos neovexões menos brilhantes foram selecionados antes da quantificação31. As áreas de neovessels fluorescem mais intensamente do que os vasos normais circundantes. A ferramenta Varinha Mágica seleciona áreas que são igualmente coloridas e a tolerância determina o quão semelhantes são os pixels selecionados. Se um neovessel é de intensidade semelhante aos vasos normais, a tolerância pode ser ajustada para baixo para aumentar a sensibilidade a diferenças de intensidade sutis. Embora a seleção de neovessel em cada amostra será realizada com um limiar idêntico, alguns neovessels são caracterizados por uma pequena intensidade de fluorescência. Neste caso, será necessária uma menor tolerância para a seleção adequada.
Tortuosidade e dilatação são medidas de distância. Um estudo abrangente da árvore vascular é útil para selecionar vasos de tipo idêntico (artérias ou veias) e calibre. Medimos a dilatação em navios a três alturas, como mostrado na Figura 4. O ângulo da seleção reta em relação à parede do vaso é outro ponto relevante a ser seguido. Isso deve ser o mais próximo possível de 90° para evitar possíveis erros. Ao desenhar a linha reta, os usuários podem usar a ferramenta zoom para se aproximar do vaso de interesse.
O ramificação vascular também pode ser medido em duas ou mais áreas de quantificação de diferentes alturas, se desejar. Neste caso, os pesquisadores devem conservar a região da retina analisada (lado central, médio ou periférico do nervo óptico). Embora o ramificamento seja alterado em vários modelos animais de retinopatia, os estágios iniciais da retinopatia associada ao MetS apresentado aqui ainda não mostram tais mudanças15. Para estudos extensivos em capilares de retina do plexo intermediário e profundo e brotação de vasos, métodos computacionais 3D fornecem dados valiosos de variações sutis na morfologia vascular e rede32. Por fim, a densidade vascular é determinada pela área ocupada pelos vasos em relação à área total de um ROI selecionado. A medição deste parâmetro requer o uso de um plugin e uma versão actualizada do ImageJ FIJI, onde as ferramentas Auto Threshold e Geometry to Distance Map devem estar disponíveis. Apesar dessas etapas adicionais, o plugin é fácil de usar, reprodutível e confiável. Para a medição da densidade vascular, foi escolhido um ROI de 0,015 mm2 , a fim de fazer dez medições da intensidade da fluorescência em diferentes regiões da retina. Esse tamanho nos permitiu cobrir toda a foto, obtendo assim um valor médio mais representativo e seu desvio em cada retina.
No geral, apesar de essas coleções de métodos não serem automatizadas e exigirem seleção manual dos parâmetros, elas são capazes de fornecer dados quantitativos e rigorosos das retinas. A principal limitação em relação aos protocolos acima apresentados para medições vasculares baseia-se na variabilidade inter-examinadora ao analisar a mesma imagem. Para minimizar esse viés, é importante pré-estabelecer o cenário geral como limites de parede de vasos, identificação de áreas avasculares e neovessels, e também critérios de exclusão de tecidos danificados. Quanto à tortuosidade do vaso, é necessário um ponto de partida acordado próximo ao nervo óptico. Para usuários iniciantes, é altamente recomendável fazer uma média dos dados coletados por dois ou mais examinadores. Em usuários treinados, não foram encontradas diferenças significativas na medição de vários parâmetros, desde que a concordância nos critérios de quantificação permaneça constante. Da mesma forma, parâmetros adicionais podem ser adicionados aos protocolos listados, dependendo das alterações vasculares detectadas na retinopatia. Em retinopatias não proliferativas, a medição do número capilar acelular, pericítos migratórios, razão de pericítos /número de células endoteliais e permeabilidade da barreira da retina sanguínea são os parâmetros mais antigos alterados na vasculatura da retina333,34,35. Para modelos crônicos e retinopatias leves, é aconselhável incluir essas medidas adicionais. Um grande número de parâmetros medidos proporcionará uma paisagem mais fiel dos eventos que ocorrem na vasculatura. Em resumo, neste artigo, temos mostrado técnicas clássicas, bem estabelecidas e reprodutíveis para quantificar alguns dos parâmetros mais relevantes levados em conta na prática clínica.
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Disclosures
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Acknowledgments
Agradecemos a Carlos Mas, María Pilar Crespo e Cecilia Sampedro do CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) pela assistência em microscopia confocal, a Soledad Miró e Victoria Blanco para cuidados dedicados aos animais e Laura Gatica para assistência histológica. Agradecemos também a Victor Diaz (Pró-Secretário de Comunicação Institucional da FCQ) pela produção e edição de vídeo e Paul Hobson por sua leitura crítica e revisão linguística do manuscrito.
Este artigo foi financiado por subvenções da Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (todos para M.C.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
References
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