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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Erzeugung von Nullmutanten zur Aufklärung der Rolle bakterieller Glykosyltransferasen in der bakteriellen Motilität

Published: March 11, 2022 doi: 10.3791/63231
Automatic Translation
1, 2,3, 2,4, 1
1Departamento de Genética, Microbiología y Estadística, Universidad de Barcelona, 2Human Health Therapeutics Research Centre, National Research Council Canada, 3Department of Chemistry, Carleton University, 4Department of Biology, Carleton University

Summary

Hier beschreiben wir die Konstruktion von Nullmutanten von Aeromonas in spezifischen Glykosyltransferasen oder Regionen, die Glykosyltransferasen enthalten, die Motilitätsassays und die Flagellenreinigung, die durchgeführt wurden, um die Beteiligung und Funktion ihrer kodierten Enzyme bei der Biosynthese eines Glykans zu bestimmen, sowie die Rolle dieses Glykans in der bakteriellen Pathogenese.

Abstract

Die Untersuchung der Glykosylierung in Prokaryoten ist ein schnell wachsendes Gebiet. Bakterien beherbergen auf ihrer Oberfläche unterschiedliche glykosylierte Strukturen, deren Glykane einen stammspezifischen Barcode bilden. Die assoziierten Glykane zeigen eine höhere Vielfalt in der Zuckerzusammensetzung und -struktur als die von Eukaryoten und sind wichtig für bakterielle Wirtserkennungsprozesse und die Interaktion mit der Umwelt. In pathogenen Bakterien waren Glykoproteine an verschiedenen Stadien des Infektionsprozesses beteiligt, und Glykanmodifikationen können bestimmte Funktionen von Glykoproteinen beeinträchtigen. Trotz der Fortschritte beim Verständnis der Zusammensetzung, Struktur und Biosynthesewege von Glykanen bleibt das Verständnis der Rolle von Glykoproteinen bei der Pathogenität oder der Wechselwirkung mit der Umwelt sehr begrenzt. Darüber hinaus werden bei einigen Bakterien die für die Proteinglykosylierung erforderlichen Enzyme mit anderen Polysaccharid-Biosynthesewegen, wie Lipopolysaccharid- und Kapsel-Biosynthesewegen, geteilt. Die funktionelle Bedeutung der Glykosylierung wurde in mehreren Bakterien durch Mutation spezifischer Gene aufgeklärt, von denen angenommen wird, dass sie am Glykosylierungsprozess beteiligt sind, und durch die Untersuchung seiner Auswirkungen auf die Expression des Zielglykoproteins und des modifizierenden Glykans. Mesophile Aeromonas haben ein einzelnes und O-glykosyliertes polares Flagellum. Flagellar-Glykane zeigen eine Vielfalt in der Kohlenhydratzusammensetzung und Kettenlänge zwischen Aeromonas-Stämmen. Alle bisher analysierten Stämme zeigen jedoch ein Pseudaminsäurederivat als verbindenden Zucker, der Serin- oder Threoninreste modifiziert. Das Pseudaminsäurederivat wird für die Anordnung polarer Flagellen benötigt, und sein Verlust hat Auswirkungen auf die Adhäsion, die Bildung von Biofilmen und die Besiedlung. Das in diesem Artikel beschriebene Protokoll beschreibt, wie die Konstruktion von Nullmutanten verwendet werden kann, um die Beteiligung von Genen oder Genomregionen, die mutmaßliche Glykosyltransferasen enthalten, an der Biosynthese eines Flagellenglykans zu verstehen. Dazu gehört auch das Potenzial, die Funktion der beteiligten Glykosyltransferasen und die Rolle des Glykans zu verstehen. Dies wird erreicht, indem die Glykanmangel-Mutante mit der Wildtyp-Sorte verglichen wird.

Introduction

Die Proteinglykosylierung wurde sowohl bei Gram-positiven als auch bei Gram-negativen Bakterien beschrieben und besteht aus der kovalenten Bindung eines Glykans an eine Aminosäure-Seitenkette 1,2. In Prokaryoten geschieht dieser Prozess normalerweise über zwei wichtige enzymatische Mechanismen: O- und N-Glykosylierung 3. Bei der O-Glykosylierung wird das Glykan an die Hydroxylgruppe eines Serin (Ser) oder Threonin (Thr) Rückstands gebunden. Bei der N-Glykosylierung ist das Glykan an den Seitenkettenamidstickstoff eines Asparagins (Asn)-Rests innerhalb der Tripeptidsequenzen Asn-X-Ser/Thr gebunden, wobei X eine beliebige Aminosäure außer Prolin sein könnte.

Glykane können lineare oder verzweigte Strukturen annehmen und bestehen aus Monosacchariden oder Polysacchariden, die kovalent durch glykosidische Bindungen verbunden sind. In Prokaryoten zeigen Glykane im Vergleich zu eukaryotischen Glykanen in der Regel eine Vielfalt in der Zuckerzusammensetzung und -struktur4. Darüber hinaus wurden zwei verschiedene bakterielle Glykosylierungswege beschrieben, die sich darin unterscheiden, wie das Glykan zusammengesetzt und auf das Akzeptorprotein übertragen wird: sequentielle und en-bloc-Glykosylierung 5,6. Für die sequentielle Glykosylierung wird das komplexe Glykan durch sukzessive Zugabe von Monosacchariden direkt auf dem Protein aufgebaut. Bei der en-bloc-Glykosylierung wird ein vormontiertes Glykan von einem lipidgebundenen Oligosaccharid durch eine spezialisierte Oligosaccharyltransferase (OTase) auf das Protein übertragen. Es wurde gezeigt, dass beide Signalwege an N- und O-Glykosylierungsprozessen beteiligt sind7.

Die Proteinglykosylierung spielt eine Rolle bei der Modulation der physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften von Proteinen. Das Vorhandensein eines Glykans kann beeinflussen, wie das Protein mit seinem Liganden interagiert, was sich auf die biologische Aktivität des Proteins auswirkt, aber auch die Proteinstabilität, Löslichkeit, Anfälligkeit für Proteolyse, Immunogenität und Mikroben-Wirt-Interaktionenbeeinflussen kann 8,9. Mehrere Glykosylierungsparameter, wie die Anzahl der Glykane, die Zusammensetzung des Glykans, die Position und der Bindungsmechanismus, könnten jedoch auch die Proteinfunktion und -struktur beeinflussen.

Glykosyltransferasen (GTs) sind die Schlüsselenzyme bei der Biosynthese komplexer Glykane und Glykokonjugate. Diese Enzyme katalysieren die glykosidische Bindungsbildung zwischen einem Zuckeranteil aus einem aktivierten Donormolekül und einem spezifischen Substratakzeptor. GTs können sowohl Nukleotide als auch Nicht-Nukleotide als Donormoleküle verwenden und auf verschiedene Substratakzeptoren wie Proteine, Saccharide, Nukleinsäuren und Lipideabzielen 10. Daher ist das Verständnis von GTs auf molekularer Ebene wichtig, um ihre Wirkmechanismen und Spezifität zu identifizieren, und ermöglicht auch das Verständnis, wie die Zuckerzusammensetzung von Glykanen, die relevante Moleküle modifizieren, mit der Pathogenität zusammenhängt. Die Carbohydrate Active Enzymdatenbank (CAZy)11 klassifiziert GTs nach ihrer Sequenzhomologie, was ein prädiktives Werkzeug darstellt, da in den meisten GT-Familien die strukturelle Falte und die Wirkmechanismen invariant sind. Vier Gründe machen es jedoch schwierig, die Substratspezifität vieler GTs vorherzusagen: 1) In Prokaryoten wurde kein klares Sequenzmotiv bestimmt, das die Substratspezifität bestimmt 12, 2) viele GTs und OTasen zeigen Substratpromiskuität13,14, 3) funktionelle GTs sind in rekombinanter Form schwer in hoher Ausbeute herzustellen und 4) die Identifizierung von Donor- und Akzeptorsubstraten ist komplex. Trotzdem haben neuere Mutagenesestudien es ermöglicht, signifikante Fortschritte im Verständnis katalytischer Mechanismen zu erzielen und die Bindung von GTs zu subtrahieren.

