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Biology

एस्चेरिचिया कोलाई और अन्य बैक्टीरिया से बाह्य पुटिकाओं का स्केलेबल अलगाव और शुद्धिकरण

Published: October 13, 2021 doi: 10.3791/63155
Automatic Translation
1,2,3, 1, 1,4, 5, 1, 1,3, 1,3,4
1Department of Cardiovascular & Metabolic Sciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2University Hospitals Cleveland Medical Center, 3Case Western Reserve University, 4Center for Microbiome & Human Health, Cleveland Clinic, 5Electron Microscopy Core, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic

Summary

बैक्टीरिया बायोएक्टिव जैविक अणुओं को ले जाने वाले नैनोमीटर आकार के बाह्य पुटिकाओं (ईवी) का स्राव करते हैं। ईवी अनुसंधान उनके बायोजेनेसिस, माइक्रोब-माइक्रोब और होस्ट-माइक्रोब इंटरैक्शन और बीमारी में भूमिका, साथ ही साथ उनके संभावित चिकित्सीय अनुप्रयोगों को समझने पर केंद्रित है। ईवी अनुसंधान के मानकीकरण की सुविधा के लिए विभिन्न बैक्टीरिया से ईवी के स्केलेबल अलगाव के लिए एक वर्कफ़्लो प्रस्तुत किया गया है।

Abstract

विविध जीवाणु प्रजातियां ~ 20-300 एनएम बाह्य पुटिकाओं (ईवी) का स्राव करती हैं, जिसमें लिपिड, प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, ग्लाइकेन्स और माता-पिता की कोशिकाओं से प्राप्त अन्य अणु शामिल होते हैं। ईवी संक्रमण और उपनिवेशीकरण के संदर्भ में बैक्टीरिया और मेजबान जीवों के बीच बातचीत में योगदान देते हुए इंट्रा-और इंटर-प्रजाति संचार वैक्टर के रूप में कार्य करते हैं। स्वास्थ्य और बीमारी में ईवी के लिए जिम्मेदार कार्यों की भीड़ को देखते हुए, इन विट्रो और विवो अध्ययनों में ईवी को अलग करने में रुचि बढ़ रही है। यह अनुमान लगाया गया था कि भौतिक गुणों, अर्थात् आकार के आधार पर ईवी का पृथक्करण, विभिन्न जीवाणु संस्कृतियों से पुटिकाओं के अलगाव की सुविधा प्रदान करेगा।

आइसोलेशन वर्कफ़्लो में बैक्टीरियल संस्कृतियों से ईवी के अलगाव के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन, निस्पंदन, अल्ट्राफिल्ट्रेशन और आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) शामिल हैं। स्केलेबिलिटी को बढ़ाने के लिए एक पंप-संचालित स्पर्शरेखीय प्रवाह निस्पंदन (टीएफएफ) चरण को शामिल किया गया था, जिससे सेल संस्कृति शुरू करने वाले लीटर से सामग्री का अलगाव सक्षम हो सके। एस्चेरिचिया कोलाई का उपयोग एक मॉडल प्रणाली के रूप में किया गया था जो ईवी से जुड़े नैनोलुसीफेरेज़ और गैर-ईवी-संबद्ध एमचेरी को रिपोर्टर प्रोटीन के रूप में व्यक्त करता था। नैनोलुसीफेरस को साइटोलिसिन ए के साथ अपने एन-टर्मिनस को फ्यूज करके ईवी को लक्षित किया गया था। प्रारंभिक क्रोमैटोग्राफी अंश जिसमें 20-100 एनएम ईवी होते हैं, जिनमें संबंधित साइटोलिसिन ए - नैनोलुक होते हैं, मुक्त प्रोटीन वाले बाद के अंशों से अलग थे। ईवी से जुड़े नैनोलुसीफेरेज़ की उपस्थिति की पुष्टि इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा की गई थी। यह ईवी अलगाव वर्कफ़्लो अन्य मानव आंत से जुड़े ग्राम-नकारात्मक और ग्राम-पॉजिटिव जीवाणु प्रजातियों पर लागू होता है। अंत में, सेंट्रीफ्यूजेशन, निस्पंदन, अल्ट्राफिल्ट्रेशन / टीएफएफ और एसईसी के संयोजन से विभिन्न जीवाणु प्रजातियों से ईवी के स्केलेबल अलगाव को सक्षम बनाया जाता है। एक मानकीकृत अलगाव वर्कफ़्लो को नियोजित करने से प्रजातियों में माइक्रोबियल ईवी के तुलनात्मक अध्ययन की सुविधा होगी।

Introduction

एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवी) नैनोमीटर के आकार की, लिपोसोम जैसी संरचनाएं होती हैं जिनमें लिपिड, प्रोटीन, ग्लाइकेन्स और न्यूक्लिक एसिड होते हैं, जो प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिककोशिकाओं दोनों द्वारा स्रावित होते हैं। ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया2 से ईवी की रिहाई की कल्पना करने वाले शुरुआती अध्ययनों के बाद से, बैक्टीरियल ईवी (व्यास में 20-300 एनएम) के लिए जिम्मेदार जैविक कार्यों की संख्या पिछले दशकों में लगातार बढ़ रही है। उनके कार्यों में एंटीबायोटिक प्रतिरोध3, बायोफिल्म गठन4, कोरम सेंसिंग5 और विष वितरण 6 को स्थानांतरित करना शामिलहै। चिकित्सीय के रूप में बैक्टीरियल ईवी के उपयोग में भी रुचि बढ़ रही है, विशेष रूप से वैक्सीनोलॉजी7 और कैंसर थेरेपी8 में।

ईवी अनुसंधान में बढ़ती रुचि के बावजूद, अलगाव के तरीकों के बारे में अभी भी तकनीकी चुनौतियां हैं। विशेष रूप से, अलगाव विधियों की आवश्यकता है जो प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, स्केलेबल और विविध ईवी-उत्पादक जीवों के साथ संगत हैं। ईवी अलगाव और अनुसंधान विधियों की योजना और रिपोर्टिंग के लिए सिद्धांतों का एक एकीकृत सेट बनाने के लिए, इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स एमआईएसईवी स्थिति पेपर9 को प्रकाशित और अपडेट करता है। इसके अलावा, ईवी-ट्रैक कंसोर्टियमपारदर्शिता बढ़ाने के लिए प्रकाशित पांडुलिपियों में उपयोग किए जाने वाले ईवी अलगाव के लिए विस्तृत पद्धतियों की रिपोर्टिंग के लिए एक खुला मंच प्रदान करता है।

इस प्रोटोकॉल में, स्तनधारी सेल संस्कृति से ईवी के अलगाव के लिए उपयोग की जाने वाली पिछली पद्धतियों कोबैक्टीरियल सेल संस्कृति से ईवी के अलगाव को सक्षम करने के लिए 11,12 अनुकूलित किया गया था। हमने उन तरीकों को नियोजित करने की मांग की जो विभिन्न प्रकार के रोगाणुओं से ईवी अलगाव को सक्षम करते हैं, जो स्केलेबल हो सकते हैं, और ईवी शुद्धता और उपज को संतुलित करते हैं (जैसा कि एमआईएसईवी स्थिति पेपर9 में चर्चा की गई है)। सेंट्रीफ्यूजेशन और निस्पंदन द्वारा जीवाणु कोशिकाओं और मलबे को हटाने के बाद, कल्चर माध्यम या तो केन्द्रापसारक डिवाइस अल्ट्राफिल्ट्रेशन (~ 100 एमएल तक की मात्रा के लिए) या पंप-संचालित टीएफएफ (बड़ी मात्रा के लिए) द्वारा केंद्रित होता है। ईवी को तब एसईसी द्वारा छोटे ईवी के शुद्धिकरण के लिए अनुकूलित कॉलम का उपयोग करके अलग किया जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: बैक्टीरियल ईवी अलगाव वर्कफ़्लो योजनाबद्ध अवलोकन। संक्षेप: ईवी = बाह्य पुटिका; टीएफएफ = स्पर्शरेखीय प्रवाह निस्पंदन; एसईसी = आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी; MWCO = आणविक भार कट-ऑफ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एस्चेरिचिया कोली (यानी, ई कोलाई एमपी1 13) के एक माउस-कॉमेंसल स्ट्रेन का उपयोग एक मॉडल जीव के रूप में किया गया था और साइटोलिसिन ए में संलयन द्वारा ईवी से जुड़े नैनोलुसिफेरस को व्यक्त करने के लिए संशोधित किया गया था, जैसा कि पहले बताया गयाथा। यहां उपयोग की जाने वाली विधियां कम से कम कई लीटर बैक्टीरिया संस्कृतियों को संसाधित कर सकती हैं और गैर-ईवी-संबद्ध प्रोटीन से ईवी-संबद्ध को प्रभावी ढंग से अलग कर सकती हैं। अंत में, इस विधि का उपयोग अन्य ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक जीवाणु प्रजातियों के लिए भी किया जा सकता है। रिपोर्ट किए गए प्रयोगों के सभी प्रासंगिक डेटा ईवी-ट्रैक नॉलेजबेस (ईवी-ट्रैक आईडी: ईवी 210211)10 को प्रस्तुत किए गए थे।

