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バイオサーファクタントの組み合わせを使用したオイル回収の強化

Published: June 3, 2022 doi: 10.3791/63207
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemical Engineering and Biotechnology, Indian Institute of Technology Delhi, 2Indian Oil Corporation, Research and Development Faridabad

Summary

我々は、バイオサーファクタント産生微生物のスクリーニングおよび同定に関与する方法を例示する。バイオサーファクタントのクロマトグラフィー特性評価および化学的同定のための方法、残留油回収の増強におけるバイオサーファクタントの産業的利用可能性の決定も提示される。

Abstract

バイオサーファクタントは、極性の異なる2つの相間の表面張力を低下させることができる界面活性化合物である。バイオサーファクタントは、毒性が低く、生分解性が高く、環境適合性があり、極端な環境条件に対する耐性があるため、化学界面活性剤の有望な代替品として浮上しています。ここでは、バイオサーファクタントを産生し得る微生物のスクリーニングに用いられる方法を例示する。バイオサーファクタント産生微生物を、ドロップ崩壊、油拡散、およびエマルジョンインデックスアッセイを用いて同定した。バイオサーファクタント産生は、微生物メンバーの増殖による培地の表面張力の低下を決定することによって検証した。また、バイオサーファクタントの特性評価および同定に関与する方法についても説明します。抽出されたバイオサーファクタントの薄層クロマトグラフィー、続いてプレートの示差染色を行い、バイオサーファクタントの性質を決定した。LCMS、 1HNMR、およびFT-IRを用いて、バイオサーファクタントを化学的に同定した。我々はさらに、シミュレートされたサンドパックカラムにおける残留油回収率を高めるための産生されたバイオサーファクタントの組み合わせの適用を評価するための方法を例示する。

Introduction

バイオサーファクタントは、微生物によって産生される両親媒性界面活性分子であり、2つの相間の表面および界面張力を低下させる能力を有する1。典型的なバイオサーファクタントは、通常、糖部分またはペプチド鎖または親水性アミノ酸から構成される親水性部分と、飽和または不飽和脂肪酸鎖2から構成される疎水性部分とを含む。その両親媒性の性質のために、バイオサーファクタントは2つの相の間の界面で集合し、境界における界面張力を低下させ、1つの相の他方の相への分散を促進する1,3。これまでに報告されている様々なタイプのバイオサーファクタントには、炭水化物がエステル結合を介して長鎖脂肪族またはヒドロキシ脂肪族酸に連結された糖脂質(例えば、ラムノリピッド、トレハロ脂質およびソホロリピッド)、脂質がポリペプチド鎖に結合しているリポペプチド(例えば、サーファクチンおよびリケニシン)、および通常、多糖−タンパク質複合体(例えば、 エムルサン、リポサン、アラサンおよびリポマンナン)4。微生物によって産生される他のタイプのバイオサーファクタントには、脂肪酸、リン脂質、中性脂質、および粒子状のバイオサーファクタント5が含まれる。バイオサーファクタントの最も研究されたクラスは糖脂質であり、その中でほとんどの研究はラムノリピッド6について報告されている。ラムノ脂質は、1分子または2分子の長鎖脂肪酸(通常はヒドロキシデカン酸)に連結されたラムノース(親水性部分を形成する)の1つまたは2つの分子を含有する。ラムノ脂質は、緑膿菌7から最初に報告された一次糖脂質である。

バイオサーファクタントは、それらが提供する様々なユニークで独特の特性のために、化学的対応物と比較してますます注目を集めています8.これらには、より高い特異性、より低い毒性、より大きな多様性、調製の容易さ、より高い生分解性、より良い発泡性、環境適合性および極端な条件下での活性が含まれる9。バイオサーファクタントの構造的多様性(図S1)は、それらに化学的対応物10に対する優位性を与える別の利点である。それらの臨界ミセル濃度(CMC)は通常、化学界面活性剤11よりも数倍低いので、それらは一般に、より低い濃度でより効果的かつ効率的である。それらは非常に耐熱性(最大100°C)であり、より高いpH(最大9)および高い塩濃度(最大50g / L)に耐えることができると報告されており12 、それによって極端な条件への曝露を必要とする工業プロセスにおいていくつかの利点を提供する13。生分解性と毒性が低いため、バイオレメディエーションなどの環境用途に適しています。彼らが提供する利点のために、彼らは食品、農業、洗剤、化粧品、石油産業のような様々な産業でますます注目を集めています11。バイオサーファクタントはまた、石油汚染物質および有毒汚染物質を除去するための油修復において多くの注目を集めている14。

ここでは、 Rhodococcus sp. IITD102、 Lysinibacillus sp. IITD104、およびPaenibacillus sp. IITD108によって産生されたバイオ サーファクタ ントの産生、特性評価、および適用を報告する。強化された油回収のためのバイオサーファクタントの組み合わせのスクリーニング、特性評価、および適用に関連するステップを 図1に概説する。

Figure 1
図1:バイオサーファクタントの組み合わせを使用した油回収率を高める方法。 ステップワイズなワークフローが表示されます。作業は4段階で行った。まず、微生物株を培養し、ドロップ崩壊アッセイ、油拡散アッセイ、エマルジョンインデックスアッセイ、および表面張力測定を含む様々なアッセイによってバイオサーファクタントの産生についてスクリーニングした。次いで、バイオサーファクタントを無細胞ブロスから抽出し、その性質を薄層クロマトグラフィーを用いて同定し、LCMS、NMR、およびFT-IRを用いてさらに同定した。次のステップでは、抽出されたバイオサーファクタントを一緒に混合し、得られた混合物の油回収率を高める可能性をサンドパックカラム技術を用いて決定した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

バイオサーファクタントを産生するこれらの微生物株のスクリーニングは、微生物の増殖による無細胞培地の表面張力の低下のドロップ崩壊、油拡散、エマルジョンインデックスアッセイおよび決定によって行われた。バイオサーファクタントを抽出し、特徴付け、LCMS、 1HNMR、およびFT-IRによって化学的に同定した。最後に、これらの微生物によって産生されるバイオサーファクタントの混合物を調製し、シミュレートされた砂パックカラムで残留油を回収するために使用した。