Bei Bakterien scheint die O-Glykosylierung häufiger anzutreffen als die N-Glykosylierung. Die O-Glykosylierungsstellen zeigen keine Konsenssequenz, und viele der O-glykosylierten Proteine sind sezernierte oder zelloberflächennahe Proteine, wie Flagelline, Pili oder Autotransporter1. Die Flagellinglykosylierung zeigt eine Variabilität in der Anzahl der Akzeptorstellen, der Glykanzusammensetzung und der Struktur. Zum Beispiel haben Burkholderia spp Flagelline nur eine Akzeptorstelle, während in Campylobacter jejuni Flagelline bis zu 19 Akzeptorstellen15,16 haben. Darüber hinaus ist das Glykan für einige Bakterien ein einzelnes Monosaccharid, während andere Bakterien heterogene Glykane besitzen, die von verschiedenen Monosacchariden kompromittiert sind, um Oligosaccharide zu bilden. Diese Heterogenität tritt sogar bei Stämmen derselben Art auf. Helicobacter-Flagelline werden nur durch Psedaminsäure (PseAc)17 modifiziert, und Campylobacter-Flagellanine können durch PseAc, die Acetamidino-Form der Psedaminsäure (PseAm) oder Legionaminsäure (LegAm) und Glykane, die von diesen Zuckern abgeleitet sind, mit Acetyl, N-Acetylglucosamin oder Propionsubstitutionen18,19 modifiziert werden. In Aeromonas werden Flagelline durch Glykane modifiziert, deren Zusammensetzung von einem einzelnen PseAc-Säurederivat bis zu einem Heteropolysaccharid20 reicht, und die Bindung von Glykanen an die Flagellinmonomere erfolgt immer über ein PseAc-Derivat.

Im Allgemeinen ist die Glykosylierung von Flagellinen für die Flagella-Filament-Assemblierung, Motilität, Virulenz und Wirtsspezifität unerlässlich. Während jedoch Flagellins von C. jejuni16, H. pylori17 und Aeromonas sp. 21 kann sich nicht zu Filament zusammensetzen, es sei denn, die Proteinmonomere sind glykosyliert, Pseudomonas spp. und Burkholderia spp. 15 erfordern keine Glykosylierung für die Flagellenmontage. Darüber hinaus beeinflussen bei einigen C. jejuni-Stämmen Veränderungen in der Zuckerzusammensetzung des Flagellenglykans die Bakterien-Wirt-Interaktion und können eine Rolle bei der Umgehung bestimmter Immunantwortenspielen 16. Autoagglutination ist ein weiteres phänotypisches Merkmal, das durch Modifikationen in der Zusammensetzung von Glykanen, die mit Flagellinen assoziiert sind, beeinflusst wird. Eine geringere Autoagglutination führt zu einer Verringerung der Fähigkeit, Mikrokolonien und Biofilm22 zu bilden. Bei einigen Bakterien war die Fähigkeit von Flagellen, eine entzündungsfördernde Reaktion auszulösen, mit der Flagellin-Glykosylierung verbunden. So induziert in P. aeruginosa glykosyliertes Flagellin eine höhere entzündungsfördernde Reaktion als unglykosyliertes23.

Aeromonas sind gramnegative Bakterien, die in der Umwelt allgegenwärtig sind, wodurch sie sich an der Schnittstelle aller One Health-Komponenten befinden können 24. Mesophile Aeromonas haben ein einzelnes polares Flagellum, das konstitutiv produziert wird. Mehr als die Hälfte der klinischen Isolate exprimieren auch laterales Flakellin, induzierbar in hochviskosen Medien oder Platten. Verschiedene Studien haben beide Flagellentypen mit den frühen Stadien der bakteriellen Pathogenese in Verbindung gebracht25. Während die bisher berichteten polaren Flagelline bei 5-8 Ser- oder Thr-Resten ihrer zentralen immunogenen Domänen O-glykosyliert sind, sind laterale Flagellaline nicht in allen Stämmen O-glykosyliert. Obwohl polare Flagellenglykane aus verschiedenen Stämmen eine Vielfalt in ihrer Kohlenhydratzusammensetzung und Kettenlänge20 aufweisen, hat sich gezeigt, dass der verbindende Zucker ein Pseudaminsäurederivat ist.

Das Ziel dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Gewinnung von Nullmutanten in spezifischen GTs oder chromosomalen Regionen, die GTs enthalten, zu beschreiben, um ihre Beteiligung an der Biosynthese relevanter Polysaccharide und an der bakteriellen Pathogenität sowie die Rolle des Glykans selbst zu analysieren. Als Beispiel identifizieren und löschen wir eine chromosomale Region, die GTs von Aeromonas enthält, um ihre Beteiligung an der polaren Flagellin-Glykosylierung festzustellen und die Rolle des Flagellin-Glykans zu analysieren. Wir zeigen, wie man ein spezifisches GT löscht, um seine Funktion bei der Biosynthese dieses Glykans und die Rolle des modifizierten Glykans zu bestimmen. Obwohl Aeromonas als Beispiel verwendet wird, kann das Prinzip verwendet werden, um Flagellenglykosylierungsinseln anderer gramnegativer Bakterien zu identifizieren und zu untersuchen und die Funktion von GTs zu analysieren, die an der Biosynthese anderer Glykane wie dem O-Antigen-Lipopolysaccharid beteiligt sind.

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Protocol

Die schematische Darstellung des Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Bioinformatische Identifizierung von Flagellenglykosylierungsinseln (FGIs) in Aeromonas

  1. Um die PseAc-Biosynthesecluster in den Aeromonas-Genomen zu identifizieren, verwenden Sie das tblastn-Tool aus der NCBI-Datenbank26. Rufen Sie zunächst orthologe Proteine zu PseC und PseI von A. piscicola AH-3 (Identifikationscodes sind OCA61126.1 und OCA61113.1) aus Datenbanken sequenzierter Aeromonas-Stämme ab und verwenden Sie dann das tblastn-Tool , um ihre übersetzten Nukleotidsequenzen zu durchsuchen.
    HINWEIS: Die pse-Gene flankieren die Aeromonas FGIs, wobei sich pseB und pseC an einem Ende des Clusters und pseI am anderen Ende befinden. Die Position der übrigen PSE-Gene kann von einer FGI-Gruppe zur anderen unterschiedlich sein.
  2. Da diese polaren Flagellin-Gene vieler Stämme an die FGIs angrenzen, verwenden Sie das Tblastn aus der NCBI-Datenbank, um orthologe Proteine zu den polaren Flaellelinen FlaA und FlaB von A. piscicola AH-3 (Identifikationscodes sind OCA61104.1 und OCA61105.1) und die Gene, die sie kodieren, zu finden.
  3. Darüber hinaus enthalten Aeromonas FGIs, die an der Biosynthese von heteropolysaccharidischen Glykanen (Gruppe II)27 beteiligt sind, mehrere Gene, die für Enzyme kodieren, die an der Fettsäuresynthese beteiligt sind, wie luxC und luxE. Verwenden Sie die tblastn aus der NCBI-Datenbank, um orthologe Proteine zu LuxC von A. piscicola AH-3 (Identifikationscode ist OCA61121.1) und dem Gen, das es kodiert, zu finden.