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Protocol

नोट: सुनिश्चित करें कि बैक्टीरिया और पुनः संयोजक डीएनए से जुड़े सभी काम प्रत्येक तनाव के जैव सुरक्षा जोखिम स्तर के लिए उपयुक्त जैव सुरक्षा नियंत्रण के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं का पालन करते हैं। काम स्थानीय, राष्ट्रीय और अंतर्राष्ट्रीय जैव सुरक्षा नियमों के अनुसार किया जाना चाहिए।

1. बैक्टीरियल उपभेदों और संवर्धन की स्थिति

नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले जीवाणु उपभेदों में एस्चेरिचिया कोलाई एमपी1 13, अक्करमैनसिया म्यूसिनोफिला, बैक्टेरोइड्स थेटाओमाइक्रोन, बिफीडोबैक्टीरियम ब्रेव और बिफीडोबैक्टीरियम डेंटियम थे।

  1. ई कोलाई के लिए, 250 से 1,000 एमएल लुरिया-बर्टानी (एलबी) शोरबा में एकल कॉलोनियों को टीका लगाने के लिए एक बाँझ लूप का उपयोग करें और संस्कृति को संसाधित करने से पहले 48 घंटे के लिए 300 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में एरोबिक रूप से इनक्यूबेट करें। पुनः संयोजक ई. कोलाई एमपी 1 स्ट्रेन के लिए पी 114-एमचेरी-क्लीलुक (पूरक विधि और पूरक चित्रा एस 1) के लिए, एलबी एगर और शोरबा में क्लोरैम्फेनिकॉल जोड़ें।
  2. ए. म्यूसिनोफिला, बी. थेटायोटोमिक्रॉन, बी. ब्रेव और बी. डेंटियम के लिए ब्रेन हार्ट इन्फ्यूजन (बीएचआई) एगर प्लेटों पर लकीरें और विनाइल एनारोबिक कक्ष के अंदर अवायवीय रूप से इनक्यूबेट करें। एकल कॉलोनियों को 100 एमएल प्री-कम बीएचआई शोरबा में टीका लगाएं और एनारोबिक रूप से 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।

