Summary
Este artículo describe un ensayo de tinción de lectina bien establecido y reproducible para las preparaciones retinianas de montaje completo y los protocolos necesarios para la medición cuantitativa de los parámetros vasculares frecuentemente alterados en las retinopatías proliferativas y no proliferativas.
Abstract
Las retinopatías son un grupo heterogéneo de enfermedades que afectan al tejido neurosensorial del ojo. Se caracterizan por neurodegeneración, gliosis y un cambio progresivo en la función y estructura vascular. Aunque el inicio de las retinopatías se caracteriza por alteraciones sutiles en la percepción visual, las modificaciones en el plexo vascular son los primeros signos detectados por los médicos. La ausencia o presencia de neovascularización determina si la retinopatía se clasifica como no proliferativa (NPDR) o proliferativa (PDR). En este sentido, varios modelos animales intentaron imitar características vasculares específicas de cada etapa para determinar los mecanismos subyacentes involucrados en las alteraciones del endotelio, la muerte neuronal y otros eventos que tienen lugar en la retina. En este artículo, proporcionaremos una descripción completa de los procedimientos necesarios para la medición de los parámetros vasculares de la retina en adultos y ratones de nacimiento prematuro en el día postnatal (P)17. Detallaremos los protocolos para llevar a cabo la tinción vascular retiniana con Isolectina GSA-IB4 en monturas enteras para su posterior visualización microscópica. También se proporcionan pasos clave para el procesamiento de imágenes con el software Image J Fiji, por lo tanto, los lectores podrán medir la densidad de los vasos, el diámetro y la tortuosidad, la ramificación vascular, así como las áreas avasculares y neovasculares. Estas herramientas son de gran ayuda para evaluar y cuantificar las alteraciones vasculares tanto en las retinopatías no proliferativas como en las proliferativas.
Introduction
Los ojos se nutren de dos sistemas arterio-venosos: la vasculatura coroidea, una red vascular externa que riega el epitelio pigmentado de la retina y los fotorreceptores; y la vasculatura neurorretiniana que irriga la capa de células ganglionares y la capa nuclear interna de la retina1. La vasculatura retiniana es una red organizada de vasos que suministran nutrientes y oxígeno a las células de la retina y cosechan productos de desecho para garantizar la transducción adecuada de la señalización visual. Esta vasculatura tiene algunas características distintivas, entre ellas: la falta de inervación autónoma, la regulación del tono vascular por mecanismos retinianos intrínsecos y la posesión de una compleja barrera retiniano-sanguínea2. Por ello, la vasculatura retiniana ha sido el foco de muchos investigadores que han estudiado ampliamente no solo la vasculogénesis durante el desarrollo, sino también las alteraciones y la angiogénesis patológica que sufren estos vasos en las enfermedades3. Los cambios vasculares más frecuentes observados en las retinopatías son la dilatación de los vasos, la neovascularización, la pérdida de arborización vascular y la deformación de los vasos principales de la retina, lo que los hace más ziggaggy4,5,6. Una o más de las alteraciones descritas son los primeros signos detectados por los médicos. La visualización vascular proporciona un método de detección rápido, no invasivo y económico7. El estudio exhaustivo de las alteraciones observadas en el árbol vascular determinará si la retinopatía es no proliferativa o proliferativa y el tratamiento posterior. Las retinopatías no proliferativas pueden manifestarse con morfología vascular aberrante, disminución de la densidad vascular, capilares acelulares, muerte de pericitos, edema macular, entre otros. Además, las retinopatías proliferativas también desarrollan una mayor permeabilidad vascular, remodelación extracelular y la formación de mechones vasculares hacia la cavidad vítrea que se descomponen o inducen fácilmente el desprendimiento de retina8.
Una vez detectada, la retinopatía puede ser monitorizada a través de sus cambios vasculares9,10. La progresión de la patología se puede seguir a través de los cambios estructurales de los vasos, que definen claramente las etapas de la enfermedad11. La cuantificación de las alteraciones vasculares en estos modelos permitió correlacionar los cambios de vasos y la muerte neuronal y probar terapias farmacológicas para pacientes en diferentes fases de la enfermedad.
A la luz de las afirmaciones anteriores, consideramos que el reconocimiento y cuantificación de las alteraciones vasculares son fundamentales en los estudios de retinopatías. En este trabajo, mostraremos cómo medir diferentes parámetros vasculares. Para ello, emplearemos dos modelos animales. Uno de ellos es el modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno12, que imita la retinopatía del prematuro y algunos aspectos de la retinopatía diabética proliferativa13,14. En este modelo, mediremos las áreas avasculares, las áreas neovasculares y la dilatación y tortuosidad de los vasos principales. En nuestro laboratorio se ha desarrollado un modelo de ratón con Síndrome Metabólico (SM), que induce una retinopatía no proliferativa15. Aquí, evaluaremos la densidad vascular y la ramificación.
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Protocol
Los ratones C57BL / 6J se manejaron de acuerdo con las pautas de la Declaración ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Los procedimientos experimentales fueron diseñados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUAL) de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Nacional de Córdoba (Res. HCD 1216/18).
