Summary
פרוטוקול זה מתאר את תהליך הייצור והאפיון של אורגנואידים אורותליאליים של עכברים, תוך מחיקות בגנים בעלי עניין. השיטות כוללות קצירת תאי אורותל של עכבר, התמרת ex vivo עם אדנו-וירוס המניע את ביטוי Cre עם מקדם CMV, ואפיון in vitro כמו גם in vivo .
Abstract
סרטן שלפוחית השתן הוא תחום לא מבוקר, במיוחד במודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMMs). GEMMs גזעיים עם אתרי Cre ו-loxP ספציפיים לרקמות היו תקני הזהב למיקוד גנים מותנה או בלתי ניתן להשראה. כדי לספק מודלים ניסיוניים מהירים ויעילים יותר, מפותחת מערכת תרבית אורגנואידית ex vivo באמצעות אדנו-וירוס Cre ותאי אורותל רגילים הנושאים אללים מרובים של loxP של מדכאי הגידול Trp53, Pten ו - Rb1. תאי אורותל רגילים מנותקים באופן אנזימטי מארבע שלפוחיות של עכברים משולשים (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). תאי האורותל מומרים ex vivo עם אדנו-וירוס-Cre המונע על ידי מקדם CMV (Ad5CMVCre). האורגנואידים המתומרים של שלפוחית השתן מתורבתים, מופצים ומאופיינים במבחנה וב-in vivo. PCR משמש לאישור מחיקות גנים ב- Trp53, Pten ו- Rb1. צביעה אימונופלואורסצנטית (IF) של אורגנואידים מדגימה ביטוי חיובי של סמני שושלת אורותל (CK5 ועמ' 63). האורגנואידים מוזרקים באופן תת עורי לעכברים מארחים לצורך הרחבת הגידול ומעברים סדרתיים. האימונוהיסטוכימיה (IHC) של קסנוגרפטים מציגה ביטוי חיובי של CK7, CK5 ועמ' 63 וביטוי שלילי של CK8 ואורופלקין 3. לסיכום, מחיקת גנים בתיווך אדנו-וירוס מתאי אורותל של עכברים המהונדסים עם אתרי loxP היא שיטה יעילה לבחון במהירות את הפוטנציאל הגידולי של שינויים גנטיים מוגדרים.
Introduction
סרטן שלפוחית השתן הוא הסרטן הרביעי בשכיחותו בקרב גברים ומשפיע על יותר מ -80,000 אנשים מדי שנה בארצות הברית1. כימותרפיה מבוססת פלטינום היא הטיפול הסטנדרטי בחולים עם סרטן שלפוחית שתן מתקדם במשך יותר משלושה עשורים. הנוף של הטיפול בסרטן שלפוחית השתן עבר מהפכה על ידי אישור מינהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) לאחרונה לאימונותרפיה (מעכבי מחסום חיסוני נגד PD-1 ואנטי PD-L1), ארדפיטניב (מעכב קולטן גורם גדילה פיברובלסט) ואנפורטומאב ודוטין (מצומד נוגדן-תרופה)2,3,4. עם זאת, אין סמנים ביולוגיים מאושרים קלינית זמינים לניבוי התגובות לכימותרפיה או אימונותרפיה. יש צורך קריטי ליצור מודלים פרה-קליניים אינפורמטיביים שיכולים לשפר את ההבנה של המנגנונים המניעים את התקדמות סרטן שלפוחית השתן ולפתח סמנים ביולוגיים חזויים עבור שיטות טיפול שונות.