2. ईवी अलगाव

  1. सेंट्रीफ्यूजेशन और निस्पंदन द्वारा बैक्टीरियल कल्चर माध्यम को स्पष्ट करना
    1. चरण 1 में लगाए गए बैक्टीरियल सेल कल्चर को 250 एमएल या 500 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन सेंट्रीफ्यूज बोतलों को डालने से साफ करने के लिए स्थानांतरित करें। बोतलों को 4 डिग्री सेल्सियस पर एक बड़ी क्षमता, निश्चित कोण रोटर में सेंट्रीफ्यूज करें और 15 मिनट के लिए 5,000 × ग्राम । सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक डालकर सेंट्रीफ्यूज बोतलों को साफ करने के लिए स्थानांतरित करें, और 15 मिनट के लिए 10,000 × ग्राम पर फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: जैव सुरक्षा-उपयुक्त सफाई और परिशोधन के बाद बोतलों का पुन: उपयोग करें।
      1. यदि दूसरे सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद बैक्टीरिया कोशिकाओं के बड़े छर्रों मौजूद हैं, तो कोशिकाओं को हटाने के लिए एक साफ बोतल में सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराएं।
    2. सुपरनैटेंट को 0.22 μm पॉलीएथरसल्फोन वैक्यूम-संचालित फ़िल्टर डिवाइस में डालें। निस्पंदन डिवाइस को वैक्यूम दीवार आपूर्ति से कनेक्ट करके फ़िल्टर करें। यदि निस्पंदन दर काफी कम हो जाती है, तो बस किसी भी अनफ़िल्टर्ड सामग्री को एक नए डिवाइस पर ले जाएं। फ़िल्टर किए गए माध्यम को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और यदि वांछित हो तो अगले दिन प्रोटोकॉल जारी रखें।
      नोट: ऊपर दिए गए सेंट्रीफ्यूजेशन आमतौर पर प्रत्येक डिवाइस के माध्यम से सेल संस्कृति की संकेतित मात्रा ~ 2x के प्रसंस्करण की अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, एक एकल 500 एमएल फ़िल्टर डिवाइस ~ 1,000 एमएल प्री-सेंट्रीफ्यूज्ड कल्चर को फ़िल्टर कर सकता है। इन उपकरणों को आमतौर पर पुन: उपयोग नहीं किया जाता है। इस चरण में सिरिंज फिल्टर का उपयोग अनुकूलन के बिना अनुशंसित नहीं है, क्योंकि परीक्षण किए गए मॉडल के साथ महत्वपूर्ण नुकसान नोट किए गए थे। यह एक संभावित रोक बिंदु है।
    3. उपयुक्त आगर प्लेटों पर फ़िल्टर किए गए सतह पर तैरने वाले का एक एलिकोट फैलाकर इस बिंदु पर व्यवहार्य कोशिकाओं को पूरी तरह से हटाने की जांच करें और बैक्टीरिया के तनाव के लिए इष्टतम परिस्थितियों में इनक्यूबेशन के बाद किसी भी कॉलोनी की अनुपस्थिति सुनिश्चित करें। यदि बैक्टीरिया का पता लगाया जाता है, तो अतिरिक्त सेंट्रीफ्यूजेशन और / या फिल्ट्रेशंस करके ऊपर की प्रक्रिया को और अनुकूलित करें।
  2. फ़िल्टर किए गए माध्यम की एकाग्रता
    1. यदि वॉल्यूम >100 एमएल के साथ काम कर रहे हैं, तो चरण 2.2.2 पर आगे बढ़ें। यदि ~ 100 एमएल की मात्रा के साथ काम कर रहे हैं, तो सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके संबंधित क्षमता 100 केडीए आणविक भार कटऑफ (एमडब्ल्यूसीओ) केन्द्रापसारक अल्ट्राफिल्ट्रेशन डिवाइस के जलाशय पर फ़िल्टर किए गए कल्चर माध्यम के 90 एमएल लोड करें। हमेशा एक मिलान अल्ट्राफिल्ट्रेशन डिवाइस के साथ संतुलन बनाएं, और 15-30 मिनट के अंतराल के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 2,000 × ग्राम पर स्विंगिंग बाल्टी रोटर में सेंट्रीफ्यूज करें, जब तक कि शीर्ष जलाशय में माध्यम की मात्रा <0.5 एमएल तक केंद्रित न हो जाए।
      1. किसी भी शेष फ़िल्टर किए गए संस्कृति माध्यम के साथ जलाशय को ऊपर उठाएं। यदि "टॉप अप" है, तो डिवाइस के निचले भाग में प्रवाह-थ्रू को हटा दें और किसी भी डिवाइस को फिर से संतुलित करें।
        नोट: यह देखा गया कि फ़िल्टर किए गए संस्कृति माध्यम की अधिकतम मात्रा जिसे इन उपकरणों का उपयोग करके केंद्रित किया जा सकता है, अनुशंसित मात्रा से <2 गुना अधिक है।
      2. यदि जलाशय में केंद्रित माध्यम की चिपचिपाहट स्पष्ट रूप से बढ़ी हुई है (अंधेरे, चिपचिपा पदार्थ), फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) के साथ पतला होता है और सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 100 केडीए के एमडब्ल्यूसीओ से छोटे किसी भी गैर-ईवी प्रोटीन को पतला करने के लिए पुन: केंद्रित होता है।
        नोट: यह एक संभावित रोक बिंदु है।
      3. केंद्रित माध्यम को कम-प्रोटीन-बाइंडिंग ट्यूब में स्थानांतरित करें, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और यदि वांछित हो तो अगले दिन प्रोटोकॉल जारी रखें।
    2. यदि वॉल्यूम >100 एमएल के साथ काम कर रहे हैं, तो संसाधित की जाने वाली मात्रा को समायोजित करने के लिए उचित आकार के टीएफएफ डिवाइस (100 केडीए एमडब्ल्यूसीओ) का चयन करें।
      नोट: 100 एमएल से >1,000 एमएल के प्रसंस्करण के लिए निस्पंदन उपकरण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। पंप और टयूबिंग / कनेक्शन के साथ स्थानीय उपलब्धता, लागत और संगतता यह तय करेगी कि कौन से विशेष मॉडल सबसे उपयोगी होंगे। फिल्टर को साफ करने की आवश्यकता से पहले सामग्री की तालिका में इंगित डिवाइस के साथ 2 एल तक कल्चर माध्यम संसाधित किया गया था (सफाई प्रोटोकॉल के लिए नीचे चरण 2.3 देखें)।
      1. # 16 लो-बाइंडिंग/ लो-लीचिंग ट्यूबिंग, लुएर एडेप्टर के लिए 1/8 इंच की नली-बार्ब, टीएफएफ डिवाइस और एक पेरिस्टालिक पंप के साथ एक निस्पंदन सर्किट को इकट्ठा करें, जैसा कि पूरक चित्रा एस 2 में दर्शाया गया है।
        नोट: पर्यावरणीय बैक्टीरिया के साथ ईवी तैयारी को दूषित करने के जोखिम को कम करने के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर टीएफएफ करें।
      2. कमरे के तापमान पर, फ़िल्टर किए गए, वातानुकूलित माध्यम को लगभग 200 एमएल / मिनट (न्यूनतम 100 एमएल / मिनट) पर प्रसारित करना शुरू करें। एक स्नातक पोत में 200 एमएल पीबीएस पंप करके वांछित प्रवाह दर के अनुरूप उपयुक्त आरपीएम निर्धारित करें। फ़िल्टर किए गए, वातानुकूलित माध्यम को प्रसारित करते समय, अणुओं <100 केडीए को इकट्ठा करें जो अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली को एक अलग पोत में कचरे के रूप में पार करते हैं।
        नोट: नीचे दिया गया उदाहरण संस्कृति के 2 एल की शुरुआती मात्रा मान रहा होगा।
      3. वातानुकूलित माध्यम को तब तक प्रसारित करना जारी रखें जब तक कि इसकी मात्रा ~ 100-200 एमएल तक कम न हो जाए। आवश्यकतानुसार छोटे जहाजों पर जाएं। पीबीएस के साथ 2 गुना पतला करें, और पंप के साथ प्रसारित करना जारी रखें, 75-100 एमएल तक ध्यान केंद्रित करें। पीबीएस के साथ 2 गुना पतला करें, और 25 एमएल की अंतिम मात्रा तक प्रसारित करना जारी रखें। पीबीएस के साथ 2 गुना पतला करें और <10 एमएल तक प्रसारित करना जारी रखें।
      4. नमूना जलाशय से फ़ीड ट्यूबिंग को बाहर उठाएं, और फिल्टर को शुद्ध करने और नमूने की अधिकतम मात्रा को पुनर्प्राप्त करने के लिए पंप करना जारी रखें।
        नोट: यह एक संभावित रोक बिंदु है।
      5. केंद्रित नमूने को शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और यदि वांछित हो तो रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। वैकल्पिक रूप से, प्रोटोकॉल के साथ जारी रखें।
      6. केंद्रित नमूने को 15 एमएल क्षमता 100 केडीए एमडब्ल्यूसीओ केन्द्रापसारक अल्ट्राफिल्ट्रेशन डिवाइस में ले जाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर झूलते हुए बाल्टी रोटर में सेंट्रीफ्यूज और 15-30 मिनट के अंतराल के लिए 2,000 × ग्राम जब तक कि शीर्ष जलाशय में माध्यम की मात्रा <2 एमएल तक केंद्रित न हो जाए।
        नोट: यह एक संभावित रोक बिंदु है।
      7. केंद्रित माध्यम को कम-प्रोटीन-बाइंडिंग ट्यूब में स्थानांतरित करें, और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, यदि वांछित हो तो अगले दिन प्रोटोकॉल जारी रखें।
  3. TFF डिवाइस की सफाई (वैकल्पिक)
    नोट: निस्पंदन दर कम हो जाती है क्योंकि टीएफएफ डिवाइस प्रक्रिया (फाउलिंग) के दौरान "क्लॉग" करना शुरू कर देता है। यदि आवश्यक हो, तो फ़िल्टर डिवाइस को उसी शुद्धिकरण रन में अतिरिक्त नमूनों के निस्पंदन की सुविधा के लिए साफ किया जा सकता है। हालांकि सैद्धांतिक रूप से संभव है, क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए एक अलग शुद्धिकरण रन के लिए एक साफ टीएफएफ फिल्टर का उपयोग नहीं किया गया है।
    1. साफ करने के लिए, टीएफएफ डिवाइस से सभी टयूबिंग और कैप्स को हटा दें और किसी भी अवशिष्ट तरल को निकाल दें।
    2. टीएफएफ डिवाइस के आंतरिक और बाहरी दोनों डिब्बों (यानी, सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध मॉडल में समानांतर और लंबवत बंदरगाहों के माध्यम से) को ~ 100 एमएल आसुत जल के साथ बाढ़ करने के लिए पेरिस्टाल्टिक पंप और टयूबिंग का उपयोग करें। सभी टयूबिंग / कैप्स को हटा दें और टीएफएफ डिवाइस को निकाल दें।
    3. बाहरी (लंबवत, छानना) बंदरगाहों को कैप करें और आंतरिक डिब्बे के माध्यम से 10 मिनट के लिए >200 एमएल / मिनट पर आसुत जल में 20% इथेनॉल के 250 एमएल को प्रसारित करें। नाली, आसुत जल से बाढ़, और ऊपर की तरह फिर से नाली।
    4. आंतरिक डिब्बे के माध्यम से 30 मिनट के लिए 0.5 एन ताजा एनएओएच घोल के 250 एमएल को प्रसारित करें और फिर से सूखा दें।
    5. पूरक चित्र S2 के रूप में सभी ट्यूबिंग और कैप्स को इनलेट, आउटलेट और फिल्ट्रेट पोर्ट से फिर से कनेक्ट करें, और 0.5 N NaOH समाधान को फिर से तब तक प्रसारित करें जब तक कि NaOH > 1 mL/cm2 फ़िल्टर सतह क्षेत्र की मात्रा फ़िल्टर झिल्ली के माध्यम से प्रवेश न करे और फ़िल्टरेट / अपशिष्ट के रूप में एकत्र हो जाए।
    6. ऊपर दिए गए आसुत जल के साथ टीएफएफ डिवाइस को कुल्ला करें। तुरंत टीएफएफ डिवाइस का उपयोग करें या डिवाइस को ~ 100 एमएल 20% इथेनॉल के साथ भरें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर करें।
      नोट: यदि इथेनॉल में संग्रहीत किया जाता है, तो डिवाइस के माध्यम से 250 एमएल पीबीएस को निकालना, पानी से धोना, निकालना और प्रसारित करना सुनिश्चित करें जब तक कि >1 एमएल / सेमी2 फिल्टर सतह क्षेत्र की मात्रा फिल्टर झिल्ली के माध्यम से प्रवेश न कर ले और नमूना प्रसंस्करण से पहले अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने के लिए फिल्ट्रेट / अपशिष्ट के रूप में एकत्र किया जाए।
  4. आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी)
    नोट: एसईसी का उपयोग ईवी की शुद्धता बढ़ाने और गैर-वेसिकुलर प्रोटीन को हटाने के लिए किया जाता है।
    1. <100 एमएल प्रारंभिक सामग्री से ईवी के अलगाव के लिए एक छोटे एसईसी कॉलम (10 एमएल बेड वॉल्यूम) का उपयोग करें और >100 एमएल प्रारंभिक सामग्री से ईवी के अलगाव के लिए एक बड़ा कॉलम (47 एमएल बेड वॉल्यूम) का उपयोग करें।
      नोट: नीचे दिया गया उदाहरण बड़े कॉलम के लिए वॉल्यूम सूचीबद्ध करेगा, जिसमें कोष्ठक में छोटे कॉलम के लिए वॉल्यूम होंगे।
    2. एसईसी कॉलम और पीबीएस को कई घंटों में कमरे के तापमान पर लाएं। एक मानक प्रयोगशाला स्टैंड और धारक का उपयोग करके एसईसी कॉलम को ऊर्ध्वाधर स्थिति में स्थिर करें। वैकल्पिक रूप से, वाणिज्यिक क्रोमैटोग्राफी कॉलम स्टैंड का उपयोग करें।
    3. एसईसी कॉलम से जुड़ने से पहले, 5 एमएल पीबीएस को फ्रिट के माध्यम से और अपशिष्ट कंटेनर में प्रवाहित करने की अनुमति देकर नमूना जलाशय को हाइड्रेट करें। एसईसी कॉलम की इनलेट कैप को अनक्रिवेट करें, नमूना जलाशय में 2 एमएल पीबीएस जोड़ें, और जलाशय को कॉलम से सावधानीपूर्वक कनेक्ट करें क्योंकि पीबीएस फ्रिट के माध्यम से बाहर निकल रहा है (छोटे एसईसी कॉलम के लिए लागू नहीं है)।
      नोट: यह पिछला कदम किसी भी हवा के बुलबुले को एसईसी कॉलम के शीर्ष पर फंसने से रोकता है। यदि हवा फंस गई है, तो जलाशय को हटा दें, हवा के बुलबुले को बाहर निकालने के लिए स्तंभ पर टैप करें, और कनेक्शन प्रक्रिया को दोहराएं। छोटे कॉलम के लिए, बस एसईसी कॉलम के शीर्ष को अनकैप करें, और नमूना हॉपर संलग्न करें।
    4. नमूना जलाशय में पीबीएस के 47 एमएल (10 एमएल) जोड़ें और एसईसी कॉलम के निचले हिस्से को अनकैप करें। संतुलन के लिए कॉलम के माध्यम से सभी लोड किए गए नमूना बफर को बहने दें। प्रवाह के माध्यम से त्याग दें।
    5. नमूना जलाशय पर अधिकतम 2 एमएल (0.5 एमएल) नमूना लोड करें, प्रवाह-माध्यम को त्याग दें, और नमूने को कॉलम में पूरी तरह से प्रवेश करने की अनुमति दें।
    6. नमूना मात्रा को माइनस 14.25 एमएल की मात्रा पर नमूना जलाशय या हॉपर में तुरंत पीबीएस जोड़ें (छोटे कॉलम के लिए नमूना मात्रा को माइनस 3 एमएल)। समाधान को स्तंभ के माध्यम से प्रवाहित होने दें और स्तंभ शून्य आयतन के बराबर इस राशि को त्याग दें।
      नोट: एक विशिष्ट 2 एमएल नमूने के लिए, नमूना जलाशय या हॉपर में जोड़े जाने वाले पीबीएस की मात्रा 12.25 एमएल होगी।
    7. एसईसी कॉलम के नीचे सीधे 2 एमएल कम-बाइंडिंग माइक्रोट्यूब रखें। तुरंत नमूना जलाशय में पीबीएस के 2 एमएल (0.5 एमएल) जोड़ें और इसे कॉलम में प्रवेश करने की अनुमति दें। प्रवाह के इस पहले 2 एमएल (0.5 एमएल) को अंश 1 के रूप में लेबल करें। प्रत्येक बाद के अंश को इकट्ठा करने के लिए नमूना जलाशय में एक समय में 2 एमएल (0.5 एमएल) जोड़ना जारी रखें।
      नोट: अधिकांश बैक्टीरियल ईवी पहले 5 अंशों में घूमते हैं। अनुकूलन के दौरान, पहले 12 अंश एकत्र किए गए थे।
    8. अंशों को अल्पकालिक भंडारण (दिनों) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    9. पुन: प्रयोज्य एसईसी कॉलम की सफाई और भंडारण
      नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित एसईसी कॉलम निर्माता के अनुसार 5 बार तक पुन: उपयोग किया जा सकता है। यदि <5 उपयोग के बाद एसईसी कॉलम की प्रवाह दर कम हो जाती है, तो निर्माता एसईसी से पहले किसी भी समुच्चय को साफ़ करने के लिए 10 मिनट के लिए 10,000 x g पर केंद्रित नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करने की सिफारिश करता है। फिर ईवी अलगाव के लिए एसईसी कॉलम पर इस सेंट्रीफ्यूजेशन के सुपरनैटेंट लोड करें।
      1. प्रत्येक उपयोग के बाद एसईसी कॉलम को साफ करने और स्टोर करने के लिए, 0.5 एम एनएओएच के 2 एमएल (0.5 एमएल) जोड़ें और इसे कॉलम में पूरी तरह से प्रवेश करने की अनुमति दें। कॉलम के माध्यम से 20% इथेनॉल के 100 एमएल (20 एमएल) चलाएं और इसे अगले उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। अगले उपयोग से पहले, इथेनॉल को ऊपर के रूप में कमरे के तापमान पर बराबर करें, और कॉलम के माध्यम से पीबीएस के एक और 150 एमएल (30 एमएल) चलाकर पीबीएस बफर के साथ इसका आदान-प्रदान करें।
      2. प्रत्येक उपयोग के बाद एसईसी कॉलम को साफ करने और तुरंत पुन: उपयोग करने के लिए, 0.5 एम एनएओएच के 2 एमएल (0.5 एमएल) जोड़ें और इसे कॉलम में पूरी तरह से प्रवेश करने की अनुमति दें। एनएओएच को धोने के लिए पीबीएस बफर के लगभग 150 एमएल (30 एमएल) चलाएं। जब एलुएट का पीएच पीबीएस (~ 7) के बराबर होता है, तो एक नया नमूना लोड किया जा सकता है।