本研究は、残留油回収率を高めるためのバイオサーファクタント組合せのスクリーニング、同定、構造特性評価、および適用に関与する方法のみを示している。微生物株15、16によって産生されるバイオサーファクタントの詳細な機能的特徴付けを提供していない。任意のバイオサーファクタントの詳細な機能特性評価のために、臨界ミセル決定、熱重量分析、表面濡れ性、および生分解性などの様々な実験が行われる。しかし、この論文は方法論文であるため、残留油回収を促進するためのバイオサーファクタントの組み合わせのスクリーニング、同定、構造特性評価、および適用に焦点を当てています。これらの実験はこの研究には含まれていない。

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Protocol

1. 微生物株の増殖

  1. ルリアブロス粉末2gの重量を量り、250mL円錐フラスコに50mLの蒸留水を加える。粉末が完全に溶解するまで内容物を混合し、蒸留水を使用して体積を100mLにする。
  2. 同様に、100mLのルリアブロスのフラスコをさらに2つ準備し、フラスコの首に綿のプラグを置きます。
  3. 綿のプラグをアルミホイルで覆い、フラスコを121°Cおよび15psiで15分間オートクレーブして媒体を滅菌する。
  4. オートクレーブ処理後、メディアを室温まで冷却します。
  5. 菌株の初代培養物の調製のために、接種ループを用いてLAプレートから単一のコロニーを選び、5mLの滅菌ルリアブロスを含む試験管に接種する。
  6. 試験管を180rpmで30°Cで一晩インキュベートする。
  7. 100mLのオートクレーブ処理されたルリアブロスを含むフラスコに、一晩成長させた種子培養物1mLを層流キャビネット内のフラスコに加えることによって接種する。
  8. フラスコをロータリーインキュベーター中で30°Cおよび180rpmで7日間インキュベートする。
  9. インキュベーション期間の終了後、フラスコを回収し、培養液を遠沈管に移す。培養物を4,500 x g で4°Cの冷蔵遠心分離機で20分間遠心分離する。
  10. 無細胞上清を新鮮なビーカーに穏やかに注ぎ、バイオサーファクタント産生のスクリーニングアッセイに使用します。

2. バイオサーファクタント生産のためのスクリーニングアッセイ

注:以下のセクションでは、市販の界面活性剤(サポニン)を陽性対照として使用し、水および非接種培地を陰性対照として使用した。

  1. ドロップコラプスアッセイ
    1. 清潔なスライドガラスを取り、スライドの表面を200μLの油でコーティングします。
    2. 20μLの無細胞上清を油の中心に加え、2〜3分間邪魔されずに放置する。
      注:滴が崩壊した場合は、上清をバイオサーファクタントの存在について陽性と評価してください。
  2. 油拡散アッセイ
    1. ペトリプレート(直径75mm)に20mLの二重蒸留水をとり、水面に200μLの原油を加える。
    2. 20 μLの無細胞上清を油の中心に加え、1分間邪魔されずに放置する。
      注:油の変位のためにクリアリングゾーンが形成された場合は、バイオサーファクタントの存在について上清を陽性と評価します。
  3. エマルジョンインデックスアッセイ(E24 アッセイ)
    1. ガソリン(ガソリン)と無細胞の上澄み液をそれぞれ4mLを清潔なガラス試験管に加える。
    2. 混合物を3分間激しく渦巻き、次の24時間邪魔しないでおきます。
    3. 24時間後、液カラム全体の高さ(cm)に対する乳化層の高さ(cm)の割合としてE24 指数を求める。
      Equation 1
      注:24時間後にエマルジョン(水中の油分または油中の水)が観察された場合、上清にはバイオサーファクタントが含まれている可能性があります。
  4. 表面張力測定
    注:表面張力は、デュノイリング法17を用いて測定した。この実験で使用した機器( 材料表を参照)は非常に敏感なので、ガラス容器とプローブを適切に洗浄してください。
    1. システムの電源を入れ、関連するソフトウェアをダブルクリックして開きます。
    2. 表面張力が決定される液体でガラス容器をきれいにしなさい。
    3. 液体(40mL)を容器に加え、容器ホルダーに容器を取り付ける。
    4. プローブホルダーのロックを解除し、プローブを取り付けます。次に、手動コントローラのロックボタンを押してプローブホルダーを ロック します。
    5. 手動コントローラーを使用して、プローブが液体の表面から約 2 ~ 3 mm 離れるようにプラットフォームの高さを調整します。
    6. 次に、ソフトウェアを使用して表面張力を測定します。画面の左上のパネルにある [ファイル ]をクリックします。「 ワークスペースを開く」をクリックします。ポップアップウィンドウが表示されます。
    7. 下にスクロールし、 K100をダブルクリックします:表面と界面張力 アイコン。
    8. 次に、画面の左上隅にある [ファイル ]アイコンをクリックします。[ 新しいデータベース]をクリックします。データを保存する名前を入力し、[ OK]をクリックします。
    9. もう一度、[ ファイル>新しい測定>SFT>リング]をクリックします。測定の名前を入力します。構成テンプレートに SFT リングが表示されていることを確認します。
    10. 「測定 構成」 ウィンドウに詳細を入力するには、測定に使用するプローブと容器を選択します。また、液相と気相の詳細を記入してください。
      注:液相は水で、気相は空気です。液相の密度は、無細胞上清の密度である。これは、液体の50mLの重量を取り、密度をKg/m3として計算することによって決定することができる。
    11. 次に、[ 手順] タブをクリックして、次の詳細を入力します:検出速度:6 mm/分、検出感度:0.005 g、検索速度:6 mm/分、検索感度:0.005 g、測定速度:3 mm /分、測定感度:0.001 g、浸漬深度:3 mm、戻り距離:10%、補正: Harkins & Jordan、最大値: 5。 [OK]をクリックします。
    12. ポップアップウィンドウで、データを保存するデータベースを選択し、[ OK]をクリックします。
      注:ここで新しいデータベースを作成することも、既存のデータに新しい測定値を追加することもできます。
    13. 次に、画面上部中央にある [再生 ]ボタンをクリックします。システムがスクリプトの実行を開始します。システムが安定すると、表面が検出されます。プローブを液体に浸し、プローブを前後に動かして、形成されたラメラの張力を検出します。
    14. 結果を取得するには、画面の中央左側にある 測定 アイコンをクリックします。[ データ ]をクリックし、決定された表面張力を書き留めます。
    15. 測定が完了したら、プラットフォームの高さを下げ、プローブと容器を装置からロック解除して取り外します。
      注:バイオサーファクタント産生による表面張力の低下を決定するには、未接種LBを対照として使用するべきである。