מכשול מרכזי במחקר התרגומי של שלפוחית השתן הוא היעדר מודלים פרה-קליניים המשחזרים את הפתוגנזה של סרטן שלפוחית השתן האנושית ואת תגובות הטיפול 5,6. פותחו מספר מודלים פרה-קליניים, כולל מודלים דו-ממדיים במבחנה (קווי תאים או תאים שתוכנתו מחדש באופן מותנה), מודלים תלת-ממדיים במבחנה (אורגנואידים, הדפסה תלת-ממדית) ומודלים in vivo (קסנוגרפט, מודלים המושרים על-ידי מסרטן, מודלים מהונדסים גנטית וקסנוגרפט שמקורו בחולה)2,6. מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMMs) שימושיים ליישומים רבים בביולוגיה של סרטן שלפוחית השתן, כולל ניתוחים של פנוטיפים של גידולים, חקירות מכניסטיות של גנים מועמדים ו/או מסלולי איתות, והערכה פרה-קלינית של תגובות טיפוליות 6,7. GEMMs יכולים להשתמש ברקומבינאזות ספציפיות לאתר (Cre-loxP) כדי לשלוט במחיקות גנטיות בגן מדכא גידול אחד או יותר. התהליך של יצירת GEMMs רצויים עם מחיקות גנים מרובות הוא גוזל זמן רב, מייגע ויקר5. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לפתח שיטה מהירה ויעילה של העברת ex vivo Cre לביסוס מודלים של נוקאאוט משולש בשלפוחית השתן (TKO) מתאי אורותל עכברים רגילים הנושאים אללים משולשים (Trp53, Pten ו- Rb1)8. היתרון העיקרי של שיטת ex vivo הוא זרימת העבודה המהירה (1-2 שבועות במקום שנים של גידול עכברים). מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לקצירת תאי אורותל רגילים עם אללים פלוקסים, התמרת אדנו-וירוס ex vivo, תרביות אורגנואידיות ואפיון in vitro ו-in vivo בעכברי C57 BL/6J אימונו-תחרותיים. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי ליצור אורגנואידים רלוונטיים מבחינה קלינית לסרטן שלפוחית השתן בעכברים מדוכאי חיסון עם כל שילוב של אללים פלוקסים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במרכז הסרטן המקיף רוזוול פארק, באפלו, ניו יורק (1395M, בטיחות ביולוגית 180501 ו- 180502).
הערה: בצע את שלבים 1-3 באותו יום.
1. כריתה של שלפוחית השתן של העכבר
- הכנה לנתיחה
- הכינו את כל המכשירים הסטריליים כולל מספריים, מלקחיים, DPBS סטרילי במנות תרבית 35 מ"מ, 70% אתנול, גזה סטרילית ומגבות נייר נקיות. נקו את כל המשטחים של אזור הנתיחה. צור זכרים של עכברים משולשים Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f (4 עכברים, בני 10 שבועות), כפי שתואר קודם לכן במעבדתו של ד"ר גודריץ' 8.
- המתת חסד וחתך
- הרדמה את העכברים על ידי חנק CO2 באמצעות קצב זרימה של 2.0 ליטר לדקה, ולאחר מכן נקע צוואר הרחם. נקו את אזור הנתיחה עם 70% אתנול וכסו במגבת נייר נקייה.
- הניחו את העכבר על גזה באזור הנתיחה. מרססים 70% אתנול על בטן העכבר ומשתמשים במספריים סטרילים של דיסקציה כדי ליצור חתך בטן בקו האמצע התחתון החושף את שלפוחית השתן.
- ניתוח שלפוחית השתן
- השתמשו במלקחיים כדי לתפוס את שלפוחית השתן ומשכו בעדינות כלפי מעלה כך שיזוהו צמתים דו-צדדיים של השופכן. השתמשו במספריים כדי להסיר את הפונדוס של שלפוחית השתן בעקבות קו הגבול בין שני פתחי השופכן.
- מעבירים את שלפוחית השתן לתוך צלחת סטרילית עם 2 מ"ל של DPBS. הסר רקמת שומן וחיבור והכנס את שלפוחית השתן למנה חדשה עם 2 מ"ל סטריליים של DPBS. בשלב זה, הוציאו את ה-adenovirus מאחסון של -80 מעלות צלזיוס ושמרו אותו על קרח.