2. Generierung von Nullmutanten in Flagellenglykosylierungsinselgenen

HINWEIS: Diese Methode der Mutagenese basiert auf dem allelischen Austausch von In-Frame-Deletionsprodukten der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung des Suizidvektors pDM428 (GenBank: KC795686.1). Die Replikation des pDM4-Vektors ist Lambda-pir-abhängig , und der vollständige Allelaustausch wird durch die Verwendung des auf dem Vektor befindlichen sacB-Gens erzwungen.

  1. Konstruktion von PCR-In-Frame-Löschprodukten.
    1. Entwerfen Sie zwei Paare von Primern, die DNA-Regionen vor (A- und B-Primer) und stromabwärts (C- und D-Primer) des ausgewählten Gens oder der zu löschenden Region amplifizieren (Abbildung 2B).
    2. Stellen Sie sicher, dass die Primer A und D mehr als 600 bp vor dem Start bzw. stromabwärts vom Stopp des zu löschenden Gens bzw. der zu löschenden Gene aufweisen. Diese beiden Primer müssen am 5'-Ende eine Restriktionsstelle für eine Endonuklease enthalten, die das Klonen in pDM4 ermöglicht.
      HINWEIS: Die Restriktions-Site, die am 5'-Ende von A- und D-Primern enthalten ist, sollte nicht mit Websites innerhalb von AB- oder CD-Amplicons identisch sein.
    3. Stellen Sie sicher, dass sich die Primer B und C innerhalb des zu löschenden Gens bzw. innerhalb des ersten bzw. letzten Gens der zu löschenden Region befinden. Stellen Sie sicher, dass sich beide Primer (B und C) im Rahmen befinden und sich zwischen 5-6 Codons im Gen befinden. Stellen Sie außerdem sicher, dass beide Primer am 5'-Ende eine 21-bp-Komplementärsequenz (Tabelle 1) enthalten, die das Verbinden der DNA-Amplikone AB und CD ermöglicht.
    4. Züchten Sie den ausgewählten Aeromonas-Stamm in 5 ml tryptischer Sojabrühe (TSB) über Nacht (O/N) bei 30 °C. Verwenden Sie ein handelsübliches Kit für die genomische DNA-Aufreinigung und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers (Table of Materials). Quantifizieren Sie 2 μL der gereinigten DNA mit einem Spektralphotometer.
      HINWEIS: Verwenden Sie doppelt destilliertes Wasser als Rohling, wobei das Instrument so eingestellt ist, dass es die Absorption bei 260 nm aufzeichnet. Zeichnen Sie die Absorption mit 2 μL gereinigter DNA 3-5 Mal auf und berechnen Sie einen durchschnittlichen Absorptionswert. Verwenden Sie das Beer-Lambert-Gesetz, um die DNA-Konzentration zu berechnen, wobei A = Ɛ.c.l. ist, wobei "A" die Absorption, "Ɛ" der molare durchschnittliche Extinktionskoeffizient für DNA, "c" die DNA-Konzentration und "l" die Weglänge ist (siehe Anweisung des Herstellers für die Weglänge jedes Instruments).
    5. Verwenden Sie 100 ng gereinigte chromosomale DNA als Vorlage in zwei Sätzen asymmetrischer PCRs mit A-B- und C-D-Primern (Materialtabelle). Verwenden Sie ein Molverhältnis von 10:1 aus A:B- und D:C-Primerpaaren (Ergänzungsmaterial).
      HINWEIS: Asymmetrische PCRs ermöglichen die bevorzugte Verstärkung eines Strangs der Schablone mehr als der andere.
    6. Analysieren Sie die PCR-Produkte durch Elektrophorese in einem 1% igen Agarosegel. Verwenden Sie TAE (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) als Gellaufpuffer und eine Leistungseinstellung von 8 V/cm. Um DNA zu visualisieren, fügen Sie dem Gel Ethidiumbromid (0,5 μg / ml) hinzu und visualisieren Sie die PCR-Produkte mit einer Bio-Imaging-Station (Table of Materials).
    7. Entfernen Sie die Amplikone mit einem Skalpell aus dem Gel, reinigen Sie sie nach dem Protokoll des Herstellers (Table of Materials) und quantifizieren Sie sie.
    8. Verbinden Sie AB- und CD-Amplicons durch ihre 21 bp überlappenden Sequenzen im 3'-Ende von PCR-Produkten (Abbildung 3). Mischen Sie 100 ng jedes Amplikons (AB und CD) in einem PCR-Röhrchen mit PCR-Reagenzien (Pre-AD-PCR), jedoch ohne Primer, und verlängern Sie es mit dem Thermocycler-Programm (Supplementary Material). Dann fügen Sie 100 μM A- und D-Primer zur Reaktion hinzu (AD-PCR) und amplifizieren Sie als einzelnes Fragment (Ergänzungsmaterial).
    9. Das PCR-Produkt (AD-Amplicon) wird durch Elektrophorese in einem 1%igen Agarosegel unter den in Schritt 2.1.6 beschriebenen Bedingungen analysiert, das Amplicon aus dem Gel entfernt, nach dem Protokoll des Herstellers gereinigt und das Amplicon (Table of Materials) quantifiziert.
  2. Aufbau eines rekombinanten pDM4-Plasmids mit der In-Frame-Deletion.
    1. Züchtung einer O/N-Kultur von Escherichia coli cc18λ pir enthaltend pDM4 in Luria-Bertani (LB) Millerbrühe (10 ml) mit Chloramphenicol (25 μg/ml) bei 30 °C.
    2. Drehen Sie die Kultur bei 5.000 x g bei 4 °C herunter und suspendieren Sie das Pellet in 600 μL sterilem destilliertem Wasser. Führen Sie die Extraktion und Reinigung von Plasmid pDM4 mit einem kommerziell erhältlichen Plasmidreinigungskit gemäß den Anweisungen des Anbieters (Materialverzeichnis) durch.
    3. Aufschluss von 1 μg pDM4 und 400 ng AD-Amplicon für 2 h mit einer Endonuklease, die beide Enden des AD-Amplikons und die Klonierungsstelle von pDM4 verdauen kann (Abbildung 3). Befolgen Sie das Protokoll des Enzymherstellers für die Reaktionsbedingungen (Tabelle der Materialien).
    4. Reinigen Sie das verdaute Plasmid und Amplikon mit einem DNA-Reinigungskit und quantifizieren Sie sie gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialverzeichnis).
    5. Um eine Religation des linearisierten pDM4 zu verhindern, entfernen Sie die Phosphatgruppe von beiden 5'-Enden mit dem alkalischen Phosphatase-Enzym gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialverzeichnis). Reinigen Sie dann das behandelte Plasmid und quantifizieren Sie es mit einem Spektralphotometer, wie in Schritt 2.1.4 (Tabelle der Materialien) beschrieben.
    6. Kombinieren Sie 150 ng des aufgeschlossenen und phosphatasealkalisch behandelten pDM4 mit 95-100 ng verdautem AD-Amplicon bei einem molaren Vektor-Insert-Verhältnis von 1:4. Bereiten Sie die Ligationsreaktion in einem Volumen von 15 μL gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialtabelle) vor.
    7. Inkubieren Sie O/N bei 20 °C oder am Wochenende bei 4 °C. Nach der Inkubation die T4-Ligase bei 70 °C für 20 min inaktivieren.
    8. Verwenden Sie Ligatur, um das Plasmid in Escherichia coli MC1061λpir-Stamm durch Elektroporation einzuführen. Verwenden Sie elektrokompetente Bakterien und 2-mm-Spalt-Elektroporationsküvetten.
  3. Herstellung von elektrokompetenten E. coli und Elektroporation von pDM4 rekombinantem Plasmid
    1. Beimpfen Sie eine einzelne Kolonie von E. coli MC1061λpir-Stamm in Luria-Bertani (LB) Miller-Brühe und wachsen Sie O / N bei 30 ° C mit 200 U / min Schütteln.
    2. 2 mL der Bakterienkultur in 18 mL LB-Brühe verdünnen und bei 30 °C mit Schütteln (200 U/min) inkubieren, bis eine optische Dichte (OD600) zwischen 0,4-0,6 erreicht ist.
    3. Die Bakterienkultur wird durch Zentrifugation bei 5.000 x g und 4 °C für 15 min pelletiert. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 40 ml gekühltem destilliertem H2O.
