方法文章

通过三维细胞培养基底的紫外光图案化技术构建多线索细胞微环境

DOI：

10.3791/63988

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2022年6月2日

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1Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems, Eindhoven University of Technology

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

传统上，细胞培养是在平面基底上进行的，而这种基底无法很好地模拟细胞的天然微环境 体内在此，我们描述了一种制备具有生理相关曲率几何形状及微图案化细胞外蛋白的细胞培养基底的方法，可实现对细胞感知这些细胞外信号的系统性研究。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞外基质是调控细胞功能的重要因素。越来越多的研究表明，细胞微环境中存在的环境信号，如配体分布和组织几何结构，在调控细胞表型和行为方面发挥着关键作用。然而，这些环境信号及其对细胞的影响通常被分别研究，使用 体外 分离单一线索的平台，这种策略极大地简化了复杂的 体内 多种线索并存的情况。工程学方法在弥合这一差距方面可能特别有用，可通过开发能够捕捉复杂性的实验装置来实现 体内 微环境，同时保持其精确性和可操控性 体外 系统。

本研究介绍了一种结合紫外光（UV）介导的蛋白质图案化与基于光刻的基底微加工技术的方法，可实现对多信号环境中细胞行为的高通量研究。通过无掩模紫外光图案化技术，可在包含多种明确定义几何信号的芯片三维（3D）细胞培养基底上，构建复杂的黏附性蛋白质分布。该方法适用于由不同聚合物材料制成的培养基底，并可与多种蛋白质的图案化黏附区域相结合。利用该技术，单个细胞以及细胞单层均可同时响应由图案化基底提供的几何信号与接触导向信号。通过系统性地组合芯片材料、蛋白质图案和细胞类型进行研究，可深入揭示细胞对多信号环境的响应机制。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

体内，细胞会受到来自细胞外基质（ECM）的各种机械、物理和生化性质的环境信号作用。已有大量环境信号被证实对调控细胞行为（如增殖、分化和迁移）起着至关重要的作用1,2,3,4,5。其中被广泛研究的现象之一是接触引导，即细胞通过黏附介导沿细胞外基质中存在的各向异性生化或拓扑结构排列6,7,8,9,10,11。除了引导细胞排列方向外，接触引导信号还被证明会影响其他细胞特性，如细胞迁移、细胞内蛋白的组织、细胞形态以及细胞命运12,13,14,15。此外，三维细胞环境的几何结构也被认为对细胞行为具有调控作用16,17。在人体中，细胞暴露于多种曲面几何结构中，尺度范围从微米级的胶原纤维、毛细血管和肾小球，到中等尺度的肺泡和动脉18,19。有趣的是，近期的体外研究表明，细胞能够感知并响应从纳米到中等尺度的此类物理信号20,21,22,23。

迄今为止，大多数研究细胞对环境信号响应的实验主要采用分离单一信号的实验设计。尽管这种方法极大地推动了人们对细胞感知环境信号基本机制的理解，但却难以真实再现细胞在体内所处的复杂环境 体内 能够同时呈现多种线索的环境。为了弥合这一差距，开发一种可独立且同时调控多种环境线索的培养平台具有重要意义。这一理念近年来受到越来越多的关注24,25，结合基质刚度与配体密度的研究26,27,28,29，基质硬度和孔隙率30，基质硬度和三维微环境体积31表面形貌与接触引导信号32,33,34以及具有介观曲率引导线索的纳米级接触引导线索23然而，以可控且高通量的方式将接触引导信号与多种三维几何结构相结合仍具挑战性。

本研究方案针对这一挑战，提出了一种方法，用于构建具有可控组合的细胞外基质蛋白图案化黏附区域（接触引导信号）与基底曲率（几何信号）的细胞培养基底。该方法能够以系统化和高通量的方式，在仿生多信号环境中解析细胞的响应行为。所获得的知识有助于进一步理解细胞在复杂环境中的行为，并可用于设计具有特定性能的指导性材料，以引导细胞反应达到预期结果。

三维蛋白质光刻图案化
在细胞培养材料上创建细胞外基质（ECM）蛋白的黏附区域（接触引导信号）可通过多种技术实现，例如深紫外（deep-UV）光刻图案化或微接触印刷35,36。深紫外图案化利用紫外光透过掩膜投射到聚合物材料上，从而在细胞培养基底的特定位置降解钝化聚合物。随后将图案化基底与目标配体孵育，形成支持细胞黏附和培养的预定义黏附区域12,37,38。另一种引入蛋白质图案的方法是微接触印刷，该方法使用带有特定形状的弹性印章，将其涂覆选定的蛋白质后压印在细胞培养基底上，从而将蛋白质涂层转移至基底表面，供细胞黏附35,37,39,40。然而，由于这两种技术均依赖于掩膜制备和软光刻方法，实验过程耗时且劳动强度大，且在图案灵活性方面存在局限。此外，深紫外图案化和微接触印刷主要适用于平面材料，在三维环境中对配体进行图案化时，技术上极为困难，甚至无法实现。

