Summary
等温滴定熱量測定を使用して、ウイルス侵入前後のライフサイクル段階を標的とする抗B型肝炎ウイルス(HBV)化合物をスクリーニングするためのプロトコルを提示し、宿主タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチドとの結合親和性(KD)を測定します。抗ウイルス効果は、ウイルスライフサイクルマーカー(cccDNA形成、転写、およびウイルス集合)の抑制によって決定されました。
Abstract
B型肝炎ウイルス(HBV)感染は、肝細胞癌の重要な危険因子と見なされてきました。現在の治療はウイルス量を減らすことしかできませんが、完全な寛解をもたらすことはできません。HBV感染の効率的な肝細胞モデルは、治療薬のスクリーニングに不可欠な、実物に忠実なウイルスライフサイクルを提供します。利用可能なほとんどの抗HBV剤は、ウイルス侵入後のライフサイクル段階を標的としていますが、ウイルス侵入前は標的としていません。このプロトコルは、前ウイルス侵入およびウイルス侵入後のライフサイクル段階を標的とする治療薬をスクリーニングすることができる有能な肝細胞モデルの生成を詳述する。これには、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド(NTCP)結合、cccDNA形成、転写、および宿主細胞としてのimHCまたはHepaRGに基づくウイルスアセンブリの標的化が含まれます。ここで、HBV侵入阻害アッセイでは、NTCPを介したHBV結合および輸送機能を阻害するためにクルクミンを使用した。阻害剤は、熱力学的パラメーターに基づくHBV薬物スクリーニングのための普遍的なツールである等温滴定熱量測定(ITC)を使用して、NTCPとの結合親和性(KD)を評価しました。
Introduction
B型肝炎ウイルス(HBV)感染は、世界中で生命を脅かす病気と見なされています。慢性HBV感染症は、肝硬変と肝細胞癌のリスクを伴います1。現在の抗HBV治療は、主にヌクレオス(t)イド類似体(NA)およびインターフェロンアルファ(IFN-α)2,3を使用したウイルス侵入後に焦点を当てています。HBV侵入阻害剤であるミルクルデックスBの発見により、抗HBV薬の新規標的が特定されました4。慢性HBVにおける侵入阻害剤とNAの組み合わせは、ウイルス複製のみを標的とするウイルス量と比較してウイルス量を大幅に減少させました5,6。しかしながら、HBV侵入阻害剤のスクリーニングのための古典的な肝細胞モデルは、低いウイルス受容体レベル(タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド、NTCP)によって制限される。肝癌細胞(すなわち、HepG2およびHuh7)におけるhNTCPの過剰発現は、HBV感染性を改善する7,8。それにもかかわらず、これらの細胞株は低レベルの第I相および第II相薬物代謝酵素を発現し、遺伝的不安定性を示します9。前ウイルス侵入、NTCP結合、ウイルス侵入など、候補抗HBV化合物の明確なメカニズムを標的とするのに役立つ肝細胞モデルは、効果的な併用レジメンの同定と開発を促進します。クルクミンの抗HBV活性の研究は、ウイルス侵入後の中断に加えて、新しいメカニズムとしてウイルス侵入の抑制を解明しました。このプロトコルは、抗HBV侵入分子10のスクリーニングのための宿主モデルを詳述する。
この方法の目的は、ウイルス侵入阻害、特にNTCP結合および輸送の遮断のための候補となる抗HBV化合物を探索することです。NTCP発現はHBVの侵入と感染にとって重要な要素であるため、NTCPレベルを最大化するために肝細胞成熟プロトコルを最適化しました11。さらに、このプロトコルは、HBV侵入に対する阻害効果を、HBV付着の阻害対内在化の阻害として区別することができる。タウロコール酸(TCA)取り込みアッセイも、NTCP輸送を表すために放射性同位元素の代わりにELISAベースの方法を用いて改変された12,13。受容体とリガンドの相互作用は、それらの3D構造によって確認された14,15。NTCP機能の阻害は、TCA取り込み活性を測定することによって評価することができる16。しかしながら、この技術は、候補阻害剤へのNTCP結合の直接的な証拠を提供しなかった。したがって、結合は、表面プラズモン共鳴17、ELISA、蛍光ベースの熱シフトアッセイ(FTSA)18、FRET19、AlphaScreen、および他の様々な方法20などの様々な技術を用いて調べることができる。これらの手法の中でも、ITCはほぼすべての反応21において熱吸収または発光を観察できるため、結合解析における目標標準である。NTCPと候補化合物の結合親和性(KD)は、ITCを用いて直接評価した。これらの親和性値は、in silico予測モデル22を用いて得られた値よりも正確であった。