3. バイオサーファクタント抽出

  1. 2 N HClを使用して無細胞上清のpHを2に調整し、混合物を4°Cで一晩保存する。
  2. 等量のクロロホルム - メタノール混合物(2:1)を上清に加え、20分間激しく混合する。
  3. 相分離が起こるように混合物を邪魔しないでおきます。
  4. 水とメタノールを含む上相を除去し、バイオサーファクタントを含む下相をヒュームフード内で蒸発させる。
  5. 有機相を蒸発させた後、蜂蜜色の粗バイオサーファクタントを3mLのクロロホルムに再溶解し、この混合物を使用してバイオサーファクタントのさらなる同定および特性評価を行う。

4. 乳化安定性試験

  1. 異なる温度での乳化安定性
    1. 5 mL の無細胞上清を異なる試験管に取ります。
    2. 各試験管に5mLのガソリンを加え、3分間ボルテックスで激しく混合する。
    3. 試験管を異なる温度(30°C、40°C、50°C、60°C、および70°C)の異なる水浴中で一晩インキュベートする。
    4. 24時間後、前述のようにエマルジョン指数を推定します。
  2. 異なるpH値での乳化安定性
    1. 5 mLの無細胞上清を清潔な試験管に取ります。
    2. 1 N HClおよび1 N NaOHを使用して、無細胞上清(2、4、6、8、および10)のpHを調整する。
    3. 試験管に等量のガソリンを加え、3分間ボルテックスで激しく混合する。
    4. 試験管を室温で24時間邪魔されずに放置する。
    5. 前述のようにエマルジョン指数を推定します。
  3. 異なる塩濃度での乳化安定性
    1. 5 mLの無細胞上清を清潔な試験管に取ります。
    2. 上清に異なる量の塩(NaCl)を加える(0 g/L、5 g/L、10 g/L、20 g/L、60 g/L、80 g/L)。
    3. 3分間ボルテックス処理することによって細胞遊離上清中の塩を溶解する。
    4. 試験管に等量のガソリンを加え、3分間ボルテックスで激しく混合する。
    5. 試験管を室温で24時間邪魔されずに放置する。
    6. 24時間後のエマルジョン指数を推定する。

5. バイオサーファクタントの性質を決定する

  1. 抽出したバイオサーファクタントのTLC
    1. TLCプレート上のバイオサーファクタントの20 μLをスポットします。一度に2 μLをスポットします。
    2. バイオサーファクタントを3つの異なるTLCプレート上に配置します。
    3. クロロホルム:メタノール(2:1)を含む溶離液の100mL混合物を調製し、溶離液をTLCチャンバーに加える。チャンバーの蓋を閉じ、20分間飽和させます。
    4. プレートを乾燥させた後、クロロホルムメタノール混合物で飽和させたチャンバー内にTLCプレートを置き、TLCを流す。
    5. 溶離液がTLCプレートの上部(上部から1cm離れた場所)に達したら、プレートを取り出し、風乾させます。
  2. 脂質検出のための染色
    1. きれいなTLCチャンバーを取り、ヨウ素のいくつかの(5-10)顆粒を新鮮なチャンバーに加え、チャンバーを5〜10分間飽和させます。
    2. TLCプレートをチャンバー内に置き、黄色の斑点の発生を観察します。斑点が現れたら、バイオサーファクタントを脂質成分の存在について陽性とスコア付けする。
  3. ペプチドまたはアミノ酸検出のための染色
    1. 0.4gのニンヒドリンを20mLのブタノールに溶解してニンヒドリン溶液を調製する。混合物に0.6mLの100%氷酢酸を加える。
    2. TLCプレートにニンヒドリン溶液をスプレーし、2分間空気乾燥させます。プレートを110°Cで加熱し、色の発色を観察した。
      注:青い斑点が現れた場合は、バイオサーファクタントをペプチド鎖またはアミノ酸の存在について陽性と評価してください。
  4. 炭水化物検出のための染色
    1. 1mLのH2SO4を含む48mLの氷酢酸に2mLのp-アニスアルデヒドを加えてp-アニスアルデヒドの溶液を調製する。混合物に0.6mLの酢酸を加える。
    2. 混合物をTLCプレート上に均等にスプレーし、2分間風乾させる。
    3. プレートを110°Cでインキュベートし、スポットの発生をモニターする。
      注:緑色または茶色の斑点が現れた場合は、バイオサーファクタントを炭水化物の存在について陽性と評価してください。

