Summary
Vi presenterar ett protokoll för att screena anti-hepatit B-virus (HBV) föreningar som riktar sig mot livscykelstadier före och efter viralt inträde, med hjälp av isotermisk titreringskalorimetri för att mäta bindningsaffinitet (KD) med värdnatriumtaurokolat som transporterar polypeptid. Antiviral effekt bestämdes genom undertryckande av virala livscykelmarkörer (cccDNA-bildning, transkription och viral sammansättning).
Abstract
Hepatit B-virus (HBV) infektion har ansetts vara en avgörande riskfaktor för hepatocellulärt karcinom. Nuvarande behandling kan bara minska virusbelastningen men inte resultera i fullständig remission. En effektiv hepatocytmodell för HBV-infektion skulle erbjuda en verklighetstrogen viral livscykel som skulle vara avgörande för screening av terapeutiska medel. De flesta tillgängliga anti-HBV-agenter riktar in sig på livscykelstadier efter viral inträde men inte före viral inträde. Detta protokoll beskriver genereringen av en kompetent hepatocytmodell som kan screena för terapeutiska medel som riktar sig mot livscykelstadier före och efter viralt inträde. Detta inkluderar inriktning på natriumtaurokolat cotransporterande polypeptid (NTCP) bindning, cccDNA-bildning, transkription och viral sammansättning baserat på imHC eller HepaRG som värdceller. Här, HBV inträde hämning analys används curcumin för att hämma HBV bindning och transportera funktioner via NTCP. Hämmarna utvärderades för bindningsaffinitet (KD) med NTCP med hjälp av isotermisk titreringskalorimetri (ITC) - ett universellt verktyg för HBV-läkemedelsscreening baserat på termodynamiska parametrar.
Introduction
Hepatit B-virus (HBV) infektion anses vara en livshotande sjukdom över hela världen. Kronisk HBV-infektion är laddad med risk för levercirros och hepatocellulärt karcinom1. Nuvarande anti-HBV-behandling fokuserar främst på postviral inträde med hjälp av nukleos(t)idanaloger (NA) och interferon-alfa (IFN-α)2,3. Upptäckten av en HBV-inträdeshämmare, Myrcludex B, har identifierat ett nytt mål för anti-HBV-medel4. Kombinationen av inträdeshämmare och NA i kronisk HBV har avsevärt minskat virusbelastningen jämfört med de som enbart riktar sig mot viral replikation 5,6. Den klassiska hepatocytmodellen för screening av HBV-inträdeshämmare begränsas emellertid av låga virala receptornivåer (natriumtaurokolat som transporterar polypeptid, NTCP). Överuttrycket av hNTCP i hepatomceller (dvs. HepG2 och Huh7) förbättrar HBV-smittsamheten 7,8. Icke desto mindre, dessa cellinjer uttrycker låga nivåer av fas I och II läkemedelsmetaboliserande enzymer och uppvisar genetisk instabilitet9. Hepatocytmodeller som kan hjälpa till att rikta in sig på distinkta mekanismer för kandidat-anti-HBV-föreningar såsom previral inträde, NTCP-bindning och viral inträde skulle påskynda identifieringen och utvecklingen av effektiva kombinationsregimer. Studien för anti-HBV aktivitet av curcumin har belyst hämningen av viral inträde som en ny mekanism utöver post viral inträde avbrott. Detta protokoll beskriver en värdmodell för screening av anti-HBV-ingångsmolekyler10.
Målet med denna metod är att utforska kandidat-anti-HBV-föreningar för virusinträdeshämning, särskilt blockering av NTCP-bindning och transport. Eftersom NTCP-uttryck är en kritisk faktor för HBV-inträde och infektion optimerade vi hepatocytmognadsprotokollet för att maximera NTCP-nivåerna11. Dessutom kan detta protokoll skilja den hämmande effekten på HBV-inträde som hämning av HBV-bindning kontra hämning av internalisering. Upptaget av taurokolsyra (TCA) modifierades också med hjälp av en ELISA-baserad metod i stället för en radioisotop för att representera NTCP-transport12,13. Receptor- och ligandinteraktionen bekräftades av deras 3D-strukturer14,15. Hämningen av NTCP-funktionen kan utvärderas genom att mäta TCA-upptagsaktivitet16. Denna teknik gav emellertid inte direkta bevis för NTCP-bindning till kandidathämmarna. Därför kan bindningen undersökas med hjälp av olika tekniker, såsom ytplasmonresonans17, ELISA, fluorescensbaserad termisk skiftanalys (FTSA)18, FRET19, AlphaScreen och olika andra metoder20. Bland dessa tekniker är ITC en målstandard för bindande analys eftersom den kan observera värmeabsorption eller utsläpp i nästan varje reaktion21. Bindningsaffiniteten (KD) hos NTCP och kandidatföreningar utvärderades direkt med användning av ITC; Dessa affinitetsvärden var mer exakta än de som erhölls med hjälp av in silico prediction model22.