このプロトコルは、肝細胞の成熟、HBV感染、およびHBV侵入阻害剤のスクリーニングにおける技術をカバーしています。簡単に説明すると、肝細胞モデルは、imHCおよびHepaRG細胞株に基づいて開発された。培養細胞は2週間以内に成熟肝細胞に分化した。NTCPレベルのアップレギュレーションは、リアルタイムPCR、ウェスタンブロット、およびフローサイトメトリーを使用して検出されました11。B型肝炎ビリオン(HBVcc)が産生され、HepG2.2.15から収集されました。分化したimHCまたはHepaRG(d-imHC、d-HepaRG)を、HBVビリオンの接種2時間前に抗HBV候補で予防的に処理した。実験の期待される結果は、細胞のHBVと感染力を低下させる薬剤の特定でした。抗NTCP活性は、TCA取り込みアッセイを用いて評価した。NTCP活性は、NTCPを特異的に結合した薬剤によって抑制され得る。ITC技術は、生体分子複合体の非共有結合相互作用を介して受容体に対するリガンドの結合親和性(KD)を決定し、阻害剤とその標的タンパク質を予測できる相互作用的結合の実現可能性を調べるために採用されました23,24。例えば、KD ≥ 1 ×10 3 mMは弱い結合を表し、K D ≥ 1 × 106 μMは中程度の結合を表し、KD ≤ 1 × 109 nMは強い結合を表す。ΔGは結合相互作用と直接相関しています。特に、負のΔGとの反応はエクセルゴニック反応であり、結合が自発的なプロセスであることを示す。負のΔHとの反応は、結合プロセスが水素結合とファンデルワールス力に依存することを示します。TCA取り込みとITCデータの両方を使用して、抗HBVエントリーエージェントをスクリーニングすることができます。これらのプロトコルの結果は、抗HBVスクリーニングだけでなく、結合親和性と輸送機能を通じて評価されるNTCPとの相互作用の基礎も提供できます。この論文では、宿主細胞の調製と特性評価、実験デザイン、および抗HBVエントリーの評価とNTCP結合親和性について説明します。
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Protocol
注意: 次の手順は、クラスIIの生物学的ハザードフローフードまたは層流フードで実行する必要があります。HBVの取り扱いはIRBによって倫理的に承認されました(MURA2020/1545)。このプロトコルで使用されるすべての溶液、試薬、機器、および細胞株の詳細については、 材料表 を参照してください。
1. 宿主細胞(成熟肝細胞)の調製
- 肝細胞(3.75 × 105 細胞HepaRGまたはimHC)を培養し、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%L-グルタミン、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを添加した10 mLのDMEM/F12培地を用いて75 cm2 の培養フラスコに維持します。細胞が80%〜90%のコンフルエントに達するのを待ちます(1週間以内)。
- フラスコから古い培地を廃棄し、4 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄します。
- PBSを吸引し、4 mLの0.05%トリプシン-EDTAを加えます。
- フラスコを37°Cのインキュベーターで2〜3分間インキュベートし、10倍の対物レンズを備えた倒立顕微鏡を使用して接着細胞を確認します。単分子膜が培養表面から剥離していることを確認します。
- 10% FBS を添加した培養液 4 mL をフラスコに加えてトリプシンを阻害し、採取した細胞を注意深く再懸濁します。細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、300 × g、25°Cで3分間遠心分離します。
- 細胞ペレットから上清を吸引し、10%FBSと抗生物質を添加した1〜2 mLの予温培養液で再懸濁します。
- 細胞懸濁液とトリパンブルーをそれぞれ10 μL混合し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。次のステップに進む前に、細胞の生存率が90%を超えていることを確認してください。
- 6ウェルプレートの各ウェルに2 mLあたり1×106 細胞を播種し、細胞が100%コンフルエントに達するまでDME/F12完全培地に維持します。
- 肝成熟のために、肝成熟培地を準備します(10%FBS、100 U / mLペニシリン、100 μg / mLストレプトマイシン、5 μg / mLインスリン、50 μMヒドロコルチゾン、2 mM L-グルタミン、および2%DMSOを補充したウィリアムズE培地)。.