3. ईवी तैयारी गुणवत्ता नियंत्रण

  1. बाँझपन परीक्षण
    नोट: चूंकि ये ईवी बैक्टीरिया संस्कृतियों से आते हैं, इसलिए डाउनस्ट्रीम उपयोग से पहले बाँझपन सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है।
    1. परख में उपयोग किए जाने वाले अंशों में से 100 μL (20 μL) प्राप्त करें और स्रोत बैक्टीरिया को विकसित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले माध्यम के 3 एमएल का टीकाकरण करें। कम से कम 3 दिनों के लिए संबंधित इष्टतम परिस्थितियों में संस्कृति और मैलापन के लिए निरीक्षण करें। वैकल्पिक रूप से, अंश के नमूनों को आगर प्लेटों पर लागू करें जिसमें उत्पादक बैक्टीरिया को विकसित करने और कॉलोनी गठन की तलाश करने के लिए उपयोग किया जाता है।
      नोट: यदि जीवाणु संदूषण का पता चला है, तो प्रयोग के लिए ईवी तैयारी का उपयोग करने की सिफारिश नहीं की जाती है। इसके बजाय, अलगाव को दोहराएं, (ए) वातानुकूलित बैक्टीरियल सेल कल्चर माध्यम के पर्याप्त सेंट्रीफ्यूजेशन / निस्पंदन का प्रदर्शन करके, (बी) साफ बोतलों, ट्यूबिंग, फिल्टर और क्रोमैटोग्राफी कॉलम का उपयोग करके, और (सी) उचित सड़न रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग करके जीवाणु संदूषण के जोखिम को कम करने का ध्यान रखें।
  2. प्रोटीन का परिमाणीकरण
    नोट: एक उच्च-संवेदनशीलता, प्रतिदीप्ति-आधारित प्रोटीन परिमाणीकरण किट का उपयोग किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। किट 485/590 एनएम के उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर एक मिलान मालिकाना फ्लोरिमीटर के साथ काम करता है।
    1. कमरे के तापमान पर सभी अभिकर्मकों, मानकों और नमूनों को लाएं।
    2. प्रत्येक नमूने और मानक की परख के लिए 199 μL बफर में अभिकर्मक के 1 μL जोड़कर प्रोटीन अभिकर्मक और बफर का एक मास्टर मिश्रण तैयार करें। पतली दीवार वाले 0.5 एमएल पीसीआर ट्यूबों का उपयोग करके, प्रत्येक मानक ट्यूब में 10 μL मानक + 190 μL मास्टर मिश्रण जोड़ें।
      नोट: परख की सीमा के भीतर होने के लिए, प्रत्येक नमूना ट्यूब में जोड़े जाने वाले प्रत्येक अंश की मात्रा शुद्धिकरण की अपेक्षित प्रोटीन उपज पर निर्भर करती है। आमतौर पर, प्रत्येक अंश के 5 μL + मास्टर मिश्रण के 195 μL का उपयोग किया गया था। नमूना + मास्टर मिश्रण की अंतिम मात्रा 200 μL होनी चाहिए।
    3. भंवर परख ट्यूबों को रोकता है, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर कम से कम 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करता है।
    4. तीर बटन का उपयोग करके प्रोटीन परख विकल्प का चयन करके और पुष्टि करने के लिए जीओ बटन दबाकर उपयुक्त मालिकाना फ्लोरिमीटर (सामग्री की तालिका देखें) पर मानकों को मापें। ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करें, प्रत्येक मानक ट्यूब डालें और जीओ दबाएं।
    5. प्रयोगात्मक नमूना ट्यूब डालें; पढ़ने के लिए GO दबाएँ ; और प्रदर्शित परिणाम पर ध्यान दें, जो परख बफर / नमूना मिश्रण में वास्तविक प्रोटीन एकाग्रता है। नमूने में प्रोटीन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, नमूना एकाग्रता विकल्प की गणना करने के लिए तीर कुंजियों का उपयोग करें, जीओ दबाएं, और दिए गए नमूने के लिए परख बफर में जोड़े गए नमूना मात्रा का चयन करने के लिए तीर कुंजियों का उपयोग करें। जीओ दबाएं और नमूना प्रोटीन एकाग्रता रिकॉर्ड करें। विश्लेषण किए जाने वाले प्रत्येक नमूने के लिए इस चरण को दोहराएं।
  3. कण गणना और आकार वितरण
    नोट: माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रतिरोधक पल्स सेंसिंग (एमआरपीएस) का उपयोग ईवी एकाग्रता और आकार वितरण को मापने के लिए किया गया था।
    1. पीबीएस में नमूनों को 1% ट्वीन -20 के साथ पूरक करें जिसे लगभग 0.1 μg / mL की प्रोटीन एकाग्रता के लिए 0.02 μm सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया है।
      नोट: कमजोर पड़ने का लक्ष्य ईवी युक्त अंशों में10 10 कणों / एमएल की सीमा में अपेक्षित कण एकाग्रता तक पहुंचना है। इष्टतम कमजोर पड़ने को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है। बाद के अंशों (अंश 6 से परे) के लिए कुछ ईवी की उम्मीद है। इस प्रकार, कण एकाग्रता कम कमजोर पड़ने पर विश्लेषण करने के बावजूद <10 10 कण / एमएल होने की संभावना होगी।
    2. माइक्रोपिपेट के साथ डिस्पोजेबल माइक्रोफ्लुइडिक्स कारतूस में प्रत्येक नमूने के 3 μL लोड करें, कारतूस को MRPS उपकरण में डालें, और धातु बटन को नीले रंग के रोशन रिम के साथ धक्का दें।
    3. अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर पर गो पर क्लिक करें और उपकरण द्वारा विश्लेषण किए जाने वाले नमूने की प्रतीक्षा करें। विश्लेषण की तकनीकी सांख्यिकीय त्रुटि को कम करने के लिए 1,000 से 10,000 कण घटनाओं का अधिग्रहण करें। इस बिंदु पर, नमूना अधिग्रहण पूरा करने के लिए रोकें और चलाएँ समाप्त करें क्लिक करें.
      नोट: कच्चे डेटा फ़ाइलों के साथ, उपकरण नमूने में कण एकाग्रता को सूचीबद्ध करने वाली एक सारांश स्प्रेडशीट आउटपुट करता है। किए गए नमूना कमजोर पड़ने के अनुसार इस मान को सही करें।
    4. विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, कच्चे डेटा को लोड करें और आकार वितरण के अनुकूलित ग्राफ उत्पन्न करें।

