Summary
Hier beschrijven we de constructie van nulmutanten van Aeromonas in specifieke glycosyltransferasen of regio's die glycosyltransferasen bevatten, de beweeglijkheidstests en flagellenzuivering die worden uitgevoerd om de betrokkenheid en functie van hun gecodeerde enzymen in de biosynthese van een glycaan vast te stellen, evenals de rol van deze glycaan in bacteriële pathogenese.
Abstract
De studie van glycosylatie in prokaryoten is een snel groeiend gebied. Bacteriën herbergen verschillende geglycosyleerde structuren op hun oppervlak waarvan de glycanen een stamspecifieke barcode vormen. De geassocieerde glycanen vertonen een hogere diversiteit in suikersamenstelling en -structuur dan die van eukaryoten en zijn belangrijk in bacteriële-gastheerherkenningsprocessen en interactie met de omgeving. Bij pathogene bacteriën zijn glycoproteïnen betrokken geweest bij verschillende stadia van het infectieuze proces en glycaanmodificaties kunnen interfereren met specifieke functies van glycoproteïnen. Ondanks de vooruitgang die is geboekt in het begrip van glycaansamenstelling, structuur en biosyntheseroutes, blijft het begrip van de rol van glycoproteïnen in pathogeniciteit of interactie met de omgeving echter zeer beperkt. Bovendien worden in sommige bacteriën de enzymen die nodig zijn voor eiwitglycosylatie gedeeld met andere polysaccharide biosynthetische routes, zoals lipopolysaccharide en capsule biosynthetische routes. Het functionele belang van glycosylatie is in verschillende bacteriën opgehelderd door mutatie van specifieke genen waarvan wordt gedacht dat ze betrokken zijn bij het glycosyleringsproces en de studie van de impact ervan op de expressie van het doelglycoproteïne en de modificerende glycaan. Mesofiele Aeromonas hebben een enkelvoudig en O-geglycosyleerd polair flagellum. Flagellaire glycanen vertonen diversiteit in koolhydraatsamenstelling en ketenlengte tussen Aeromonas-stammen. Alle tot nu toe geanalyseerde stammen tonen echter een pseudamininezuurderivaat als de koppelende suiker die serine- of threonineresiduen wijzigt. Het pseudamininezuurderivaat is vereist voor polaire flagella-assemblage en het verlies ervan heeft een impact op adhesie, biofilmvorming en kolonisatie. Het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, beschrijft hoe de constructie van nulmutanten kan worden gebruikt om de betrokkenheid van genen of genoomgebieden die vermeende glycosyltransferasen bevatten in de biosynthese van een flagellaire glycaan te begrijpen. Dit omvat het potentieel om de functie van de betrokken glycosyltransferasen en de rol van de glycaan te begrijpen. Dit zal worden bereikt door de glycaan-deficiënte mutant te vergelijken met de wild-type stam.
Introduction
Eiwitglycosylatie is beschreven in zowel Gram-positieve als Gram-negatieve bacteriën en bestaat uit de covalente hechting van een glycaan aan een aminozuurzijketen 1,2. Bij prokaryoten vindt dit proces meestal plaats via twee belangrijke enzymatische mechanismen: O- en N-glycosylatie 3. Bij O-glycosylatie is de glycaan bevestigd aan de hydroxylgroep van een serine (Ser) of threonine (Thr) residu. Bij N-glycosylatie is de glycaan bevestigd aan de zijketenamidestikstof van een asparagine (Asn) residu binnen de tripeptidesequenties Asn-X-Ser/Thr, waarbij X elk aminozuur kan zijn behalve proline.
Glycanen kunnen lineaire of vertakte structuren aannemen en zijn samengesteld uit monosachariden of polysacchariden die covalent verbonden zijn door glycosidische bindingen. In prokaryoten vertonen glycanen meestal diversiteit in suikersamenstelling en -structuur in vergelijking met eukaryote glycanen4. Verder zijn twee verschillende bacteriële glycosylatieroutes beschreven die verschillen in de manier waarop de glycaan wordt samengesteld en overgebracht naar het acceptoreiwit: sequentiële en en bloc glycosylatie 5,6. Voor sequentiële glycosylatie wordt het complexe glycaan direct op het eiwit opgebouwd door opeenvolgende toevoeging van monosacchariden. Bij en bloc glycosylatie wordt een voorgeassembleerd glycaan door een gespecialiseerd oligosaccharyltransferase (OTase) overgebracht naar het eiwit van een lipide-gebonden oligosacharide. Van beide routes is aangetoond dat ze betrokken zijn bij N- en O-glycosylatieprocessen7.
Eiwitglycosylatie speelt een rol bij het moduleren van de fysisch-chemische en biologische eigenschappen van eiwitten. De aanwezigheid van een glycaan kan beïnvloeden hoe het eiwit interageert met zijn ligand, wat de biologische activiteit van het eiwit beïnvloedt, maar kan ook de eiwitstabiliteit, oplosbaarheid, gevoeligheid voor proteolyse, immunogeniciteit en microbe-gastheerinteracties beïnvloeden 8,9. Verschillende glycosylatieparameters, zoals het aantal glycanen, de samenstelling, positie en het hechtingsmechanisme van glycanen, kunnen echter ook de eiwitfunctie en -structuur beïnvloeden.
Glycosyltransferasen (GT's) zijn de belangrijkste enzymen in de biosynthese van complexe glycanen en glycoconjugaten. Deze enzymen katalyseren de glycosidische bindingsvorming tussen een suikergroep van een geactiveerd donormolecuul en een specifieke substraatacceptor. GT's kunnen zowel nucleotiden als niet-nucleotiden gebruiken als donormoleculen en zich richten op verschillende substraatacceptoren, zoals eiwitten, sacchariden, nucleïnezuren en lipiden10. Daarom is het begrijpen van GT's op moleculair niveau belangrijk om hun werkingsmechanismen en specificiteit te identificeren, en maakt het ook mogelijk om te begrijpen hoe de suikersamenstelling van glycanen die relevante moleculen wijzigen, gerelateerd is aan pathogeniciteit. De Carbohydrate Active enzyme database (CAZy)11 classificeert GT's op basis van hun sequentie homologie, wat een voorspellend hulpmiddel biedt omdat in de meeste GT-families de structurele vouw en werkingsmechanismen invariant zijn. Vier redenen maken het echter moeilijk om substraatspecificiteit van veel GT's te voorspellen: 1) er is geen duidelijk sequentiemotief dat de substraatspecificiteit bepaalt bepaald in prokaryoten12, 2) veel GT's en OTases vertonen substraatpromiscuïteit 13,14, 3) functionele GT's zijn moeilijk te produceren in hoge opbrengst in recombinante vorm en 4) de identificatie van zowel donor- als acceptorsubstraten is complex. Desondanks hebben recente mutagenesestudies het mogelijk gemaakt om aanzienlijke vooruitgang te boeken in het begrip van katalytische mechanismen en het aftrekken van binding van GT's.