2. דיסוציאציה של תאי אורותל
- הכנה לדיסוציאציה של תאים
- הכינו את כל המכשירים הסטריליים, כולל מלקחיים, אזמלים כירורגיים (להב בגודל 10 עם ידית), DPBS סטרילי במנות תרבית של 35 מ"מ, מדיום תרבית שלם ללא FBS מופשט פחם המוגדר כ-CCM(-), תערובת קולגן/היאלורונידאז, אנזים רקומביננטי לתחליף טריפסין, 10% FBS מופשט פחם ב-DPBS עם Y-27632 טרי של 10 מיקרומטר, מסננת תאים סטרילית של 100 מיקרומטר וצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
הערה: מדיום התרבית השלם (CCM) מורכב ממדיום גדילה של תאי אפיתל של יונקים בתוספת גורמי הגדילה המסופקים ו-5% FBS מופשט פחם, 1% תחליף L-גלוטמין, פרימוצין של 100 מיקרוגרם/מ"ל ו-10 מיקרומטר טרי Y-27632.
- הכינו את כל המכשירים הסטריליים, כולל מלקחיים, אזמלים כירורגיים (להב בגודל 10 עם ידית), DPBS סטרילי במנות תרבית של 35 מ"מ, מדיום תרבית שלם ללא FBS מופשט פחם המוגדר כ-CCM(-), תערובת קולגן/היאלורונידאז, אנזים רקומביננטי לתחליף טריפסין, 10% FBS מופשט פחם ב-DPBS עם Y-27632 טרי של 10 מיקרומטר, מסננת תאים סטרילית של 100 מיקרומטר וצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
- כריכה ועיכול של שלפוחית השתן
- מעבירים ושוטפים שוב את שלפוחית השתן עם 2 מ"ל של DPBS סטרילי בצלחת 35 מ"מ בארון בטיחות ביולוגית.
- אספו רקמות שלפוחית שתן מארבעה עכברים לתוך צלחת עם 1 מ"ל של CCM(-) וטחנו כל שלפוחית שתן לארבעה חלקים שווים באמצעות להב כירורגי. השתמש במלקחיים כדי לפתוח את שלפוחית השתן כדי לחשוף את פני השטח של אורותליום למדיום.
- מעבירים את חלקי שלפוחית השתן והמדיום לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. לשטוף את המנה עם 2 מ"ל של CCM(-) 2x ולאסוף אותו בצינור צנטריפוגה לנפח כולל של 5 מ"ל.
- הוסיפו את תערובת הקולג'אנאז/היאלורונידאז לריכוז סופי של 300 U/mL collagenase ו-100 U/mL hyaluronidase והניחו את הצינור אופקית בשייקר דגירה מסלולי של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב-200 סל"ד.
- לאחר עיכול רקמות, הוסיפו נפח שווה (5 מ"ל) של 10% FBS מופשט פחם ב-DPBS לתוך הצינור וצנטריפוגה של הצינור ב-200 x גרם למשך 5 דקות.
- הסר והשליכו את ה-supernatant. מוסיפים 2 מ"ל של תחליף טריפסין לכדור התא ומערבבים היטב. שים את הצינור באינקובטור תאים ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 4 דקות.
- לאחר הדגירה, פיפטה למעלה ולמטה פי 10 עם קצה P1000 סטנדרטי. הוסף 5 מ"ל של 10% FBS מופשט פחם ב- DPBS.
- מסננים את התאים המנותקים דרך מסננת תאים סטרילית של 100 מיקרומטר. אספו את מתלי התא והצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות.
- ספירה ושימוש חוזר בתאים
- הסר והשליכו את ה-supernatant. החייא את גלולת התא עם 1 מ"ל של CCM.