- 培養液を週に2回交換してください。
- 肝細胞を成熟培地で2週間維持して、HBV感染の準備ができている成熟肝細胞を取得します。
2. 細胞NTCPの定量化
- リアルタイムPCRを用いたNTCP発現の測定
- トリプシン処理によって成熟肝細胞のペレットを収集します(ステップ1.2-1.5を参照)。
- DNase I処理を施したRNA抽出キットを用いて、細胞ペレットから全RNAを抽出します。
- 製造元の指示に従って、オリゴdTプライマーと逆転写システムを使用して、200 ngの全RNAからcDNAを合成します。
- cDNAを50 ng/μLに希釈し、PCR反応のテンプレートとして使用します。希釈したcDNA2 μLを、SYBRグリーンqRT-PCRキット溶液を含むPCRマスターミックス試薬と5 μM NTCP特異的プライマー(5'-GGACATGAACCACCCATTGTG-3'および5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3')と混合します。
- 正規化のために、特定のプライマー(5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3'および5'-AAATGAGCCCCCCAGCCCCTTCTC-3')を有するハウスキーピング遺伝子として GAPDH を使用する。
- 以下の温度条件下でサーマルサイクラーを使用してcDNAサンプルを増幅する:95°Cで3分間の1サイクル(初期変性);95°Cで30秒(変性)、60°Cから65°Cで30秒(アニーリング)、72°Cで30秒(伸長)の40サイクル;72°Cで5分間の1サイクル(最終伸長)。
- 2-ΔΔCT法に基づいて、GAPDHをキャリブレーター遺伝子として使用して、未分化細胞上の成熟肝細胞におけるNTCP倍変化を計算します。
- ウェスタンブロット解析を用いたNTCPの定量(英語)
- セルスクレーパーを用いて肝細胞を回収し、300 x g、25°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットを回収します。
- RIPAバッファーの製造元の指示に従って、1xプロテアーゼ阻害剤を含む100 μLのRIPAバッファーで細胞タンパク質を抽出します。
- ビシンコニン酸(BCA)法を用いて総タンパク質濃度を測定します。
- 12.5 μLのタンパク質と2倍ローディング色素を体積比1:1で混合します。
- タンパク質混合物と標準はしごを95°Cで5分間煮沸します。
- 電気泳動チャンバーに1xランニングバッファーを追加します。
- 5 μLのタンパク質標準ラダーまたは20 μLの煮沸したタンパク質混合物を10%(w / v)ポリアクリルアミドゲルに入れます。
- ゲル電気泳動:50 Vで30分間、続いて室温で90 Vで1時間。
- PVDFメンブレンをメタノールに30秒間浸して準備し、二重蒸留水で1〜2分間洗浄し、2枚のろ紙と一緒に転写バッファーに10分間または使用するまで浸します。
- ろ紙をセミドライトランスファーセルのアノードプレートに置きます。次に、PVDFメンブレン、ゲル、およびろ紙をこの順序で上に置きます。
- タンパク質をゲルからPVDFメンブレンに10 Vで室温で25分間移します。
- 室温で1時間WBブロッキング溶液でメンブレンをブロックします。
- メンブレンを抗タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド(抗NTCP)(1:100希釈)とともに4°Cで一晩インキュベートします。
- 膜をTBSTで3 x 10分洗浄します。
- 西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗ウサギ抗体(1:10,000希釈)でメンブレンを室温で1時間インキュベートします。
- メンブレンをTBSTで3 x 10分洗浄し、次にTBSで1 x 5分洗浄します。
- HRP基板を使用してNTCPを検出します( 材料の表を参照)。
- メンブレンのHRP基質溶液/ cm2 を少なくとも0.1 mL加え、メンブレンを暗所で3〜5分間インキュベートします。
- 化学発光モードでゲルドキュメンテーションシステムを使用してNTCPを視覚化し、膜のマーカーオプションを選択し、1分ごとに累積モードで露光時間を調整し、さまざまな露光時間で5分間写真を撮ります。
- マウス抗GAPDH抗体(1:200,000希釈)およびHRP標識ヤギ抗マウス二次抗体(1:10,000希釈)でブロットをストリップしてプローブします。
- フローサイトメトリーを使用したNTCPレベルの測定
- 細胞を8 mM EDTAで15分間インキュベートすることにより、成熟肝細胞の細胞ペレットを収集します。
注:細胞表面受容体を破壊する可能性のあるトリプシンやその他のプロテアーゼの使用は避けてください。NTCPは細胞表面受容体タンパク質であるため、トリプシン処理による損傷は否定的な結果をもたらす可能性があります。 - 肝細胞を300 μLの3.7%パラホルムアルデヒドで1x PBSで15分間固定します。細胞懸濁液を1.5 mLの微量遠心チューブに移し、300 × g、25°Cで10分間遠心分離します。
- 細胞を1% FBS(v/v)を含む1x PBSで700 μLで2回洗浄し、300 × g、25°Cで10分間遠心分離し、PBS中の0.05%Triton X-100を300 μLで細胞ペレットに加え、室温で20分間インキュベートして透過処理します。
- 300 × g、25°Cで10分間遠心分離し、細胞ペレットを1%FBS(v/v)を含む700 μLのPBSで3 x 1分間洗浄します。細胞をNTCPに対する一次抗体(1:100希釈)とともに4°Cで30分間インキュベートします。細胞をPerm/Washバッファーで3 x 1分間洗浄し、300 × g、25°Cで10分間遠心分離します。
- Alexa Fluor 488に結合した二次抗体で細胞を4°Cで30分間染色します。細胞をPerm/Washバッファーで3 x 1分間洗浄し、300 × g、25°Cで10分間遠心分離します。 細胞ペレットを1%FBS(v/v)を含む200 μLのPBSで再懸濁します。