Bij bacteriën lijkt O-glycosylatie vaker voor te komen dan N-glycosylatie. De O-glycosylatieplaatsen vertonen geen consensussequentie en veel van de O-geglycosyleerde eiwitten zijn uitgescheiden of celoppervlakeiwitten, zoals flagellinen, pili of autotransporters1. Flagelline glycosylatie toont variabiliteit in het aantal acceptorplaatsen, glycaansamenstelling en structuur. Burkholderia spp flagellins hebben bijvoorbeeld slechts één acceptantensite, terwijl flagellins in Campylobacter jejuni maar liefst 19 acceptorsites hebben15,16. Bovendien is de glycaan voor sommige bacteriën een enkele monosacharide, terwijl andere bacteriën heterogene glycanen bezitten die zijn aangetast door verschillende monosachariden om oligosachariden te vormen. Deze heterogeniciteit komt zelfs voor bij stammen van dezelfde soort. Helicobacter flagellinen worden alleen gewijzigd door pseudamininezuur (PseAc)17, en Campylobacter flagellinen kunnen worden gewijzigd door PseAc, de acetamidinovorm van het pseudamininezuur (PSEAm) of legionaminezuur (LegAm), en glycanen afgeleid van deze suikers met acetyl, N-acetylglucosamine of propionische substituties18,19. In Aeromonas worden flagelliërs gemodificeerd door glycanen waarvan de samenstelling varieert van een enkel PseAc-zuurderivaat tot een heteropolysaccharide20, en de aanhechting van glycanen aan de flagellinemonomeren verloopt altijd via een PseAc-derivaat.
Over het algemeen is glycosylatie van flagellinen essentieel voor de assemblage van flagellaire filamenten, motiliteit, virulentie en gastheerspecificiteit. Echter, terwijl flagellins van C. jejuni16, H. pylori17 en Aeromonas sp. 21 kan niet tot filament worden samengevoegd tenzij de eiwitmonomeren zijn geglycosyleerd, Pseudomonas spp. en Burkholderia spp. 15 vereisen geen glycosylatie voor flagella-assemblage. Bovendien beïnvloeden bij sommige C. jejuni-stammen veranderingen in de suikersamenstelling van de flagella glycan de interactie tussen bacteriën en gastheer en kunnen ze een rol spelen bij het ontwijken van bepaalde immuunresponsen16. Autoagglutinatie is een ander fenotypisch kenmerk dat wordt beïnvloed door wijzigingen in de samenstelling van glycanen geassocieerd met flagellinen. Een lagere autoagglutinatie leidt tot een vermindering van het vermogen om microkolonies en biofilm te vormen22. Bij sommige bacteriën was het vermogen van flagella om een pro-inflammatoire reactie te veroorzaken gekoppeld aan flagelline glycosylatie. Dus, in P. aeruginosa, geglycosyleerde flagelline induceert een hogere pro-inflammatoire respons dan unglycosylated23.
Aeromonas zijn Gram-negatieve bacteriën die alomtegenwoordig zijn in de omgeving, waardoor ze zich op het grensvlak van alle One Health-componenten kunnen bevinden 24. Mesofiele Aeromonas hebben een enkel polair flagellum, dat constitutief wordt geproduceerd. Meer dan de helft van de klinische isolaten drukt ook laterale flagelline uit, inducerend in media of platen met een hoge viscositeit. Verschillende studies hebben beide flagellatypen in verband gebracht met de vroege stadia van bacteriële pathogenese25. Terwijl polaire flagelylen die tot nu toe zijn gemeld O-geglycosyleerd zijn op 5-8 Ser- of Thr-residuen van de centrale immunogene domeinen, zijn laterale flagellines niet O-geglycosyleerd in alle stammen. Hoewel polaire flagella glycanen van verschillende stammen diversiteit vertonen in hun koolhydraatsamenstelling en ketenlengte20, is aangetoond dat de koppelende suiker een pseudamininezuurderivaat is.
Het doel van dit manuscript is om een methode te beschrijven om nulmutanten te verkrijgen in specifieke GT's of chromosomale regio's die GT's bevatten om hun betrokkenheid bij de biosynthese van relevante polysacchariden en bacteriële pathogeniciteit te analyseren, evenals de rol van de glycaan zelf. Als voorbeeld identificeren en verwijderen we een chromosomaal gebied dat GT's van Aeromonas bevat om zijn betrokkenheid bij polaire flagellineglycosylatie vast te stellen en de rol van de flagelline glycaan te analyseren. We laten zien hoe je een specifieke GT kunt verwijderen om zijn functie in de biosynthese van deze glycaan en de rol van gemodificeerde glycaan vast te stellen. Hoewel Aeromonas als voorbeeld wordt gebruikt, kan het principe worden gebruikt om flagellaglycosylatie-eilanden van andere Gram-negatieve bacteriën te identificeren en te bestuderen en de functie van GT's te analyseren die betrokken zijn bij de biosynthese van andere glycanen zoals de O-antigeen lipopolysaccharide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De schematische weergave van de procedure is weergegeven in figuur 1.
1. Bioinformatische identificatie van flagella glycosylatie eiland (GFI's) in Aeromonas
- Om de pseac biosynthetische clusters in de Aeromonas genomen te identificeren, gebruikt u de tblastn tool uit de NCBI database26. Haal eerst orthologe eiwitten naar PSEC en PSEI van A. piscicola AH-3 (identificatiecodes zijn OCA61126.1 en OCA61113.1) uit databases van gesequencede Aeromonas-stammen en gebruik vervolgens de tblastntool om hun vertaalde nucleotidensequenties te doorzoeken.
OPMERKING: De pse-genen flankeren de Aeromonas FFI's, met pseB en pseC aan het ene uiteinde van de cluster en pseI aan het andere uiteinde. De locatie van de rest van de pse-genen kan van FGI-groep tot FGI verschillen. - Aangezien die polaire flagellinegenen van veel stammen grenzen aan de GFI's, gebruikt u het tblastn uit de NCBI-database om orthologe eiwitten te vinden voor de polaire flagellines FlaA en FlaB van A. piscicola AH-3 (identificatiecodes zijn OCA61104.1 en OCA61105.1) en de genen die coderen voor hen.
- Bovendien bevatten Aeromonas FFI's die betrokken zijn bij de biosynthese van heteropolysaccharidische glycanen (groep II)27 verschillende genen die coderen voor enzymen die betrokken zijn bij de vetzuursynthese, zoals luxC en luxE. Gebruik het tblastn uit de NCBI-database om orthologe eiwitten te vinden voor LuxC van A. piscicola AH-3 (identificatiecode is OCA61121.1) en het gen dat daarvoor codeert.
2. Generatie van nulmutanten in flagella glycosylatie eilandgenen
OPMERKING: Deze methode van mutagenese is gebaseerd op de allelische uitwisseling van polymerasekettingreactie (PCR) in-frame deletieproducten met behulp van de zelfmoordvector pDM428 (GenBank: KC795686.1). Replicatie van pDM4-vector is lambda pir-afhankelijk en de volledige allelische uitwisseling wordt afgedwongen door gebruik te maken van het sacB-gen dat zich op de vector bevindt.
- Constructie van PCR in-frame verwijderingsproducten.
- Ontwerp twee paar primers die DNA-gebieden stroomopwaarts (A- en B-primers) en stroomafwaarts (C- en D-primers) van het geselecteerde gen of gebied versterken dat moet worden verwijderd (figuur 2B).