1. Preparación de soluciones tampón y reactivos
- Preparación de 1x solución salina tampón de fosfato (PBS): Agregue 8 g de cloruro de sodio (NaCl), 0.2 g de cloruro de potasio (KCl), 14.4 g de dihidrato de hidrógeno-fosfato disódico (Na2HPO4 2H2O) y 0.24 g de fosfato de potasio-dihidrógeno (KH2PO4) a 800 ml de agua destilada. Revuelva la solución hasta la disolución completa de las sales. Ajuste el pH a 7.4 con ácido cloruro (HCl) y ajuste el volumen a 1 L con agua destilada adicional. Filtre la solución y guárdela a 4 °C.
- Preparación de paraformaldehído al 4% (PFA): Añadir 40 g de PFA sólido a 800 ml de PBS recién preparado. Revuelva la solución en una placa calefactora a una temperatura constante de 60 °C. Agregue 1 M de hidróxido de sodio (NaOH) hasta que el PFA se disuelva por completo, verificando que el pH se mantenga en un rango de 7.2-7.4. Recarga el volumen a 1.000 mL con PBS y mezcla. Apague la placa calefactora y filtre la solución cuando su temperatura sea inferior a 35 °C. Guarde la solución a 4 °C durante un máximo de 3 días.
PRECAUCIÓN: El PFA es dañino si se ingiere o si se inhala y es probablemente un compuesto mutagénico. Use guantes y mascarilla durante todo el proceso y trabaje en una cabina de seguridad. - Preparación de 1 solución salina tamponada con Tris (TBS): Agregue 6.1 g de Tris y 9 g de NaCl a 800 ml de agua destilada. Revuelva la solución hasta la disolución completa de las sales. Ajuste el pH a 7.4 con HCl y ajuste el volumen a 1 L con agua destilada adicional. Filtre la solución y guárdela a 4 °C.
- Preparación de TBS- 0.1% Triton X-100: Agregue 0.1 mL de TritonX-100 a 100 mL de TBS. Mezcle suavemente y guárdelo a 4 ° C durante un máximo de 1 semana.
NOTA: Como Tritón es un detergente muy denso, corte ligeramente el terminal de la punta para un mejor pipeteo. - Preparación de TBS-5%-Albúmina Sérica Bovina (BSA) -0.1% Tritón-X-100: Pesar 5 g de BSA y agregar TBS- 0.1% tritón X-100 solución hasta un volumen final de 100 mL. Revuelva suavemente. Alícuota y conservar a -20 °C durante un máximo de 2 meses.
- Isolectina GSA-IB4 Alexa fluor-488 conjugada (Isolectina GSA-IB4): Peso 36,75 mg de cloruro de calcio dihidratado (CaCl2·2H2O) y añadirlo a 500 mL de PBS recién preparado. Revuelva la solución con una barra de agitación. Pipetear 500 μL de la solución de CaCl2/PBS y añadirlo al vial que contiene 500 μg de polvo de isolectina GSA-IB4 liofilizada. Mezclar suavemente y alícuota la solución en tubos de 0,5 ml. Guárdelos a -20 °C protegidos de la luz.
- Poli(alcohol vinílico) en glicerol/Tris: Pesar 2,4 g de Poli(alcohol vinílico), añadir 6 g de glicerol y remover suavemente. Luego, agregue 6 ml de agua y continúe revolviendo durante varias horas a temperatura ambiente. Añadir 12 ml de solución Tris de 0,2 M precalentada (pH: 8,5) y calentar a una temperatura constante de 50 °C durante 10 min y mezclar ocasionalmente. Finalmente, centrifugar la solución a 5.000 x g durante 15 min para su clarificación.
NOTA: Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente, alícuota y guárdela a -20 °C.
2. Tinción fluorescente de lectina
- Tras el sacrificio de ratones por inhalación de dióxido de carbono (CO2), enucle los ojos con tijeras16. Fije los ojos enucleados con PFA al 4% recién preparado durante 1 h a temperatura ambiente (RT).
NOTA: La fijación también se puede realizar incubando los ojos en PFA al 4% durante la noche (ON) a 4 ° C. Los ratones fueron sacrificados de acuerdo con los lineamientos de la Declaración ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUAL) de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Nacional de Córdoba (Res. HCD 1216/18). - Bajo el microscopio de disección, retire las córneas con tijeras cortando a lo largo del limbo y diseccione todas las retinas. Deseche el segmento anterior del ojo y luego separe la retina de la RPE-Coroides.
NOTA: Asegúrese de eliminar los restos y los vasos hialoides de la retina con fórceps. - Coloque las retinas en tubos de 200 μL. Luego, bloquee y permeabilice las retinas en 100 μL de solución salina tamponada con Tris (TBS) que contiene albúmina sérica bovina al 5% (BSA) y Triton-X-100 al 0,1% durante 6 h a 4 °C con agitación suave en el agitador.
NOTA: Este paso se puede realizar durante 2 h en RT. - Luego, invierta el tubo para colocar la retina en la tapa y retire la solución de bloqueo con una pipeta.