- フローサイトメーターの電源を入れ、レーザーを15分間ウォームアップして、定期的なクリーニングを実行します。
- 前方散乱(FSC)、側方散乱(SSC)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)またはフィコエリスリン(PE)などの測定パラメータを選択し、ソフトウェアによる 自動補正調整 を設定します。補正コントロールサンプルを含めます:非染色コントロール、FITC染色コントロール、およびPE染色コントロール。
注: FSC および SSC パラメータは、ゲーティング分析用の細胞集団を選択するために、個々の細胞のサイズと粒度を決定するために使用されます。蛍光チャンネル検出器には、 FITC チャンネルと PE チャンネルがあります。このプロトコルでは、 FITC チャンネルを選択してAlexa Fluor 488を検出します。 - 染色されていないサンプルを中程度の流体流量(60 μL/min)で分析し、FSCとSSCの閾値を調整して、目的の細胞集団をカバーするまで調整し、この領域のゲート領域にマークを付けて、すべての補正コントロールに適用します。
- 無染色コントロールを使用して蛍光光電子増倍管(PMT)を設定し、負の象限でFITCまたはPEのPMT電圧を調整します。陽性染色サンプルを実行し、正の象限スケールでFITCまたはPEを調整します。染色なし、FITC染色、またはPE染色のコントロールを実行し、補正を計算してサンプル設定に適用します。肝細胞サンプルを実行して、NTCPレベルを測定します。
- 染色された肝細胞をフローサイトメーターソフトウェアを使用して分析します( 材料の表を参照)。
- BD FACSuiteウィンドウで、[データソース]タブでコントロールチューブをクリックし、生データが表示されるのを待ちます。
- 右側の ワークシート タブで、 楕円ゲート ボタンをクリックし、マウスカーソルを使用して SSCのセル集団 と FSCドットプロット を選択し、円P1が表示されるのを待ちます。
- インターバルゲートボタンをクリックし、FITCヒストグラムで、最も高い蛍光強度値から右側に向かって領域をマークします。表示される行 P2 を確認します。
- 実験チューブをクリックして、ワークシートタブのデータが変更されることを確認します。統計ボタンをクリックしてから、ワークシートの空のスペースをクリックします。表示されるNTCP母集団の統計値を観察します。
- 細胞を8 mM EDTAで15分間インキュベートすることにより、成熟肝細胞の細胞ペレットを収集します。
3. 細胞培養由来HBV粒子(HBVcc)の製造
- HepG2.2.15を完全培地(10%FBS、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを添加したDMEM)で10 cmペトリ皿で24時間培養します。
- HepG2.2.15が60%〜70%のコンフルエントに達したら、380 μg/mLのジェネティシン(G418)を添加した完全な培地を交換します。2日ごとに調整培地を収穫します。HBVを含む培地を4°Cで保存します。
- 上清を5,000 × g、4°Cで20分間遠心分離して細胞残渣を除去します。20 mLシリンジを使用して馴化培地を回収し、0.45 μmの低タンパク質結合フィルターでろ過して細胞破片を除去します。
- HBVを濃縮するには、1容量の濃縮器を3容量のステップ3.3でろ過した上清で円錐形の遠沈管で希釈し、チューブ反転によって溶液を注意深く混合します。混合物を4°Cで1時間置く。溶液を1,500 × g、4°Cで1時間遠心分離し、オフホワイトのペレットが見えるようにします。
注意: ステップ3.3でろ過した上清30 mLごとに、濃縮器を10 mL追加して、総容量40 mLに到達します。 - HBV 1.3-mer WTレプリコンを、前述のように絶対リアルタイムPCRを用いて、1 × 102 から1 ×10 10 の範囲の標準曲線としてHBV力価(ゲノム等価)を評価する11。
- ペレットをFBSで穏やかに再構成し、使い捨てアリコートで-80°Cで最大1年間保管します。
4.抗HBVエントリーアッセイ
- 成熟培地(ウィリアムズE培地に2%DMSO、10%FBS、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、5 μg/mLインスリン、50 μMヒドロコルチゾン、および2 mM L-グルタミン)の6ウェルプレートで100%コンフルエントなimHCまたはHepaRGを2週間維持し、培地を週に2回交換します。
- 培地を吸引し、ウィリアムE培地で希釈したクルクミン(10-30μM)または4μMシクロスポリンA(CsA)を2時間加えます。候補HBV侵入阻害剤を吸引し、4%ポリエチレングリコールを含む1 mLのウィリアムE培地と交換します。
- HBV粒子をウェルあたり100の感染多重度(MOI)で培地に添加し、37°Cで18時間インキュベートします。上清を廃棄し、2 mLの冷たいPBSを加え、穏やかに回転させて、結合していないHBVで古い培地を洗い流します。
- 2 mLの完全ウィリアムズE培地を加え、7日間培養します。培地を吸引し、1x PBSで細胞を洗浄し、3.7%パラホルムアルデヒドをPBS中で室温で15分間固定します。感染細胞をIFブロッキング溶液(0.2%Triton X-100および3%ウシ血清アルブミンPBS溶液)で透過処理およびブロックし、室温で60分間インキュベートします。
- 一次抗体(抗HBVコア抗原)をブロッキング溶液に1:200希釈で加え、4°Cで一晩インキュベートします。 細胞を洗浄液(PBS中の0.5%トゥイーン20)で3 x 1分間洗浄する。
- 二次抗体(1:500希釈)をIFブロッキング溶液に加え、室温で1時間インキュベートし、細胞を洗浄液で3 x 1分間洗浄します。