4. ईवी स्टोरेज

  1. कम प्रोटीन-बाइंडिंग ट्यूबों में व्यक्तिगत अंश आकार (उपयोग किए गए कॉलम के आकार के आधार पर) के 25-50% तक एलिकोट व्यक्तिगत या पूल किए गए अंश और फ्रीज-पिघलने चक्र से बचने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: विभिन्न अनुप्रयोगों को प्रत्येक प्रयोग में उपयोग की जाने वाली अपेक्षित राशि के आधार पर छोटे या बड़े एलिकोट की आवश्यकता हो सकती है। इसे अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता होगी। गैर-ईवी युक्त अंशों को छोड़ दिया जा सकता है यदि अनुसंधान उद्देश्यों पर लागू नहीं होता है।

5. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

  1. नकारात्मक धुंधलापन
    1. कार्बन-लेपित तांबा 400 जाल ग्रिड में ईवी नमूने का 5 μL जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। नमूना पक्ष को 5 mM Tris बफर (pH 7.1) की 5 बूंदों के साथ धो लें और फिर आसुत जल की 5 बूंदों के साथ धो लें।
    2. 2% यूरिनिल एसीटेट की 5 बूंदों के साथ दाग नमूना पक्ष। फिल्टर पेपर के साथ किसी भी अतिरिक्त मात्रा में दाग को दूर करें, और ग्रिड को कई घंटों या रात भर पूरी तरह से सूखने दें। 80 केवी पर संचालित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ नमूनों की कल्पना करें।
  2. इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग
    1. कार्बन 400 जाल ग्रिड पर ईवी निलंबन के 10 μL लागू करें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। पीबीएस में ग्रिड को तीन बार धोएं, और फिर नमूना ठीक करने के लिए 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड लागू करें। पीबीएस के साथ ग्रिड को पांच बार धोएं।
    2. 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) युक्त पीबीएस के तीन वॉश के साथ ग्रिड को अवरुद्ध करें। फिर, कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए एक प्राथमिक एंटीबॉडी के 10 μL लागू करें (यहां, nluc एंटीबॉडी का 1 μg / mL)। 0.1% बीएसए युक्त पीबीएस के साथ फिर से तीन बार धोएं।
    3. ग्रिड में द्वितीयक सोने के लेबल वाले एंटीबॉडी के 10 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पीबीएस के साथ ग्रिड को तीन बार धोएं।
      नोट: यहां, 10 एनएम सोने के नैनोकणों के साथ संयुग्मित एक बकरी एंटी-माउस एंटीबॉडी का उपयोग बफर को अवरुद्ध करने में 1: 10 को पतला करने के बाद किया गया था। यदि गोल्ड लेबलिंग ईवी विज़ुअलाइज़ेशन को अस्पष्ट करती है, तो इसके बजाय छोटे सोने के नैनोकणों (जैसे 5 एनएम) के साथ द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है।
    4. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2.5% ग्लूटारल्डिहाइड के 10 μL के साथ ग्रिड को ठीक करें। पीबीएस में तीन बार धोएं। 15 मिनट के लिए 2% यूरिनिल एसीटेट (10 μL) के साथ नकारात्मक धुंधलापन करें। नमूनों को 10 मिनट के लिए 0.5% यूरिनिल एसीटेट और 0.13% मिथाइल सेल्यूलोज समाधान के 10 μL में एम्बेड करें।
    5. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग से पहले नमूना ग्रिड को कमरे के तापमान पर रात भर सूखने दें।
    6. माइक्रोस्कोप अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर, छवि की इष्टतम गुणवत्ता (जैसे, इस विशेष सेटअप में 0.80851 एस) प्राप्त करने के लिए अनुभवजन्य रूप से एक्सपोजर निर्धारित करें और इस मान को एक्सपोज़र टाइम विकल्प बॉक्स में टाइप करके इसे समायोजित करें। 80 kV विकल्प का चयन करें, और छवि कैप्चर करने के लिए अधिग्रहण प्रारंभ करें क्लिक करें।

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Representative Results

यह आकलन करने के लिए कि ईवी के लिए कौन से एसईसी क्रोमैटोग्राफी अंश समृद्ध थे, एसईसी कॉलम को ई कोलाई एमपी 1-वातानुकूलित संस्कृति माध्यम के 2 एमएल के साथ लोड किया गया था, जिसे टीएफएफ द्वारा 1,000 गुना केंद्रित किया गया था, और अनुक्रमिक अंश एकत्र किए गए थे। एमआरपीपीएस का उपयोग करते हुए, यह पाया गया कि अंश 1-6 में सबसे अधिक ईवी (चित्रा 2 ए) शामिल थे। बाद के अंशों में बहुत कम ईवी थे, जिसमें ईवी-मुक्त प्रोटीन (चित्रा 2 बी) के बजाय शामिल थे। ईवी मुख्य रूप से व्यास में <100 एनएम थे (चित्रा 2 सी)। टीईएम ने ईवी-संवर्धन और आकार की पुष्टि की, विशेष रूप से अंश 2-6 (चित्रा 2 डी) में।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि विधियां ईवी को गैर-ईवी-संबद्ध प्रोटीन से अलग करने में सक्षम थीं, ई कोलाई एमपी 1 का एक पुनः संयोजक तनाव जो साइटोलिसिन ए-नैनोलुसीफेरस संलयन प्रोटीन और मुक्त (गैर-फ्यूज्ड) एमचेरी को व्यक्त करता है ( चित्रा 3 ए में स्कीमाटाइज्ड)। साइटोलिसिन ए संलयन प्रोटीन को पहले ई कोलाई ईवी 14 के साथ जुड़ा हुआ दिखाया गया था। एमचेरी फ्लोरेसेंस की निगरानी के लिए, प्रत्येक क्रोमैटोग्राफी अंश से 100 μL एलिकोट को 96-वेल प्लेट के कुओं में स्थानांतरित किया गया था। उनकी प्रतिदीप्ति को क्रमशः अवशोषण और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के रूप में 580 एनएम और 620 एनएम का उपयोग करके एक माइक्रोप्लेट रीडर में मापा गया था।

इसी तरह, ल्यूमिनेसेंस माप के लिए, प्रत्येक अंश के 20 μL एलिकोट को 384-वेल प्लेट में लूसिफेरस परख समाधान की समान मात्रा के साथ मिलाया गया था, जिसे 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया था, और दृश्य प्रकाश ल्यूमिनेसेंस मापा गया था। यह देखा गया कि ईवी-समृद्ध अंशों (अंश 2-7) में बाद के अंशों की तुलना में उच्च नैनोलुसीफेरेज़ गतिविधि थी, लेकिन गैर-ईवी-संबद्ध एमचेरी से केवल बहुत कम फ्लोरोसेंट सिग्नल था (चित्रा 3 बी)। नकारात्मक नियंत्रण ईवी की समान मात्रा से पृष्ठभूमि संकेत (नैनोलुसिफेरस अभिव्यक्ति की कमी वाले मिलान किए गए जीवाणु तनाव से अलग) ईवी अंशों में > 1,000 गुना कम था। सकारात्मक नियंत्रण (एक नैनोलुसीफेरस-व्यक्त करने वाले बैक्टीरियल सेल पेलेट) से संकेत ईवी अंशों (नहीं दिखाया गया) की तुलना में लगभग 1,000 गुना अधिक था। उत्तरार्द्ध को क्रमशः विश्लेषण की गई कोशिकाओं या ईवी उत्पन्न करने वाली सेल कल्चर सामग्री की प्रारंभिक मात्रा के लिए सामान्यीकृत किया गया था। इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग (चित्रा 3 सी) द्वारा अंश 2-5 में नैनोलुसीफेरस के ईवी-एसोसिएशन की पुष्टि की गई थी, जो छोटे ~ 20 एनएम ईवी के भीतर लेबलिंग का अवलोकन करता है।