- Zorg ervoor dat primers A en D meer dan 600 bp hebben stroomopwaarts vanaf respectievelijk het begin en stroomafwaarts van de stop van het gen of de genen die moeten worden verwijderd. Deze twee primers moeten aan het 5'-uiteinde een restrictieplaats bevatten voor een endonuclease die klonen in pDM4 mogelijk maakt.
OPMERKING: De restrictieplaats aan het 5'-uiteinde van A- en D-primers mag niet hetzelfde zijn als die in AB- of CD-amplicons. - Zorg ervoor dat primers B en C zich in het te verwijderen gen bevinden of in respectievelijk het eerste en laatste gen van het te verwijderen gebied. Zorg ervoor dat beide primers (B en C) in-frame zijn en zich tussen 5-6 codons in het gen bevinden. Zorg er bovendien voor dat beide primers aan het 5'-uiteinde een complementaire sequentie van 21 bp bevatten (tabel 1) die het mogelijk maakt om de DNA-ampliconen AB en CD samen te voegen.
- Kweek de geselecteerde Aeromonas-soort in 5 ml tryptische sojabouillon (TSB) gedurende de nacht (O/N) bij 30 °C. Gebruik een in de handel verkrijgbare kit voor genomische DNA-zuivering en volg de instructies van de fabrikant (Tabel met materialen). Kwantificeer 2 μL van het gezuiverde DNA met behulp van een spectrofotometer.
OPMERKING: Gebruik dubbel gedestilleerd water als een blanco, waarbij het instrument is ingesteld om de absorptie bij 260 nm te registreren. Registreer absorptie met 2 μL gezuiverd DNA 3-5 keer en bereken een gemiddelde absorptiemeting. Gebruik de wet van Beer-Lambert om de DNA-concentratie te berekenen, waarbij A = Ɛ.c.l. waarin "A" absorptie is, "Ɛ" de molaire gemiddelde extinctiecoëfficiënt voor DNA is, "c" DNA-concentratie is en "l" de padlengte is (raadpleeg de instructie van de fabrikant voor de padlengte van elk instrument). - Gebruik 100 ng gezuiverd chromosomaal DNA als sjabloon in twee sets asymmetrische PCR's met A-B- en C-D-primers (Tabel met materialen). Gebruik een 10:1 molaire verhouding van A:B en D:C primerparen (Aanvullend Materiaal).
OPMERKING: Asymmetrische PCR's maken de preferentiële versterking van de ene streng van de sjabloon meer mogelijk dan de andere. - Analyseer de PCR-producten door elektroforese in een 1% agarose gel. Gebruik TAE (40 mM Tris-acetaat, 1 mM EDTA) als gelloopbuffer en een vermogensinstelling van 8 V/cm. Om DNA te visualiseren, voegt u ethidiumbromide (0,5 μg / ml) toe aan de gel en visualiseert u de PCR-producten met behulp van een biobeeldvormingsstation (Table of Materials).
- Snijd de amplicons uit de gel met behulp van een scalpel, zuiver volgens het protocol van de fabrikant (Table of Materials) en kwantificeer ze.
- Voeg AB- en CD-amplicons samen met hun 21 bp overlappende sequenties in het 3'-uiteinde van PCR-producten (figuur 3). Meng 100 ng van elk amplicon (AB en CD) in een PCR-buis met PCR-reagentia (pre-AD PCR), maar zonder primers, en breid uit met behulp van het thermocycler-programma (aanvullend materiaal). Voeg vervolgens 100 μM A- en D-primers toe aan de reactie (AD PCR) en versterk als een enkel fragment (aanvullend materiaal).
- Analyseer het PCR-product (AD amplicon) door elektroforese in een 1% agarosegel met behulp van de voorwaarden beschreven in stap 2.1.6, verwijder het amplicon uit de gel, zuiver volgens het protocol van de fabrikant en kwantificeer het amplicon (Tabel met materialen).
- Constructie van pDM4 recombinant plasmide met de in-frame deletie.
- Kweek een O/N-cultuur van Escherichia coli cc18λ pir met pDM4 in Luria-Bertani (LB) Miller-bouillon (10 ml) met chlooramfenicol (25 μg/ml) bij 30 °C.
- Draai de cultuur af bij 5.000 x g bij 4 °C en suspensie de pellet in 600 μL steriel gedestilleerd water. Voer extractie en zuivering van plasmide pDM4 uit met behulp van een in de handel verkrijgbare plasmidezuiveringskit, volgens de instructies van de leverancier (Tabel met materialen).
- Verteer 1 μg pDM4 en 400 ng AD amplicon gedurende 2 uur met een endonuclease dat beide uiteinden van het AD-amplicon en de kloonplaats van pDM4 kan verteren (figuur 3). Volg het protocol van de enzymfabrikant voor reactiecondities (Tabel met materialen).
- Reinig het verteerde plasmide en amplicon met behulp van een DNA-zuiveringskit en kwantificeer ze volgens de instructies van de fabrikant (Tabel met materialen).
- Om religatie van de gelineariseerde pDM4 te voorkomen, verwijdert u de fosfaatgroep van beide 5'-uiteinden met behulp van het alkalische fosfatase-enzym volgens de instructies van de fabrikant (Tabel met materialen). Reinig vervolgens het behandelde plasmide en kwantificeer het met behulp van een spectrofotometer zoals beschreven in stap 2.1.4 (Tabel met materialen).
- Combineer 150 ng van de verteerde en fosfatase alkalische behandelde pDM4 met 95-100 ng verteerd AD amplicon bij een molaire vector:insert verhouding van 1:4. Bereid de ligatiereactie voor in een volume van 15 μL, volgens de instructies van de fabrikant (Tabel met materialen).
- Incubeer O/N bij 20 °C of in het weekend bij 4 °C. Inactiveer na incubatie de T4-ligase bij 70 °C gedurende 20 minuten.
- Gebruik ligatie om het plasmide in Escherichia coli MC1061λpir stam te introduceren door elektroporatie. Gebruik elektrocompetente bacteriën en elektroporatiecuvetten met een spleet van 2 mm.
- Bereiding van elektrocompetente E. coli en elektroporatie van pDM4-recombinant plasmide
- Ent een enkele kolonie E. coli MC1061λpir-stam in Luria-Bertani (LB) Miller-bouillon en kweek O/N bij 30 °C met 200 rpm schudden.
- Verdun 2 ml van de bacteriecultuur in 18 ml LB bouillon en incubeer bij 30 °C met schudden (200 rpm) tot een optische dichtheid (OD600) tussen 0,4-0,6 is bereikt.
- Pellet de bacteriecultuur door centrifugering bij 5.000 x g en 4 °C gedurende 15 min. Gooi het supernatant weg en suspensie de pellet in 40 ml gekoeld gedestilleerd H2O.
- Herhaal deze reinigingsstap nog twee keer om alle kweekzouten te verwijderen. Suspensie ten slotte de pellet in 4 ml gekoeld gedestilleerd H2O en breng 1 ml van de suspensie over in elk van de vier conische microfugebuizen van 1,5 ml.