- サンプルを4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む退色防止封入剤でマウントし、ガラスカバーガラスで覆います。DAPIフィルター(Ex 352-402 nMおよびEm 417-477)およびPEフィルター(Ex 542-582およびEm 604-644)を備えた蛍光顕微鏡と20倍の対物レンズを使用して蛍光シグナルを検出し、候補化合物の抗HBV侵入活性を測定します。
5. HBV細胞結合アッセイ
- 成熟培地(ウィリアムズE培地に2%DMSO、10%FBS、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、5 μg/mLインスリン、50 μMヒドロコルチゾン、および2 mM L-グルタミン)の6ウェルプレートで100%コンフルエントなimHCまたはHepaRGを2週間維持し、培地を週に2回交換します。
- 培地を吸引し、ウィリアムE培地で希釈したクルクミン(10〜30μM)またはシクロスポリンA(4μM)を2時間加えます。HBV侵入阻害剤を吸引し、4%ポリエチレングリコールを含む1mLのウィリアムE培地と交換します。
- HBV粒子を1ウェルあたり100のMOIで培養培地に加え、4°Cで2時間インキュベートして、HBVが肝細胞に結合できるようにします。未結合のHBVを含む培地を廃棄し、2 mLの冷たいPBSを加え、穏やかに旋回させて使用済み培地の痕跡を取り除きます。
- セルスクレーパーを使用して感染細胞を回収し、溶解バッファーで細胞を破壊します。ライセートを採取チューブに移し、全DNAを抽出し、内部コントロールとして PRNP (フォワードプライマー:5'-GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3'、リバースプライマー:5'-GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3')を用いてHBV特異的プライマー(フォワードプライマー:5'-ガッカッタッタグタカガ-3'、リバースプライマー:5'-TTTATGCCTAGCCTCTCTA-3')を用いたリアルタイムPCRを用いてHBV DNAを評価した。
- ステップ2.1で説明されている温度条件を使用して、サーマルサイクラーでPCR産物を増幅します。
- 2-ΔΔCT法に基づいて、PRNPをキャリブレーション遺伝子として使用して、治療中の相対HBV DNAレベル/ 1×106細胞を対照と比較して計算します。
6.タウロコール酸(TCA)取り込みアッセイ
- 100%コンフルエントなimHCおよびHepaRG細胞を成熟培地中で14日間維持します。
- 培地を吸引し、1x PBSで肝細胞を洗浄します。ウィリアムズE培地で希釈したクルクミンまたはシクロスポリンA(10〜50μM)を2時間加えます。培地をタウロコール酸ナトリウム溶液(1x HEPES中の0.5 Mタウロコール酸ナトリウム水和物)と交換し、室温で15分間インキュベートします。
- タウロコール酸ナトリウム溶液を吸引し、冷たい1x HEPESで3回洗浄します。300〜500 μLの冷たい1x HEPESを加え、氷上でセルスクレーパーで細胞を回収します。
- 20秒間20kHzの周波数で超音波処理によって細胞を均質化し、5分間氷上でインキュベートする。ライセートを10,000 × g で20分間遠心分離し、細胞破片を沈殿させます。上清を採取し、TCA ELISAアッセイキット( 材料表を参照)を用いて細胞内タウロコール酸濃度を評価します。
7. 等温滴定熱量測定によるタンパク質-リガンド相互作用の解明
注:このアッセイシステムは、MicroCal PEAQ-ITC(ITCソフトウェア)に基づいて開発されました。
- バッファー(50 mM トリス塩酸バッファー、pH 7.0)を準備します。
- バッファーに15 μMのNTCPを準備します。
- バッファー中の150 μM候補HBV侵入阻害剤溶液を調製します。
- バッファーを使用して、ITC装置内のサンプルセル、参照セル、およびシリンジを洗浄します(ステップ7.1)。
- Windowsシステムのソフトウェアアイコンをダブルクリックして、ITCソフトウェアを起動します。[実験の強調表示の実行] タブで、[19 Injection.itcm の microCal メソッド] を選択し、[開く] をクリックします。新しいウィンドウが開いたら、[クリーニング方法]タブをクリックし、[クリーニング方法]ウィンドウで、[細胞洗浄方法]の[洗浄]ボタンとシリンジ洗浄方法の[すすぎ]ボタンを選択します。 [次へ]をクリックして、画面の指示に従います。
注意: 洗浄ステップが完了するまでに1.4時間かかる場合があります。
- Windowsシステムのソフトウェアアイコンをダブルクリックして、ITCソフトウェアを起動します。[実験の強調表示の実行] タブで、[19 Injection.itcm の microCal メソッド] を選択し、[開く] をクリックします。新しいウィンドウが開いたら、[クリーニング方法]タブをクリックし、[クリーニング方法]ウィンドウで、[細胞洗浄方法]の[洗浄]ボタンとシリンジ洗浄方法の[すすぎ]ボタンを選択します。 [次へ]をクリックして、画面の指示に従います。
- サンプルをITCにロードします。[ 実験の実行 ] タブで [ 読み込み ] ボタンをクリックし、画面の指示を読みます。 [次へ ]をクリックし、この読み込み手順が完了するまでビデオの指示に従います。
- シリンジを使用して参照セルを溶液バッファーで満たします。シリンジを使用してサンプルセルに15 μM NTCPバッファーを満たし、サンプルセル上の余分なNTCP溶液を除去します。シリンジ内の気泡を避けて、クルクミン(リガンド)の150μM溶液でシリンジを満たします。
- サンプルを実行し、[実験の実行] タブで [実行] ボタンをクリックします。左側のウィンドウに実験情報と実験設定が表示されます。リガンドとタンパク質の濃度を[Syr]に150 μM、[細胞]に15 μM、温度に25°Cとして入力します。
- ソフトウェアで、 開始 をクリックして注入プロセスを実行し、タンパク質-リガンド相互作用が完了するまで1.4時間待ちます。