- Añadir 100 μL de la solución que contiene 0,01 μg/μL de isolectina GSA-IB4 (GSA-IB4). Envuelva los tubos con papel de aluminio para proteger las muestras de la luz. Incubar las retinas con la solución de lectina ON a 4 °C o durante 2 h a RT con agitación suave en el agitador.
- Lavar la retina con 100 μL de TBS que contenga 0,1% de Triton-X-100 durante 20 min con una agitación suave en el agitador. Para un lavado adecuado, coloque la retina en la tapa del tubo invirtiéndola. Vuelva el tubo a su posición de pie y retire el medio que queda en el recipiente. Repita este paso tres veces.
- Coloque la retina en un portaobjetos y agregue una gota de PBS. Bajo el microscopio de disección, realice cuatro cortes igualmente distantes desde los bordes de la retina hacia el nervio óptico.
- Para desplegar los pétalos de la retina, use fórceps o pequeños trozos de papel de filtro. Asegúrese de que el lado del fotorreceptor esté hacia abajo.
- Retire el PBS restante de la diapositiva con papel de filtro. Luego, agregue un medio de montaje (Poly(alcohol vinílico) en glicerol / Tris) y un estuche. Déjalo secar durante 1 h en RT.
- Guarde los portaobjetos a 4 °C protegidos de la luz.
NOTA: Las retinas también se pueden almacenar en PBS a 4 °C hasta la visualización de la microscopía confocal.
3. Visualización de microscopía confocal y adquisición de microfotografías
- Antes de la visualización, incube las diapositivas durante 10 minutos en RT cubiertas de luz.
- En el microscopio confocal, coloque el portaobjetos en la placa boca abajo.
- Enfoque el plexo superior de la vasculatura retiniana y seleccione un área para iniciar la adquisición de la imagen.
- Establezca parámetros generales del láser en el software: Longitud de onda: 488 nm; Intensidad del láser; HV; Compensación; Ganar.
NOTA: La intensidad del láser, PMT, Offset y ganancia pueden variar según las condiciones y el uso de la lámpara. Los ajustes óptimos proporcionan una imagen clara de los vasos evitando la saturación en la sensibilidad del tubo fotomultiplicador para tener una relación lineal con la señal de fluorescencia. - Establecer otros parámetros de adquisición: Modo; Tamaño; Objetivo, sin zoom; No Kalman; Tamaño del paso.
NOTA: Se deben utilizar condiciones de adquisición idénticas para obtener imágenes de las muestras de control y experimentales. - Establecer las coordenadas en los ejes x e y: Escanear la retina en foco 2x. Si el área muestra vasos, selecciónelo haciendo clic dos veces en el área para marcarla para su posterior adquisición de imágenes.
NOTA: Es muy recomendable seleccionar el área de la retina siguiendo el plexo vascular superior ya que la fluorescencia de los vasos más grandes es mayor. - Mueva la cuadrícula a un cuadrado vecino, enfoque la retina y seleccione el área si corresponde. Repita este paso hasta que el área seleccionada comprenda toda la retina.
- Seleccione un área y establezca las coordenadas en el eje z para definir la extensión de espesor que se va a escanear. Para hacer esto, visualice la retina en foco 2x; con el micrómetro, vaya a la parte superior de la retina y haga clic en Establecer en la posición Inicio. Luego, vaya a la parte inferior de la retina y haga clic en Establecer en la posición Final.
- Repita el paso 3.8 en cada área seleccionada en la cuadrícula.
NOTA: Para verificar el área escaneada en profundidad, presione Ir en la posición Inicio. Si los vasos aún se visualizan, reajuste la posición moviendo el micrómetro y luego haga clic en Establecer. Repita el proceso en la posición Fin. - Inicialice el escaneo automatizado.
- Una vez finalizado el proceso de escaneo, abra la imagen.
- Seleccione el formato Serie para grabar la imagen como mosaico y guárdela con la extensión preferida. Finalmente, la imagen cosida se mostrará en la pantalla.
4. Procesamiento de imágenes
- En el software ImageJ FIJI, vaya a la barra de menús y haga clic en Archivo > Abrir. Seleccione la imagen que desea procesar. En la ventana Opciones de importación de bioformatos , seleccione los metadatos Mostrar OME-XML y haga clic en Aceptar.
NOTA: Las imágenes con un nombre similar deben guardarse en carpetas separadas. - En la ventana Metadatos de OME , busque la información de tamaño de píxel, denominada PhysicalSizeX, PhysicalSizeY y PhysicalSizeZ. Copie estos datos.
- Para la calibración de la imagen, vaya a la barra de menús y seleccione Propiedades de > de imagen. Copie la información de la imagen en el paso 4.2 y haga clic en Aceptar. La imagen se abre como una ventana con varias fotos, donde cada una representa las microfotografías adquiridas en un eje z.
- Asigne una lut preferida a la imagen para consignar un color a la etiqueta fluorescente. Para hacer eso, vaya a la barra de menú y haga clic en el icono LUT .
- Para visualizar todas las pilas en una sola imagen, vaya a la barra de menús y seleccione > pilas > proyecto Z.