- Pellet de bacteriecultuur door centrifugeren bij 14.000 x g en 4 °C gedurende 5 min. Verwijder het supernatant zonder de pellet te storen en suspensie van elke pellet in 100 μL gekoeld gedestilleerd H2O.
- Voeg 3-3,5 μL van het ligatiemengsel toe aan elke buis en incubeer gedurende 5 minuten op ijs. Breng vervolgens de inhoud van elke buis over naar een gekoeld elektroporatiecuvet met een spleet van 2 mm en breng 2 kV, 129 Ω en tijdconstante rond 5 ms aan.
OPMERKING: Koel de elektroporatiecuvetten voor op ijs. Houd de bacteriën tijdens de hele procedure op ijs. - Voeg na elektroporatie 250 μL SOC-medium toe aan elk van de vier cuvetten om hun inhoud terug te winnen, breng ze over naar een kweekbuis (ongeveer 1 ml) en incubeer gedurende 1 uur bij 30 °C met schudden (200 tpm).
- Plaat de getransformeerde cellen op Luria-Bertani (LB) agarplaten aangevuld met chlooramfenicol (25 μg / ml) om ervoor te zorgen dat alle kolonies die in de plaat groeien de plasmide-ruggengraat hebben.
- Pluk enkele kolonies van de LB-agarplaten met chlooramfenicol en incubeer O/N bij 30 °C. Wanneer kolonies groeien, controleert u het inbrengen van de deletieconstructie in pDM4 door PCR met behulp van primers die de pDM4-kloonzijde flankeren: pDM4for en pDM4rev (tabel 1) en gelyseerde kolonies als sjabloon (aanvullend materiaal).
- Kies een kolonie met een steriele tandenstoker en dompel deze in een buis van 1,5 ml met 15 μL van 1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 mM EDTA pH 8,0. Incubeer de buizen bij 100 °C gedurende 5 minuten en vervolgens 1 min op ijs.
- Draai de buisjes in een microfuge van 12.000 x g gedurende 10 minuten om bacteriën en puin te pelleteren. Gebruik 1 μL van het supernatant als sjabloon in de PCR-reactie (Tabel met materialen). De gloeitemperatuur van het primerpaar is 50 °C en de PCR-reactie vereist 10% DMSO (Aanvullend Materiaal).
- Ent de kolonies die het product van belang hebben versterkt in 10 ml LB-bouillon met chlooramfenicol (25 μg / ml) en kweek O / N bij 30 ° C. Extraheer het plasmide uit culturen zoals beschreven in stap 2.2.1-2.2.2. Volgorde met behulp van de pDM4-primers volgens de instructies van de fabrikant (materiaaltabel).
- Overdracht van in-frame verwijdering naar de Aeromonas zeven
OPMERKING: Het pDM4 recombinante plasmide moet in de geselecteerde Aeromonas stam door triparentale paring (Figuur 4). Aeromonas de stam moet rifampicine-resistent zijn om na de triparentale paring te worden geselecteerd. Kweek daarom de geselecteerde stammen O/N op TSB bij 30 °C, centrifugeer 2 ml, 4 ml en 6 ml culturen bij 5.000 x g gedurende 15 minuten, suspensie van elke pellet in 100 μL TSB en plaat in TSA met rifampicine (100 μg/ml).- Bereid O/N-culturen van E. coli MC1061λpir voor met het pDM4-recombinante plasmide op LB-agar met 25 μg/ml chlooramfenicol (donorstam), de Aeromonas-stam rifampicine-resistent op TSA met 100 μg/ml rifampicine (vatstam) en de E. coli HB101 met het pRK2073-plasmide op LB-agar met 80 μg/ml spectinomycine (helperstam) bij 30 °C.
- Wanneer de kolonies zijn gegroeid, schorst u hetzelfde aantal kolonies (10-15 kolonies) van de donor-, ontvanger- en helperstammen voorzichtig met een steriele tandenstoker in drie LB-buizen met 150 μL LB.
- Meng vervolgens op een LB-agarplaat, zonder antibiotica, de drie bacteriële suspensies in twee druppels bij een ontvanger: helper: donorverhouding van 5: 1: 1 (50 μL ontvanger, 10 μL van de donor en 10 μL helper). Incubeer de plaat met de voorkant O/N omhoog bij 30 °C. Voer negatieve controle van conjugatie uit met behulp van de donorstam zonder recombinant plasmide.
OPMERKING: De helperstam draagt het conjugatieve plasmide pRK2073 en helpt bij de overdracht van de pDM4 in de Aeromonas. Gebruik geen vortex om de donors-, ontvanger- en helperstammen op te schorten om te voorkomen dat de pili breekt. - Oogst bacteriën uit de LB-agarplaat door 1 ml LB-bouillon toe te voegen en deze te verspreiden met een steriele glazen spreader om een bacteriële suspensie te verkrijgen. Gebruik een pipet om de bacteriële suspensie over te brengen naar een conische microfugebuis van 1,5 ml en vortex krachtig.
- Om de ontvangende kolonies te selecteren die het pDM4-recombinante plasmide bevatten, plaat 100 μL van de geoogste bacteriële suspensie op LB-agarplaten met rifampicine (100 μg / ml) en chlooramfenicol (25 μg / ml).
- Draai 200 μL en 600 μL van de monsters in een microfuge bij 5.000 x g gedurende 15 minuten, suspensie de pellet in 100 μL LB bouillon en plaat op LB agar met rifampicine (100 μg/ml) en chlooramfenicol (25 μg/ml). Incubeer alle platen gedurende 24-48 uur bij 30 °C.
- Pak de gekweekte kolonies op, breng over op LB-platen met rifampicine (100 μg / ml) en chlooramfenicol (25 μg / ml) en incubeer ze O / N bij 30 ° C. Bevestig vervolgens dat de kolonies Aeromonas zijn door de oxidasetest29 en dat pDM4-recombinant plasmide werd ingebracht (eerste recombinatie) in het specifieke chromosomale gebied door PCR met behulp van de E- en F-primers (aanvullend materiaal), die buiten het gebied binden dat is versterkt met de A- en D-primers (materiaaltabel). Zoals beschreven in stap 2.3.11, gebruikt u 1 μL gelyseerde kolonies als sjabloon.
- Om de allelische uitwisseling voor de in-frame deletie te voltooien, dwingt u de kolonies met het geïntegreerde zelfmoordplasmide tot een tweede recombinatie. Kweek de recombinante kolonies in 2 ml LB met 10% sucrose en zonder antibiotica, O/N bij 30 °C.
- Plaat 100 μL van de bacterieculturen uit stap 2.4.8 op LB agarplaat met sucrose (10%). Ook plaat 100 μL van verschillende cultuurverdunningen (10-2-10-4) en incubateer O/N bij 30 °C.
- Om het verlies van pDM4 te bevestigen, pak je de kolonies op, breng je ze over naar LB-platen met en zonder chlooramfenicol (25 μg / ml), incubeer je ze O / N bij 30 ° C en selecteer je vervolgens de chlooramfenicolgevoelige kolonies.