メモ: 色あせた 解析 ボタンがソフトウェアウィンドウの下に表示されます。 - 挿入の完了後に 分析 ボタンが明るくなることを確認します。制御ソフトウェアの解析ボタンをクリックして、解析ソフトウェアを使用して生データを 解析 します。 概要 をクリックして生データを表示し、フィットモデルを 「結合部位の1セット」として選択します。
- 結合ステータスに実験データ(結合、結合なし、対照、またはチェックデータ)が表示され、実験値(KD、ΔG、ΔH、TΔS、およびN)がソフトウェアパネルに表示されていることを確認します。
- 水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用など、相互作用結合を予測する熱力学的パラメータをtifまたはjpeg形式にエクスポートします。
- 実験が完了したら、ステップ7.4に従ってサンプルセルを洗浄します。
8.統計分析
- すべての実験を3回の独立した反復で実行します(n = 3)。
- SD±手段として実験データを提示し、所望の統計解析ソフトウェアを用いて統計解析を行う。
- 両側対応のないスチューデントの t検定を使用して2つの平均値を比較するか、Dunnettで一元配置分散分析(ANOVA)を適用して、複数の値を管理値に多重比較します。有意水準を p ≤0.05に設定します。
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Representative Results
特にimHCの分化期(図1A)において、二核細胞および多角形の形態(図1)を含む肝成熟の特徴が観察された。NTCP発現の大幅な増加は、d-HepaRGおよびd-imHCにおいてそれぞれ7倍および40倍で測定された(図1B)。HBV侵入に対する感受性を付与すると仮定された高度にグリコシル化されたNTCPは、d-HepaRGよりもd-imHCでより多く検出されました(図1C)。分化したimHCは、未分化細胞よりも65.9%高いNTCPレベルを含んでいました(図1D)。
図2A は、予防的処置の概要を示す。図 2B は、感染後7日目の抗HBV侵入活性を評価するために実施されたHBV免疫蛍光染色を示し、 図2C はHBV結合アッセイプロトコルの概要を示す。細胞表面受容体に対するHBV結合のレベルをリアルタイムPCRにより評価した(図2D)。NTCPがHBV付着の受容体であるかどうかを決定するために、候補結合阻害剤についてTCA取り込みを決定した(図2E)。このモデルに基づいて、候補化合物の推定阻害活性は、NTCPを介したHBV結合を減少させた。
熱量の変化は、サンプルセルへの連続注入で検出されました(図3)。標準的な非線形最小二乗回帰を、データによく適合した1つの結合部位に基づいてプロットしました。実線は実験値に最も適合していることを示した(図3A、B)。 表1 は、NTCPとシクロスポリンA(CsA)または候補化合物との結合と相関する熱力学的パラメータを示す。
図1:NTCP特性評価によるHepaRGおよびimHCの肝成熟。 両細胞株を肝成熟培地中で2週間培養した。(A)二核細胞や多角形の形態などの肝細胞の特徴は、imHCの成熟段階でのみ観察されました。スケールバー = 50 μm。 (B)NTCPの発現は、HepaRGおよびimHCの両方でアップレギュレーションされた。GAPDHで正規化されたNTCPは、HepaRGよりもimHCで高かった。(C)成熟後に高度にグリコシル化されたNTCPが観察された。(D)d-imHCにおけるNTCP上昇の割合は、フローサイトメトリーを用いて評価した。データは平均±SDとして表され、*、**、および***は、それぞれ p <0.05、 p <0.01、 およびp <0.001との統計的差を表す。略語:NTCP =タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド;GAPDH =グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ;NTCP-FITC = フルオレセインイソチオシアネート標識NTCP。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:予防的CCM治療は、ウイルス侵入、細胞内HBV DNA、およびTCA取り込み活性を低下させた 。 (a)d-imHCをHBVの接種前に2時間CCMで前処理した。(B)抗HBV侵入活性は、感染後7日目に免疫蛍光染色により測定した。(C)HBVバインディングプロトコルの概略スケジュールが提示される。(D)肝細胞上の結合HBV DNAのレベルを評価し、4 μM CsAおよび古典的なHBV侵入阻害剤25ユニット/ mLヘパリンと比較しました。(E)TCA取り込み阻害に対する10-30μM CCMの効果は、NTCP受容体を介して媒介された。略語:CCM =クルクミン;HBV =B型肝炎ウイルス;TCA =タウロコール酸;d-imHC = 差別化された imHC;CsA = シクロスポリンA;HP =ヘパリン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:個々の分子(CsAまたは候補化合物)に対するNTCPの親和性は、ITCを使用して実証されました。 NTCPと(A)CsAまたは(B)クルクミンのいずれかの組み合わせのITCプロファイルは、化合物(150 μM CsAまたは候補)をNTCP溶液(15 μMのNTCP、pH 7.0、25°C)に順次注入して生成しました。微分電力(μcal/s)と時間(分)の間の熱量測定生データをプロットした。データは、実線が最良の結果を示すワンサイト結合モデルに基づいて分析されました。NTCP溶液へのリガンド(CSAまたはクルクミン)の注入中に、サンプルセル内のリガンド濃度の増加後にエンタルピー(ΔH)が変化しました。これらのデータは、結合反応が起こったことを示している。略語:CsA =シクロスポリンA;NTCP =タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド;ITC =等温滴定熱量測定;DP =差動電力。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 蛋白質 | リガンド | 結合定数(KD) | エンタルピー変化 (ΔH) | エントロピー変化 (ΔTΔS) | ギブズ自由エネルギー変化(ΔG) | バインドの種類 |