- En la ventana Proyección Z que se muestra, seleccione todas las pilas donde se visualizan los buques. En Tipo de proyección, elija Intensidad promedio y haga clic en Aceptar.
NOTA: El resultado de la suma de las pilas se mostrará en una nueva imagen denominada AVG (nombre de la imagen). - Ajuste el brillo y el contraste en la imagen resultante para reducir el fondo y resaltar los vasos. Vaya a la barra de menú y haga clic en Imagen> Ajustar> Brillo / Contraste. En las ventanas B y C se mueven las barras hasta que se observe una mejor intensidad. Haga clic en Aplicar y guarde los cambios.
- Copie los parámetros seleccionados para Brillo/Contraste; estos deben ser idénticos para todas las imágenes.
- Antes de la cuantificación de la imagen, defina los parámetros que se van a medir. En la barra de menús, vaya a Analizar > establecer medidas. En los procedimientos aquí descritos, será necesario obtener Área y Perímetro (esto en última instancia también es necesario para medir distancias). Haga clic en Aceptar.
- Descargue el complemento necesario para la cuantificación de la densidad de recipientes17 y siga las instrucciones de instalación proporcionadas por el complemento.
- Continuar con la cuantificación de un parámetro vascular específico.
5. Cuantificación de áreas avasculares
- En la barra de menús, elija la herramienta Varita. Seleccione el área de la retina que carece de vasos.
NOTA: Se pueden seleccionar áreas más grandes o más pequeñas dependiendo de la tolerancia. Para ajustar la tolerancia, haga clic en el icono de la herramienta varita dos veces. Modo empleado: Legado. - Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI. Repita los pasos 5.1 y 5.2 con todas las áreas avasculares de la retina.
- Haga clic en Medir en el gestor de ROI para obtener la información del área avascular. El programa mostrará una nueva ventana con la información requerida. Copie los datos en otro programa o guarde el archivo.
NOTA: En algunas imágenes, uno puede preferir seleccionar las áreas avasculares manualmente. En este caso, elija la herramienta Selección de polígonos, dibuje distancias cortas alrededor del área avascular y haga clic en la imagen cuando una nueva distancia esté a punto de comenzar. Cierre el área seleccionada haciendo clic en el primer punto. - Repita los pasos 5.1, 5.2 y 5.3 para medir el área total de la retina.
- Calcule el área avascular de la retina como la suma de todas las áreas avasculares medidas divididas por el área total de la retina.
6. Cuantificación de áreas neovasculares
- En la barra de menús, elija la herramienta Varita.
- Amplíe la imagen para visualizar mejor los neovasos. Seleccione los neovasos uno por uno con la herramienta de varita.
NOTA: Ajuste la tolerancia no superior a 20 para garantizar la selección de un solo neovaso. Este nivel de tolerancia debe permanecer constante durante todas las cuantificaciones de imágenes. - Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI. Repita los pasos 6.1 y 6.2 con todas las áreas neovasculares de la retina.
- Haga clic en Medir en el gestor de ROI para obtener los datos del área. El programa mostrará una nueva ventana con la información requerida. Copie los datos en otro programa o guarde el archivo.
- Repita los pasos 6.1, 6.2 y 6.3 para cuantificar el área total de la retina.
- Calcule el área neovascular de la retina como la suma de todas las áreas de neovasos medidas divididas por el área total de la retina.
7. Cuantificación del diámetro del vaso
- En la barra de menús, seleccione la herramienta Línea recta.
- Amplíe la imagen para visualizar mejor la pared del recipiente. Realizar tres líneas transversales al buque principal antes del primer ramal. Esto debe hacerse dibujando una línea desde el límite de una pared del recipiente hasta el opuesto.
NOTA: La línea debe ser perfectamente perpendicular al recipiente de pared para evitar errores de cuantificación. - Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI. Repita los pasos 7.1 y 7.2 en todos los recipientes que necesiten ser cuantificados.
- Haga clic en Medir en el gestor de ROI para obtener los datos de distancia. El programa mostrará una nueva ventana con la información requerida. Copie los datos en otro programa o guarde el archivo.
8. Cuantificación de la tortuosidad del vaso
- En la barra de menús, haga clic en el icono de la herramienta de línea recta con el botón derecho del ratón y seleccione Línea segmentada o Línea a mano alzada. Dibuje una línea dentro del vaso desde el nervio óptico hasta la primera ramificación del vaso después de la forma vascular.
NOTA: La línea debe seguir la forma vascular para evitar errores de cuantificación. - Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI.
- En la barra de menús, seleccione la herramienta Línea recta. Dibuje una línea desde el nervio óptico hasta la ramificación del primer vaso.
- Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI.
- Haga clic en Medir en el Roi Manager para obtener los datos de distancias. El programa mostrará una nueva ventana con la información requerida. Copie los datos en otro programa o guarde el archivo.
- Calcule el índice de tortuosidad de la siguiente manera: distancia obtenida con línea segmentada dividida por la distancia obtenida con línea recta.
9. Cuantificación de la ramificación vascular
- Con la herramienta Oval de la barra de menús, defina un área aplicada por igual a todas las condiciones experimentales. El área seleccionada debe ser un círculo concéntrico dibujado alrededor del nervio óptico.
- Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI.
NOTA: En este caso, es recomendable guardar el ROI ya que la cuantificación es lenta y se debe utilizar el ROI idéntico en todas las imágenes. Para ello, en el ROI Manager haz clic en MÁS > Guardar. - Manualmente, cuente el número de ramas primarias que surgen de los vasos principales dentro del área de selección.
- Repetir los pasos 9.2 y 9.3 en las zonas vecinas, manteniendo los criterios nervio-periferia óptica.
10. Cuantificación de la densidad vascular
- Transforme la imagen en modo de 8 bits.
- Vaya a Plugins en la barra de menús, seleccione Análisis de vasos > densidad vascular.
- Defina un área con la herramienta Cuadrado de la barra de menús, donde se debe medir la densidad del recipiente. Haga clic en Aceptar.
- El programa mostrará una nueva ventana con la información requerida. Copie los datos en otro programa o guarde el archivo.
- Repita los pasos 10.2, 10.3 y 10.4 en las áreas vecinas, manteniendo el ROI pero colocándolo nueve veces abarcando la periferia y el centro de toda la retina.
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Representative Results
Como se describe en el apartado de protocolo, a partir de un único ensayo de tinción fluorescente se puede obtener la morfología vascular y evaluar cuantitativamente varios parámetros de interés. La búsqueda de una alteración específica dependerá del tipo de retinopatía estudiada. En este artículo, las áreas avasculares y neovasculares, la tortuosidad y la dilatación se evaluaron en un modelo de ratón de retinopatía proliferativa, mientras que la ramificación vascular y la densidad se analizaron en un modelo de ratón MetS, que induce una retinopatía no proliferativa.
En el primer ejemplo experimental, se empleó el modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno (OIR), que se asemeja a la retinopatía del prematuro y algunas características de la etapa proliferativa de la retinopatía diabética. En este modelo, las camadas se mantienen con su madre lactante en una cámara hiperóxica desde el día postnatal (P)7 hasta P1218. Las inyecciones intravítreas se realizaron en P12 para determinar la efectividad de un fármaco como antiangiogénico (condición llamada tratamiento). Los ratones fueron sacrificados en P17, el punto temporal de la formación máxima de neovasos19. Los ratones inyectados con vehículo se emplearon como control. Ambas muestras fueron fijadas y teñidas con Isolectina GSA-IB4 juntas. Después de la adquisición confocal, las imágenes se analizaron con el software ImageJ FIJI como se indicó anteriormente. Con el módulo de costura integrado en el microscopio confocal, se observó toda la montura completa como una imagen única (Figura 1). En P17 es posible observar la vasculatura hialoide, un sistema vascular transitorio esencial durante la vida intrauterina (Figura 1, flechas blancas)20.
Como consecuencia del suministro excesivo de oxígeno en la cámara hiperóxica, los ratones OIR detienen el desarrollo vascular fisiológico y generan áreas avasculares en la retina. Luego, las áreas avasculares se definen como las zonas que carecen de vasos sanguíneos retinianos (Figura 2). A partir de las imágenes adquiridas, las áreas avasculares se pueden cuantificar como la suma de las regiones sin vasos dividida por el área total de la retina. Las áreas con daños mecánicos también muestran ausencia de embarcaciones. Para identificar áreas dañadas, analice la integridad de las capas neuronales con tinción de Hoechst.
Las zonas avasculares de la retina evitan el suministro de oxígeno y, por tanto, se establece una fuerte respuesta proangiogénica, induciendo la neovascularización16. Los neovasos son vasos de pequeño calibre que se originan en un vaso preexistente del plexo vascular superior. Su estructura está desorganizada, por lo tanto, los neovasos crecen como mechones hacia la cavidad vítrea21. Se calculó el área ocupada por los mechones de neovasos cuantificando el área neovascular de la retina dividida por el área total de la retina (Figura 3). Como la forma y el tamaño de los neovasos son variables, ocasionalmente pueden parecer similares a los escombros y artefactos. Para distinguir los neovasos, verifique que el mechón crezca a partir de un recipiente maduro.
La dilatación vascular y la tortuosidad son otras dos alteraciones frecuentes, que tienen efectos negativos en la biología vascular, ya que producen una circulación sanguínea turbulenta. Para el análisis de la dilatación, medimos el diámetro de los vasos principales a tres alturas antes de la primera rama22,23 (Figura 4). Los investigadores deben definir una distancia predeterminada para medir el diámetro del vaso con el fin de reducir la variabilidad entre los resultados. Idealmente, el punto más alejado del nervio óptico debe ser de alrededor de 300 μm. Sugerimos realizar el análisis y luego tomar un promedio de al menos seis ratones por condición.
En cuanto a la tortuosidad, medimos la distancia recorrida por los vasos principales siguiendo su forma con respecto a la distancia recta entre el nervio óptico y el primer punto de ramificación24 (Figura 5). Como podemos ver en la imagen, existe heterogeneidad en la sinuosidad de los vasos principales. Para obtener un resultado representativo, se deben cuantificar no menos de seis ratones por condición.