- Analyseer de gevoelige kolonies door PCR met behulp van het E-F primerspaar en 1 μL gelyseerde kolonies als sjabloon (Tabel van materialen en aanvullend materiaal). Selecteer de kolonies waarvan het PCR-product correleerde met de grootte van de verwijderde constructie.
3. Motiliteitstests
OPMERKING: Bij sommige bacteriesoorten met geglycosyleerde flagella beïnvloeden wijzigingen in de niveaus van glycosylatie of glycaansamenstelling de assemblage van flagellinen, wat meestal wordt weerspiegeld als een motiliteitsvermindering of afwezigheid van motiliteit. Daarom werden twee motiliteitstests uitgevoerd met de nulmutanten.
- Motiliteitstest in vloeibare media
- Culture Aeromonas stamt O/N in 1 ml TSB bij 25-30 °C. Om een microscoopdekselglaasje op een uitgegraven dia te bevestigen, pakt u een kleine hoeveelheid siliconen met de punt van een tandenstoker en plaatst u een kleine druppel op de vier hoeken van de afdekplaat. Plaats vervolgens 1 μL van de Aeromonas-cultuur in het midden van de afdekplaat en meng er een druppel verse TSB-media (2 μL) in.
- Plaats een uitgegraven dia op de afdekplaat. Stem de opgraving af op de gedeponeerde druppel, druk zachtjes en draai de glijbaan ondersteboven.
- Analyseer de zwemmotiliteit door lichtmicroscopie met behulp van een optische microscoop (Table of Materials) met een 100x objectief met behulp van onderdompelingsolie.
OPMERKING: De wild-type stam van Aeromonas moet worden gebruikt als de positieve controle. Gebruik als negatieve controle een niet-flagellated bacterie zoals Klebsiella.
- Motiliteitstest in semi-vaste media
- Culture Aeromonas stamt O/N in TSB (1 ml) bij 25-30 °C. Breng vervolgens 3 μL van de cultuur over op het midden van een zachte agarplaat (1% trypton, 0,5% NaCl, 0,25% bacto agar) en incubeer de plaat met de voorkant naar boven O/N bij 25-30 °C.
- Meet met behulp van een liniaal de bacteriële migratie door de agar van het centrum van de plaat naar de periferie.
4. Flagella zuivering
- Isolatie van flagella verankerd aan het bacteriële oppervlak
- Culture Aeromonas stamt O/N in TSB (10 ml) bij 25-30 °C. Breid vervolgens de kweek uit tot een kolf met TSB (900 ml) en laat deze O/N groeien bij 25-30 °C met schudden (200 tpm).
- Centrifugeer bij 5.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Suspensie van de pellet in 20 ml tris-hcl-buffer van 100 mM (pH 7,8).
- Om de verankerde flagella te verwijderen, scheert u de suspensie in een vortex met een glazen staaf (2-3 mm diameter) gedurende 3-4 minuten en passeert u vervolgens herhaaldelijk (minimaal zes keer) door een spuit van 21 G.
- Pelletbacteriën door twee opeenvolgende centrifugaties bij 4 °C: eerst bij 8.000 x g gedurende 30 minuten. Verwijder het supernatant en centrifugeer bij 18.000 x g gedurende 20 minuten. Verzamel het supernatant, dat gratis flagella bevat.
- Ultracentrifugeer het supernatant bij 100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C en suspensie de pellet in 150 μL van 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) plus 2 mM EDTA-buffer. De pellet bevat flagellellen.
- Analyseer 5-10 μL van de geresuspendeerde pellet uit stap 4.1.5 door elektroforese in een 12% SDS-Polyacrylamide-gel en visualiseer de eiwitten met coomassie blauwe kleuring.
OPMERKING: Volg de instructies van de fabrikant voor eiwitelektroforese en gelkleuring. Als een positieve controle van geglycosyleerde flagelline, gebruik de gezuiverde flagella van de wild-type stam. Zuiver de verrijkte fractie van flagella in een cesiumchloride (ClCs) gradiënt.
- Cesiumchloride gradiënt om flagellen te zuiveren.
- Meng 12,1 g CsCl met 27 ml gedestilleerde H2O.
- Breng de verrijkte fractie flagella (150 μL) over in een dunwandige ultraheldere buis (14 mm x 89 mm) (Materiaaltafel) en vul deze met 12 ml CsCl-oplossing.
- Ultracentrifugeer de buis bij 60.000 x g gedurende 48 uur bij 4 °C in een zwenkbakrotor (Table of Materials).
- Verzamel de flagellenband in de CsCl-gradiënt met een spuit en dialyseer tegen 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) plus 2 mM EDTA. Analyseer vervolgens de gedialyseerde flagellen door elektroforese in een 12% SDS-Polyacrylamide-gel en Coomassie blauwe kleuring (stap 4.1.6) of door massaspectrometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze methodologie biedt een effectief systeem om nulmutanten te genereren in genen of chromosomale regio's van Aeromonas die flagellaglycosylering en de rol van flagellafilament kunnen beïnvloeden (figuur 1).
Het protocol begint met de bioinformatische identificatie van vermeende FFI's en de genen die coderen voor GT's die in deze regio aanwezig zijn. In Aeromonas is de chromosomale locatie van GFI's gebaseerd op de detectie van drie soorten genen: genen die betrokken zijn bij de biosynthese van het pseudamininezuur (pseI en pseC), polaire flagellinegenen en luxC. Stammen waarvan de polaire flagellen zijn geglycosyleerd door een enkel pseudamininezuurderivaat, zoals A. hydrophila AH-130, hebben geen genen die coderen voor GT's tussen de pse-genen in FFI's groep I27. De meeste stammen die tot deze FGI-groep behoren, vertonen polaire flagellinegenen die grenzen aan dit gebied. Daarentegen vertonen stammen waarvan de polaire flagella is geglycosyleerd met een heteropolysaccharide glycaan, zoals A. piscicola AH-319, verschillende genen die coderen voor GT's stroomafwaarts van luxC, gelokaliseerd tussen pse-genen van FFI's groep II27, en ze grenzen niet altijd aan polaire flagellinegenen (figuur 2A).
Het gebied dat betrokken is bij de biosynthese van de flagella heteropolysaccharide glycaan en de functie van vermeende GT's die daar aanwezig zijn, werd bevestigd door de constructie van nulmutanten. De generatie van elke mutant vereist vier primers: A, B, C en D (tabel 1). Primer B gloeit 5-6 codons stroomafwaarts van het begin van het gen (fgi-4) of eerste gen van de cluster (fgi-1) om te worden verwijderd en primer A gloeit 600-800 bp stroomopwaarts vanaf het begin van dit gen (fgi-4 of fgi-1). Primer C gloeit stroomopwaarts van de laatste 5-6 codons van het gen (fgi-4) of laatste gen van de cluster (fgi-12) die moeten worden verwijderd en primer D gloeit 600-800 bp stroomafwaarts van de stop van dit gen (fgi-4 of fgi-12) (figuur 2B). Primers A en D voor de deletie van fgicluster en fgi-4 van A. piscicola AH-3 bevatten een restrictieplaats voor de endonuclease BamHI aan hun 5'-uiteinden (tabel 1). Deze endonuclease heeft geen interne doelen in de AB noch CD PCR fragmenten. Een belangrijke stap is het ontwerp van B- en C-primers. Beide moeten in-frame zijn om het open leesframe van gen of fragment niet te breken om te worden verwijderd. De 21 bp complementaire sequenties aan het 5' einde van B en C primers maken het mogelijk om AB- en CD-ampliconen te genereren met 3' eindcomplementaire sequenties, die het samenvoegen en uitbreiden van deze ampliconen mogelijk maken. Het PCR-programma om de amplicons samen te voegen en uit te breiden bestaat uit een eerste denaturalisatiestap en vijf cycli met een gloeitemperatuur van 54 °C (aanvullend materiaal). Vervolgens maakt de toevoeging van A- en D-primers de versterking van het uitgebreide fragment mogelijk (figuur 3). De enzymatische werking van BamH Igeeft aanleiding tot een amplicon met kleverige uiteinden die compatibel zijn voor ligatie met de zelfmoordvector pDM4 verteerd met BglII.