| (M-1) | (キロカロリー/モル) | (キロカロリー/モル) | (キロカロリー/モル) | |||
| ヒトNTCP (SLA10A1) | ティッカー | 1.21 ×10-6 | -1 | 0.6 | -0.39 | 水素結合 |
| ヒトNTCP (SLA10A1) | ティッカー | 1 ×10-9 | 80 | -96 | -16 | 疎水性相互作用 |
表1:ITCを使用したNTCPと個々の化合物(CCMおよびTCA)との相互作用から生じる熱力学的パラメータ。 略語:NTCP =タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド;CCM = クルクミン;TCA =タウロコール酸;ITC = 等温滴定熱量測定。
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Discussion
HBV感染は、肝細胞上のヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)への低親和性結合25、続いてNTCPへの結合、続いてエンドサイトーシス26によるインターナリゼーションによって開始されます。NTCPはHBV侵入の重要な受容体であるため、HBV侵入を標的とすることは、臨床的には 、de novo 感染、母子感染(MTCT)、および肝移植後の再発を減少させるように翻訳することができます。ウイルスの侵入を中断することは、慢性HBV感染の実行可能な代替治療法となるでしょう。
上記のプロトコルのいくつかの重要なステップをここに要約します。宿主細胞を調製する際に、2%DMSOを含む成熟培地を添加する前に、肝細胞が100%コンフルエントに達することを確認してください。サブコンフルエント肝細胞を2%DMSOで培養すると、細胞死と剥離につながります。成熟期間は、NTCP発現を最大化するために最大4週間まで延長することができる27,28が、2週間の成熟期間が推奨される。
細胞NTCP発現の定量化のために3つの技術が提案されている。ユーザーは、最も使い慣れた手法を選択することをお勧めします。ここでは、ウェスタンブロット解析よりもフローサイトメトリーの方が便利、迅速、簡単であるため、好んでいました。
細胞培養由来HBV粒子(HBVcc)の産生のために、HepG2.2.15は、ヘネティシン(G418)耐性遺伝子29と共にHBV全長ゲノムを用いた一過性トランスフェクションによってHepG2から誘導された。培養液には380〜500 μg/mLのジェネチシンが含まれている必要があり、そうでなければ細胞はHBVccを産生しません。HBV収量の損失を避けるために、低タンパク質結合の0.45 μmフィルターを使用して上清を清澄化する必要があります。HBVを濃縮するために、ポリエチレングリコール(PEG)を標準的な遠心分離機と共に使用した。HBV粒子は、スクロース勾配および超遠心分離を用いて濃縮することもできる。感染力が低下するため、複数の凍結および解凍サイクルは避ける必要があります。
抗HBVエントリーアッセイでは、肝細胞は成熟誘導前に100%コンフルエントに到達する必要があります。このプロトコルは予防的治療に基づいて開発されました。宿主細胞は、HBV12に感染する前の2時間、候補化合物に曝露された。感染後7日後、HBV感染価を免疫蛍光法を用いて評価した。すべての成分、ブロッキング溶液の濃度、一次抗体と二次抗体、および洗浄ステップを最適化して、最小限の非特異的染色で最良の結果を得る必要があります。ここでは、最適化された濃度と技術を提供しました。
TCA取り込みアッセイプロトコルは、NTCP輸送の阻害のゴールドスタンダードを説明しています。放射性TCAを避けるためにプロトコルを修正しました。TCA取り込みアッセイの重要なステップは、細胞の洗浄と回収です。これらの手順はすべて、化合物のさらなる細胞活性内部化を防ぐために、常に氷上で実行する必要があります。細胞を均質化し、細胞破片をペレット化した後、上清はペレットを破壊することなく穏やかに吸引されなければならない。ユーザーの施設で液体シンチレーション技術の使用が許可されている場合、 3H-タウロコール酸はTCA輸送および取り込み研究で一般的に使用されます。ELISAを用いてTCAの取り込みを検証したため、この代替技術は放射性化合物の使用を代替することができます。
ITCは、可溶性タンパク質と低分子量リガンドとの相互作用に関連する熱力学的パラメータを決定するために広く使用されている生物物理学的方法です30,31。この手法は、さまざまなリガンドと低分子またはタンパク質との相互作用を調べるために使用できます。ITCは、シグナル検出のための追加のステップ、分子量制限、標識、固定化、またはその他の化学修飾のない直接的かつ非侵襲的な方法です。ITCの制限は、相互作用する材料の高濃度の前提条件です。タンパク質とリガンドは高度に精製され、攪拌しながら25°Cで1時間の水(10-100μM)に十分に溶解する必要があります。不安定なタンパク質溶液は、時間の関数としての熱信号の変化によって検出できます。
ヒト増強NTCP肝細胞は、HBV感染のin vitro研究のための代替モデルを提供しますが、HepaRGおよび初代ヒト肝細胞に似ています。これらのホストモデルは、信頼性と感受性が限られていることによって妨げられています8,33。HepG2-NTCPまたはHuh7-NTCP細胞における非効率的なHBV増殖は、HBVcc産生細胞に由来する低HBV接種材料によって証明された。いくつかの研究では、HBVは1,00033,34のMOIで標的細胞に感染するために使用された。HBVccのサブウイルス粒子はHBVエンベロープタンパク質(L / M / S)を含み、NTCPと競合的に結合するため、感染力が低下します35。この制限を克服するために、このプロトコルは、NTCPレベルを最大化するために、成熟プロトコルを使用してHepaRGまたはimHC培養を変更しました。HepG2.2.15由来のHBVccは、接種材料として使用される前に濃縮された。HBVコア抗原11の測定に基づく分化型imHCではHBV感染価が80%以上高かった。