अंत में, अन्य जीवाणु प्रजातियों के लिए इस प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता का आकलन करने के लिए, ईवी को निम्नलिखित विविध एनारोबिक बैक्टीरिया के ~ 100 एमएल संस्कृतियों से अलग किया गया था: ए म्यूसिनोफिला, बी थेटाओमाइक्रोन, बी ब्रेव, और बी डेंटियम बीएचआई संस्कृति माध्यम में तैयार किए गए थे। एक नियंत्रण के रूप में, ईवी को नए बीएचआई संस्कृति माध्यम से अलग किया गया था। जबकि ईवी उपज प्रजातियों द्वारा भिन्न होती है, यह फिर से देखा गया कि प्रारंभिक क्रोमैटोग्राफी अंश 1-4 ईवी के लिए समृद्ध थे (चित्रा 4 ए)। जटिल बीएचआई माध्यम में ईवी-आकार के कण भी शामिल थे, हालांकि इन तैयारियों में कुल ईवी उपज का <25% (चित्रा 4 ए, ब्लैक बार्स)। इन जीवाणुओं के ईवी भी मुख्य रूप से आकार में <100 एनएम (चित्रा 4 बी) पाए गए।

Figure 2
चित्रा 2: प्रारंभिक क्रोमैटोग्राफी अंशों में प्रतिनिधि ई कोलाई एमपी 1 ईवी क्षालन। (ए) अनुक्रमिक 2 एमएल क्रोमैटोग्राफी अंशों में एमआरपीएस द्वारा कण गणना। एसईसी इनपुट 2 एमएल तक केंद्रित बैक्टीरियल कल्चर सुपरनैटेंट का 2 एल था। ठोस रेखा माध्य का प्रतिनिधित्व करती है; छायांकित क्षेत्र एसईएम को दर्शाता है। (बी) प्रत्येक अंश में प्रोटीन एकाग्रता। (ग) एमआरपीएस द्वारा मापे गए अंश 3 ईवी का आकार वितरण। ठोस रेखा माध्य का प्रतिनिधित्व करती है; छायांकित क्षेत्र 95% सीआई का प्रतिनिधित्व करता है। ध्यान दें कि उपकरण कणों <50 एनएम की मात्रा निर्धारित नहीं कर सकता है। (डी) अनुक्रमिक, पूल किए गए क्रोमैटोग्राफी अंशों और ताजा संस्कृति माध्यम (नियंत्रण) के ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। सभी छवियों को एक ही पैमाने (100 एनएम) के साथ लिया गया था। वाइड-फील्ड टीईएम छवियों को पूरक चित्रा एस 3 में दिखाया गया है। संक्षेप: ईवी = बाह्य पुटिका; एमआरपी = माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रतिरोधक पल्स सेंसिंग; एसईसी = आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी; एसईएम = माध्य की मानक त्रुटि; सीआई = आत्मविश्वास अंतराल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एसईसी द्वारा ईवी-मुक्त प्रोटीन से ई कोलाई एमपी 1 ईवी का पृथक्करण। (ए) साइटोप्लाज्म में पुनः संयोजक एमचेरी (लाल) को व्यक्त करने वाले ई कोलाई एमपी 1 का योजनाबद्ध और पेरिप्लाज्म-ट्रैफिकिंग साइटोलिसिन ए-नैनोलुसिफेरस फ्यूजन प्रोटीन (पीला हीरे)। (बी) नैनोलुसीफेरस बायोल्यूमिनेसेंस गतिविधि और एमचेरी फ्लोरेसेंस की निगरानी क्रमिक रूप से एल्यूटेड क्रोमैटोग्राफी अंशों में की गई थी। ऊर्ध्वाधर बिंदीदार रेखा चित्र 2 में विश्लेषण के आधार पर ईवी-समृद्ध अंशों की सीमा का प्रतिनिधित्व करती है। (सी) ईवी अंशों (एफ 2-5) को एंटी-नैनोलुसिफेरस एंटीबॉडी के साथ धुंधला होने के बाद इम्यूनोगोल्ड लेबल किया गया था। सियान एरोहेड्स छोटे ईवी के साथ सोने-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी कोलोकलाइजिंग की ओर इशारा करते हैं। वाइल्डटाइप ई कोलाई एमपी 1 से नियंत्रण ईवी में नगण्य गैर-विशिष्ट धुंधलापन था। दोनों छवियों को एक ही पैमाने (100 एनएम) के साथ लिया गया था। वाइड-फील्ड टीईएम छवियों को पूरक चित्रा एस 4 में दिखाया गया है। संक्षेप: ईवी = बाह्य पुटिका; एसईसी = आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी; एफ = अंश; टीईएम = ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी; क्लाइआ-एनलुक = साइटोलिसिन ए-नैनोलुसीफेरेज़ संलयन प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: विभिन्न जीवाणु प्रजातियों से ईवी का अलगाव। संकेतित प्रजातियों को एनारोबिक परिस्थितियों में बीएचआई माध्यम में 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था। (ए) ईवी को एमआरपीएस द्वारा मापा गया पहले 4 एसईसी अंशों में ईवी एकाग्रता द्वारा अलग किया गया था। माध्य ± एसईएम। काली सलाखों ताजा बीएचआई माध्यम (नियंत्रण) के एक बैच में पाए गए कणों का प्रतिनिधित्व करती हैं। (बी) अंश 2 में ईवी का आकार वितरण। संक्षेप: ईवी = बाह्य पुटिका; एमआरपी = माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रतिरोधक पल्स सेंसिंग; एसईसी = आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी; बीएचआई = मस्तिष्क हृदय जलसेक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा एस 1: पी 114-एमचेरी-क्लाइलक प्लास्मिड। (ए) पी 114-एमचेरी-क्लाइलक प्लास्मिड का नक्शा। (बी) जे 23114-एमचेरी-क्लाया-एनएलयूसी क्षेत्र का अनुक्रम। वायलेट, जे 23114 प्रमोटर; गुलाबी, एमचेरी जीन; ग्रे, क्लाइआ जीन; ग्रीन, लिंकर अनुक्रम; नारंगी, एनलुक जीन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: स्पर्शरेखीय प्रवाह निस्पंदन (टीएफएफ) सेटअप योजनाबद्ध। बार्ब-होस के साथ टयूबिंग टीएफएफ डिवाइस से जुड़ी थी, जैसा कि दिखाया गया है। फ़ीड प्रवाह ट्यूबिंग फ़िल्टर किए गए, वातानुकूलित संस्कृति माध्यम पोत में डूबना शुरू होता है, पेरिस्टालिक पंप के माध्यम से जारी रहता है, और टीएफएफ डिवाइस इनलेट पोर्ट से जुड़ता है। वापसी प्रवाह टीएफएफ डिवाइस आउटलेट पोर्ट से शुरू होता है और फ़िल्टर किए गए, वातानुकूलित संस्कृति माध्यम की सतह के ऊपर समाप्त होता है। वैकल्पिक रूप से, निस्पंदन की दर को बढ़ाने के लिए एक बैकप्रेशर क्लैंप (जैसे, एक स्क्रू नट + बोल्ट या सरल पेपर क्लैंप) का उपयोग किया जा सकता है। चूंकि पंप वातानुकूलित माध्यम को प्रसारित करता है, टीएफएफ डिवाइस के भीतर विकसित दबाव से अल्ट्राफिल्ट्रेशन और घटकों <100 केडीए को निस्पंदन / अपशिष्ट प्रवाह ट्यूबिंग के माध्यम से हटा दिया जाता है, जिसे निपटान के लिए एक अलग पोत (मैजेंटा) में एकत्र किया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 3: वाइडफील्ड ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। अनुक्रमिक, पूल क्रोमैटोग्राफी अंशों और ताजा संस्कृति माध्यम (नियंत्रण) की टीईएम छवियां चित्रा 2 डी में दिखाई गई हैं। छवियों से पता चलता है कि ई कोलाई एमपी 1 बाह्य पुटिकाएं प्रारंभिक क्रोमैटोग्राफी अंशों में होती हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 4: चित्रा 3 सी के लिए वाइडफील्ड टीईएम छवियां। ईवी अंशों (एफ 2-5) को एंटी-नैनो-लूसिफेरस एंटीबॉडी के साथ धुंधला होने के बाद इम्यूनोगोल्ड-लेबल किया गया था। सियान एरोहेड्स छोटे ईवी के साथ सोने-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी कोलोकलाइजिंग की ओर इशारा करते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक विधि: पुनः संयोजक ई कोलाई एमपी 1 तनाव के लिए पी 114-एमचेरीक्ल्यूक। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

उपरोक्त प्रोटोकॉल में, एक विधि का वर्णन किया गया है जो स्केलेबल है और विश्वसनीय रूप से ईवी को विभिन्न ग्राम-नकारात्मक / सकारात्मक और एरोबिक / एनारोबिक बैक्टीरिया से अलग करता है। इसमें पूरी प्रक्रिया में कई संभावित स्टॉपिंग पॉइंट हैं, हालांकि वातानुकूलित बैक्टीरियल कल्चर मीडिया से ईवी को अलग करने के लिए 48 घंटे से अधिक समय लेने से बचना बेहतर है।