Detta protokoll täcker tekniker vid hepatocytmognad, HBV-infektion och screening för HBV-inträdeshämmare. Kortfattat utvecklades en hepatocytmodell baserad på imHC- och HepaRG-cellinjer. De odlade cellerna differentierades till mogna hepatocyter inom 2 veckor. Uppregleringen av NTCP-nivåer upptäcktes med hjälp av PCR, western blot och flödescytometrii realtid 11. Hepatit B-virion (HBVcc) producerades och samlades in från HepG2.2.15. Den differentierade imHC eller HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) behandlades profylaktiskt med anti-HBV-kandidaterna 2 h före inokuleringen med HBV-virion. Det förväntade resultatet av experimentet var identifieringen av de medel som minskar cellulär HBV och smittsamhet. Anti-NTCP-aktivitet utvärderades med hjälp av TCA-upptagsanalysen. NTCP-aktivitet kan undertryckas av de agenter som specifikt band NTCP. ITC-tekniken användes för att undersöka genomförbarheten av interaktiv bindning som kunde förutsäga hämmare och deras målproteiner, bestämma bindningsaffiniteten (KD) hos liganden för receptorn via icke-kovalenta interaktioner av det biomolekylära komplexet23,24. Till exempel representerar K D ≥ 1 × 103 mM svag bindning, K D ≥ 1 × 106 μM representerar måttlig bindning och K D ≤ 1 × 109 nM representerar stark bindning. ΔG är direkt korrelerad med bindande interaktioner. I synnerhet är en reaktion med negativ ΔG en exergonisk reaktion, vilket indikerar att bindning är en spontan process. En reaktion med en negativ ΔH indikerar att bindningsprocesserna beror på vätebindning och Van der Waals-krafter. Både TCA-upptag och ITC-data kan användas för att söka efter anti-HBV-ingångsagenter. Resultaten av dessa protokoll kan ge en grund för inte bara anti-HBV-screening utan också interaktionen med NTCP som bedöms genom bindande affinitet och transportfunktion. Detta dokument beskriver värdcellsberedning och karakterisering, experimentell design och utvärdering av anti-HBV-posten tillsammans med NTCP-bindningsaffiniteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Följande procedurer måste utföras i en biologisk faroflödeshuv av klass II eller en laminär flödeshuv. Hanteringen av HBV var etiskt godkänd av IRB (MURA2020/1545). Se materialförteckningen för mer information om alla lösningar, reagenser, utrustning och cellinjer som används i detta protokoll.
1. Förbereda värdceller (mogna hepatocyter)
- Odla hepatocyter (3,75 × 105 celler HepaRG eller imHC) och behåll i en 75 cm2 odlingskolv med 10 ml DMEM/F12-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin, 100 U / ml penicillin och 100 μg / ml streptomycin. Vänta tills cellerna når 80% -90% sammanflöde (inom 1 vecka).
- Kassera det gamla mediet från kolven och tvätta cellerna med 4 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Aspirera PBS och tillsätt 4 ml 0,05% trypsin-EDTA.
- Inkubera kolven i 37 °C inkubatorn i 2-3 minuter och kontrollera de vidhäftande cellerna med hjälp av ett inverterat mikroskop med en 10x objektivlins. Se till att monolagret har lossnat från odlingsytan.
- Hämma trypsin genom att tillsätta 4 ml av odlingsmediet kompletterat med 10% FBS till kolven och försiktigt återsuspendera de skördade cellerna. Överför cellsuspensionen till ett 15 ml koniskt rör och centrifugera i 3 minuter vid 300 × g och 25 °C.
- Aspirera supernatanten från cellpelleten och återsuspendera med 1-2 ml av det förvärmda odlingsmediet kompletterat med 10% FBS och antibiotika.
- Blanda 10 μL vardera av cellsuspensionen och trypanblå och räkna cellerna med hjälp av en hemacytometer. Se till att cellviabiliteten är högre än 90% innan du fortsätter till nästa steg.
- Frö 1 × 106 celler per 2 ml i varje brunn på en 6-brunnsplatta och behåll i DME / F12 komplett medium tills cellerna når 100% sammanflöde.
- För levermognad, förbered levermognadsmedium (Williams E-medium kompletterat med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 5 μg / ml insulin, 50 μM hydrokortison, 2 mM L-glutamin och 2% DMSO).
- Byt ut odlingsmediet 2x per vecka.
- Håll hepatocyterna i mognadsmedium i 2 veckor för att få mogna hepatocyter redo för HBV-infektion.
2. Kvantifiering av cellulär NTCP
- Mäta NTCP-uttryck med PCR i realtid
- Samla pelleten av mogna hepatocyter genom trypsinisering (se steg 1.2-1.5).
- Extrahera totalt RNA från cellpelleten med hjälp av ett RNA-extraktionssats med DNase I-behandling.
- Syntetisera cDNA från 200 ng totalt RNA med hjälp av en oligo-dT-primer och omvänd transkriptionssystem enligt tillverkarens instruktioner.
- Späd cDNA till 50 ng/μL och använd det som mall för PCR-reaktionen. Blanda 2 μL av det utspädda cDNA med PCR-mastermixreagenserna innehållande SYBR-grön qRT-PCR Kit-lösning med 5 μM NTCP-specifika primers (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' och 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
- För normalisering, använd GAPDH som en hushållningsgen med specifika primers (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' och 5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3').
- Förstärk cDNA-proverna med hjälp av en termisk cykler under följande temperaturförhållanden: 1 cykel på 3 min vid 95 °C (initial denaturering); 40 cykler på 30 s vid 95 °C (denaturering), 30 s vid 60 °C till 65 °C (glödgning), 30 s vid 72 °C (förlängning); 1 cykel på 5 min vid 72 °C (slutlig förlängning).