NTCPを標的とする抗HBV化合物の同定について説明し、ウイルスの侵入を妨害し、NTCPレベルを上昇させるために肝臓成熟手順を採用しました。侵入阻害剤を同定するために、肝細胞をHBV感染の2時間前に4°Cで候補化合物で前処理し、ウイルスの結合は許可したが侵入は許可しなかった。HBV感染力の低下は、感染後7日目に評価されました。代表的なデータには、モデルを検証するためのポジティブコントロールとして、古典的なNTCP阻害剤であるシクロスポリンAが含まれていました。
NTCPはトランスポーターと受容体を介したエンドサイトーシス機能の両方を促進するため、HBV侵入阻害剤はこれらのメカニズムの少なくとも1つを標的にする可能性があります。NTCP輸送の阻害は、ELISAに基づくTCA取り込みアッセイを用いて評価することができ、古典的なプロトコル36から放射性TCAを排除する。NTCPと侵入阻害剤との親和性をITCを用いて測定した。この手法は、化学量論(n)、解離定数(KD)、自由エネルギーの変化(ΔG)、エンタルピー(ΔH)、エントロピー(ΔS)、結合熱容量(ΔCp)などの重要な熱力学的パラメータを提供しました。ケルセチン、ルチン、ヘスペリジン、ルペロールなど、ヌクレオシド類似体であるラミブジンに匹敵するHBV逆転写酵素に特異的に結合する可能性のあるさまざまな抗HBV薬が分子ドッキングによって同定されています。化合物はITCを用いて調査され、HBVポリメラーゼ37で−9.3〜−5.2 kcal/molの範囲の負のギブエネルギー(−ΔG)および1 × 10-6から1 × 10-3 MのKDを示した。まとめると、これらの前述のアッセイから得られたデータは、HBV侵入阻害剤として機能する候補化合物の抗ウイルス効果をスクリーニングするのに役立ちます。確立されたプロトコルは、新規NTCPアンタゴニスト/阻害剤の発見に有用です。ウイルス侵入の抑制は、予防的および治療的治療に有用である可能性がある。
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Disclosures
著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で実施されたと宣言しています。
Acknowledgments
この研究プロジェクトは、マヒドン大学とタイ科学研究イノベーション(TSRI)の支援を受けており、A. WongkajornsilpとK. Sa-ngiamsuntornに別々に授与されています。この作業は、競争力のためのプログラム管理ユニット(助成金番号C10F630093)を通じて、国立高等教育科学研究イノベーション政策評議会のオフィスによって財政的に支援されました。A. Wongkajornsilpは、マヒドン大学医学部シリラート病院のChalermprakiat助成金の受領者です。著者らは、ITC技術を支援してくれたSawinee Seemakhan嬢(マヒドン大学理学部創薬エクセレントセンター)に感謝の意を表します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
| Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
| Antibodies | |||
| Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
| Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
| HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
| Reagent composition | |||
| 1° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Blocking solution | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
| Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
| PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
| NaF | Final concentration: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
| 1x Running buffer 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
| Blot transfer buffer 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
| Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
| CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
| Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
| PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 cell culture flask | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
| Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
References
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