सबसे पहले, इसमें वातानुकूलित जीवाणु संस्कृति माध्यम उत्पन्न करने के लिए बैक्टीरिया की खेती शामिल है। यह पाया गया कि संस्कृति समय को कम से कम 48 घंटे तक बढ़ाने और इष्टतम विकास माध्यम का उपयोग करने से ईवी उपज को अधिकतम करने में मदद मिलती है। यह संभावना है कि प्रत्येक जीवाणु प्रजातियों को इन दो मापदंडों के संबंध में अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। बैक्टीरियल कल्चर की मात्रा भी यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि वांछित अनुप्रयोग के लिए पर्याप्त ईवी को अलग किया जाता है। इन विट्रो अध्ययनों के लिए, ईवी को आमतौर पर न्यूनतम 100 एमएल से अलग किया जाता है, जबकि विवो अध्ययनों में , ईवी को आमतौर पर संस्कृति माध्यम के > 1 एल से अलग किया जाता है। फिर, प्रत्येक जीवाणु तनाव की ईवी उत्पादन विशेषताएं और डाउनस्ट्रीम परख के लिए आवश्यक ईवी राशि न्यूनतम प्रारंभिक संस्कृति मात्रा को निर्धारित करेगी।

एक बार वातानुकूलित संस्कृति माध्यम उपलब्ध होने के बाद, कोशिकाओं और बड़े गैर-ईवी मलबे को हटा दिया जाना चाहिए। यह पाया गया कि सेंट्रीफ्यूजेशन इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है। जैसा कि ऊपर प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया है, दो बढ़ते जी-फोर्स सेंट्रीफ्यूजेशन किए गए थे। कभी-कभी, अतिरिक्त 10,000 × जी सेंट्रीफ्यूजेशन किया जाता है यदि यह ध्यान दिया गया था कि दूसरे स्पिन की गोली कॉम्पैक्ट नहीं है। इसके बाद, इस सतह पर तैरने वाले का बाँझ निस्पंदन 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से किया जाता है। अपर्याप्त सेंट्रीफ्यूजेशन इस निस्पंदन चरण के क्लॉगिंग और खराब प्रदर्शन की ओर जाता है। यह ध्यान दिया गया कि निस्पंदन दर काफी धीमी होने के बाद सुपरनैटेंट को फ़िल्टर करना जारी रखने से फ़िल्टर की खराबी और माता-पिता के बैक्टीरिया के साथ ईवी तैयारी का संदूषण हो सकता है। फ़िल्टर के लगातार क्लॉगिंग का समाधान यह है कि स्टेरिलिटी सुनिश्चित करते हुए सुपरनैटेंट को फिर से सेंट्रीफ्यूज और / या फिर से फ़िल्टर किया जाए। वर्णित सेंट्रीफ्यूजेशन और वैक्यूम-संचालित निस्पंदन चरणों का परीक्षण कुल 4 एल बैक्टीरियल कल्चर के लिए किया गया था। ईवी अलगाव के आगे के स्केल-अप में संशोधन की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, इन दोनों चरणों को संभावित रूप से 0.22 μm तक घटते छिद्र आकार के साथ संगत फ़िल्टर उपकरणों का उपयोग करके अनुक्रमिक पंप-संचालित निस्पंदन के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। हालांकि, इसका परीक्षण किया जाना बाकी है।

वर्तमान प्रोटोकॉल में, बैक्टीरियल कल्चर की शुरुआती मात्रा के आधार पर दो विविधताओं का वर्णन किया गया है। वॉल्यूम <100 एमएल के लिए, संस्कृति मीडिया को केंद्रित करने के लिए केन्द्रापसारक अल्ट्राफिल्ट्रेशन उपकरणों का उपयोग करें। इन चरणों में एमडब्ल्यूसीओ महत्वपूर्ण है। स्तनधारी ईवी के लिए, >300 केडीए एमडब्ल्यूसीओ का उपयोग पहले11,12 किया गया था। हालांकि, इसके परिणामस्वरूप बैक्टीरिया से बहुत खराब ईवी पैदावार हुई, संभवतः छोटे आकार के वितरण के कारण। इस प्रकार, 100 केडीए एमडब्ल्यूसीओ का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। एक छोटे एमडब्ल्यूसीओ का भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह लंबे सेंट्रीफ्यूजेशन समय और छोटे आणविक भार दूषित पदार्थों के कम हटाने से जुड़ा हुआ है, जिससे नमूना चिपचिपाहट बढ़ जाती है। प्रोटोकॉल के दौरान नमूने के विभिन्न शुरुआती संस्करणों को केंद्रित करने में मदद करने के लिए 100 केडीए एमडब्ल्यूसीओ पर अल्ट्राफिल्ट्रेशन उपकरणों के विभिन्न आकारों को रखना भी सहायक है।

वैकल्पिक रूप से, नमूना आकार के लिए काफी >100 एमएल, नमूना केंद्रित करने के लिए पंप संचालित टीएफएफ का उपयोग करें; फिर, 100 केडीए एमडब्ल्यूसीओ का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। यह विधि अर्ध-स्वचालित फैशन में संस्कृति माध्यम की बड़ी मात्रा को संसाधित करने की अनुमति देती है। शुरुआती संस्कृति मात्रा के लिए उचित आकार का टीएफएफ डिवाइस प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। उपयोग किए गए डिवाइस को निर्माता द्वारा 200 एमएल तक सामग्री के प्रसंस्करण पर रेट किया गया है। लगभग 2 एल तक प्रक्रिया करना संभव था। हालांकि, बड़ी मात्रा में संसाधित करने की कोशिश करते समय निस्पंदन दर में एक गंभीर गिरावट देखी गई, जिससे प्रक्रिया को रोकने और अतिरिक्त प्रसंस्करण से पहले डिवाइस को साफ करने की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, प्रत्येक जीवाणु संस्कृति की विशेषताएं और शुरुआती सामग्री की मात्रा टीएफएफ डिवाइस के आवश्यक आकार को निर्धारित करेगी। इसके अलावा, प्राप्य पंप गति टीएफएफ के लिए एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर है। ~ 100 एमएल / मिनट की कम दरों पर, क्लैंप का उपयोग करके टीएफएफ डिवाइस में बैकप्रेशर को बढ़ाना आवश्यक था, जैसा कि पूरक चित्रा एस 2 में इंगित किया गया है, निस्पंदन की सुविधा के लिए, जो फिल्टर की फाउलिंग दर को बढ़ाता है। उचित परिशोधन और आटोक्लेविंग के बाद टयूबिंग को 2 बार तक पुन: उपयोग किया गया था।

एक बार नमूना केंद्रित होने के बाद, इसे ईवी को अलग करने के लिए एसईसी कॉलम पर लोड किया जा सकता है। छोटे ईवी अलगाव के लिए अनुकूलित वाणिज्यिक कॉलम का उपयोग किया गया था। छोटे शुरुआती नमूनों के लिए, 0.5 एमएल लोडिंग वॉल्यूम वाले कॉलम का उपयोग करें, और 2 एल तक बड़े शुरुआती नमूनों के लिए 2 एमएल लोडिंग वॉल्यूम वाले कॉलम का उपयोग करें। यह संभावना है कि संस्कृतियों >2 एल शुरू करने के प्रसंस्करण के लिए बड़े कॉलम की आवश्यकता होगी। ईवी-अनुकूलित कॉलम के निर्माता वर्तमान में एसईसी कॉलम प्रदान करते हैं जो >100 एमएल केंद्रित सामग्री को स्वीकार करने में सक्षम हैं।

पृथक ईवी को चिह्नित करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जाता है, जिनमें से अधिकांश व्यापक रूप से उपलब्ध हैं। सामान्यीकरण अधिकांश परखों के लिए प्रोटीन एकाग्रता पर आधारित था क्योंकि यह बहुत छोटे ईवी <50 एनएम का पता लगाने के लिए अन्य परिमाणीकरण विधियों (अर्थात्, एमआरपीपीएस जैसी प्रौद्योगिकियों द्वारा कण परिमाणीकरण) की अक्षमता से प्रभावित नहीं होता है। एमआरपीएस और अन्य नैनोपार्टिकल परिमाणीकरण प्रौद्योगिकियां विभिन्न अंशों के बीच ईवी के सापेक्ष परिमाणीकरण में उपयोगी बनी हुई हैं।