    4. Wiederholen Sie diesen Reinigungsschritt noch zwei weitere Male, um alle Kultursalze zu entfernen. Schließlich suspendiert das Pellet in 4 ml gekühltem destilliertemH2Ound überträgt 1 ml der Suspension auf jedes der vier konischen 1,5 mL Mikrofugenröhrchen.
    5. Pelletieren Sie die Bakterienkultur durch Zentrifugation bei 14.000 x g und 4 °C für 5 min. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und suspendieren Sie jedes Pellet in 100 μL gekühltem destilliertemH2O.
    6. 3-3,5 μL der Ligationsmischung in jedes Röhrchen geben und 5 min auf Eis inkubieren. Übertragen Sie dann den Inhalt jedes Röhrchens auf eine gekühlte 2-mm-Spalt-Elektroporationsküvette und tragen Sie 2 kV, 129 Ω und eine Zeitkonstante von etwa 5 ms auf.
      HINWEIS: Kühlen Sie die Elektroporationsküvetten auf Eis vor. Pflegen Sie die Bakterien während des gesamten Eingriffs auf Eis.
    7. Nach der Elektroporation 250 μL SOC-Medium in jede der vier Küvetten geben, um ihren Inhalt wiederherzustellen, sie in ein Kulturröhrchen (ca. 1 ml) zu übertragen und 1 h bei 30 °C mit Schütteln (200 U/min) zu inkubieren.
    8. Platte der transformierten Zellen auf Luria-Bertani (LB) Agarplatten ergänzt mit Chloramphenicol (25 μg/ml), um sicherzustellen, dass alle in der Platte wachsenden Kolonien das Plasmid-Rückgrat haben.
    9. Pflücken Sie einige Kolonien aus den LB-Agarplatten mit Chloramphenicol und inkubieren Sie O/N bei 30 °C. Wenn Kolonien wachsen, überprüfen Sie das Einfügen des Deletionskonstrukts in pDM4 durch PCR mit Primern, die die pDM4-Klonseite flankieren: pDM4for und pDM4rev (Tabelle 1), und lysierte Kolonien als Vorlage (Ergänzungsmaterial).
    10. Wählen Sie eine Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher und tauchen Sie sie in ein 1,5 ml Röhrchen mit 15 μL 1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 mM EDTA pH 8,0. Die Röhren bei 100 °C für 5 min und dann 1 min auf Eis inkubieren.
    11. Drehen Sie die Röhrchen in einer Mikrofuge bei 12.000 x g für 10 Minuten, um Bakterien und Ablagerungen zu pelletieren. Verwenden Sie 1 μL des Überstands als Vorlage in der PCR-Reaktion (Table of Materials). Die Glühtemperatur des Primerpaares beträgt 50 °C, und die PCR-Reaktion erfordert 10% DMSO (Supplementary Material).
    12. Beimpfen Sie die Kolonien, die das interessierende Produkt in 10 ml LB-Brühe amplifiziert haben, mit Chloramphenicol (25 μg / ml) und wachsen Sie O / N bei 30 ° C. Das Plasmid wird aus Kulturen extrahiert, wie in den Schritten 2.2.1-2.2.2 beschrieben. Sequenzierung mit den pDM4-Primern gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialverzeichnis).
  4. Übertragung der In-Frame-Löschung auf die Aeromonas Dehnung
    HINWEIS: Das rekombinante Plasmid pDM4 muss in das ausgewählte Aeromonas Belastung durch triparentale Paarung (Abbildung 4). Aeromonas Der Stamm muss Rifampicin-resistent sein, um nach der triparentalen Paarung ausgewählt zu werden. Wachsen Sie daher die ausgewählten Stämme O/N auf TSB bei 30 °C, zentrifugieren Sie 2 ml, 4 ml und 6 ml Kulturen bei 5.000 x g Für 15 min suspendieren Sie jedes Pellet in 100 μL TSB und die Platte in TSA mit Rifampicin (100 μg / ml).
    1. Herstellen Sie O/N-Kulturen von E. coli MC1061λpir mit dem rekombinanten Plasmid pDM4 auf LB-Agar mit 25 μg/ml Chloramphenicol (Donorstamm), dem Aeromonas-Stamm Rifampicin-resistent auf TSA mit 100 μg/ml Rifampicin (Empfängerstamm) und dem E. coli HB101 mit dem pRK2073-Plasmid auf LB-Agar mit 80 μg/ml Spektinomycin (Helferstamm) bei 30 °C.
    2. Wenn die Kolonien gewachsen sind, suspendieren Sie die gleiche Anzahl von Kolonien (10-15 Kolonien) der Spender-, Empfänger- und Helferstämme vorsichtig mit einem sterilen Zahnstocher in drei LB-Röhrchen mit 150 μL LB.
    3. Mischen Sie dann auf einer LB-Agarplatte ohne Antibiotika die drei bakteriellen Suspensionen in zwei Tropfen bei einem Empfänger: Helfer: Spenderverhältnis von 5: 1: 1 (50 μL des Empfängers, 10 μL des Spenders und 10 μL Helfer). Inkubieren Sie die Platte mit der Vorderseite nach oben O/N bei 30 °C. Führen Sie eine Negativkontrolle der Konjugation unter Verwendung des Spenderstamms ohne rekombinantes Plasmid durch.
      HINWEIS: Der Helferstamm trägt das konjugative Plasmid pRK2073 und unterstützt den Transfer des pDM4 in den Aeromonas. Verwenden Sie keinen Wirbel, um die Spender-, Empfänger- und Helferstämme auszusetzen, um zu vermeiden, dass der Pili gebrochen wird.
    4. Ernten Sie Bakterien aus der LB-Agarplatte, indem Sie 1 ml LB-Brühe hinzufügen und mit einem sterilen Glasstreuer verteilen, um eine bakterielle Suspension zu erhalten. Verwenden Sie eine Pipette, um die bakterielle Suspension auf eine konische 1,5-ml-Mikrofugenröhre und einen Wirbel zu übertragen.
    5. Zur Auswahl der Empfängerkolonien, die das rekombinante pDM4-Plasmid enthalten, werden 100 μL der geernteten Bakteriensuspension auf LB-Agarplatten mit Rifampicin (100 μg/ml) und Chloramphenicol (25 μg/ml) beschichtet.
    6. Spin down 200 μL und 600 μL der Proben in einer Mikrofuge bei 5.000 x g für 15 min, suspendiert das Pellet in 100 μL LB-Brühe und Platte auf LB-Agar mit Rifampicin (100 μg/ml) und Chloramphenicol (25 μg/ml). Inkubieren Sie alle Platten für 24-48 h bei 30 °C.
    7. Nehmen Sie die gewachsenen Kolonien auf, übertragen Sie sie auf LB-Platten mit Rifampicin (100 μg / ml) und Chloramphenicol (25 μg / ml) und inkubieren Sie sie O / N bei 30 ° C. Bestätigen Sie dann, dass die Kolonien Aeromonas durch den Oxidase-Test29 sind und dass pDM4-rekombinantes Plasmid (erste Rekombination) durch PCR unter Verwendung der E- und F-Primer (Ergänzungsmaterial) in die spezifische chromosomale Region eingeführt wurde, die außerhalb der Region binden, die mit den A- und D-Primern amplifiziert wird (Tabelle der Materialien). Wie in Schritt 2.3.11 beschrieben, verwenden Sie 1 μL lysierte Kolonien als Vorlage.
    8. Um den allelischen Austausch für die In-Frame-Deletion abzuschließen, zwingen Sie die Kolonien mit dem integrierten Suizidplasmid zu einer zweiten Rekombination. Züchten Sie die rekombinanten Kolonien in 2 ml LB mit 10% Saccharose und ohne Antibiotika, O / N bei 30 ° C.
    9. Platte 100 μL der Bakterienkulturen aus Schritt 2.4.8 auf LB-Agarplatte mit Saccharose (10%). Auch Platte 100 μL verschiedener Kulturverdünnungen (10-2-10-4) und Inkubation O/N bei 30 °C.
    10. Um den Verlust von pDM4 zu bestätigen, nehmen Sie die Kolonien auf, übertragen Sie sie auf LB-Platten mit und ohne Chloramphenicol (25 μg / ml), inkubieren Sie sie O / N bei 30 ° C und wählen Sie dann die Chloramphenicol-empfindlichen Kolonien aus.
    11. Analysieren Sie die empfindlichen Kolonien mittels PCR unter Verwendung des E-F-Primerpaares und 1 μL lysierter Kolonien als Vorlage (Table of Materials and Supplementary Material). Wählen Sie die Kolonien aus, deren PCR-Produkt mit der Größe des gelöschten Konstrukts korreliert.