6. バイオサーファクタントの化学的同定

  1. バイオサーファクタントのLCMS
    1. 抽出したバイオサーファクタント25mgをクロロホルム1mLに溶解する。
    2. C18列を使用してLCMS(基準スキャン周波数10秒のロックスプレー構成)を実行します。
    3. 移動相としてクロロホルム:メタノール(1:1)を使用し、0.1 mL/minの流速で2 μLのサンプルをカラムに注入します。
    4. 実験パラメータを、極性:ES正、キャピラリー電圧:3kV、ソース温度:80°C、脱溶媒温度:300°C、脱溶媒ガス流量:7,000L/h、トラップガス流量:0.40mL/minに設定しました。
    5. 20分の検出時間中に100~1,200Daの範囲をスキャンし、正のESモードでイオンを調査する。
    6. 任意の質量分析ソフトウェアを使用してm / z値を定量的に分析します。
    7. 分析するには、ソフトウェアにログインします。
    8. バッチ検索をクリックし、得られた質量のリストを入力します。結果を正電荷モードで調査し、付加物としてM+HおよびM+Naを使用する。精度を 10 PPM に維持し、表示構造にチェックマークを付けます。
    9. [検索]をクリックし、化合物のリストから、PPMレベルが最も低い化合物を選択します。
  2. 1バイオサーファクタントのH NMR
    注:バイオサーファクタントの 1HNMRは、400MHz NMR分光計を用いて行った( 材料表を参照のこと)。
    1. 5mgのバイオサーファクタントを1mLの重水素化クロロホルム(CdCl3)に溶解する。
    2. 混合物をNMRチューブに移す。チューブを適切にキャップし、チューブをスパナに挿入します。アジャスターチューブを使用してチューブの高さを調整します。
    3. チューブをスパナとともにNMRマシンに置き、以下の手順に従ってNMRスペクトルを取得します。
    4. サンプル管タイプを選択するには:sxN、ここでNは、関連するソフトウェアにおいて、チューブが置かれた位置(例えば、sx 13、チューブが13番目の 位置に置かれた場合)である。
    5. edc と入力し 、Enter キーを押して、データを保存できる新しいフォルダーを作成します。
    6. ポップアップが表示されます。リスト内のCdCl 3 をクリックして溶媒を選択し、サンプルの名前を入力します。
    7. プロトコルを開始するには、"getprosol" と入力します。溶剤をロックするには、「CD cl3 をロック」と入力します。
    8. "topshim" と入力してサンプルをシムし、最後に "rga;zgefp" と入力してデータを取得します。これにより、プロトコルが開始されます。
    9. スペクトルが得られたら、「apk;abs n」と入力し、Enter キーを押して位相とベースラインの補正を行います。
    10. プライマリピークを選択するには、「pp」と入力して Enter キーを押し ます。強烈なピークのみを選択するには、「mi」と入力し、ピークを選択する強度を入力します。デフォルト値は 0.2 です。
    11. ピークを統合するには、「 統合」(Integrate ) をクリックし、統合するピークの左側にカーソルを置き、カーソルを押しながらカーソルをクリックしてピークの周りをドラッグします。
    12. 左上隅の [ファイル ]をクリックしてデータを保存し、[ 保存]をクリックします。
    13. サンプルは、「sx ej」と入力することでマシンから取り出すことができます。
    14. ピークを分析し、H原子の環境を決定します。
  3. バイオサーファクタントのフーリエ変換赤外分光法
    注:抽出されたバイオサーファクタントのFT−IRは、ATRモードで市販の分光光度計を用いて行った( 材料表を参照)。
    1. 分光光度計をオンにし、パージ、乾燥剤、検出器を確認します。
    2. スペクトルを収集するには、まずサンプルを配置せずにバックグラウンドスペクトルを収集します。
    3. 抽出したバイオサーファクタントを取り、完全に乾燥させます。乾燥したバイオサーファクタントをダイヤモンドクリスタルの上に直接置き、圧力をかけてATRタッチポイントを押します。
    4. ソフトウェアで、スキャン回数(30と入力)を選択し、400 cm-1 ~ 4,000 cm-1 のスペクトルをスキャンします。
    5. [ OK] をクリックして、サンプルスペクトルをスペクトルウィンドウに追加します。
    6. [ ファイル]>[名前を付けて保存]>クリック し、ファイル名に続いて拡張子.spaを入力して[ OK]をクリックします。

7.バイオサーファクタントの適用(強化された油回収)

注:この実験では、二重蒸留水を陰性対照として用い、10%SDS、10%Tween 80、および10%市販のサポニンを陽性対照として用いた。

  1. ガラスを取り、底の出口をグラスウールとガラスビーズで密封します。
  2. 土壌の上部に液体を加え、流れを下部に集めることができるように、砂質土壌でカラムを充填します。ホルダーに柱を取り付け、土の上にガラスビーズを加えます。
  3. カラムに 50 mL のブライン溶液をフラッディングし、流れを集めて細孔容積を決定します。
    細孔容積=上部に加えられた塩水の量 - 回収されたフロースルーの体積。
  4. カラムの上部から添加した後、原油を強制的に通過させてカラムからブラインを除去します。カラムから出てくるブラインとオイルの量を集めて、初期オイル飽和量を決定します。カラムから放出されるブラインの量は、初期オイル飽和量または元のオイルになります。
  5. カラムを 24 時間邪魔しないでおきます。
  6. 24 時間後、カラムに 10 細孔容のブラインを溢れさせ、カラムから出てくるオイルを収集して、二次オイル回収率を推定します。二次油回収後にカラムに残された油分が残油に相当する。
  7. 抽出したバイオサーファクタント(工程3.5後に抽出)をガラスビーカーに等量加えることにより、バイオサーファクタントの混合物を調製する。バイオサーファクタントをカラムの上部に追加し、カラムを24時間インキュベートします。
  8. 24時間後、油と水の量を測定して、油の追加または増強された油回収率を決定します。カラムから放出される油の量は、回収された残留油に対応する。
  9. 次の式で強化されたオイル回収率を推定します。
    Equation 2

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Representative Results

3つの細菌株(Rhodococcus sp. IITD102、Lysinibacillus sp. IITD104、およびPaenibacillus sp. IITD108)を、ドロップ崩壊アッセイ、油置換アッセイ、エマルジョンインデックスアッセイ、および表面張力低下を含む様々なアッセイによってバイオサーファクタントの産生についてスクリーニングした。3つの細菌株すべておよび化学界面活性剤の溶液の無細胞上清は、滴下崩壊をもたらし、したがって、バイオサーファクタントの存在について陽性とスコア付けされた(図4a)。一方、水の液滴は崩壊しなかったため、バイオサーファクタントの存在について陰性にスコアリングされた。3つの細菌培養物の市販の界面活性剤および無菌上清も、油拡散アッセイにおいて油の層を置換することに成功し、したがって、バイオサーファクタントの存在について陽性とスコア付けされた(図4b)。一方、水は油を置き換えることができなかったため、スコアは陰性でした。エマルジョンインデックスアッセイにおいて、市販の界面活性剤および3つの微生物株の上清を含む試験管において、安定なエマルジョンが観察された。しかしながら、未接種培養液を含む試験管には乳液は認められなかった(図4c)。これは再び、Rhodococcus sp. IITD102、Lysinibacillus sp. IITD104、およびPaenibacillus sp. IITD108がバイオサーファクタントを産生することを示唆した。 バイオサーファクタント産生の確認は、無細胞ブロスの表面張力を測定し、それを未接種対照と比較することによって得られた。Rhodococcus sp. IITD102、Lysinibacillus sp. IITD104、およびPaenibacillus sp. IITD108のバイオサーファクタントは、培地の表面張力をそれぞれ58.89 mN/mから45.41 mN/m、45.82 mN/m、および28.43 mN/mに低下させることが見出された(図5)。