为了改进这些传统方法，Waterkotte 等人结合了无掩模光刻、化学气相沉积和热压成型技术，以制备具有微图案的三维聚合物基底41。然而，该技术依赖于可热成型的聚合物薄膜，且蛋白质图案分辨率较低（7.5 µm），而已有研究表明细胞可响应小至 0.1 µm 的几何形蛋白质图案2,42。Sevcik 等人描述了另一种有前景的方法，可在含有纳米和微米级形貌结构的基底上实现细胞外基质（ECM）配体的纳米级图案化43。该方法采用微接触印刷技术，将细胞外基质蛋白从聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章转移至温敏性聚（N-异丙基丙烯酰胺）（pNIPAM）基底上；随后，利用 pNIPAM 网络的温敏特性，将二维（2D）蛋白质图案转移至具有形貌结构的 PDMS 基底（沟槽深度为 10–100 µm），从而实现对形貌特征上黏附位点定位的控制。然而，并非所有可能的微米级形貌结构均可实现图案化，因为润湿性降低的问题使得在更深的形貌基底上进行图案化更加困难。据报道，沟槽深度与宽度的长宽比达到 2.4 时，已接近成功转移图案至形貌基底的极限43。此外，由于依赖微接触印刷技术，该方法在图案多样性及所生成图案分辨率方面均较为有限。

本文介绍了一种克服上述瓶颈的方法，提供了一种灵活且高通量的技术，用于制备可用于细胞培养的多线索基底（见图1）。在PDMS芯片中预先设计并微加工出具有生理相关性的几何结构（如圆柱形、穹顶形、椭圆形和鞍形表面），其曲率范围为 ĸ = 1/2500 至 ĸ = 1/125 µm-1。随后，通过采用分辨率达1.5 µm的光刻图案化技术，并结合多种数字图案设计，在这些三维几何结构表面构建接触引导线索44。具体而言，首先对PDMS芯片进行钝化处理，以防止细胞和蛋白质黏附；该钝化层随后可通过光引发剂4-苯甲酰基苄基三甲基氯化铵（PLPP）与紫外光照射的联合作用被选择性去除45。通过设计数字掩模来确定紫外光照射的位置，从而精确控制钝化层被去除的区域。蛋白质可选择性地吸附至这些区域，进而实现细胞的黏附。由于该图案化过程使用的是数字掩模（而非物理掩模），因此可快速生成多种不同的图案，避免了设计和制造额外光掩模所带来的繁琐流程与成本。此外，多种细胞外基质蛋白（如I型胶原、明胶和纤连蛋白）均可被图案化于该基底上。尽管本实验方案使用PDMS材料制成的细胞培养芯片进行操作，但该方法原理可推广至其他任意感兴趣的材料46。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案所述研究中使用了原代人角膜细胞。本研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行。原代角膜细胞从深板层角膜内皮移植术（Descemet Membrane Endothelial Keratoplasty）后剩余的人尸体角巩膜组织中分离获得，这些组织来自荷兰贝弗维克ETB-BISLIFE多组织中心角膜科，在获得所有已故供体近亲的知情同意后获取。