3. Motilitäts-Assays

HINWEIS: Bei einigen Bakterienarten mit glykosylierten Flagellen beeinflussen Modifikationen der Glykosylierungs- oder Glykanzusammensetzung die Montage von Flagellinen, was sich normalerweise als Motilitätsreduktion oder Motilitätsfreiheit widerspiegelt. Daher wurden zwei Motilitätsassays mit den Nullmutanten durchgeführt.

  1. Motilitätsassay in flüssigen Medien
    1. Culture Aeromonas belastet O/N in 1 mL TSB bei 25-30 °C. Um einen Objektträger an einem ausgegrabenen Objektträger zu befestigen, nehmen Sie eine kleine Menge Silikon mit der Spitze eines Zahnstochers auf und geben Sie einen kleinen Tropfen auf die vier Ecken des Abdeckobjektträgers. Anschließend 1 μL der Aeromonas-Kultur in der Mitte des Deckobjektträgers ablegen und in einem Tropfen frischer TSB-Medien (2 μL) mischen.
    2. Legen Sie eine ausgegrabene Rutsche auf die Abdeckrutsche. Passen Sie die Ausgrabung mit dem abgelagerten Tropfen an, drücken Sie vorsichtig und drehen Sie die Rutsche auf den Kopf.
    3. Analysieren Sie die Schwimmmotilität durch Lichtmikroskopie mit einem optischen Mikroskop (Table of Materials) mit einem 100-fachen Objektiv unter Verwendung von Tauchöl.
      HINWEIS: Der Wildtypstamm von Aeromonas muss als Positivkontrolle verwendet werden. Verwenden Sie als Negativkontrolle ein nicht geißeltes Bakterium wie Klebsiella.
  2. Motilitätsassay in halbfesten Medien
    1. Culture Aeromonas belastet O/N in TSB (1 ml) bei 25-30 °C. Übertragen Sie dann 3 μL der Kultur auf die Mitte einer weichen Agarplatte (1% Trypton, 0,5% NaCl, 0,25% Bacto-Agar) und inkubieren Sie die Platte mit Blick nach oben O / N bei 25-30 ° C.
    2. Messen Sie mit einem Lineal die bakterielle Migration durch den Agar von der Mitte der Platte in Richtung Peripherie.

4. Flagellenreinigung

  1. Isolierung von Flagellen, die an der Bakterienoberfläche verankert sind
    1. Culture Aeromonas belastet O/N in TSB (10 ml) bei 25-30 °C. Erweitern Sie dann die Kultur in einen Kolben mit TSB (900 ml) und lassen Sie ihn O / N bei 25-30 ° C mit Schütteln (200 U / min) wachsen.
    2. Zentrifuge bei 5.000 x g für 20 min bei 4 °C. Schwebe das Pellet in 20 ml 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,8).
    3. Um die verankerte Flagelle zu entfernen, scheren Sie die Aufhängung in einem Wirbel mit einer Glasstange (2-3 mm Durchmesser) für 3-4 min und führen Sie sie dann wiederholt (mindestens sechsmal) durch eine 21-G-Spritze.
    4. Pelletbakterien durch zwei aufeinanderfolgende Zentrifugationen bei 4 °C: zuerst bei 8.000 x g für 30 min. Überstand und Zentrifuge bei 18.000 x g für 20 min entfernen. Sammle den Überstand, der freie Flagellen enthält.
    5. Ultrazentrifugieren Sie den Überstand bei 100.000 x g für 1 h bei 4 °C und suspendieren Sie das Pellet in 150 μL von 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) plus 2 mM EDTA-Puffer. Das Pellet enthält Flagellenfilamente.
    6. Es werden 5-10 μL des resuspendierten Pellets aus Schritt 4.1.5 durch Elektrophorese in einem 12%igen SDS-Polyacrylamid-Gel analysiert und die Proteine mittels Coomassie-Blau-Färbung visualisiert.
      HINWEIS: Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für Proteinelektrophorese und Gelfärbung. Verwenden Sie als Positivkontrolle von glykosyliertem Flagellin die gereinigten Flagellen des Wildtypstamms. Reinigen Sie die angereicherte Fraktion der Flagellen in einem Cäsiumchlorid (ClCs) -Gradienten.
  2. Cäsiumchlorid-Gradient zur Reinigung von Flagellen.
    1. Mischen Sie 12,1 g CsCl mit 27 ml destilliertem H2O.
    2. Den angereicherten Flagellenanteil (150 μL) in ein dünnwandiges ultraklares Rohr (14 mm x 89 mm) (Materialverzeichnis) geben und mit 12 ml CsCl-Lösung füllen.
    3. Ultrazentrifugieren Sie das Rohr bei 60.000 x g für 48 h bei 4 °C in einem schwingenden Schaufelrotor (Table of Materials).
    4. Sammeln Sie das Flagellenband mit einer Spritze in den CsCl-Gradienten und dialysieren Sie gegen 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) plus 2 mM EDTA. Anschließend werden die dialysierten Flagellen durch Elektrophorese in einem 12%igen SDS-Polyacrylamid-Gel und Coomassie-Blaufärbung (Schritt 4.1.6) oder durch Massenspektrometrie analysiert.

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Representative Results

Diese Methodik bietet ein effektives System zur Erzeugung von Nullmutanten in Genen oder chromosomalen Regionen von Aeromonas, die die Glykosylierung von Flagellen und die Rolle von Flagellenfilamenten beeinflussen können (Abbildung 1).