IFT測定はリングプル法を用いて行った。3つの株すべてからのバイオサーファクタントは、様々な水性相および有機相間の界面張力を有意に低下させることができた(表S1)。表面張力および界面張力測定は、3つの株すべてがバイオサーファクタントを産生することを確認する。

Rhodococcus sp. IITD102、Lysinibacillus sp. IITD104、およびPaenibacillus sp. IITD108の無細胞培養物からのバイオサーファクタントの溶媒抽出は、それぞれ820mg/L、560mg/L、および480mg/Lのバイオサーファクタント濃度をもたらした。

図4Cで観察されるように、バイオサーファクタントによって形成されたエマルジョンは、油中の水マイクロエマルジョンであった。乳化安定性アッセイは、バイオサーファクタントが多様な環境条件下で良好な安定性を示すことを示した(図6)。製造されたエマルジョンは、試験した多様な温度(図6a)、pH値(図6b)、および塩濃度(図6c)にわたって非常に安定であった。

バイオサーファクタントの性質を決定するために薄層クロマトグラフィーを行った。プレートをヨウ素蒸気で染色すると、全てのバイオサーファクタントおよび対照において黄色の斑点の発生が生じた( Bacillus sp. IITD 106由来のバイオサーファクタント(図7a)。これは、バイオサーファクタントが脂質部分を含むことを示した。ニンヒドリンで染色したところいずれのTLCプレートにおいても青色の斑点は得られなかった(図7b)。これは、バイオサーファクタントがペプチド部分を全く含まないことを示した。青色および緑色の斑点は、アニスアルデヒド染色で染色した場合、全てのTLCプレートにおいて観察された(図7c)。これは、バイオサーファクタントが炭水化物部分を含むことを示した。TLCの結果から、全てのバイオサーファクタントは糖脂質であると結論付けられた。

LCMSを用いたバイオサーファクタントの化学的同定により、 Rhodococcus sp. IITD102および Lysinibacillus sp. IITD104が同種のバイオサーファクタントを産生することが明らかになり、これは480.25Daの質量を有するジラムノピラン酸ヒドロキシデカン酸として同定された。バイオサーファクタントの構造は 、1HNMRおよびFT−IRデータによって支持された(図8)。

1HNMRスペクトルにおいて、7.2で得られた化学シフトは、カルボキシル基のプロトンを表した。メチル基のプロトンに対応する化学シフトは、1〜2ppmの範囲で得られた。アルキル基に結合したプロトンに対応するシフトは2.3ppmで得られた。ロドコッカス・エスピーIITD102およびリシニバチルス・エスピーIITD104から抽出されたバイオサーファクタントのFT−IRスペクトルは、波数3,290cm−1に強いピークの存在を示し、これはOH官能基の存在を確認する。波数2,951cm-1の小さなピークはCH延伸に相当する。1,620cm−1における強いピークは、バイオサーファクタント中のカルボキシル基の存在を表した。1,530、1,410、1,200、および1,060で得られた他のピークは、それぞれアルキル、CH3、C-O-C、およびC-CH3官能基の存在を確認した。NMRおよびFT-IRデータの両方が、LCMS研究から決定されたバイオサーファクタントの構造を支持した。Paenibacillus sp. IITD108(図9)由来の粗バイオサーファクタントのLCMSは、バイオサーファクタントのバルク疎水性コアを形成する3つの脂質鎖を含むラムノリピッドを生成することを示した。バイオサーファクタントは、802Daの質量を有する2デカノイル)−αLラムノピラノシル−3−ヒドロキシデカン酸として同定された。LCMSの結果は、1HNMRおよびFT-IRデータによって支持された。

オイル回収を強化するためのセットアップを 図2に示します。

Figure 2
図2:サンドパックカラム技術を使用したオイル回収を強化するための実験セットアップ。 土壌を充填したカラムをホルダーに取り付けた。底部出口はグラスウールとガラスビーズで密封した。二次回収後、カラム内部の残油を、それにバイオサーファクタント混合物を添加して油分回収率を高めた。チューブをカラムの底部に置き、溶出画分を回収するために使用した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

シミュレートされた強化油回収実験では、カラムの上部に添加された50mLのブラインのうち、フロースルーで12mLが回収されたため、細孔容積は38mLと推定された。油をカラムに強制的に通過させると、33mLのブラインがカラムから放出された。これは初期油飽和量を表した。10細孔容のブラインを使用した二次回収は、10mLの油の溶出をもたらした。カラムに残った残油は23mLであった。バイオサーファクタントの混合物を含む水は、カラムから13mLの油を回収することができた(図3)。

Figure 3
図3:サンドパックカラムを使用したオイル回収率のシミュレーション コントロールおよび試験カラムの両方の初期油飽和容量は約33mLであった。二次油回収中に、コントロールカラムと試験カラムの両方から約10mLの油を回収した。試験および対照カラムの回収プロファイルの違いは、カラムに残った残留油の回収中にのみ観察された。バイオサーファクタント混合物は、試験カラムから残った13mLの残留油のさらなる回収をもたらしたが、対照カラムでは、このステップで1.03mLの油のみが回収された。これは、バイオサーファクタント混合物が、リザーバからの残留油の回収を促進する上で大きな可能性を秘めていることを示している。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