- Beräkna NTCP-veckförändringen i mogna hepatocyter över odifferentierade celler med GAPDH som en kalibratorgen baserad på 2-ΔΔCT-metoden .
- Kvantifiering av NTCP med hjälp av western blot-analys
- Skörda hepatocyter med en cellskrapa och centrifugera dem vid 300 x g, 25 °C i 5 minuter för att samla upp cellpelleten.
- Följ ripa-bufferttillverkarens instruktioner för att extrahera det cellulära proteinet med 100 μl RIPA-buffert innehållande 1x proteashämmare.
- Mät den totala proteinkoncentrationen med hjälp av bicinchoninic acid (BCA) -metoden.
- Blanda 12,5 μL protein med 2x laddningsfärgämne i ett volymförhållande på 1:1.
- Koka proteinblandningen och standardstegen vid 95 °C i 5 minuter.
- Lägg till 1x löpande buffert i elektroforeskammaren.
- Ladda 5 μl av proteinstandardstegen eller 20 μl av den kokta proteinblandningen i en 10% (w / v) polyakrylamidgel.
- Utför gelelektrofores: 50 V i 30 min följt av 90 V i 1 h vid rumstemperatur.
- Förbered ett PVDF-membran genom att blötlägga det i metanol i 30 s, tvätta det med dubbeldestillerat vatten i 1-2 minuter och blötlägg det tillsammans med två bitar filterpapper i överföringsbuffert i 10 minuter eller tills det används.
- Placera filterpapperet på anodplattan i en halvtorr överföringscell; placera sedan PVDF-membranet, gelén och filterpapperet ovanpå, i den ordningen.
- Överför proteinerna från gelén till PVDF-membranet vid 10 V i 25 minuter vid rumstemperatur.
- Blockera membranet med WB-blockerande lösning i 1 h vid rumstemperatur.
- Inkubera membranet med antinatriumtaurokolat som transporterar polypeptid (anti-NTCP) (1:100 utspädning) vid 4 °C över natten.
- Tvätta membranet 3 x 10 min med TBST.
- Inkubera membranet med pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerad getantikaninantikropp (1:10 000 utspädning) i 1 timme vid rumstemperatur.
- Tvätta membranet 3 x 10 min med TBST och sedan 1 x 5 min med TBS.
- Upptäck NTCP med hjälp av ett HRP-substrat (se materialförteckningen).
- Tillsätt minst 0,1 ml HRP-substratlösning/cm2 av membranet och inkubera membranet i 3-5 minuter i mörker.
- Visualisera NTCP med hjälp av ett geldokumentationssystem i kemiluminescensläget, välj marköralternativet för membranet, justera exponeringstiden med ackumulerande läge var 1: e minut och ta fotot med olika exponeringstider i 5 minuter.
- Remsa och sondra fläcken med musanti-GAPDH-antikropp (1: 200,000 utspädning) och HRP-konjugerad get-anti-mus sekundär antikropp (1: 10,000 utspädning).
- Mätning av NTCP-nivån med hjälp av flödescytometri
- Samla cellpellets av mogna hepatocyter genom att inkubera cellerna med 8 mM EDTA i 15 min.
OBS: Undvik att använda trypsin eller andra proteaser som kan störa cellytereceptorer. Eftersom NTCP är ett cellytereceptorprotein kan skador på grund av trypsinisering ge negativa resultat. - Fixera hepatocyterna med 300 μl 3,7% paraformaldehyd i 1x PBS i 15 min. Överför cellsuspensionen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugera i 10 minuter vid 300 × g och 25 °C.
- Tvätta cellerna 2x med 700 μL 1x PBS med 1% FBS (v / v), centrifugera i 10 min vid 300 × g, 25 ° C, tillsätt 300 μL 0,05% Triton X-100 i PBS till cellpelleten och inkubera cellerna vid rumstemperatur i 20 minuter för att permeabilisera dem.
- Centrifugera i 10 min vid 300 × g, 25 °C, tvätta cellpelleten 3 x 1 min med 700 μl PBS innehållande 1 % FBS (v/v). Inkubera cellerna med den primära antikroppen mot NTCP (1:100 utspädning) vid 4 °C i 30 minuter. Tvätta cellerna 3 x 1 min med Perm/Tvättbuffert och centrifugera i 10 min vid 300 × g, 25 °C.
- Färga cellerna med sekundär antikropp konjugerad till Alexa Fluor 488 vid 4 °C i 30 minuter. Tvätta cellerna 3 x 1 min med Perm/Wash-buffert och centrifugera i 10 min vid 300 × g, 25 °C. Återsuspendera cellpelleten med 200 μL PBS med 1% FBS (v / v).
- Slå på flödescytometern, värm upp lasern i 15 minuter och utför rutinmässig rengöring.
- Välj mätparametrar, inklusive framåtspridning (FSC), sidospridning (SSC) och fluoresceinisotiocyanat (FITC) eller phycoerythrin (PE), och ställ in den automatiska kompensationsjusteringen av programvaran. Inkludera kompensationskontrollproverna: ofärgad kontroll, FITC-färgad kontroll och PE-färgad kontroll.
OBS: FSC - och SSC-parametrar används för att bestämma storleken och granulariteten hos enskilda celler för att välja cellpopulationen för gatinganalys. Fluorescenskanaldetektorn har FITC- och PE-kanaler . För detta protokoll väljer du FITC-kanalen för att upptäcka Alexa Fluor 488. - Kör det ostoppade provet med medelhög fluidisk flödeshastighet (60 μL/min), justera tröskeln för FSC och SSC tills de täcker cellpopulationen av intresse, markera grindregionen i detta område och applicera på alla kompensationskontroller.