Das Protokoll beginnt mit der bioinformatischen Identifizierung von mutmaßlichen FGIs und den Genen, die GTs kodieren, die in dieser Region vorhanden sind. In Aeromonas basiert die chromosomale Lage von FGIs auf dem Nachweis von drei Arten von Genen: Genen, die an der Biosynthese der Pseudaminsäure (pseI und pseC) beteiligt sind, polaren Flagellingenen und luxC. Stämme, deren polare Flagellen durch ein einzelnes Pseudaminsäurederivat glykosyliert sind, wie A. hydrophila AH-130, haben keine Gene, die für GTs zwischen den pse-Genen in FGIs der Gruppe I27 kodieren. Die meisten Stämme, die zu dieser FGI-Gruppe gehören, zeigen polare Flagellin-Gene, die an diese Region angrenzen. Im Gegensatz dazu zeigen Stämme, deren polare Flagellen mit einem Heteropolysaccharid-Glykan glykosyliert sind, wie A. piscicola AH-3 19, verschiedene Gene, die GTs nach luxC kodieren, lokalisiert zwischen pse-Genen der FGI-Gruppe II27, und sie sind nicht immer neben polaren Flagellin-Genen (Abbildung 2A).

Die Region, die an der Biosynthese des Flagella-Heteropolysaccharid-Glykans beteiligt ist, und die Funktion der dort enthaltenen mutmaßlichen GTs wurde durch die Konstruktion von Nullmutanten bestätigt. Die Erzeugung jeder Mutante erfordert vier Primer: A, B, C und D (Tabelle 1). Primer B glüht 5-6 Codons stromabwärts vom Beginn des Gens (fgi-4) oder des ersten Gens des zu löschenden Clusters (fgi-1) und Primer A glüht 600-800 bp vor dem Beginn dieses Gens (fgi-4 oder fgi-1). Primer C glüht vor den letzten 5-6 Codons des zu löschenden Gens (fgi-4) oder des letzten Gens des Clusters (fgi-12) und Primer D anneet 600-800 bp stromabwärts vom Stopp dieses Gens (fgi-4 oder fgi-12) (Abbildung 2B). Die Primer A und D für die Deletion von fgi-Cluster und fgi-4 von A. piscicola AH-3 enthalten an ihren 5'-Enden eine Restriktionsstelle für die Endonuklease BamHI (Tabelle 1). Diese Endonuklease hat keine internen Ziele in den AB- oder CD-PCR-Fragmenten. Ein wichtiger Schritt ist das Design von B- und C-Primern. Beide müssen im Rahmen sein, um den offenen Leserahmen des zu löschenden Gens oder Fragments nicht zu unterbrechen. Die 21 bp komplementären Sequenzen am 5'-Ende von B- und C-Primern ermöglichen die Erzeugung von AB- und CD-Amplicons mit 3'-Endkomplementärsequenzen, die das Verbinden und Erweitern dieser Amplicons ermöglichen. Das PCR-Programm zum Verbinden und Erweitern der Amplicons besteht aus einem ersten Ausbürgerungsschritt und fünf Zyklen mit einer Glühtemperatur von 54 °C (Ergänzungsmaterial). Dann ermöglicht die Zugabe von A- und D-Primern die Verstärkung des erweiterten Fragments (Abbildung 3). Die enzymatische Wirkung von BamHI führt zu einem Amplicon mit klebrigen Enden, die für die Ligation mit dem mit BglII verdauten Suizidvektor pDM4 kompatibel sind.

Da pDM4 ein λpir-abhängiges Plasmid ist, wurde das Ligationsprodukt in den E. coli-Stamm MC1061λ pir (thi thr1 leu6 proA2 his4 argE2 lacY1 galK2 ara14 xyl5 supE44 λ pir) elektropoliert und in Chloramphenicolplatten ausgewählt. pDM4 verfügt nicht über ein direktes System zur Auswahl der rekombinanten Klone, und die Kolonien wurden mittels PCR mit einem pDM4-Primerpaar (pDM4for und pDM4rev) (Tabelle 1 und ergänzendes Material) analysiert, das den Klonierungsbereich flankiert. Der E. coli-Stamm MC1061λpir ohne pDM4 wurde als Negativkontrolle in der PCR-Reaktion verwendet.

Zur Durchführung des Allelaustauschs wurde das rekombinante pDM4-Plasmid auf den Empfängerstamm A. piscicola AH-3 übertragen. Da viele Aeromonas nicht durch Elektroporation transformierbar sind, wurde das rekombinante pDM4 durch Konjugation mittels triparentaler Paarung übertragen (Abbildung 4). Zur Auswahl der transkonjuganten Kolonien verwenden wir einen Rifampicin-resistenten Empfängerstamm, der es ermöglicht, den Aeromonas-Stamm aus der Konjugationspaarung auszuwählen. Darüber hinaus wurden die ausgewählten Kolonien dem Oxidase-Test unterzogen, denn während Aeromonas oxidase-positiv ist, ist E. coli oxidase-negativ . Die erste und zweite Rekombination wurden durch PCR mit externen Primern (E- und F-Primer) von amplifizierten Regionen (AB- und CD-Fragmente) bestätigt (Tabelle 1, Ergänzungsmaterial und Abbildung 5A).

In Aeromonas ist die Glykosylierung von polaren Flagellinen essentiell für die Montage des Flagellenfilaments. Das Vorhandensein funktioneller polarer Flagellen wurde unter Verwendung von Motilitätsassays der Bakterienkolonien mit gelöschten GTs-Genen oder -Regionen analysiert. Lichtmikroskopische Assays zeigten, dass die Schwimmmotilität in flüssigem Medium bei beiden Mutanten im Vergleich zum Wildtypstamm reduziert war. Darüber hinaus zeigten beide eine verminderte radiale Ausdehnung in Bezug auf den Wildtypstamm, wenn die Motilität an weichem Agar analysiert wurde (Abbildung 5B). Angesichts der Tatsache, dass beide Mutanten schwimmen konnten, aber mit reduzierter Motilität in Bezug auf den Wildtypstamm, wurden ihre polaren Flagellen gereinigt und das Flagellin-Molekulargewicht wurde in einem 12% igen SDS-Polyacrylamid-Gel analysiert. Diese Analyse zeigte, dass beide Mutanten polare Flagellaline mit niedrigerem Molekulargewicht als der Wildtypstamm aufweisen (Abbildung 5C), was auf Veränderungen im Flagellenglykan hindeutet. Flagellen, die durch CsCl-Gradienten gereinigt wurden (Abbildung 5C), werden in massenspektrometrischen Assays verwendet, um die Glykanzusammensetzung und Nullmutanten zu identifizieren, die in Biofilm-, Adhäsions- oder anderen Assays verwendet werden, um die Rolle der Glykan- und Glykanzusammensetzung zu identifizieren.