これは、石油回収率の向上を表していました。したがって、バイオサーファクタントの混合物を含む水は、カラムから残留油の56.52%を回収することができた(表1)。一方、10%SDS、10%Tween 80、および10%サポニンの溶液は、カラムから85%、68%、および73%の残留油を回収することができた。

パラメーター フラッディングの制御 複合バイオサーファクタントフラッディング 10 % SDS 10 % トゥイーン 10 % サポニン
PV (mL) 37 38 38 35 37
OOIP / IOSV (mL) 33 33 33 29 33
POS (%) 89.91 86.84 86.84 82.85 89.18
SV (ミリリットル) 330 330 330 330 330
ソル (mL) 9.77 10 11.5 9.2 10
中華民国 (mL) 23.23 23 21.5 18.8 23
ロス(%) 70.39 69.69 65.15 64.82 69.69
Rv (ml) 60 60 60 60 60
ロール (mL) 1.03 13 18.5 12.8 16.8
アオール(%) 4.43 56.5 85 68.08 73.04

ここで、PV = ブラインによる初期カラム飽和後に決定された細孔容積、OOIP = 元のオイル、IOSV = 初期オイル飽和量、POS = オイル飽和率、Sv = 二次回収のために添加されたブラインの量、SOR = ブラインフラッディング後に回収された二次オイル、ROC = 二次回収後のカラム内の残留油、ROS = 残留オイル飽和度、ROS = バイオサーファクタントフラッディング後に回収された残留オイル、 AOR = 回収された追加のオイル

表 1: サンドパックカラムでのオイル回収率のシミュレーション。

Figure 4
図4:バイオサーファクタント産生のためのスクリーニングアッセイ(a)ドロップ崩壊アッセイ:3つの細菌株の化学界面活性剤および無細胞上清が滴崩壊をもたらした間、油コーティングされた表面に添加された後、水滴は崩壊しなかった。(b)油置換アッセイ:3つの細菌株の化学界面活性剤および無細胞上清が油の層を変位させた間、水滴は油の変位をもたらさなかった(c)エマルジョン指数アッセイ:無細胞上清および市販界面活性剤溶液はすべて、安定したエマルジョン指数の形成をもたらした。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:バイオサーファクタント産生による表面張力低下 微生物増殖による培地の表面張力の低下の定量は、微生物メンバーによるバイオサーファクタント産生を確認した。 Rhodococcus sp. IITD 102および Lysinibacillus sp. IITD 104の成長により、培地の表面張力は59mN/mから45mN/mに低下した。 Paenibacillus sp. IITD 108の成長により、培地の表面張力は59 mN/mから28 mN/m に低下しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:様々な(a)温度、(b)pH値および(c)塩濃度での乳化安定性。 3つの微生物株の上清および市販界面活性剤の混合物を用いて生成された全てのエマルジョンは、異なる環境条件下で大きな安定性を示す。試験した温度、pH、および塩濃度の範囲内で、決定されたエマルジョン指数は類似しており、バイオサーファクタントが極端な環境条件下で使用できることを示唆する様々な要因のより高い値でEIの大きな減少は観察されなかった。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:バイオサーファクタントのTLC特性評価(a)ヨウ素蒸気で染色されたプレート:TLCプレート上に発達した様々なスポットは、抽出されたバイオサーファクタントが脂質基を含む様々な化合物の混合物であることを示している。青い矢印でマークされた斑点は、脂質部分の存在に対して陽性に染色されたバイオサーファクタントを表す。他のスポットは、粗バイオサーファクタントの混合物中に存在する残りの化合物を表す。(b)ニンヒドリンで染色されたプレート:プレートをニンヒドリンで染色したときに紫色の斑点は現れなかった。これは、バイオサーファクタント混合物中のアミノ酸の非存在下および(c)アニスアルデヒドで染色されたプレート:TLCプレート上に明るい緑色および黄色の斑点が現れ、これらは糖を含む化合物を表す。黒い矢印でマークされた斑点は、炭水化物部分の存在に対して陽性に染色されたバイオサーファクタントを表す。ヨウ素とアニスアルデヒドの両方で染色された斑点は、脂質部分と炭水化物部分の両方を含む化合物を表し、おそらく糖脂質バイオサーファクタントである可能性があります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 8
図8:Rhodococcus sp. IITD 102およびLysinibacillus sp. IITD 104から抽出されたバイオサーファクタントの化学的特徴付け。 (a)は、Rhodococcus sp. IITD 102およびLysinibacillus sp. IITD 104から抽出されたバイオサーファクタントのFT−IRスペクトルを表し、(b)は、Rhodococcus sp. IITD 102およびLysinibacillus sp. IITD 104から抽出されたバイオサーファクタントのH1 NMRスペクトルを表し、(c)は、Rhodococcus sp. IITD 102およびLysinibacillus sp. IITD 104から抽出された粗バイオサーファクタントの構造を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 9
図9:Paenibacillus sp. IITD 108から抽出されたバイオサーファクタントの化学的特徴付け。 (a)はPaenibacillus sp. IITD 108から抽出されたバイオサーファクタントのFT-IRスペクトルを表し、(b)はPaenibacillus sp. IITD 108から抽出されたバイオサーファクタントの1H NMRスペクトルを表し、(c)はPaenibacillus sp. IITD 108から抽出された粗バイオサーファクタントの構造を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図S1:異なるタイプのバイオサーファクタントの構造。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表S1:水と炭化水素の間の界面張力(IFT)に対するバイオサーファクタントの影響。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