Aangezien pDM4 een λpir-afhankelijk plasmide is, werd het ligatieproduct geëlektroporated in de E. coli-stam MC1061λpir (thi thr1 leu6 proA2 his4 argE2 lacY1 galK2 ara14 xyl5 supE44 λ pir) en geselecteerd in chlooramfenicolplaten. pDM4 heeft geen direct systeem om de recombinante klonen te selecteren en kolonies werden geanalyseerd door PCR met een pDM4-primerspaar (pDM4for en pDM4rev) (tabel 1 en aanvullend materiaal) die het kloongebied flankeren. De E. coli stam MC1061λpir zonder pDM4 werd gebruikt als negatieve controle in de PCR-reactie.
Om de allelische uitwisseling uit te voeren, werd het recombinante pDM4-plasmide overgebracht naar de ontvangende stam A. piscicola AH-3. Aangezien veel Aeromona's niet door elektroporatie kunnen worden omgezet, werd de recombinante pDM4 overgebracht door conjugatie met behulp van triparentale paring (figuur 4). Om de transconjugante kolonies te selecteren, gebruiken we een rifampicine-resistente vatenstam, waarmee de Aeromonas-stam uit de conjugatieparing kan worden geselecteerd. Bovendien werden de geselecteerde kolonies onderworpen aan de oxidasetest, want terwijl Aeromonas oxidase-positief is, is E. coli oxidase-negatief. De eerste en tweede recombinaties werden bevestigd door PCR met externe primers (E- en F-primers) van versterkte gebieden (AB- en CD-fragmenten) (tabel 1, aanvullend materiaal en figuur 5A).
In Aeromonas is de glycosylering van polaire flagellines essentieel voor de assemblage van het flagellaire filament. De aanwezigheid van functionele polaire flagella werd geanalyseerd met behulp van motiliteitstests van de bacteriekolonies met verwijderde GT-genen of -regio. Lichte microscopie-assays toonden aan dat de zwemmotiliteit in vloeibaar medium in beide mutanten was verminderd in vergelijking met de wild-type stam. Bovendien vertoonden beide een verminderde radiale expansie in relatie tot de wildtype-stam wanneer de beweeglijkheid werd geanalyseerd op zachte agar (figuur 5B). Gezien het feit dat beide mutanten in staat waren om te zwemmen, maar met verminderde beweeglijkheid in relatie tot de wild-type stam, werd hun polaire flagella gezuiverd en werd het flagellin molecuulgewicht geanalyseerd in een 12% SDS-polyacrylamide gel. Deze analyse toonde aan dat beide mutanten polaire flagellines hebben met een lager molecuulgewicht dan de wild-type stam (figuur 5C), wat veranderingen in de flagella glycaan suggereert. Flagella gezuiverd door CsCl-gradiënten (figuur 5C) zal worden gebruikt in massaspectrometrietests om de glycaansamenstelling en nulmutanten te identificeren die worden gebruikt in biofilm, adhesie of andere assays om de rol van de glycaan- en glycaansamenstelling te identificeren.
Figuur 1: Overzicht van de stappen die in deze procedure worden gebruikt. Schema van het proces beschreven in het protocol om flagella glycosylatie eiland Aeromonas te identificeren, en GT's die betrokken zijn bij glycaan biosynthese. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bioinformatische detectie van chromosomale gebieden en primerontwerp. (A) Schema van chromosomale gebieden geïdentificeerd in A. hydrophila AH-1 en A. piscicola AH-3. A. hydrofilie AH-1 flagella glycosylatie eiland is representatief voor stammen waarvan de flagella glycaan alleen een pseudaminic zuurderivaat heeft, en A. piscicola AH-3 flagella glycosylatie eiland is representatief voor stammen waarvan flagella glycaan een heteropolysaccharide is. Genen aangeduid in zwart zijn betrokken bij de biosynthese van pseudaminic acid, en die aangeduid geel zijn vermeende GT's. (B) Schema van de chromosomale locatie van primerparen ontworpen voor de PCR in-frame deleties. Blauwe vakjes in A- en D-primers bevatten de restrictieve bindingsplaats voor een endonuclease. Rode vakjes in B- en C-primers bevatten 21 bp complementaire sequenties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schema met de methode om PCR-deleties en ligatie naar het zelfmoordplasmide pDM4 te construeren. MCS: multi kloonplaats, CmR: chlooramfenicolresistente genen, sacB: codeert voor de Bacillus subtilis levansucrase, waarvan de expressie wordt geïnduceerd door sucrose en dodelijk is voor Gram-negatieve bacteriën, en mob: mobilisatiegenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Triparentale conjugatie en procedure gebruikt voor de allelische uitwisseling. De eerste recombinatie treedt op als gevolg van de afwezigheid van λpir in de Aeromonas-stammen en geeft aanleiding tot de integratie van het recombinante plasmide in het geselecteerde gen. Tweede recombinatie wordt geïnduceerd door groei in LB met 10% sucrose, wat leidt tot de expressie van het sacB-gen , en het plasmide wordt uit het chromosoom verwijderd. Na de cross-over kan het wildtype of het gemuteerde gen op het bacteriële chromosoom achterblijven. Nulmutanten worden geselecteerd door PCR met externe primers. RifR: rifampicine-resistent; CmR: chlooramfenicol resistent; SpcR: spectinomycine resistent. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Bevestiging van nulmutanten en fenotypische analyse van polaire flagella. (A) PCR met fgi-4 externe primers (EF primers) van A. piscicola AH-3 om de allelische uitwisseling na tweede recombinatie in chlooramfenicol gevoelige kolonies te bevestigen. Baan WT: A. piscicola AH-3; rijstroken 1-8: chlooramfenicol-gevoelige kolonies van de tweede recombinatie; St: HyperLadder 1 Kb marker. Lanes 1-3 en 5-8 tonen de kolonies met wild-type fgi-4 gen als lane WT. Lane 4 toont een kolonie met het verwijderde fgi-4 gen. (B) Beweeglijkheid op zachte agar van A. piscicola AH-3 en nulmutanten in het fgi-gebied (AH-3ΔFgi) en fgi-4 gen (AH-3ΔFgi-4) bij 25 °C. (C) Polair flagellum van AH-3 (lane1) en de nulmutanten in het fgi-gebied (lane 2) en fgi-4 gen (lane 3), geïsoleerd, gezuiverd in CsCl gradiënten, geanalyseerd in 12% SDS-PAGE, en gekleurd met Coomassie blauw. Maat standaard (St). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Primer naam | Volgorde in 5' tot 3' richting | Gebruikt voor | ||
| A. piscicola AH-3 | ||||
| A-Flgi1 | CGCGGATCCGACTGTACCCGTTTCAATCA | fgi mutant | ||
| B-Flgi1 | CCCATCCACTAAACTTAAACA GATCACCTCGAACTCGAAA | |||
| C-Flgi12 | TGTTTAAGTTTAGTGGATGGG GGAACCTTAAATGCCATGA | |||
| D-Flgi12 | CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC | |||
| E-Flgi1 | ACCCGCTTCATTCGCTAT | |||
| F-Flgi12 | TCCGATTTTCTGACTCAGGG | |||
| A-FGI4 | CGCGGATCCGATGCGTACGCTAATATGAA | FGI-4 mutant | ||
| B-Fgi4 | CCCATCCACTAAACTTAAACA CATATTATCTTGCCCCTGAT | |||
| C-FGI4 | TGTTTAAGTTTAGTGGATGGG ATGGAGCTAATCACTCGTTT | |||
| D-FGI4 | CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC | |||
| E-FGI4 | ATTTCCCTGCCAAATACG | |||
| F-FGI4 | CCTGCCAACAGGATGTAAG | |||
| pDM4 vector | ||||
| pDM4voor | AGTGATCTTCCGTCACAGG | Invoegingen in de pDM4-vector | ||
| PDM4rev | AAGGTTTAACGG TTGTGGA | |||
Tabel 1: Primers gebruikt voor de constructie van nulmutanten. Overlappende gebieden in primers B en C worden onderstreept. Bam HI-site is vetgedrukt in primers A en D.