Figure 1
Abbildung 1: Übersicht über die in diesem Verfahren verwendeten Schritte. Schema des im Protokoll beschriebenen Prozesses zur Identifizierung der Flagellenglykosylierungsinsel von Aeromonas und GTs, die an der Glykanbiosynthese beteiligt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Bioinformatischer Nachweis von Chromosomenregionen und Primerdesign. (A) Schema der chromosomalen Regionen, die in A. hydrophila AH-1 und A. piscicola AH-3 identifiziert wurden. A. hydrophila AH-1 Flagellenglykosylierungsinsel ist repräsentativ für Stämme, deren Flagellenglykan nur ein Pseudaminsäurederivat enthält, und A. piscicola AH-3 Flagella Glykosylierungsinsel ist repräsentativ für Stämme, deren Flagellenglykan ein Heteropolysaccharid ist. Gene, die schwarz bezeichnet werden, sind an der Biosynthese von Pseudaminsäure beteiligt, und die gelb bezeichneten sind mutmaßliche GTs. (B) Schema der chromosomalen Lage von Primerpaaren, die für die PCR-In-Frame-Deletionen entwickelt wurden. Blaue Kästchen in A- und D-Primern enthalten die Restriktionsbindungsstelle für eine Endonuklease. Rote Kästchen in B- und C-Primern enthalten 21 bp komplementäre Sequenzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Schema, das die Methode zur Konstruktion von PCR-In-Frame-Deletionen und Ligatur zum Selbstmordplasmid pDM4 darstellt. MCS: Multiklonstelle, CmR: Chloramphenicol-resistente Gene, sacB: kodiert für den Bacillus subtilis levansucrase, dessen Expression durch Saccharose induziert wird und für gramnegative Bakterien tödlich ist, und mob: Mobilisationsgene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Triparentale Konjugation und Verfahren für den Allelaustausch Die erste Rekombination erfolgt aufgrund der Abwesenheit von λpir in den Aeromonas-Stämmen und führt zur Integration des rekombinanten Plasmids in das ausgewählte Gen. Die zweite Rekombination wird durch das Wachstum von LB mit 10% Saccharose induziert, was zur Expression des SacB-Gens führt, und das Plasmid wird aus dem Chromosom entfernt. Nach dem Cross-Over kann der Wildtyp oder das mutierte Gen auf dem bakteriellen Chromosom verbleiben. Nullmutanten werden durch PCR mit externen Primern ausgewählt. RifR: Rifampicin-beständig; CmR: chloramphenicol resistent; SpcR: spektinomycinbeständig. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Bestätigung von Nullmutanten und phänotypische Analyse polarer Flagellen. (A) PCR mit fgi-4 externen Primern (EF-Primern) von A. piscicola AH-3 zur Bestätigung des Allelaustauschs nach zweiter Rekombination in chloramphenicolsensitiven Kolonien. Bahn WT: A. piscicola AH-3; Bahnen 1-8: Chloramphenicol-empfindliche Kolonien der zweiten Rekombination; St: HyperLadder 1 Kb Markierung. Die Bahnen 1-3 und 5-8 zeigen die Kolonien mit Wildtyp-fgi-4-Gen als Lane WT. Lane 4 zeigt eine Kolonie mit dem gelöschten fgi-4-Gen. (B) Motilität auf weichem Agar von A. piscicola AH-3 und Nullmutanten in der fgi-Region (AH-3ΔFgi) und fgi-4-Gen (AH-3ΔFgi-4) bei 25 °C. (C) Polares Flagellum aus AH-3 (Spur1) und den Nullmutanten in der fgi-Region (Spur 2) und dem fgi-4-Gen (Spur 3), isoliert, in CsCl-Gradienten gereinigt, in 12% SDS-PAGE analysiert und mit Coomassie-Blau gefärbt. Größenstandard (St). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Name der Grundierung Sequenz in 5' bis 3' Richtung Verwendet für
A. piscicola AH-3
A-Flgi1 CGCGGATCCGACTGTCGTTTCAATCA FGI Mutant
B-Flgi1 CCCATCCACTAAACTTAAACA GATCACCTCGAACTCGAAA
C-Flgi12 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGG GGAACCTTAAATGCCATGA
D-Flgi12 CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC
E-Flgi1 ACCCGCTTCATTCGCTAT
F-Flgi12 TCCGATTTTCTGACTCAGGG
A-FGI4 CGCGGATCCGATGCGTACGCTAATATGAA FGI-4 Mutant
B-Fgi4 CCCATCCACTAAACTTAAACA CATATTATCTTGCCCCTGAT
C-Fgi4 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGG ATGGAGCTAATCACTCGTTT
D-FGI4 CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC
E-Fgi4 ATTTCCCTGCCAAATACG
F-FGI4 CCTGCCAACAGGATGTAAG
pDM4-Vektor
pDM4für AGTGATCTTCCGTCACAGG Einfügungen in den pDM4-Vektor
pDM4rev AAGGTTTAACGG TTGTGGA

Tabelle 1: Primer für die Konstruktion von Nullmutanten. Überlappende Bereiche in den Primern B und C werden hervorgehoben. Bam Die HI-Site ist in den Grundierungen A und D fett gedruckt.

Ergänzendes Material. Reagenzien und Reaktionen, die in asymmetrischen PCRs verwendet werden, um die AB- und CD-Amplicons zu erhalten, Pre-AD- und AD-PCRs, um die AD-Amplicons zu erweitern und zu erhalten, pDM4-PCRs, um das Einfügen des gelöschten Konstrukts in den pDM4-Vektor zu überprüfen, und EF-PCRs, um die erste und zweite Rekombination zu überprüfen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Der entscheidende frühe Schritt dieser Methode ist die Identifizierung von Regionen, die an der Glykosylierung von Flagellen und mutmaßlichen GTs beteiligt sind, da diese Enzyme eine hohe Homologie aufweisen und an vielen Prozessen beteiligt sind. Die bioinformatische Analyse von Aeromonas-Genomen in öffentlichen Datenbanken zeigt, dass diese Region an die polare Flagellenregion 2 angrenzt, die die Flagellin-Gene in vielen Stämmen enthält und Gene enthält, die an der Biosynthese von Pseudaminsäure27 beteiligt sind. Dies hat es ermöglicht, eine Richtlinie für den Nachweis von Flagellenglykosylierungsinseln in Aeromonas zu entwickeln, mit der diese Region in anderen Bakterien identifiziert werden kann, deren Flagellenglykan Pseudaminsäurederivate enthält. Obwohl diese Methode beschreibt, wie ein Gencluster analysiert wird, der an der Glykosylierung von Flagellen beteiligt ist, kann sie auch verwendet werden, um Gene zu untersuchen, die für Proteine kodieren, die an der Bildung, Rotation oder Regulation von Flagellen in verschiedenen gramnegativen Bakterien beteiligt sein könnten.

Wichtig bei der Generierung von PCR-In-Frame-Deletionen ist auch das Design von B- und C-Primern. Diese Primer sollten 5-6 Codons vor dem Start (B-Primer) und vor dem Stop (C-Primer) des ausgewählten Gens oder der zu löschenden Region lokalisiert sein und den offenen Leserahmen nicht unterbrechen. Darüber hinaus ist ein wichtiger zu berücksichtigender Faktor die Länge der Homologieregion, die zur Erzeugung der AB- und CD-Amplicons verstärkt wird. Dieses Protokoll empfiehlt, dass beide Amplikone eine homologe Region von jeweils 600-800 bp enthalten. Kürzere Homolog-Regionen machen die erste Rekombination schwieriger.