Los últimos parámetros, ramificación vascular y densidad, fueron analizados en el modelo MetS exhibiendo retinopatía no proliferativa. En el SM, tanto los trastornos lipídicos como los de carbohidratos se asocian a la disfunción y muerte de los pericitos retinianos y las células endoteliales, lo que lleva a la formación de capilares acelulares o a una disminución de la ramificación vascular25. En nuestro modelo, los ratones ApoE-KO fueron alimentados con fructosa añadida al agua potable, a una concentración del 10% p/v. Los animales de control acaban de recibir agua del grifo. Después de 4 meses de dieta, los ratones fueron sacrificados y las retinas procesadas como se indicó anteriormente. Para la medición de la ramificación vascular, definimos el área de cuantificación dibujando un círculo concéntrico, y luego contamos, una por una, las ramas primarias que surgen de un vaso central principal (Figura 6).
A partir de las imágenes adquiridas, se cuantificó la densidad vascular como el área ocupada por los vasos dividida por el área del ROI (un cuadrado de 0,015 mm2, ver aplanamiento en la Figura 7), que se colocó en diferentes lugares en cada microfotografía, como se explicó en la sección de protocolo. Evite cuantificar áreas con daños mecánicos (Figura 7, flechas blancas). Si hay más de dos áreas con punciones, se debe descartar la retina.
Figura 1: Tinción vascular de retinas de montura entera marcada con Isolectina GSA-IB4: Imágenes confocales representativas de retinas de ratones P17 OIR inyectadas con vehículo o tratamiento en P12. La tinción fluorescente se realizó en retinas de montaje entero con Isolectina GSA-IB4 Alexa 488 según el protocolo. Las áreas avasculares (AV) y las áreas neovasculares (NV) están indicadas. Barra de escala: 500 μm. Las flechas blancas muestran la vasculatura hialoide remanente. Las flechas amarillas muestran áreas de escaneo incompletas durante la adquisición de imágenes confocales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cuantificación de áreas avasculares: (A) Imágenes representativas de retinas de montaje completo en P17 que muestran tinción vascular GSA-IB4 en ratones con vehículo OIR y tratamiento OIR. Las zonas con vaso-obliteración están indicadas en amarillo. Barra de escala: 500 μm. (B) El área AV (%) se cuantificó como la relación entre el área avascular central y el área retiniana completa. Se utilizó la prueba t no apareada de dos colas para la comparación estadística. Los datos presentados como media ± SEM. *** p < 0,001. Al menos seis animales fueron empleados para cada condición en el tiempo de supervivencia examinado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación de áreas neovasculares: (A) Imágenes representativas de retinas de montaje entero en P17 que muestran tinción vascular GSA-IB4 en ratones con vehículo OIR y tratamiento con OIR. Las zonas con neovascularización están indicadas en color blanco. Barra de escala: 500 μm. (B) El área nv (%) se cuantificó como la relación entre el área ocupada por neovasos y toda el área retiniana. Se utilizó la prueba t no apareada de dos colas para la comparación estadística. Los datos presentados como media ± SEM. *** p < 0,001. Al menos seis animales fueron empleados para cada condición en el tiempo de supervivencia examinado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cuantificación de la dilatación vascular: (A) Imágenes representativas de retinas de montura completa en P17 que muestran tinción vascular GSA-IB4 en ratones con vehículo OIR y tratamiento con OIR. Paneles izquierdos: ROIs seleccionados para la cuantificación. Paneles derechos: zoom de los ROI, mostrando las líneas rectas realizadas en un recipiente principal para medir el diámetro del buque. Se trazaron tres líneas transversalmente hasta el buque y se promedió. Barra de escala: 100 μm. (B) El diámetro del vaso (%) se cuantificó como el diámetro medio medido en los vasos principales de la retina. Se utilizó la prueba t no apareada de dos colas para la comparación estadística. Los datos presentados como media ± SEM. *p < 0,05. Al menos seis animales fueron empleados para cada condición en el tiempo de supervivencia examinado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Determinación del índice de tortuosidad: (A) Imágenes representativas de retinas de montaje completo en P17 que muestran tinción vascular GSA-IB4 en ratones con vehículo OIR y tratamiento con OIR. Paneles izquierdos: ROIs seleccionados para la cuantificación. Paneles centrales: zoom del ROI, mostrando líneas segmentadas trazadas en un vaso principal desde el nervio óptico hasta el primer punto de ramificación. Paneles derechos: zoom del ROI, mostrando líneas rectas trazadas en un vaso principal desde el nervio óptico hasta el primer punto de ramificación. Barra de escala: 100 μm. (B) El índice de tortuosidad se obtuvo dividiendo la distancia de la línea segmentada a la distancia de la línea recta. Se utilizó la prueba t no apareada de dos colas para la comparación estadística. Los datos presentados como medios ± SEM. ns, no significativos. Al menos seis animales fueron empleados para cada condición en el tiempo de supervivencia