Aanvullend materiaal. Reagentia en reacties die worden gebruikt in asymmetrische PCR's om de AB- en CD-ampliconen te verkrijgen, Pre-AD- en AD-PCR's om de AD-ampliconen uit te breiden en te verkrijgen, pDM4 PCR's om de insertie van verwijderde construct in pDM4-vector te verifiëren, en EF PCR's om de eerste en tweede recombinatie te verifiëren. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De cruciale vroege stap van deze methode is de identificatie van regio's die betrokken zijn bij de glycosylatie van flagella en vermeende GT's, omdat deze enzymen een hoge homologie vertonen en betrokken zijn bij veel processen. Bioinformatische analyse van Aeromonas-genomen in openbare databases toont aan dat dit gebied grenst aan het polaire flagellagebied 2, dat de flagellinegenen in veel stammen bevat en genen bevat die betrokken zijn bij de biosynthese van pseudamininezuur27. Dit heeft het mogelijk gemaakt om een richtlijn te ontwikkelen voor het detecteren van flagellaglycosylatie-eilanden in Aeromonas die kan worden gebruikt om dit gebied te identificeren in andere bacteriën waarvan de flagellaire glycaan pseudamininezuurderivaten bevat. Bovendien, hoewel deze methode beschrijft hoe een gencluster dat betrokken is bij flagellaglycosylatie moet worden geanalyseerd, kan het ook worden gebruikt om genen te bestuderen die coderen voor eiwitten die betrokken kunnen zijn bij flagellavorming, rotatie of regulatie in verschillende Gram-negatieve bacteriën.
Ook belangrijk bij het genereren van PCR in-frame deleties is het ontwerp van B- en C-primers. Deze primers moeten worden gelokaliseerd 5-6 codons stroomafwaarts van de start (B-primer) en stroomopwaarts van de stop (C-primer) van het geselecteerde gen of gebied dat moet worden verwijderd en mogen het open leesframe niet breken. Bovendien is een belangrijke factor om te overwegen de lengte van het homologiegebied dat wordt versterkt om de AB- en CD-ampliconen te genereren. Dit protocol beveelt aan dat beide amplicons elk een homoloog gebied van 600-800 bp bevatten. Kortere homologe regio's maken de eerste recombinatie uitdagender.
Aeromonas-stammen dragen niet het lambda pir-gen , dat nodig is om het pDM4-zelfmoordplasmide te repliceren. Daarom moet het pDM4-recombinante plasmide worden geïntegreerd in het chromosomale DNA. Na de triparentale paring is het belangrijk om de bacteriekolonies te identificeren waarin de eerste recombinatie heeft plaatsgevonden. Deze kolonies bevatten de recombinante pDM4 die in het homologe chromosomale gebied is ingebracht. Identificatie van recombinante kolonies wordt uitgevoerd met behulp van een PCR-reactie met primers (E- en F-primers) buiten het beoogde gebied dat moet worden verwijderd. Als een standaard DNA-polymerase wordt gebruikt, zullen de E-F primers alleen leiden tot het genereren van een PCR-product in het wild-type. Dit primerpaar zal geen PCR-product produceren in bacteriekolonies waarin het pDM4-recombinante plasmide in het chromosomale DNA is ingebracht. Het ontbreken van PCR-product is te wijten aan de afstand tussen de gloeisequenties van E- en F-primers. Deze afstand kan niet worden versterkt door standaard polymerasen. Andere factoren kunnen echter ook de vorming van PCR-producten voorkomen. Daarom kunnen de eerste recombinante kolonies worden geïdentificeerd door DNA-polymerasen voor lange fragmentversterking of door PCR-reacties met behulp van paren primers bestaande uit een pDM4 en een externe primer. Wanneer grote genetische clusters worden verwijderd, vereist amplificatie in de wild-type stam het gebruik van DNA-polymerasen voor lange fragmentversterking. Bacteriële kolonies met de eerste recombinatie kunnen worden geïdentificeerd door PCR met pDM4-externe paren primers. Eerste en tweede recombinaties worden echter meestal tegelijkertijd geproduceerd, waardoor de pDM4 na recombinatie met het wildtype of met het verwijderde gen achterblijft. Dit leidt tot chlooramfenicolresistente kolonies waarvan de PCR met behulp van externe primers ampliconen geeft met een identieke grootte van het wild-type gen of kleine ampliconen, die correleren met het verwijderde gen of fragment. Kolonies waarvan werd aangetoond dat ze de juiste recombinante insert hadden, werden geïncubeerd met sucrose om de niet-ingebrachte pDM4 te verwijderen. Sucrose induceert de expressie van het sacB-gen op de pDM4, dat codeert voor een dodelijk enzym voor gramnegatieve bacteriën. Daarom zullen alleen kolonies zonder het zelfmoordplasmide groeien in LB met sucrose. Om de identiteit van kolonies die het verwijderde gen bevatten te ondersteunen, kan het fragment dat is versterkt met het externe primerspaar vervolgens worden gesequenced.
Het implementeren van deze in-frame mutatiemethode in Aeromonas maakt het mogelijk om stabielere nulmutanten te genereren zonder wijzigingen in de expressieniveaus van downstream genen. Andere methoden, zoals het inbrengen van een antibioticacassette, verzekeren de transcriptie van downstream-genen, maar het expressieniveau kan worden gewijzigd. Bovendien kan deze methode worden geëxtrapoleerd naar andere doelgenen en -regio's, waaronder andere Gram-negatieve bacteriën 29,31,32,33.