Aeromonas-Stämme tragen nicht das Lambda-Pir-Gen, das benötigt wird, um das pDM4-Selbstmordplasmid zu replizieren. Daher muss sich das rekombinante pDM4-Plasmid in die chromosomale DNA integrieren. Nach der triparentalen Paarung ist es wichtig, die Bakterienkolonien zu identifizieren, in denen die erste Rekombination stattgefunden hat. Diese Kolonien enthalten das rekombinante pDM4, das in die homologe Chromosomenregion eingeführt wird. Die Identifizierung rekombinanter Kolonien erfolgt unter Verwendung einer PCR-Reaktion mit Primern (E- und F-Primern) außerhalb der Region, die gelöscht werden soll. Wenn eine Standard-DNA-Polymerase verwendet wird, führen die E-F-Primer nur zur Erzeugung eines PCR-Produkts im Wildtyp. Dieses Primerpaar produziert kein PCR-Produkt in Bakterienkolonien, in denen das rekombinante pDM4-Plasmid in die chromosomale DNA eingefügt wurde. Das Fehlen eines PCR-Produkts ist auf den Abstand zwischen den Glühsequenzen von E- und F-Primern zurückzuführen. Dieser Abstand kann nicht durch Standardpolymerasen verstärkt werden. Aber auch andere Faktoren können die Bildung von PCR-Produkten verhindern. Daher können erste rekombinante Kolonien durch DNA-Polymerasen für eine lange Fragmentamplifikation oder durch PCR-Reaktionen unter Verwendung von Primerpaaren, bestehend aus einem pDM4 und einem externen Primer, identifiziert werden. Wenn große genetische Cluster gelöscht werden, erfordert die Amplifikation im Wildtypstamm die Verwendung von DNA-Polymerasen für eine lange Fragmentamplifikation. Bakterienkolonien mit der ersten Rekombination können durch PCR mit pDM4-externen Primerpaaren identifiziert werden. Erste und zweite Rekombinationen werden jedoch in der Regel gleichzeitig hergestellt, so dass das pDM4 nach der Rekombination mit dem Wildtyp oder mit dem gelöschten Gen verbleibt. Dies führt zu Chloramphenicol-resistenten Kolonien, deren PCR unter Verwendung externer Primer Amplikone mit einer identischen Größe des Wildtypgens oder kleine Amplikone ergeben, die mit dem gelöschten Gen oder Fragment korrelieren. Kolonien, von denen gezeigt wurde, dass sie den richtigen rekombinanten Einsatz hatten, wurden mit Saccharose inkubiert, um das nicht eingefügte pDM4 zu entfernen. Saccharose induziert die Expression des sacB-Gens auf dem pDM4, das für ein tödliches Enzym für gramnegative Bakterien kodiert. Daher werden nur Kolonien, denen das Selbstmordplasmid fehlt, in LB mit Saccharose wachsen. Um die Identität von Kolonien zu unterstützen, die das gelöschte Gen enthalten, kann das mit dem externen Primerpaar amplifizierte Fragment dann sequenziert werden.

Die Implementierung dieser In-Frame-Mutationsmethode in Aeromonas ermöglicht die Erzeugung stabilerer Nullmutanten ohne Modifikationen der Expressionsniveaus nachgeschalteter Gene. Andere Methoden, wie das Einsetzen einer Antibiotikakassette, stellen die Transkription nachgeschalteter Gene sicher, aber das Expressionsniveau könnte modifiziert werden. Darüber hinaus könnte diese Methode auf andere Zielgene und -regionen extrapoliert werden, einschließlich anderer gramnegativer Bakterien 29,31,32,33.

In einigen Bakterienstämmen kann der Verlust oder die Modifikation von Glykan, das mit Flagellinen verbunden ist, zur Unfähigkeit der Flagellenmontage oder zur Instabilität des Flagellenfilaments führen, was zu einer Verringerung der polaren Flagellenmotilität führt. Während es leicht ist, einen nicht-beweglichen Phänotyp von einem beweglichen Phänotyp mit Motilitätsassays in flüssigen Medien zu unterscheiden, können Unterschiede im Grad der Motilität schwer zu quantifizieren sein. Motilitätsplatten-Assays sind erforderlich, um Unterschiede im Motilitätsgrad zu messen. Einige Bakterienarten, darunter viele mesophile Aeromonas-Stämme , exprimieren jedoch zusätzlich zu den konstitutiven polaren Flagellen induzierbare laterale Flagellen, wenn sie in hochviskosen Medien oder Platten wachsen. Beide Flagellentypen tragen zur bakteriellen Motilität in halbfesten Platten bei. Daher führen Modifikationen von polaren oder lateralen Flagellen nur zu einer Verringerung der Migrationsdurchmesser. So zeigen AH-3ΔFgi- und AH-3ΔFgi-4-Mutanten nur eine reduzierte Motilität in Bezug auf den Wildtypstamm. Um die Bewertung der durch die Rotation polarer Flagellen erzeugten Motilität zu verbessern, sollte der Expansionsdurchmesser von Nullmutanten nicht nur in Bezug auf den Wildtypstamm, sondern auch auf eine Mutante ohne polares Flagellum verglichen werden. Darüber hinaus beeinflusst eine Verringerung der Anzahl der Glykanreste oder Änderungen der Glykanzusammensetzung die elektrophoretische Motilität von glykosylierten Flagellinen. Zum Beispiel ist das Molekulargewicht von glykosylierten Flagellinen, die mit SDS-PAGE-Gelen beobachtet wurden, höher als aus der Flagellin-Aminosäuresequenz vorhergesagt, und Störungen des Glykans werden als Verringerung ihres Molekulargewichts beobachtet. In einigen Fällen sind die Veränderungen der Glykanmodifikation des Flagellin-Proteins möglicherweise nicht mit SDS-PAGE nachweisbar. In diesen Fällen kann eine massenspektrometrische Analyse von intaktem Protein oder Flagellinpeptiden erforderlich sein, um das Vorhandensein und die Masse von Glykan zu bestätigen.

Die Pathogenität von Aeromonas sowie anderen gramnegativen Bakterien kann durch das Fehlen von Flagellum, aber auch durch Veränderungen in der Zusammensetzung von Flagella-Glykanen beeinflusst werden. Diese Veränderungen können die bakterielle Interaktion mit biotischen und abiotischen Oberflächen, die Autoagglutination, die Vermeidung der Immunantwort und / oder die Induktion einer entzündungsfördernden Reaktion beeinflussen. Daher sind Adhärenz-, Biofilmbildungs- und Pro-Entzündungsreaktions-Assays erforderlich, um den Zusammenhang zwischen der Glykosylierung von Flagellen und der Aeromonas-Pathogenität zu bewerten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom National Research Council Canada für den Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien) und für die Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit Applied Biosystems 4337455 Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity Invitrogen 12346-086 Used for amplification of AB, CD and AD fragments
Agarose Conda-Pronadise 8008 Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) Promega M1821 Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agar Becton Dickinson 214010 Use for motility analysis
BamHI Promega R6021 Used for endonuclease restriction
BglII Promega R6081 Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin System UVP Bio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymerase Bioline BIO-21040 Used for colony screening
Cesium chloride Applichem A1126,0100 Used for flagella purification
Chloramphenicol Applichem A1806,0025 Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit Cytivia 28-9034-71 Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTA Applichem 131026.1211 Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gap VWR 732-1133 Used for transformation
Ethidium bromide Applichem A1152,0025 Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb marker Bioline BIO-33053 DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit Invitrogen 10750204 Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agar Condalab 996 Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller broth Condalab 1551 Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000 NanoDrop Techonologies Inc Spectrophotometer used for DNA quantification
Rifampicin Applichem A2220,0005 Used for triparental mating
SOC Medium Invitrogen 15544034 Used for electroporation recovery
Spectinomycin Applichem A3834,0005 Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman 331362 Used for flagella purification
T4 DNA ligase Invitrogen 15224017 Used for ligation reaction
Trypticasein soy agar Condalab 1068 Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy broth Condalab 1224 Used for Aeromonas grown
Tryptone Condalab 1612 Use for motility analysis
Tris Applichem A2264,0500 Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100 Applichem A4975,0100 Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) Beckman 344059 Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal Cycler Applied Biosystems Used for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II Kit Zymmo research D4020 Used for isolation of plasmid DNA

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Immunologie und Infektion Ausgabe 181 O-Glykosylierung Glykosyltransferasen Heteroglykan In-Frame-Mutanten mesophile Aeromonas Flagelline Flagellenreinigung CsCl-Gradient
Erzeugung von Nullmutanten zur Aufklärung der Rolle bakterieller Glykosyltransferasen in der bakteriellen Motilität
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Tomás, J. M., Fulton, K. M.,… More

Tomás, J. M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Merino, S. Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility. J. Vis. Exp. (181), e63231, doi:10.3791/63231 (2022).

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