- Ställ in fluorescensfotomultiplikatorröret (PMT) med den ofärgade kontrollen och justera PMT-spänningen för FITC eller PE i den negativa kvadranten. Kör det positiva färgade provet och justera FITC eller PE i den positiva kvadrantskalan. Kör de ofärgade, FITC-färgade eller PE-färgade kontrollerna, beräkna kompensationen och tillämpa den på provinställningarna. Kör hepatocytprovet för att mäta NTCP-nivån.
- Analysera de färgade hepatocyterna med hjälp av flödescytometerprogramvara (se materialförteckningen).
- Under BD FACSuite-fönster klickar du på kontrollröret på fliken Datakällor och väntar på att rådata ska visas.
- På fliken Kalkylblad till höger klickar du på Ellipse Gate-knappen , väljer cellpopulationen i SSC och FSC-punktdiagrammet med muspekaren och väntar på att cirkeln P1 ska visas.
- Klicka på knappen Interval Gate och markera regionen i FITC-histogrammet, från det högsta fluorescensintensitetsvärdet till höger sida. Observera raden P2 som visas.
- Klicka på experimentröret och observera att data på fliken Kalkylblad ändras. Klicka på knappen Statistik och sedan på det tomma utrymmet i kalkylbladet. Observera de statistiska värdena för NTCP-populationen som visas.
- Samla cellpellets av mogna hepatocyter genom att inkubera cellerna med 8 mM EDTA i 15 min.
3. Produktion av cellodlingsderiverade HBV-partiklar (HBVcc)
- Kultur HepG2.2.15 i komplett medium (DMEM kompletterat med 10% FBS, 100 U / ml penicillin och 100 μg / ml streptomycin) i en 10 cm petriskål i 24 h.
- Byt ut hela mediet kompletterat med 380 μg / ml genetiskt in (G418) när HepG2.2.15 når 60% -70% sammanflöde. Skörda det konditionerade mediet var 2: e dag; förvara mediet som innehåller HBV vid 4 °C.
- Ta bort cellrester genom att centrifugera supernatanten vid 5 000 × g, 4 °C i 20 minuter. Samla det konditionerade mediet med en 20 ml spruta och filtrera det genom ett 0,45 μm lågproteinbindande filter för att avlägsna cellskräp.
- För att koncentrera HBV, späd 1 volymdel koncentrator med 3 volymer av den filtrerade supernatanten från steg 3.3 i ett koniskt centrifugrör och blanda försiktigt lösningen genom rörinversion. Placera blandningen vid 4 °C i 1 timme. Centrifugera lösningen i 1 timme vid 1 500 × g, 4 °C och se till att en benvit pellet är synlig.
OBS: För varje 30 ml filtrerad supernatant från steg 3.3, tillsätt 10 ml av koncentratorn för att nå 40 ml total volym. - Utvärdera HBV-titern (genomekvivalent) med HBV 1,3-mer WT-replik som en standardkurva som sträcker sig från 1 × 102 till 1 × 1010 med absolut realtids-PCR, som beskrivits tidigare11.
- Rekonstituera försiktigt pelleten i FBS och förvara den i upp till 1 år vid −80 °C i alikvoter för engångsbruk.
4. Analys mot HBV-inträde
- Bibehåll 100% sammanflytande imHC eller HepaRG i 6-brunnsplattor i mognadsmedium (2% DMSO i Williams E-medium, 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 5 μg / ml insulin, 50 μM hydrokortison och 2 mM L-glutamin) i 2 veckor och byt medium 2x per vecka.
- Aspirera mediet, tillsätt sedan curcumin (10-30 μM) eller 4 μM cyklosporin A (CsA) utspätt med Williams E-medium i 2 h. Aspirera kandidaten HBV-inträdeshämmare och ersätt den med 1 ml William's E-medium innehållande 4% polyetylenglykol.
- Tillsätt HBV-partiklar till odlingsmediet vid en multiplicitet av infektion (MOI) på 100 per brunn och inkubera vid 37 °C i 18 timmar. Kassera supernatanten, tillsätt 2 ml kall PBS och virvla försiktigt för att skölja av det gamla mediet med obundet HBV.
- Tillsätt 2 ml komplett William's E-medium och kultur i 7 dagar. Aspirera mediet, tvätta cellerna med 1x PBS och fixera cellerna med 3,7% paraformaldehyd i PBS i 15 min vid rumstemperatur. Permeabilisera och blockera de infekterade cellerna med IF-blockerande lösning (0,2% Triton X-100 och 3% bovint serumalbumin i PBS) och inkubera dem i 60 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt den primära antikroppen (anti-HBV-kärnantigen) vid spädning 1:200 i blockeringslösningen och inkubera över natten vid 4 °C. Tvätta cellerna 3 x 1 min med tvättlösning (0,5% Tween 20 i PBS).
- Tillsätt sekundär antikropp (1:500 utspädning) till IF-blockeringslösningen, inkubera i 1 timme vid rumstemperatur och tvätta cellerna 3 x 1 min med tvättlösning.