एमआरपीएस परिमाणीकरण का एक महत्वपूर्ण पहलू कमजोर पड़ने का स्तर है। जब उचित रूप से पतला किया जाता है, तो पता लगाए गए ईवी की आवृत्ति ज्यादातर मामलों में पहचान की सीमा तक बढ़नी चाहिए, क्योंकि उपकरण कणों <50 एनएम की मात्रा निर्धारित नहीं कर सकता है। अपर्याप्त कमजोर पड़ने से उच्च उपकरण शोर होगा, जो एक शिखर >65 एनएम (अनुशंसित सी -300 माइक्रोफ्लुइडिक्स कारतूस का उपयोग करते समय) के साथ एक कृत्रिम घंटी के आकार का वक्र उत्पन्न करेगा। आकार आवृत्ति वितरण डेटा विश्लेषण के दौरान, पर्याप्त कमजोर पड़ने के बावजूद, 50 एनएम (उपकरण का पता लगाने की पूर्ण सीमा) और 60 एनएम के बीच एक कलात्मक शिखर अभी भी कभी-कभी देखा जाता है। यह बहुत छोटे बैक्टीरियल ईवी की महत्वपूर्ण संख्या (जैसा कि टीईएम, चित्रा 2 डी में कल्पना की गई है) की उपस्थिति के कारण होने की संभावना है जो एमआरपीएस द्वारा सटीक पहचान की सीमा से नीचे हैं और फिर से उपकरण शोर का कारण बनते हैं। इस मामले में, देखे गए "शिखर" से छोटे डेटा बिंदुओं को बाहर करें, जो दिए गए नमूने की मात्रा की वास्तविक निचली सीमा बन जाती है।

जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, ईवी बहुतायत, कुल प्रोटीन एकाग्रता और गैर-ईवी प्रोटीन की प्रचुरता का परिमाणीकरण एलोटेड क्रोमैटोग्राफी अंशों में उपयोगकर्ताओं को यह तय करने में मदद कर सकता है कि डाउनस्ट्रीम परख के लिए किन अंशों का उपयोग करना है। उदाहरण के लिए, पूल किए गए अंश 7-8 (चित्रा 2 डी) में छोटे ईवी का पता लगाया गया था; हालांकि, उनकी बहुतायत तुरंत पूर्ववर्ती अंशों की तुलना में कम थी, जबकि कुल प्रोटीन एकाग्रता (चित्रा 2 बी) अधिक थी। यह सुझाव दे सकता है कि अंश 7-8 में गैर-ईवी-संबद्ध प्रोटीन की उच्च मात्रा होती है और इस प्रकार कुछ डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए वांछनीय नहीं हो सकता है।

सारांश में, एक बहुमुखी ईवी अलगाव प्रोटोकॉल जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सामग्रियों पर निर्भर करता है, यहां वर्णित है। व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित तरीकों की तुलना में इस पद्धति का महत्व यह है कि इसमें ऐसे चरण शामिल हैं जिन्हें विभिन्न उपयोगकर्ताओं द्वारा आसानी से पुन: पेश किया जा सकता है और अत्यधिक स्केलेबल है। यह विवो अध्ययनों में पर्याप्त सामग्री के उत्पादन की सुविधा के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। इसका उपयोग 100 एमएल से 2 एल की संस्कृतियों से ईवी को अलग करने के लिए किया गया था। उपलब्ध टीएफएफ उपकरणों की विस्तृत श्रृंखला को देखते हुए, यह संभव है कि इस प्रोटोकॉल को कुछ संशोधन के साथ बड़े पैमाने पर शुद्धिकरण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। वर्णित अलगाव प्रोटोकॉल मुख्य रूप से ईवी के भौतिक गुणों पर आधारित है, अर्थात् उनका आकार, और इस अध्ययन में वर्णित लोगों से परे जीवाणु प्रजातियों पर लागू होने की संभावना है।

वर्णित प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि यह छोटे ईवी के अलगाव का पक्ष लेता है, विशेष रूप से <100 एनएम, जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में देखा गया है। पूर्व रिपोर्टों में बड़े बैक्टीरियल ईवी15,16 की उपस्थिति का भी वर्णन किया गया है। बड़े बैक्टीरियल ईवी के अलगाव के लिए ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल के संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है, उदाहरण के लिए, बड़े ईवी के लिए अनुकूलित एसईसी कॉलम का उपयोग करके। ऐसे एसईसी कॉलम व्यावसायिक रूप से भी उपलब्ध हैं। इसके अलावा, अन्य प्रोटोकॉल संभवतः उच्च ईवी शुद्धता प्राप्त कर सकते हैं (उदाहरण के लिए, घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन या इम्यूनो-आइसोलेशन)। हालांकि, इन विधियों में इस अध्ययन में वर्णित विधियों के थ्रूपुट और स्केलेबिलिटी की कमी है। भविष्य में अतिरिक्त शुद्धिकरण चरणों के साथ इस प्रोटोकॉल के संशोधन से तैयारी की उपज और शुद्धता में और वृद्धि हो सकती है, जो प्रयोगात्मक और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हो सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

ऊपर वर्णित शोध एनआईएच टीएल 1 टीआर 002549-03 प्रशिक्षण अनुदान द्वारा समर्थित था। हम कण आकार विश्लेषक उपकरण तक पहुंच की सुविधा के लिए डॉ जॉन सी टिल्टन और ज़चारी ट्रॉयर (केस वेस्टर्न रिजर्व यूनिवर्सिटी) को धन्यवाद देते हैं; कण आकार वितरण डेटा के विश्लेषण के साथ तकनीकी सहायता के लिए ल्यू ब्राउन (स्पेक्ट्राडाइन); कॉर्नेल विश्वविद्यालय में डॉ डेविड पुतनाम पीसीएए-जीएफपी प्लास्मिड14 प्रदान करने के लिए; और पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय में डॉ मार्क गौलियन हमें ई कोलाई एमपी 113 प्रदान करने के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes Thermo Scientific 3430 it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution Electron microscopy sciences 15700
250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles ThermoFisher 010-1495
500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles ThermoFisher 010-1493
65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter Beckman Coulter 392077 Allows Vivacell to fit in rotor
Akkermansia mucinophila ATCC BAA-835
Amicon-15 (100 kDa MWCO) MilliporeSigma UFC910024
Avanti J-20 XPI centrifuge Beckman Coulter No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482 ATCC 29148
Bifidobacterium breve NCIMB B8807
Bifidobacterium dentium ATCC 27678
Brain Heart infusion (BHI) broth Himedia M2101 After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.
C-300 microfluidics cartridge Spectradyne
Chloramphenicol MP Biomedicals ICN19032105
Electron microscope FEI company Tecnai G2 SpiritBT
Escherichia coli HST08 (Steller competent cells) Takara 636763
Escherichia coli MP1 Dr. Mark Goulian (gift) commensal bacteria derived from mouse gut
Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter ThermoFisher 010-0151-05 used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture
Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor ThermoFisher F12-6x500-LEX fits 6 x 500 mL bottles
Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper Electron microscopy sciences FCF-400-CU
Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution) Electron microscopy sciences 16100
Hematin ChemCruz 207729B Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as  1.2 mg/mL
Infinite M Nano+ Microplate reader Tecan This equibment was used to measure the mCherry fluorescence
In-Fusion  HD Cloning Plus Takara 638909 For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors
JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 368690
Lauria Bertani (LB) broth, Miller Difco 244620
L-Cysteine Hydrochloride J.T. Baker 2071-05 It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK cole-parmer - special HV-30800-08 connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK cole-parmer - special HV-30800-24 connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm Masterflex HV-07555-00
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor Masterflex EW-07514-10
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft Cole Palmer EW-06435-16 low-binding/low-leaching tubing
Menadione (Vitamin K3) MP 102259 Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL
MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK Repligen D04-E100-05-N TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant
Nano-Glo Luciferase Assay System Promega N1110 This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein
NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808 R&D Systems MAB10026
nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument Spectradyne
nCS1 Viewer Spectradyne Analysis software for particle size distribution
OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer NEB M0482 DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking
Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes Eppendorf 30108450
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix NEB M0492 DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning
qEV original, 35 nm Izon maximal loading volume of 0.5 mL
qEV rack Izon for use with the qEV-original SEC columns
qEV-2, 35 nm Izon maximal loading volume of 2 mL
Qubit fluorometer ThermoFisher Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)
Qubit protein assay kit ThermoFisher Q33211 Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C.
Sorvall Lynx 4000 centrifuge ThermoFisher 75006580
SpectraMax i3x Microplate reader Molecular Devices This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence
Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL) MilliporeSigma S2GPU01RE
S2GPU02RE
S2GPU05RE		 One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.
Uranyl acetate Electron microscopy sciences 22400
Vinyl anaerobic chamber Coy Lab
Vivacell 100, 100,000 MWCO PES Sartorius VC1042
Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron) MilliporeSigma WHA68093002 to filter MRPS diluent

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References

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जीव विज्ञान अंक 176
<em>एस्चेरिचिया कोलाई</em> और अन्य बैक्टीरिया से बाह्य पुटिकाओं का स्केलेबल अलगाव और शुद्धिकरण
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Watson, D. C., Johnson, S., Santos,… More

Watson, D. C., Johnson, S., Santos, A., Yin, M., Bayik, D., Lathia, J. D., Dwidar, M. Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria. J. Vis. Exp. (176), e63155, doi:10.3791/63155 (2021).

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