バイオサーファクタントは、化学界面活性剤の魅力的な代替品になりつつある生物学的に活性な成分の最も汎用性の高いグループの1つです。洗剤、塗料、化粧品、食品、医薬品、農業、石油、水処理など、濡れ性の向上、CMCの低下、構造の多様化、環境への優しさなど、幅広い用途があります18。これは、バイオサーファクタント産生が可能なより多くの微生物株を発見することへの関心の高まりにつながった。ここでは、ロドコッカス・エスピーIITD 102、リシニバチルス・エスピーIITD 104、およびパエニバチルス・エスピーIITD 108によって産生されるバイオサーファクタントの混合物のスクリーニング、同定、および適用のための方法を例示し、油回収を増強する。バイオサーファクタント産生は、落下崩壊、油拡散、エマルジョンインデックスアッセイによってスクリーニングし、微生物増殖による培地の表面張力の低下を測定することによって確認した。ロドコッカスからの糖脂質バイオサーファクタント(ラムノ脂質およびトレハロ脂質)の産生に関する種々の報告は、文献19、20、21、22、23、24に入手可能である。Najafiらは、Paenibacillus sp. alvei ARN6325からのリポペプチドバイオサーファクタントの産生および最適化を報告している。Bezzaらは、Paenibacillus dendritiformis CN526によって産生されるリポペプチドバイオサーファクタントによるピレンの生分解を報告している。バイオサーファクタント(リポペプチドおよび糖脂質)の産生は、パエニバチルス27、28、29、30、31の他の株によっても報告されている。様々な種のリシニバチルスがバイオサーファクタント32、33、34を産生することが報告されている。リシニバチルス・スファエリカスは、疎水性農薬35の可溶化が可能なラムノリピッドを産生することが報告されている。

バイオサーファクタントが化学的対応物よりも提供する利点の1つは、極端な環境条件下での安定性です。Rhodococcus sp. IITD 102、Lysinibacillus sp. IITD 104、およびPaenibacillus sp. IITD 108によって産生されたバイオサーファクタントは、温度、pH、および塩濃度の異なる範囲下での安定性についてアッセイされ、これらのパラメータの極値の下で安定であることが判明した。 以前、Habibらは、炭化水素分解ロドコッカス属によって産生されたリポペプチドを報告し、異なる範囲の温度、pH値、および塩濃度にわたって安定性を示した36。無機塩の濃度の増加は、エマルション37の安定性を増加させることが報告されている。凝集または分離するコロイドの傾向は、粒子相互作用38の間に関与する引力(ファンデルウォール力)および反発力(静電力)の関数である。水に溶けた塩の結晶は、独自の電荷を確立し、放出されたイオンはエマルジョン液滴に吸着します。塩濃度を高めると、第2層の膨張および反発が減少する。また、イオンの電荷密度が高いほど、電気層の長さは低くなります。したがって、Na2+などの2価カチオンは、1価カチオン39と比較してより安定なエマルジョンの形成をもたらす。

バイオサーファクタントが化学界面活性剤よりも有するもう一つの利点は、それらが生分解性であるということです40。Zengらは、合成界面活性剤Triton X 100、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩(LAS)およびラムノリピッドの分解能力を比較し、ラムノリピッドバイオサーファクタントが完全に分解されたのに対し、LASおよびTriton X 100は部分的にしか分解されなかったことを見出した41。Liuらはまた、合成界面活性剤CTAB、Triton X 100およびSDSとは対照的に、ラムノリピッドは毒性を示さず、 枯草菌 および他の堆肥微生物42によって容易に分解され得ることを報告している。

3つの微生物株すべてによって産生されたバイオサーファクタントは、糖脂質であることが判明した。ロドコッカスは、種々の研究グループ20、21、23によって糖脂質を産生することが以前に報告されている。リシニバチルスおよびパエニバチルスによる糖脂質バイオサーファクタント産生に関する同様の報告は、文献31、32、35、43、44においても入手可能である。バイオサーファクタントの化学的同定は、それらがラムノ脂質であることを明らかにした。ラムノリピッドは、脂質鎖45に連結された1つまたは2つのラムノース単位を含む糖脂質バイオサーファクタントのクラスである。それらはバイオサーファクタントの最も研究されたタイプです。種々の微生物株がラムノ脂質7、46、47、48、49を産生することが報告されている。ラムノ脂質は、残油の回収率を高める高い可能性を示すことが報告されている50、51、52、53。我々の研究では、Rhodococcus sp. IITD 102、Lysinibacillus sp. IITD 104、およびPaenibacillus sp. IITD 108によって製造されたバイオサーファクタントの混合物が、シミュレートされたサンドパックカラム試験で残留油の約56.52%を回収することに成功したことを発見しました。これは、バイオサーファクタントの混合物が、地上貯水池からの残留油の回収に使用できることを示した。同様のサンドパック試験において、Sunらは、バイオサーファクタントが残留油54の50%の回収に成功したと報告している。枯草菌の無細胞ブロスを含有するバイオサーファクタントもまた、残留油の33%を回収するのに有効であることが報告されている55。27%および26%〜36%の残留油回収は、DarvishiらおよびWahabi et al.56,57によっても報告されている。

貯水池からの残留油の回収のためのバイオサーファクタントの経済的評価は、EORにおけるバイオサーファクタントの利用が経済的に実行可能な選択肢であることを示している。Moutinhoらは、市販のバイオサーファクタント(ラムノ脂質)の典型的なコストは、1kgあたり約59.6米ドルであると報告した58。別の研究では、バイオサーファクタント濃度28mg/Lのバイオサーファクタントが残留油分回収率を高め、52.5m3の追加油分59の生産につながったことも報告されている。研究は、10mg/Lのバイオサーファクタント濃度が油回収を動員するのに十分であることを示した。報告されたデータによると、52.5 m3の追加オイルを生産するために必要なバイオサーファクタントの量は約0.525 kgです。52.5 m3オイルの生産の全体的なコストは約US $ 21463であり、そのうち30ドルのみがバイオサーファクタントの生産コストです。データは、バレルあたりの石油生産におけるバイオサーファクタントのパーセンテージコストがわずか0.0000139%であることを示しています。