- ספרו את מספר התאים באמצעות המוציטומטר ורק צלחת 0.5 x 106 תאים לתוך באר של צלחת של 24 בארות עם 0.5 מ"ל של CCM טרי. בשלב זה, הוציאו את תמציות המטריצה של תאי סרקומה של עכבר אנגלברת'-הולם-נחיל (ראו טבלת חומרים) מאחסון של -20 מעלות צלזיוס והפשרה על קרח. מחממים מראש צלחת של 6 בארות באינקובטור תאים של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: ניתן לבצע צנטריפוגה ולהקפיא את התאים הנותרים ככדורי תאים לבקרת התמרה שאינה וירוסים.
3. התמרה אדנו-ויראלית וציפוי אורגנואידים
אזהרה: אנא היו זהירים בעת עיבוד אדנו-וירוס. אנשי המעבדה צריכים לעקוב אחר שיטות בטיחות ביולוגית ברמה 2 ולחטא אדנו-וירוס עם 10% אקונומיקה.
- הוסיפו 2 μL של אדנו-וירוס (Ad5CMVCre; 1 x 107 PFU/μL) לצלחת בעלת 24 הבארות. ערבבו היטב עם תאי השתן המנותקים.
- כדי לשפר את יעילות ההעתקה, בצע ספינוקולציה על ידי צנטריפוגה של צלחת 24 הבאר ב- 300 x g למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מקם את צלחת 24 הבאר באינקובטור תאים ב- 37 °C ו- 5% CO2 למשך שעה אחת.
- מעבירים תאים ומדיום מהבאר לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות. מסירים ומשליכים את הסופרנאטנט, מוסיפים 50 μL של CCM ומערבבים היטב עם התאים בתחתית.
- הוסיפו 140 μL של תמצית מטריצה וערבבו בעדינות היטב כדי למנוע בועות אוויר. הוסיפו את התמיסה במהירות לתוך צלחת 6 הבארות שחוממה מראש ב-50 μL/dome כדי ליצור כיפות לאורגנואידים.
- העבירו את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 בעדינות ואפשרו לכיפות להתמצק למשך 5 דקות. הפכו את צלחת 6 הבארים במהופך והמשיכו להתמצק במשך 25 דקות נוספות.
- לאחר הדגירה, מוסיפים 2.5 מ"ל של CCM לכל באר ומניחים את הצלחת באינקובטור לתרבית אורגנואידית.
4. התרבות האורגנואידית וההתפשטות
- שנה את המדיום כל 3-4 ימים. בצע התרבות האורגנואידית, ההקפאה וההקפאה כפי שדווח ב-Lee et al.9. בצע הטבעה של אורגנואידים באמצעות ג'ל עיבוד דגימות כמתואר בפוג'י ואחרים.
- הסר את המדיום והוסף 1 מ"ל של dispase לכל באר. שברו בעדינות את הכיפה וערבבו היטב עם קצה פיפטה P1000.
- הניחו את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 30 דקות. לאחר מכן, לאסוף את כל התאים בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל ולשטוף את הבאר עם 4 מ"ל של 10% FBS מופשט פחם ב- DPBS. אם התאים האורגנואידים מופיעים כאשכולות גדולים, בצע את שלב 2.2.6. ושלב 2.2.7. כדי לקבל תאים מנותקים.
- צנטריפוגה הצינור ב 200 x g במשך 5 דקות. הסר את ה- supernatant ושטף את התאים עם 1 מ"ל של CCM.
- בצעו החייאה של התאים בתמצית מטריצה של 70% ופעלו לפי שלבים 3.4.-3.6. לתרבות. לחלופין, שמרו את התאים בהקפאה על ידי החייאה ב-90% FBS מופשט פחם ו-10% DMSO בתוספת 10 μM טרי Y-27632.
5. השתלת תאים אורגנואידים בעכבר C57BL/6J תת עורית
- הכנה להשתלה
- הכן 25G 1.5 במחטים, מזרק 1 מ"ל, 1 מ"ג / מ"ל dispase, תמצית מטריצה, 10% FBS מופשט פחם ב- DPBS עם 10 μM טרי Y-27632, וצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
- איסוף תאים אורגנואידים
- לאחר השגת תרבית יציבה במשך 5 מעברים לפחות, אספו את התאים האורגנואידים המורחבים להזרקת in vivo . בצע את השלבים 4.2.-4.4. ותאי החייאה ב-1 מ"ל של CCM.