Bij sommige bacteriestammen kan het verlies of de modificatie van glycaan gekoppeld aan flagellinen leiden tot het onvermogen van flagella-assemblage of de instabiliteit van flagellafilament, wat leidt tot een vermindering van de polaire flagellamotiliteit. Hoewel het gemakkelijk is om een niet-beweeglijk fenotype van een beweeglijk fenotype te onderscheiden met behulp van motiliteitstests in vloeibare media, kunnen verschillen in de mate van beweeglijkheid moeilijk te kwantificeren zijn. Motiliteitsplaattests zijn nodig om verschillen in de mate van motiliteit te meten. Sommige bacteriesoorten, waaronder veel mesofiele Aeromonas-stammen , drukken echter induceerbare laterale flagellen uit bij het groeien in hoog viskeuze media of platen, naast de constitutieve polaire flagella. Beide flagellatypen dragen bij aan de bacteriële beweeglijkheid in halfvaste platen. Daarom leiden modificaties van polaire of laterale flagellen alleen tot reducties in de migratiediameters. AH-3ΔFgi en AH-3ΔFgi-4 mutanten vertonen dus slechts verminderde beweeglijkheid ten opzichte van de wildtype stam. Om de evaluatie van de beweeglijkheid geproduceerd door de rotatie van polaire flagellen te verbeteren, moet de uitzettingsdiameter van nulmutanten worden vergeleken met niet alleen de wildtype stam, maar ook met een mutant zonder het polaire flagellum. Bovendien beïnvloedt een vermindering van het aantal glycaanresiduen of veranderingen in de glycaansamenstelling de elektroforetische beweeglijkheid van geglycosyleerde flagellinen. Het molecuulgewicht van geglycosyleerde flagellines waargenomen met BEHULP VAN SDS-PAGE-gels is bijvoorbeeld hoger dan voorspeld op basis van flagellin aminozuursequentie, en verstoringen van de glycaan worden waargenomen als verminderingen van hun molecuulgewicht. In sommige gevallen zijn de veranderingen in glycaanmodificatie in het flagelline-eiwit mogelijk niet detecteerbaar met SDS-PAGE. In deze gevallen kan massaspectrometrie-analyse van intacte eiwit- of flagellinepeptiden nodig zijn om de aanwezigheid en massa van glycaan te bevestigen.
Pathogeniciteit van Aeromonas, evenals andere Gram-negatieve bacteriën, kan worden beïnvloed door de afwezigheid van flagellum, maar ook door veranderingen in de samenstelling van flagella glycanen. Deze veranderingen kunnen de bacteriële interactie met biotische en abiotische oppervlakken beïnvloeden, autoagglutinatie, een rol spelen bij het ontwijken van de immuunrespons en / of inductie van pro-inflammatoire respons. Daarom zijn therapietrouw, biofilmvorming en pro-inflammatoire responstests vereist om de relatie tussen flagellaglycosylatie en Aeromonas-pathogeniciteit te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Research Council Canada, voor het Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Spanje) en voor de Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit | Applied Biosystems | 4337455 | Used for sequencing |
| AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity | Invitrogen | 12346-086 | Used for amplification of AB, CD and AD fragments |
| Agarose | Conda-Pronadise | 8008 | Used for DNA electrophoresis |
| Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) | Promega | M1821 | Used to remove phosphate at the 5’ end |
| Bacto agar | Becton Dickinson | 214010 | Use for motility analysis |
| BamHI | Promega | R6021 | Used for endonuclease restriction |
| BglII | Promega | R6081 | Used for endonuclease restriction |
| BioDoc-It Imagin System | UVP | Bio-imaging station used for DNA visualization | |
| Biotaq polymerase | Bioline | BIO-21040 | Used for colony screening |
| Cesium chloride | Applichem | A1126,0100 | Used for flagella purification |
| Chloramphenicol | Applichem | A1806,0025 | Used for triparental mating |
| Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit | Cytivia | 28-9034-71 | Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments. |
| EDTA | Applichem | 131026.1211 | Used for DNA electrophoresis |
| Electroporation cuvettes 2 mm gap | VWR | 732-1133 | Used for transformation |
| Ethidium bromide | Applichem | A1152,0025 | Use for DNA visualization |
| HyperLadder 1 Kb marker | Bioline | BIO-33053 | DNA marker |
| Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit | Invitrogen | 10750204 | Used for bacterial chromosomal DNA purification |
| Luria-Bertani (LB) Miller agar | Condalab | 996 | Used for Escherichia coli culture |
| Luria-Bertani (LB) Miller broth | Condalab | 1551 | Used for Escherichia coli culture |
| Nanodrop ND-1000 | NanoDrop Techonologies Inc | Spectrophotometer used for DNA quantification | |
| Rifampicin | Applichem | A2220,0005 | Used for triparental mating |
| SOC Medium | Invitrogen | 15544034 | Used for electroporation recovery |
| Spectinomycin | Applichem | A3834,0005 | Used for triparental mating |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman | 331362 | Used for flagella purification |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224017 | Used for ligation reaction |
| Trypticasein soy agar | Condalab | 1068 | Used for Aeromonas grown |
| Trypticasein soy broth | Condalab | 1224 | Used for Aeromonas grown |
| Tryptone | Condalab | 1612 | Use for motility analysis |
| Tris | Applichem | A2264,0500 | Used for DNA electrophoresis and flagella purification |
| Triton X-100 | Applichem | A4975,0100 | Used for bacterial lysis |
| Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman | 344059 | Used for flagella purification |
| Veriti 96 well Thermal Cycler | Applied Biosystems | Used for PCR reactions | |
| Zyppy Plasmid Miniprep II Kit | Zymmo research | D4020 | Used for isolation of plasmid DNA |
References
- Schäffer, C., Messner, P.
- De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae. BMC Genomics. 17, 377 (2016).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M.
- Benz, I., Schmidt, M. A. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).
- Guerry, P., Szymanski, C. M.
- Hug, I., Feldman, M. F. Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria. Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).
- Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation. Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).
- Szymanski, C. M., Wren, B. W.
- Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions. Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).
- Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).
- Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Research. 42, Database Issue 490-495 (2014).
- Weerapana, E., Imperiali, B. Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems. Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).
- Faridmoayer, A., et al. Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).
- Wacker, M., et al. Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).
- Scott, A. E., et al. Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).
- Thibault, P., et al. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin. Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).
- Schirm, M., et al. Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).
- McNally, D. J., et al. Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans. Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).
- Logan, S. M., et al. Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches. FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).
- Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).
- Canals, R., et al. Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila. Microbiology. 153, Pt 4 1165-1175 (2007).
- Howard, S. L., et al. Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens. Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).
- Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response. Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).
- Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world. Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).
- Gavín, R., et al. Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation. Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).
- Altschul, F. S., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Forn-Cuní, G., et al. Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation. Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).
- Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).
- Kovács, N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178 (4535), 703 (1956).
- Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11). International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).
- Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida. BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).
- Pawar, S. V., et al. Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).
- Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).