examinado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Cuantificación de la ramificación vascular: (A) Imágenes representativas de retinas de montura entera que muestran tinción vascular de isolectina GSA-IB4 en ratones alimentados con ApoE-KO y ApoE-KO + fructosa. Las áreas de cuantificación circular se definieron en amarillo. Barra de escala: 100 μm, aumento de 100x. (B) El número de ramas se cuantificó como el número de ramas primarias de un vaso principal, desde el nervio óptico hasta la periferia. Se utilizó la prueba t no apareada de dos colas para la comparación estadística. Los datos presentados como medios ± SEM. ns, no significativos. Al menos seis animales fueron empleados para cada condición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Cuantificación de la densidad vascular: (A) Imágenes representativas de retinas de montura entera que muestran tinción vascular de isolectina GSA-IB4 en ratones alimentados con ApoE-KO y ApoE-KO + fructosa. El cuadrado de 0,015 mm2 de área de cuantificación se definió en amarillo. Barra de escala: 100 μm, aumento de 100x. (B) La densidad vascular se cuantificó como la relación entre el área vascular y el área total de ROI, que se colocó nueve veces en diferentes lugares en cada microfotografía. Las flechas blancas muestran áreas con daños mecánicos. Se utilizó la prueba t no apareada de dos colas para la comparación estadística. Los datos presentados como medios ± SEM. ns, no significativos. Al menos seis animales fueron empleados para cada condición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los modelos animales de retinopatías son herramientas poderosas para estudiar el desarrollo vascular, la remodelación o la angiogénesis patológica. El éxito de estos estudios en el campo se basa en el fácil acceso al tejido que permite realizar una amplia variedad de técnicas, aportando datos de ratones in vivo y postmortem26,27. Además, se ha encontrado una gran correlación entre los estudios in vivo y los análisis clínicos, proporcionando una sólida trazabilidad y fiabilidad a estos modelos28. En este artículo, presentamos una descripción simple y robusta de los pasos para caracterizar la red vascular en modelos de ratón de enfermedades vasculares de la retina. En la literatura, los lectores encontrarán otros posibles parámetros a medir y enfoques paralelos para cuantificar los aquí seleccionados. Los protocolos compilados tienen muchos beneficios sobre otros porque son reproducibles, y solo requieren un software libre para realizar el análisis (Imagen J Fiji).
Además, estos protocolos son fáciles de realizar por estudiantes que no tienen un amplio conocimiento sobre el programa y la mayoría de las mediciones no necesitan complementos adicionales (excepto de densidad vascular).
La extracción de muestras y la técnica de tinción por fluorescencia son sencillas y breves29. Es muy importante trabajar con retinas frescas, aunque se pueden almacenar a 4 °C en PBS con inhibidores del crecimiento bacteriano. Como el tejido es delgado y blando, las muestras viejas se descomponen con frecuencia durante la incubación o al desplegar la muestra antes del montaje. Además, la fijación excesiva con 4% de PFA hace que la retina sea excesivamente rígida y quebradiza, pero esto no afecta la tinción de lectina. La tinción de isolectina GSA-IB4 permite visualizar la red vascular completa en cada capa, incluidos los neovasos y las células endoteliales en proliferación. Otros marcadores, como el CD 31, requieren la incubación de la muestra con anticuerpos concentrados y tienen más antecedentes. Por otro lado, en la angiografía, el tinte fluorescente tiende a difundirse fuera de los vasos, lo que aumenta la variabilidad en el calibre del vaso y la cuantificación de la tortuosidad. Una desventaja de la isolectina GSA-IB4 es que también puede etiquetar células microgliales30. Se debe tener cuidado al realizar inyecciones intravítreas u otros procedimientos experimentales que inducen una infiltración excesiva porque las células microgliales pueden formar aglomerados.
La adquisición de imágenes se puede realizar con cualquier microscopio confocal. El uso de un par de placas motorizadas a un software que incluye el módulo de costura proporcionará una visualización completa de toda la retina montada en una sola imagen. Al seleccionar el área de la retina, asegúrese de que se incluyan todos los extremos de la muestra, de lo contrario la foto estará incompleta (Figura 1, flechas amarillas). Esto no es muy relevante en el modelo de ratón de OIR, como ejemplo, porque las alteraciones vasculares están cerca del nervio óptico. Mientras que en el modelo de rata de OIR, este error puede conducir a una cuantificación inexacta, ya que las áreas avascular y neovascular están al lado del limbo. Otra posibilidad es tomar microfotografías retinianas individuales. El usuario puede organizarlos más tarde como un rompecabezas con un software adecuado. No es recomendable usar el microscopio de epifluorescencia, especialmente cuando se analiza la ramificación, porque los vasos brotan a lo largo de todo el grosor de la retina y algunos vasos no se detectarán en una pila únicamente z.