- ספירת תאים והזרקה תת עורית
- ספור את מספר התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות, resuspened 2 x 106 תאים ב 100 μL של 50% תמצית מטריצה ב DPBS. הניחו את ההשעיה על הקרח וקחו אותה לארון בטיחות ביולוגית בחדר פרוצדורות של בעלי חיים.
- הרדמה שני עכברי C57BL/6J זכרים (בני 10 שבועות) עם זרימה של 4% איזופלורן ו-1 ליטר/דקה O2 למשך כ-4 דקות בתא. לאחר שהעכברים איבדו את רפלקס הימין שלהם ותבנית הנשימה שלהם נעשתה עמוקה ואיטית יותר, העבירו את העכברים למעגל שאינו מתרבה מחדש עם 2% איזופלורן וזרימה של 1 ליטר/דקה O2 . יש למרוח משחה וטרינרית כדי להגן על עיניהם של בעלי החיים מפני פגיעה טראומטית.
- גילחו אזור אחד סביב אתר ההזרקה באגף הימני של העכבר והשתמשו ב-70% אתנול כדי לנקות, ולאחר מכן השתמשו במחט של 25 גרם כדי להזריק ישירות את מתלה התאים של 100 μL לאגף הימני תחת הרדמה.
- לאחר ההזרקה, יש להסיר את ההרדמה השאיפה ולהניח את העכברים בכלוב מתחת למנורת חום עד להתאושש ולהתגייס באופן מלא. להחזיר את העכברים לדיור ולעקוב אחר היווצרות הגידול.
6. איסוף גידולים והתפשטות in vivo
- עקוב אחר שלב ההכנה 2.1.1. המתת עכברים על ידי חנק CO2 באמצעות קצב זרימה של 2.0 ליטר לדקה ולאחר מכן נקע צוואר הרחם לאחר שנוצר גידול בקוטר של כ-2.0 ס"מ (כמעט 2-3 שבועות). מעבירים את העכברים לאזור כריתה נקי, מרססים 70% אתנול על אזור הגידול באגף העכבר, ומשתמשים במספריים ומלקחיים של דיסקציה סטרילית כדי לבצע חתך להפרדת הגידול.
- לשטוף את הגידול בצלחת 60 מ"מ עם 5 מ"ל של DPBS ולהשתמש מספריים כדי להסיר את רקמת החיבור. חותכים חתיכה אחת מהגידול הטרי ומטביעים אותה עם 4% פרפורמלדהיד ב-DPBS למשך 48 שעות ושולחים להטבעת פרפין וחתך לניתוח היסטולוגיה.
- לעבד את החצי השני של הגידול הטרי להתנתקות תאים. בקצרה, לטחון את הגידול הטרי לתוך 1 מ"מ3 חתיכות עבור דיסוציאציה בצלחת 60 מ"מ עם 5 מ"ל של CCM(-). לאחר מכן, לאחר ביצוע שלבים 2.2.4.-2.2.8., הזריקו את התאים המנותקים לעכברי C57BL/6J חדשים עבור מעבר in vivo לאחר שלב 5.3. או לשמור כתרבית אורגנואידית במבחנה בעקבות שלבים 3.4.-3.6., או להקפיא ישירות בחנקן נוזלי באמצעות 90% FBS מופשט פחם ו-10% DMSO עם 10 μM טרי Y-27632.