我々の結果は、バイオサーファクタントの組み合わせが貯水池から残留油を回収するために効率的に使用できることを示唆している。我々の知る限り、これは、異なる微生物株によって産生されるバイオサーファクタントの混合物を用いて、貯留層からの残留油の回収を促進することに関する最初の報告である。我々の研究は、強化された油回収におけるバイオサーファクタントのスクリーニング、構造特性評価、および適用に関与する方法を明確に説明しているが、この研究は、様々な用途におけるそれらの効率に影響を与えるバイオサーファクタントの詳細な機能的特徴付けを提供していない。臨界ミセル濃度は、ミセルを形成する際の任意の界面活性剤の効率の尺度であり、その有意義な使用のための界面活性剤の限界濃度を指定するが、本研究60では決定されていない。同様に、バイオサーファクタントの熱安定性は、EORに対するリザーバ条件下でのその適用性を決定するものであり、61も記載されていない。バイオサーファクタントは、いくつかの用途において、抗バイオフィルム剤としても使用される。それらの表面濡れ性は、それらの抗バイオフィルムの性質を決定する上で重要な役割を果たしている。表面濡れ性試験も本研究62では行われていない。バイオサーファクタントの様々な用途において重要な他の機能的特性、すなわちそれらの生分解性および抗菌性を含むものもまた、この研究63、64では決定されていない。そこで、バイオサーファクタントの構造特性評価に着目しました。対象用途に応じて、安定性、生分解性、抗菌活性などの機能的特性評価が行われてもよい。

液滴崩壊アッセイおよび油拡散アッセイにおいては、視認性を高めるために、ある程度の色を有する油を使用する方がよい。油展延アッセイでは、エマルジョンは24時間後に観察されるべきである。軽い泡は、形成された場合、24時間で崩壊する。テンシオメータは非常に敏感な機器であるため、表面張力測定中は、最後の測定の持ち越しによる誤差を避けるために、すべての測定の前に容器とプローブを適切に洗浄する必要があります。バイオサーファクタントの抽出は、無細胞上清へのクロロホルムメタノール混合物の添加を含む。この工程は、ヒュームフード内で行うか、抽出混合物の移送直後にフラスコをアルミニウム箔で覆うべきである。EOR実験での二次回収中は、カラムからオイルが出てこなくなるまで、ブライン溶液を過剰に添加する必要があります。

この方法は、カラムからの残留油の回収におけるバイオサーファクタントの混合物の範囲を議論する。このプロセスは多くの要因に依存します。初期培養物が収穫される微生物の成長段階。いくつかのバイオサーファクタントは、対数相で産生されることが報告されており、他の生物界面活性剤は固定相で産生されることが報告されている。培養物は、バイオサーファクタント産生が最大に達した特定の段階でそれに応じて収穫されるべきである。バイオサーファクタントスクリーニングアッセイは感度が低いため、特定の株のバイオサーファクタント産生能に関する結論に達する前にすべてのアッセイを実施すべきである。バイオサーファクタントの精製は、粗バイオサーファクタント中のバイオサーファクタントの濃度が低い場合、バイオサーファクタントの化学的特性評価の前に行うべきである。強化されたオイル回収実験は、カラムの充填に使用される土壌の種類に大きく依存します。土壌は完全に乾燥していなければならず、より大きな顆粒および他の固体汚染物質を除去するためにふるいにかけられるべきである。砂質土壌と乾燥した庭の土壌(等しい比率)の混合物は、カラムを充填するために好ましいべきである。カラム出口は、実験の過程でカラムから土壌が漏れないように、グラスウールとガラスビーズで適切に密封する必要があります。

記載された方法は、シミュレートされたサンドパックカラム実験における追加の油の回収における産生されたバイオサーファクタントおよびそれらの混合物の意義を決定するのに有用である。異なるバイオサーファクタントは、異なる官能基65を含むため、異なる特異性を有する。バイオサーファクタントの組み合わせは、多様な炭化水素の可溶化を可能にし、したがって、貯留層からの残留油回収を増加させる。記載された方法は、油井からの油回収率の向上などのフィールド用途におけるバイオサーファクタント混合物の可能性を決定するのに役立ちます。

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Disclosures

著者らは利益相反がないと宣言しています。

Acknowledgments

著者らは、インド政府バイオテクノロジー省の財政支援に感謝したい。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml pipette Eppendorf, Germany G54412G
1H NMR Bruker Avance AV-III type spectrometer,USA
20 ul pipette Thermo scientific, USA H69820
Autoclave JAISBO, India Ser no 5923 Jain Scientific
Blue flame burner Rocker scientific, Taiwan dragon 200
Butanol GLR inovations, India GLR09.022930
C18 column Agilent Technologies, USA 770995-902
Centrifuge Eppendorf, Germany 5810R
Chloroform Merck, India 1.94506.2521
Chloroform-d SRL, India 57034
Falcon tubes Tarsons, India 546041 Radiation sterilized polypropylene
FT-IR Thermo Fisher Scientific, USA  Nicolet iS50
Fume hood Khera, India 47408 Customied
glacial acetic acid Merck, India 1.93002
Glass beads Merck, India 104014
Glass slides Polar industrial Corporation, USA Blue Star 75 mm * 25 mm
Glass wool Merk, India 104086
Hydrochloric acid Merck, India 1003170510
Incubator Thermo Scientific, USA MaxQ600 Shaking incubator
Incubator Khera, India Sunbim
Iodine resublimed Merck, India 231-442-4  resublimed Granules
K12 –Kruss tensiometer Kruss Scientific, Germany K100
Laminar air flow cabnet Thermo Scientific, China 1300 Series A2
LCMS Agilent Technologies, USA 1260 Infinity II
Luria Broth HIMEDIA, India M575-500G Powder
Methanol Merck, India 107018
Ninhydrin Titan Biotech Limited, India 1608
p- anisaldehyde Sigma, USA 204-602-6
Petri plate Tarsons, India 460090-90 MM Radiation sterilized polypropylene
Saponin Merck, India 232-462-6
Sodium chloride Merck, India 231-598-3
Test tubes Borosil, India 9800U06 Glass tubes
TLC plates Merck, India 1055540007
Vortex GeNei, India 2006114318
Water Bath Julabo, India SW21C

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環境科学 第184号
バイオサーファクタントの組み合わせを使用したオイル回収の強化
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Nissar Zargar, A., Patil, N., Kumar, … More

Nissar Zargar, A., Patil, N., Kumar, M., Srivastava, P. Enhanced Oil Recovery using a Combination of Biosurfactants. J. Vis. Exp. (184), e63207, doi:10.3791/63207 (2022).

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