Durante el procesamiento de imágenes con ImageJ FIJI, se recomienda no actualizar el software hasta que se cuantifiquen todas las imágenes, con el fin de mantener condiciones idénticas en el software. La calibración de las imágenes (asignación de tamaño de píxel en micras) es un paso crítico ya que estos protocolos implican la cuantificación de distancias y áreas. Cuando se familiariza con el programa, el usuario puede explorar otras herramientas para seleccionar el área neovascular y avascular además de la herramienta de varita. La herramienta de selección de polígonos es particularmente útil para medir áreas avasculares que se han cortado en dos partes en el paso de montaje. Otros investigadores han creado plugins específicos para automatizar la selección de neovasos en función de la intensidad de fluorescencia de estas estructuras. Estos métodos son más rápidos y menos laboriosos, aunque se recomienda comprobar que se han seleccionado pequeños neovasos menos brillantes antes de la cuantificación31. Las áreas de neovasos fluorescenciarán más intensamente que los vasos normales circundantes. La herramienta Varita mágica selecciona áreas de color similar y la tolerancia determina qué tan similares en color son los píxeles seleccionados. Si un neovaso es de intensidad similar a los vasos normales, la tolerancia puede ajustarse hacia abajo para aumentar la sensibilidad a las diferencias de intensidad sutiles. Aunque la selección de neovasos en cada muestra se realizará con un umbral idéntico, algunos neovasos se caracterizan por una intensidad de fluorescencia menor. En este caso, se requerirá una tolerancia más baja para una selección adecuada.
La tortuosidad y la dilatación son medidas de distancia. Un estudio exhaustivo del árbol vascular es útil para seleccionar vasos de tipo idéntico (arterias o venas) y calibre. Medimos la dilatación en vasos a tres alturas como se muestra en la Figura 4. El ángulo de la selección recta respecto a la pared del recipiente es otro punto relevante a tener en cuenta. Esto debe ser lo más cercano posible a 90° para evitar posibles errores. Al dibujar la línea recta, los usuarios pueden usar la herramienta de zoom para acercarse al recipiente de interés.
La ramificación vascular también se puede medir en dos o más áreas de cuantificación de diferentes alturas, si se desea. En este caso, los investigadores deben conservar la región de la retina analizada (lado central, medio o periférico del nervio óptico). Aunque la ramificación está alterada en varios modelos animales de retinopatía, las primeras etapas de la retinopatía asociada al SM aquí presentadas aún no muestran tales cambios15. Para estudios extensos en capilares retinianos del plexo intermedio y profundo y brotación de vasos, los métodos computacionales 3D proporcionan datos valiosos de variaciones sutiles en la morfología vascular y la red32. Finalmente, la densidad vascular está determinada por el área ocupada por los vasos con respecto al área total de un ROI seleccionado. La medición de este parámetro requiere el uso de un complemento y una versión actualizada de ImageJ FIJI, donde las herramientas Umbral automático y Geometría a mapa de distancia deben estar disponibles. A pesar de estos pasos adicionales, el plugin es fácil de usar, reproducible y confiable. Para la medición de la densidad vascular se eligió un ROI de 0,015 mm2 , con el fin de realizar diez mediciones de la intensidad de la fluorescencia en diferentes regiones de la retina. Este tamaño nos permitió cubrir toda la foto, obteniendo así un valor medio más representativo y su desviación en cada retina.
En general, a pesar de que estas colecciones de métodos no están automatizadas y requieren la selección manual de los parámetros, son capaces de proporcionar datos cuantitativos y rigurosos de las retinas. La principal limitación con respecto a los protocolos presentados anteriormente para las mediciones vasculares se basa en la variabilidad entre examinadores al analizar la misma imagen. Para minimizar este sesgo, es importante preestablecer el ajuste general como límites de la pared del vaso, identificación de áreas avasculares y neovasos, y también criterios de exclusión para los tejidos dañados. En cuanto a la tortuosidad de los vasos, se requiere un punto de partida acordado junto al nervio óptico. Para los usuarios principiantes, es muy recomendable promediar los datos recopilados por dos o más examinadores. En los usuarios entrenados, no se han encontrado diferencias significativas en la medición de diversos parámetros, siempre y cuando la concordancia en los criterios de cuantificación se mantenga constante. Del mismo modo, se pueden añadir parámetros adicionales a los protocolos enumerados, en función de las alteraciones vasculares detectadas en la retinopatía. En las retinopatías no proliferativas, la medición del número capilar acelular, los pericitos migratorios, la relación entre el número de pericitos/células endoteliales y la permeabilidad de la barrera retiniana sanguínea son los primeros parámetros alterados en la vasculatura retiniana33,34,35. Para modelos crónicos y retinopatías leves, es recomendable incluir estas mediciones adicionales. Un gran número de parámetros medidos proporcionarán un paisaje más fiel de los eventos que tienen lugar en la vasculatura. En resumen, en este artículo, hemos mostrado técnicas clásicas, bien establecidas y reproducibles para cuantificar algunos de los parámetros más relevantes tenidos en cuenta en la práctica clínica.
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Disclosures
Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Carlos Mas, María Pilar Crespo y Cecilia Sampedro de CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) por su asistencia en microscopía confocal, a Soledad Miró y Victoria Blanco por el cuidado dedicado a los animales y a Laura Gatica por la asistencia histológica. También agradecemos a Víctor Díaz (Pro-Secretario de Comunicación Institucional de la FCQ) por la producción y edición del video y a Paul Hobson por su lectura crítica y revisión lingüística del manuscrito.
Este artículo fue financiado por subvenciones de la Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (todos a M.C.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
References
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