- במידת הצורך, שחזרו את התאים הקפואים על ידי הפשרתם במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ושטיפה עם CCM(-). לאחר מכן, החייא אותם ב 100 μL של 50% תמצית מטריצה ב- DPBS להזרקה ישירה לעכברים להיווצרות גידול in vivo . השתמש לפחות 2 x 106 תאים מופשרים להזרקה אחת in vivo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זרימת העבודה של מחיקות גנים בתיווך אדנו-וירוס-Cre בתאי אורותל של עכברים מוצגת באיור 1A. הסרטון הנלווה מדגים כיצד תאי השתן מנותקים מהפונדוס של שלפוחית השתן וכיצד התאים המשולשים של פלוקס מומרים ex vivo עם Ad5CMVCre. איור 1A הראה כי תת-מולקולות ותאי שריר מינימליים היו מנותקים לאחר עיכול אנזימים. כדי לאשר את היעילות של אספקת אדנו-וירוס-Cre, תאי אורותל מנותקים מעכברים משולשים עם ממברנה ממוקדת tdTomato/ חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר מקומי (mT/mG) הומרו עם אדנו-וירוס Cre. חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) זוהה בכמעט 100% מהתאים, מה שמצביע על יעילות גבוהה של התמרת אדנו-וירוס (איור 1B).
האורגנואידים היציבים של TKO הוקמו בעקבות פרוטוקולים אורגנואידים סטנדרטיים (במבחנה עם יותר מ -5 מעברים; איור 2א). H&E ואימונופלואורסצנציה (IF) של מקטעים אורגנואידים במבחנה (איור 2A) הדגימו מורפולוגיה של קרצינומה אורותליאלית בדרגה גבוהה עם ביטוי חיובי של סמני שושלת אורותליאלית CK5 ו-p6311. ניתוח PCR גילה אללים רקומבינציה באורגנואידים של TKO, בעוד שאללים לא מלוכסנים זוהו רק בתאי אורותל שלא טופלו באדנו-וירוס (איור 2B). בסך הכל הוזרקו 2 x 106 אורגנואידים ראשוניים של ex vivo ל-C57BL/6J לצורך היווצרות גידול תת עורית ראשונית (SQ) תוך 8 שבועות. לאחר מכן, גידול SQ (מעבר 1) נאסף והועבר בעכברים. באופן כללי, היה צורך ב-2-3 שבועות כדי ליצור גידול SQ של 2 ס"מ (מעברים 2-5) (איור 2C). האימונוהיסטוכימיה (IHC) של TKO in vivo xenograft הציגה ביטוי חיובי של CK7 (טלאי), CK5 ו-p63 וביטוי שלילי של CK8 ואורופלקין 3 (איור 2D). כדי לזהות זיהום של תאי מזנכים, גידולי TKO הוכתמו עבור וימנטין. כתם H&E הראה את הגידול משמאל ואת הקפסולה מימין המסומנת על ידי הקו הצהוב. וימנטין חיובי זוהה רק בקפסולת הגידול או בסטרומה (איור 2E).
איור 1: מחיקות גנים בתיווך אדנו-וירוס-Cre בתאי אורותל של עכברים עם אתרי loxP . (A) זרימת העבודה של ייצור אורגנואידים TKO באמצעות ex vivo אדנווירוס Ad5CMVCre. עיכול אנזים קצר-זמן של 30 דקות הספיק כדי לנתק את תאי האורותל מהתת-מולקולות והשרירים פרופריה הבסיסיים. תאי האורותל המנותקים הומרו עם Ad5CMVCre עבור אורגנואידים של TKO ולאחר מכן הוזרקו לעכברי C57BL/6J. (B) תאי אורותל משולשים עם mT/mG (ביטוי טרנסגן מכונן של חלבון פלואורסצנטי אדום הממיר לחלבון פלואורסצנטי ירוק לאחר רקומבינציה של Cre) הומרו עם Ad5CMVCre. כמעט 100% מהתאים היו חיוביים ל-GFP, מה שמעיד על התמרה יעילה ביותר ורקומבינציה של Cre. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: אפיון אורגנואידים של TKO באמצעות אקס-ויוו אדנו-וירוס-קר רקומבינאז. (A) תאי ה-Trp53f/f המנותקים: Ptenf/f: תאי Rb1f/f urothelial הומרו עם אדנו-וירוס (Ad5CMVCre) כדי ליצור אורגנואידים של TKO (שדה בהיר). האורגנואידים של TKO הוטמעו בג'ל לעיבוד דגימות והוכתמו עבור H&E ואימונופלואורסצנציה. (B) דנ"א גנומי הופק מתאי אורותל משולשים (נתיב 2) ואורגנואידים של TKO (נתיב 4) והוגבר על ידי PCR כדי לזהות אללים מרופדים או אללים רקומבינציה של Cre של Trp53, Rb1 ו-Pten. רצועות PCR היו מוכתמות באתידיום ברומיד. נתיב 1 ונתיב 3 היו בקרות רקומבינציה שליליות וחיוביות. (C) גידול TKO SQ ברוטו (מעבר 4) הוצג ביום 17 לאחר הזרקת SQ. (D) מקטעי רקמת הגידול מהקסנוגרפטים של TKO SQ הוכתמו ב-H&E, IF (CK5, CK8) או IHC (CK7, p63, Upk3). קיצורים: CK5 = ציטוקרטין 5; CK20 = ציטוקראטין 20; CK8 = ציטוקרטין 8; CK7 = ציטוקרטין 7; Upk3 = אורופלקין השלישי. (E) מקטעי רקמת הגידול מהקסנוגרפטים של TKO SQ הוכתמו ב-H&E וב-IF (וימנטין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GEMMs היו תקני הזהב למודלים סרטניים שיזמו מתאים רגילים, ואפשרו לבחון בקפדנות את ההשלכות של הפרעות אונקוגניות פוטנציאליות (הפעלת אונקוגן ו/או אובדן מדכאי גידולים). כאן, פרוטוקול מהיר ויעיל מסופק ליצירת אורגנואידים של סרטן שלפוחית השתן באמצעות עריכת גנים ex vivo של תאי אורותל עכברים רגילים הנושאים אללים מפוקסים בגנים בעלי עניין. צביעת H&E ו-IHC מדגימה כי אורגנואידים מסוג TKO מפגינים היסטולוגיה התואמת את האורותל בדרגה גבוהה, עם התמיינות קשקשית ותת-סוג דמוי-בסיס הן כאורגנואידים במבחנה והן כ-in vivo xenografts. האורגנואידים של TKO יכולים לשמש במבחנה לחקר ההשפעות של Trp53, Rb1 ואובדן Pten , סינון תרופות והערכה מולקולרית של מסלולי איתות. היווצרות מהירה של גידולים בעכברי C57BL/6J תאפשר מחקרי in vivo שנועדו להעריך את תגובות הטיפול לטיפולים סיסטמיים כמו כימותרפיה או אימונותרפיה.
האורותליום מורכב משכבה של תאים בסיסיים (חיוביים ל-CK5 ו-p63), 1-2 שכבות של תאי ביניים (אורופלקינס ו-p63 חיוביים) ותאי מטריה (אורופלקינס, CK8 ו-CK20 חיוביים)6. שלב קריטי בשיטה הוא הזמן המוגבל (30 דקות) של התנתקות רקמות במקום עיכול אנזים ממושך (4 שעות), המאפשר זיהום מינימלי של תאים תת-תתי-תאיים שאינם אורותליאליים (איור 1A). זמן התנתקות ארוך יותר עשוי להגדיל את אחוז התאים הסטרומליים, כגון תאי אנדותל ותאי פיברובלסט. שלב ההתמרה ex vivo של אדנו-וירוס יעיל ביותר. לאחר התמרת ex vivo adenovirus Cre, GFP הודגם בכמעט 100% מתאי האורותל עם אללים מדווחי mT/mG (איור 1B).