- Montera provet med antifadmonteringsmedium med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) och täck med en glasöverdrag. Upptäck fluorescenssignalen med hjälp av ett fluorescensmikroskop utrustat med ett DAPI-filter (Ex 352-402 nM och Em 417-477) och ett PE-filter (Ex 542-582 och Em 604-644), tillsammans med en 20x objektivlins, och bestäm anti-HBV-ingångsaktiviteten för kandidatföreningarna.
5. HBV-cellbindningsanalys
- Bibehåll 100% sammanflytande imHC eller HepaRG i 6-brunnsplattor i mognadsmedium (2% DMSO i Williams E-medium, 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 5 μg / ml insulin, 50 μM hydrokortison och 2 mM L-glutamin) i 2 veckor och byt medium 2x per vecka.
- Aspirera mediet, tillsätt sedan curcumin (10-30 μM) eller cyklosporin A (4 μM) utspätt i Williams E-medium i 2 timmar. Aspirera HBV-inträdeshämmaren och ersätt den med 1 ml William's E-medium innehållande 4% polyetylenglykol.
- Tillsätt HBV-partiklar till odlingsmediet med en MOI på 100 per brunn och inkubera vid 4 °C i 2 timmar för att tillåta HBV-bindning till hepatocyterna. Kassera mediet som innehåller obundet HBV, tillsätt 2 ml kallt PBS och virvla försiktigt för att ta bort spår av det förbrukade mediet.
- Skörda de infekterade cellerna med hjälp av en cellskrapa och stör cellerna med lysbuffert. Överför lysatet till ett uppsamlingsrör och extrahera totalt DNA för att utvärdera HBV-DNA med hjälp av PCR i realtid med specifika primers för HBV (framåtprimer: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3', och omvänd primer: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') med PRNP (framåtprimer: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3', omvänd primer: 5'- TTTATGCCTACAGCCTCCTA-3') som intern kontroll.
- Förstärk PCR-produkterna i en termisk cykler med hjälp av de temperaturförhållanden som beskrivs i steg 2.1.
- Beräkna relativa HBV-DNA-nivåer/1 × 106 celler i behandling kontra kontroll med PRNP som kalibratorgen baserat på 2-ΔΔCT-metoden .
6. Upptagsanalys av taurokolsyra (TCA)
- Behåll 100% sammanflytande imHC- och HepaRG-celler i mognadsmedium i 14 dagar.
- Aspirera mediet och tvätta hepatocyterna med 1x PBS. Tillsätt curcumin eller cyklosporin A (10-50 μM) utspätt i Williams E-medium i 2 timmar. Byt ut mediet mot natriumtaurocholsyralösningen (0,5 M natriumtaurokolathydrat i 1x HEPES) och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera natriumtaurocholsyralösningen och tvätta 3x med kall 1x HEPES. Tillsätt 300-500 μl kall 1x HEPES och skörda cellerna med cellskrapor på is.
- Homogenisera cellerna genom ultraljud vid en frekvens av 20 kHz för 20 s och inkubera på is för 5 min. Centrifugera lysaterna vid 10 000 × g i 20 minuter för att fälla ut cellrester. Samla supernatanten och utvärdera intracellulär taurocholsyrakoncentration med hjälp av ett TCA ELISA-analyskit (se materialtabellen).
7. Bestämning av protein-ligandinteraktioner med användning av isotermisk titreringskalorimetri
OBS: Detta analyssystem utvecklades baserat på MicroCal PEAQ-ITC (ITC-programvara).
- Förbered bufferten (50 mM Tris-HCl-buffert, pH 7,0).
- Förbered 15 μM NTCP i bufferten.
- Förbered 150 μM kandidat HBV-inträdeshämmare i bufferten.
- Tvätta provcellen, referenscellen och sprutan i ITC-instrumentet med hjälp av bufferten (steg 7.1).
- Starta ITC-programvaran genom att dubbelklicka på programvaruikonen i Windows-system. Under fliken Kör experimenthöjdpunkt väljer du microCal Method för 19 Injection.itcm och klickar på öppna. När ett nytt fönster öppnas klickar du på fliken Rensa och i fönstret Rengöringsmetod väljer du knappen Tvätta för cellrengöringsmetod och sköljknappen för sprutrengöringsmetod. Klicka på Nästa och följ instruktionerna på skärmen.
OBS: Tvättsteget kan ta 1,4 timmar att slutföra.
- Starta ITC-programvaran genom att dubbelklicka på programvaruikonen i Windows-system. Under fliken Kör experimenthöjdpunkt väljer du microCal Method för 19 Injection.itcm och klickar på öppna. När ett nytt fönster öppnas klickar du på fliken Rensa och i fönstret Rengöringsmetod väljer du knappen Tvätta för cellrengöringsmetod och sköljknappen för sprutrengöringsmetod. Klicka på Nästa och följ instruktionerna på skärmen.
- Ladda provet i ITC; under fliken Kör experiment klickar du på knappen Läs in och läser instruktionerna på skärmen. Klicka på nästa och följ videoinstruktionerna tills detta laddningssteg är klart.
- Fyll referenscellen med lösningsbuffert med en spruta. Fyll provcellen med 15 μM NTCP i buffert med en spruta och avlägsna överskottet av NTCP-lösningen över provcellen. Fyll sprutan med 150 μM lösning av curcumin (ligand), undvik luftbubblor i sprutan.