ישנן מגבלות לשיטת ex vivo. ראשית, התאים המנותקים אינם נבחרים מראש לפני התמרת אדנווירוס. לדוגמה, תאים אינם מומרים עבור תאי אורותל לעומת תאים שאינם אורותליאליים, או תאים לומינליים לעומת תאי בסיס. ניתן להשתמש במיון תאים עם EpCAM ו/או CD49f כדי למיין תאי אפיתל טהורים ו/או תאי גזע לפני התמרת ex vivo 12,13. שנית, ה-adenovirus המניע ביטוי Cre עם מקדם CMV המשמש בפרוטוקול זה מכוון למגוון רחב של סוגי תאים לאחר התנתקות רקמות (אורותל לעומת תאים שאינם אורותליאליים, בסיסיים לעומת לומינליים). מיקוד לא ספציפי זה עלול להוביל להטיית סלקציה הגורמת לצמיחת יתר של תאים בעלי הפוטנציאל האונקוגני ביותר. וקטורים ספציפיים לסוג התא אדנו-וירוס שימשו באופן מקומי הן בסרטן הריאות והן בסרטן שלפוחית השתן GEMMs 14,15,16,17. מחקרים עתידיים באמצעות אדנו-וירוס ספציפי לסוג תא ex vivo (אדנו-וירוס עם מקדם CK8 או מקדם CK5) עשויים לענות על שאלות של תא המוצא האם האורגנואידים של TKO מופקים מתאי בסיס או לומינלי18. CK20 או Upk2 אדנו-וירוס ספציפי למקדם (שאינו זמין למיטב ידיעתנו) יכול גם להיות מתוכנן כדי להתמר תאי מטריה באורותליום. עם זאת, נדרשים מחקרים עתידיים כדי לבחון את היעילות והספציפיות של אדנו-וירוסים ספציפיים אלה עבור זיהום בשלפוחית השתן ex vivo. ייתכן שיש פער ביעילות אדנו-וירוס-Cre בין התמרה in vivo ו- ex vivo עקב הסביבה המארחת18. שלישית, שיטת ה-ex vivo מוגבלת על ידי היעדר סביבת הגידול, מה שעלול להשפיע על הגידולים וההיסטומורפיולוגיה של in vivo. למרות מגבלות אלה, יתרון מרכזי של שיטת ex vivo הוא זרימת העבודה המהירה (1-2 שבועות במקום שנים של גידול עכברים). היתרון השני של גישת ה-ex vivo הוא ש-adenovirus-Cre (Ad5CMVCre) זמין מסחרית, פשוט ויעיל בכמעט 100% עבור התמרה נגיפית ורקומבינציה של Cre (איור 1B). לעומת זאת, שיטות ex vivo חלופיות המשתמשות בעריכת CRISPR או בהתמרה לנטי-ויראלית דורשות בחירת שיבוט נוספת בשל עריכה גנומית פחות יעילה 5,13,19,20.
לסיכום, גישת ה-ex vivo adenovirus המתוארת היא נוחה, מהירה ויעילה ביצירת מודלים של סרטן שלפוחית השתן תוך שימוש בכל שילוב של גנים בעלי עניין (אללים פלוקסים) הקשורים לסרטן שלפוחית השתן האנושית. ניתן לשלב מודלים אלה עם אדנו-וירוס ספציפי לסוג התא ומיון תאים כדי לטפל בהשפעת תא המוצא על פנוטיפ סרטן שלפוחית השתן ולהעריך את תגובות הטיפול לאימונותרפיות בסביבה של מוטציות גנטיות מוגדרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודת מחקר זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי NIH, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 ו- R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (מענק תמיכת ליבה של מרכז הסרטן NCI), קרן הברית של רוזוול פארק וקרן הידידים של אורולוגיה. אנו מודים למריסה בלאסק ולמילה פאחומובה על ההגהה של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall Legend RT | Thermo Fisher | 75004377 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- DeGraff, D. J., et al. Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).
- Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma. Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).
- Wang, L., et al. A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).
- Yang, D., et al. Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin. Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Bottger, F., et al. Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer. Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).
- Puzio-Kuter, A. M., et al. Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).
- Park, S., et al. Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression. Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).
- Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).
- Feng, W., et al. Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).