- Kör exemplet och klicka på knappen Kör under fliken Kör experiment . Observera fönstren till vänster som visar experimentell information och experimentell inställning. Ange ligand- och proteinkoncentrationerna som 150 μM i [ Syr], 15 μM i [Cell] och 25 °C i temperatur.
- I programvaran klickar du på start för att utföra injektionsprocessen och väntar i 1,4 timmar tills protein-ligandinteraktionen är klar.
OBS: Den bleka analysknappen visas under programvarufönstren. - Observera att analysknappen lyser upp efter att injektionen är klar. Klicka på analysknappen i styrprogramvaran för att analysera rådata med hjälp av analysprogramvaran. Klicka på översikten för att visa rådata och välj passningsmodellen som En uppsättning bindningsplats.
- Se till att bindningsstatus visar experimentella data (bindning, ingen bindning, kontroll eller kontrolldata) och att experimentvärdena (KD, ΔG, ΔH, TΔS och N) visas på programvarupanelen.
- Exportera de termodynamiska parametrarna som förutsäger interaktionsbindningen, inklusive vätebindning, van der Waals-bindning och hydrofob interaktion till tif- eller jpeg-format.
- När experimentet är klart tvättar du provcellen enligt steg 7.4.
8. Statistisk analys
- Utför alla experiment i tre oberoende replikat (n = 3).
- Presentera experimentella data som medel ± SD och utföra statistisk analys med hjälp av önskad statistisk analysprogramvara.
- Använd ett tvåsidigt oparat Students t-test för att jämföra mellan två medelvärden eller tillämpa envägsanalys av varians (ANOVA) med Dunnett för flera jämförelser mellan flera värden och ett kontrollvärde. Ställ in signifikansnivån på p ≤ 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Levermognadsegenskaper observerades, inklusive binukleerade celler och polygonformad morfologi (figur 1), särskilt i det differentierade stadiet av imHC (figur 1A). En stor ökning av NTCP-uttrycket mättes i d-HepaRG och d-imHC vid 7-faldigt respektive 40-faldigt (figur 1B). Den mycket glykosylerade formen av NTCP, postulerad för att ge mottaglighet för HBV-inträde, detekterades mer i d-imHC än i d-HepaRG (figur 1C). Den differentierade imHC innehöll 65,9% högre NTCP-nivåer än de odifferentierade cellerna (figur 1D).
Figur 2A visar en sammanfattning av den profylaktiska behandlingen. Figur 2B visar HBV-immunofluorescensfärgning utförd för att utvärdera anti-HBV-inträdesaktiviteterna på dag 7 efter infektion, medan figur 2C beskriver HBV-bindningsanalysprotokollet. Nivån av HBV-bindning på cellytereceptorn utvärderades med PCR i realtid (figur 2D). För att avgöra om NTCP var receptorn för HBV-bindning bestämdes TCA-upptag för kandidatbindningshämmarna (figur 2E). Baserat på denna modell minskade den förmodade hämmande aktiviteten hos kandidatföreningar HBV-bindning genom NTCP.
Den kalorimetriska förändringen detekterades med kontinuerliga injektioner till provcellen (figur 3). En standard icke-linjär minsta kvadratregression plottades baserat på ett bindningsställe som passade väl till data. Den heldragna linjen angav den bästa anpassningen till försöksvärdena (figur 3A,B). Tabell 1 visar termodynamiska parametrar korrelerade med bindningen av NTCP med cyklosporin A (CsA) eller en kandidatförening.
Figur 1: Levermognad av HepaRG och imHC med NTCP-karakterisering. Båda cellinjerna odlades i levermognadsmedium i 2 veckor. (A) Hepatocytegenskaper såsom binukleerade celler och polygonformad morfologi observerades uteslutande i mognadsstadiet av imHC. Skalstänger = 50 μm. (B) Uttrycket av NTCP uppreglerades i både HepaRG och imHC. NTCP normaliserat med GAPDH var högre i imHC än i HepaRG. (C) En mycket glykosylerad form av NTCP observerades efter mognad. (D) Procentandelen NTCP-förhöjning i d-imHC utvärderades med hjälp av flödescytometri. Data presenteras som medelvärde ± SD. *, ** och *** representerar statistisk skillnad med p < 0,05, p < 0,01 respektive p < 0,001 . Förkortningar: NTCP = natriumtaurokolat som transporterar polypeptid; GAPDH = glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas; NTCP-FITC = fluoresceinisotiocyanatmärkt NTCP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Profylaktisk CCM-behandling minskade virusinträdet, intracellulärt HBV-DNA och TCA-upptagsaktivitet. (A) d-imHC förbehandlades med CCM i 2 timmar före inokuleringen med HBV. (B) Anti-HBV-inträdesaktiviteten bestämdes genom immunofluorescensfärgning på dag 7 efter infektion. (C) Ett schematiskt schema för HBV-bindande protokoll presenteras. (D) Nivån av bundet HBV-DNA på hepatocyter utvärderades och jämfördes med 4 μM CsA och den klassiska HBV-inträdeshämmaren 25 enheter/ml heparin. (E) Effekten av 10-30 μM CCM på TCA-upptagshämning medierades genom NTCP-receptorn. Förkortningar: CCM = curcumin; HBV = hepatit B-virus; TCA = taurokolsyra; d-imHC = differentierad imHC; CsA = ciklosporin A; HP = heparin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Affiniteten mellan NTCP och enskilda molekyler (CsA eller kandidatförening) demonstrerades med hjälp av ITC. ITC-profilen för kombinationen av NTCP med antingen (A) CsA eller (B) curcumin genererades från sekventiell injektion av en förening (150 μM CsA eller kandidat) i NTCP-lösningen (15 μM NTCP, pH 7,0, 25 °C). De kalorimetriska rådata mellan differentiell effekt (μcal/s) och tid (min) plottades. Data analyserades baserat på en bindningsmodell på en plats där de heldragna linjerna indikerade de bäst lämpade resultaten. Under injektionen av ligander (CSA eller curcumin) i NTCP-lösningen förändrades entalpi (ΔH) efter en ökning av ligandkoncentrationen i provcellen. Dessa data indikerar att bindningsreaktionen inträffade. Förkortningar: CsA = ciklosporin A; NTCP = natriumtaurokolat som transporterar polypeptid; ITC = isotermisk titreringskalorimetri; DP = differentiell effekt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Protein | Ligand | Bindningskonstant (KD) | Entalpi förändring (ΔH) | Entropiförändring (ΔTΔS) | Gibbs fria energiförändring (ΔG) | Typ av bindning |
| (M-1) | (kcal/mol) | (kcal/mol) | (kcal/mol) | |||
| Mänsklig NTCP (SLA10A1) | CCM | 1.21 ×10-6 | -1 | 0.6 | -0.39 | Vätebindning |
| Mänsklig NTCP (SLA10A1) | TCA | 1 ×10-9 | 80 | -96 | -16 | Hydrofob interaktion |
Tabell 1: Termodynamiska parametrar som härrör från interaktionen mellan NTCP och enskilda föreningar (CCM och TCA) med hjälp av ITC. Förkortningar: NTCP = natriumtaurokolat som transporterar polypeptid; CCM = curcumin; TCA = taurokolsyra; ITC = isotermisk titreringskalorimetri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HBV-infektion initieras via lågaffinitetsbindning till heparansulfatproteoglykaner (HSPG) på hepatocyter25, följt av bindning till NTCP med efterföljande internalisering genom endocytos26. Eftersom NTCP är en avgörande receptor för HBV-inträde kan riktad HBV-inträde kliniskt översättas till minskad de novo-infektion , mor-till-barn-överföring (MTCT) och återfall efter levertransplantation. Att avbryta virusinträde skulle vara ett genomförbart alternativt botemedel mot kronisk HBV-infektion.
Några kritiska steg i ovannämnda protokoll sammanfattas här. När du förbereder värdceller, se till att hepatocyter når 100% sammanflöde innan du lägger till mognadsmediet med 2% DMSO. Odling av subkonfluenta hepatocyter i 2% DMSO kommer att leda till celldöd och frigöring. Mognadsperioden kan förlängas upp till 4 veckor för att maximera NTCP-uttrycket27,28, även om en mognadsperiod på 2 veckor rekommenderas.
Tre tekniker har föreslagits för kvantifiering av cellulärt NTCP-uttryck. Det rekommenderas att användare väljer den teknik de är mest bekanta med; Här föredrog vi flödescytometri framför Western blot-analys eftersom det är bekvämt, snabbt och enkelt.
För produktion av cellodlingshärledda HBV-partiklar (HBVcc) härleddes HepG2.2.15 från HepG2 genom övergående transfektion med HBV-genomet i full längd tillsammans med genetinresistensgenen (G418)29. Odlingsmediet bör innehålla 380-500 μg / ml geneticin, annars kommer cellerna inte att producera HBVcc. Det lågproteinbindande filtret på 0,45 μm bör användas för att klargöra supernatanten för att undvika att förlora HBV-utbytet. För koncentration av HBV användes polyetylenglykol (PEG) med en standardcentrifug. HBV-partiklar kan också koncentreras med hjälp av en sackarosgradient och ultracentrifugering. Flera frys- och upptiningscykler bör undvikas eftersom smittsamheten kommer att minska.
I anti-HBV-ingångsanalysen måste hepatocyterna nå 100% sammanflöde före mognadsinduktion. Detta protokoll utvecklades baserat på profylaktisk behandling. Värdceller exponerades för kandidatföreningarna i 2 timmar före infektion med HBV12. Efter 7 dagar efter infektion utvärderades HBV-smittsamhet med användning av immunofluorescens. Alla komponenter, koncentrationer av blockeringslösningen, primära och sekundära antikroppar och tvättsteg måste optimeras för att uppnå bästa resultat med minimal ospecifik färgning. Här har vi tillhandahållit optimerade koncentrationer och tekniker.
TCA-upptagsanalysprotokollet beskriver guldstandarden för hämning av NTCP-transport. Vi ändrade protokollet för att undvika radioaktiv TCA. De kritiska stegen för TCA-upptagsanalysen är celltvätt och skörd. Alla dessa procedurer måste utföras på is hela tiden för att förhindra ytterligare cellulär aktivitet-internalisering av föreningen. Efter homogenisering av cellerna och pelleteringscellskräp måste supernatanten försiktigt aspireras utan att störa pelleten. Om användarens anläggning tillåter användning av vätskescintillationstekniken används 3H-taurokolsyra ofta i TCA-transport- och upptagsstudier. Eftersom vi validerade TCA-upptag med ELISA kan denna alternativa teknik ersätta användningen av den radioaktiva föreningen.
ITC är en biofysisk metod som ofta används för att bestämma de termodynamiska parametrarna kopplade till interaktionerna mellan lösliga proteiner och små molekylviktligander30,31. Denna teknik kan användas för att undersöka interaktionen mellan olika ligander och en liten molekyl eller protein. ITC är en direkt och icke-invasiv metod utan ytterligare steg för signaldetektering, inga molekylviktsbegränsningar och ingen märkning, immobilisering eller någon annan kemisk modifiering. Begränsningen av ITC är förutsättningen för höga koncentrationer av de interagerande materialen. Protein och ligand måste vara högrenade och tillräckligt lösliga i vatten (10–100 μM) vid 25 °C under 1 timme under omrörning. Den instabila proteinlösningen kan detekteras genom värmesignalförändring som en funktion av tiden.
Humana förbättrade NTCP-hepatocyter ger en alternativ modell för in vitro-studien av HBV-infektion men liknar HepaRG och primära humana hepatocyter. Dessa värdmodeller hindras av deras begränsade tillförlitlighet och mottaglighet 8,33. Den ineffektiva HBV-förökningen i HepG2-NTCP- eller Huh7-NTCP-celler bevisades av låg HBV-inokulum härledd från HBVcc-producerande celler. I flera studier användes HBV för att infektera målcellerna vid en MOI på 1 00033,34. De subvirala partiklarna i HBVcc innehåller HBV-kuvertprotein (L/M/S) och binder NTCP i konkurrenskraft, vilket resulterar i minskad smittsamhet35. För att övervinna denna begränsning modifierade detta protokoll HepaRG- eller imHC-kultur med ett mognadsprotokoll för att maximera NTCP-nivåerna. HBVcc härledd från HepG2.2.15 koncentrerades innan den användes som inokulum. HBV-infektiviteten var högre än 80% i differentierad imHC baserat på mätningen av HBV-kärnantigenet11.
Vi har beskrivit identifieringen av anti-HBV-föreningar som riktar sig mot NTCP för att avbryta viral inträde och antagit ett levermognadsförfarande för att öka NTCP-nivåerna. För att identifiera entry-hämmare förbehandlades hepatocyter med kandidatföreningar i 2 timmar före infektion med HBV vid 4 °C för att möjliggöra viral bindning men inte inträde. Minskningen av HBV-smittsamhet utvärderades på dag 7 efter infektion. De representativa data inkluderade cyklosporin A, en klassisk NTCP-hämmare, som en positiv kontroll för att validera modellen.
Eftersom NTCP underlättar både transportör- och receptormedierade endocytosfunktioner kan HBV-inträdeshämmare rikta in sig på minst en av dessa mekanismer. Hämningen av NTCP-transport kan utvärderas med hjälp av en TCA-upptagsanalys baserad på ELISA, vilket eliminerar den radioaktiva TCA från det klassiska protokollet36. Samhörigheten mellan NTCP och entry-hämmaren mättes med hjälp av ITC. Denna teknik gav väsentliga termodynamiska parametrar, inklusive stökiometri (n), dissociationskonstant (KD), förändring i fri energi (ΔG), entalpi (ΔH), entropi (ΔS) och värmekapacitet för bindning (ΔCp). Olika anti-HBV-medel har identifierats genom molekylär dockning, såsom quercetin, rutin, hesperidin och luperol, som specifikt kan binda HBV-omvänd transkriptas jämförbart med lamivudin, en nukleosidanalog. Föreningarna undersöktes med hjälp av ITC och uppvisade negativ Gibb-energi (−ΔG) från −9,3 till −5,2 kcal/mol och KD av 1 × 10-6 till 1 × 10-3 M med HBV-polymeras 37. Sammantaget kommer de data som erhållits från dessa ovannämnda analyser att hjälpa till att screena den antivirala effekten av kandidatföreningar som fungerar som HBV-ingångshämmare. Det etablerade protokollet kommer att vara användbart för att upptäcka nya NTCP-antagonister / hämmare. Undertryckandet av viral inträde kan vara användbart vid profylaktisk och terapeutisk behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta forskningsprojekt stöds av Mahidol University och Thailand Science Research and Innovation (TSRI) som tilldelas A. Wongkajornsilp och K. Sa-ngiamsuntorn. Detta arbete stöddes ekonomiskt av Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council genom Program Management Unit for Competitiveness (bidragsnummer C10F630093). A. Wongkajornsilp är mottagare av ett Chalermprakiat-bidrag från medicinska fakulteten Siriraj Hospital, Mahidol University. Författarna vill tacka fröken Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Naturvetenskapliga fakulteten, Mahidol University) för hennes hjälp med ITC-tekniken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
| Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
| Antibodies | |||
| Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
| Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
| HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
| Reagent composition | |||
| 1° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Blocking solution | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
| Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
| PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
| NaF | Final concentration: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
| 1x Running buffer 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
| Blot transfer buffer 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
| Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
| CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
| Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
| PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 cell culture flask | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
| Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
References
- Levrero, M., Zucman-Rossi, J.
- Kim, K. -H., Kim, N. D., Seong, B. -L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
- Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
- Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
- Mak, L. -Y., Seto, W. -K., Yuen, M. -F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169 (2021).
- Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).
- Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
- Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
- Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
- Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).
- Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952 (2019).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
- Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
- Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).
- Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
- Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
- Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
- Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
- Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
- Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
- Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).
- Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
- Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
- Srivastava, V. K., Yadav, R. Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. Misra, G. , Academic Press. 125-137 (2019).
- Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
- Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, 216 (2014).
- Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
- Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
- Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
- Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).