注意：有关本实验方案中使用的所有材料、试剂、设备和软件的详细信息，请参见材料表。

1. 三维细胞培养基质的制备

  1. 使用飞秒激光直写技术在玻璃上制备包含所有目标特征的负玻璃模具（#1）（见图2）。
  2. 将负玻璃模具（#1）小心地放置在培养皿底部。
  3. 准备PDMS预聚物：将一个空的50 mL锥形管放在天平上归零，然后倒入所需量的硅弹性体基础液至管中。
  4. 使用巴斯德移液管加入固化剂，使弹性体基础液与固化剂的最终质量比为10:1（w/w）。
  5. 使用刮刀在锥形管中充分混合各组分。
  6. 在2,000 × g条件下离心70秒，以去除所有气泡。
  7. 将PDMS预聚物倒入培养皿中的负玻璃模具（#1）上方，完全覆盖模具。
  8. 将含有负玻璃模具（#1）和PDMS预聚物的培养皿放入真空干燥器中，启动真空泵。达到真空后，保持5分钟，以去除模具表面与PDMS预聚物界面处的所有气泡。
  9. 解除真空，将培养皿从干燥器中取出。
  10. 在65 °C烘箱中过夜固化PDMS预聚物。
  11. 使用刮刀轻轻撬起PDMS边缘，将新固化的正PDMS芯片（#2）从负玻璃模具（#1）上小心剥离。若正PDMS芯片（#2）容易粘附于负玻璃模具（#1），可在剥离时向印模边缘滴加乙醇或水。
    注：液体将渗入两层之间，有助于分离负玻璃模具（#1）和正PDMS芯片（#2）。
  12. 使用刀片切去正PDMS芯片（#2）的边缘，保留矩形芯片。
  13. 将正PDMS芯片（#2）放入干燥器中，并在其旁放置一个小瓶，内含一滴十三氟-1,1,2,2-四氢辛基三氯硅烷（一种硅烷化试剂），在真空条件下静置过夜。
    注：硅烷化可确保后续步骤中印模不会与其他PDMS层粘连。其他硅烷化试剂和/或方法也可用于防止PDMS芯片表面与其他PDMS层粘附。
    警告：十三氟-1,1,2,2-四氢辛基三氯硅烷易燃（H226），可引起严重皮肤灼伤和眼损伤（H314）。操作时应穿戴个人防护装备，在通风橱中进行，并在操作后彻底洗手。避免接触热源、高温表面、火花、明火及其他点火源。储存温度应保持在15至30 °C之间（P280、P210、P240、P403、P235、P310）。
  14. 解除真空，将正PDMS芯片（#2）放置于培养皿底部。在其上方倒入PDMS预聚物（10:1），以制备多个负PDMS模具（#3）。
  15. 将培养皿置于干燥器中抽真空15分钟，以去除所有气泡。
  16. 在65 °C下过夜固化PDMS预聚物，随后可用刮刀将负PDMS模具（#3）从正PDMS芯片（#2）上剥离。
  17. 将最终的负PDMS模具（#3）在真空干燥器中使用硅烷化试剂进行硅烷化处理，静置过夜。
  18. 通过在负PDMS模具（#3）中倒入PDMS预聚物，使用干燥器去除气泡，并在65 °C下固化3小时，制备多个厚度约为5 mm的细胞培养芯片（#4，见图2）。使用剃刀刀片将芯片切割至图2所示的最终尺寸。芯片可在室温下储存。
    ​注：表面粗糙度可能影响细胞反应。如有需要，可在正PDMS芯片（#2）上涂覆一层额外的薄PDMS以平滑表面。具体操作为：在芯片上滴加少量PDMS预聚物，用加压空气均匀铺展。将涂层芯片在65 °C下固化3小时，然后继续进行步骤1.12。

2. 制备平面PDMS样品（对照样品）

  1. 按照步骤 1.3–1.6 制备 PDMS 预聚物（10:1）。
  2. 将玻璃盖玻片放置在匀胶机中心圆形真空柱上。
  3. 打开真空泵，使玻璃盖玻片固定在设备上，然后使用巴斯德移液管在盖玻片中央滴加一滴 PDMS。
  4. 采用以下程序将 PDMS 预聚物均匀涂布在玻璃基底上，以获得约 10 µm 厚的薄膜。
    1. 以 0.45 × g 转速旋涂 10 秒，加速度：0.2 × g/s。
    2. 以 44.8 × g 转速旋涂 50 秒，加速度：0.54 × g/s。
  5. 关闭真空泵，用镊子将盖玻片从匀胶机上取下，并放入培养皿中。在 65 °C 烤箱中固化 PDMS 过夜，之后于室温下保存。

3. 三维细胞培养基底的底物钝化

  1. 使用 O2-等离子体活化 PDMS 芯片（#4）表面的羟基。用镊子将芯片放入等离子体刻蚀仪的样品篮中。
  2. 以 20 W 功率运行 30 秒的刻蚀循环，随后用 N2 对刻蚀腔体进行放气。
  3. 将芯片从样品篮中取出，并放入一个小的 PDMS 容器中（见图 1）。
  4. 使用巴斯德移液管，在芯片表面加入 500 µL 的聚-L-赖氨酸（PLL, 0.01%），使整个表面完全浸没在 PLL 溶液中。在室温下孵育 30 分钟。
  5. 用移液器移除细胞培养芯片中的 450 µL PLL 溶液，并用 500 µL 的 0.1 M HEPES 缓冲液（8 < pH < 8.5）对芯片表面冲洗三次。每次操作后始终保留少量液体在 PDMS 芯片上，以避免样品干燥，否则会降低最终图案的质量。
  6. 为每张细胞培养芯片配制 500 µL 的 50 mg/mL 甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基戊酸酯（mPEG-SVA；分子量 5,000 Da）溶液，溶剂为 0.1 M HEPES 缓冲液（8 < pH < 8.5），并将溶液加入样品上，孵育 60 分钟。由于 mPEG-SVA 的半衰期为 15 分钟，务必在使用前立即配制所需用量。
    注意：当溶液完全透明时，表明 mPEG-SVA 已完全溶解。
  7. 使用微量移液器移除 450 µL 的 mPEG-SVA 溶液，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗芯片表面五次。每次清洗时需反复吹打数次，以确保所有未结合的 mPEG-SVA 被彻底去除。为防止样品干燥，应尽量缩短各次清洗步骤之间的时间，并确保每次使用足量（500 µL 或更多）的 PBS 进行清洗。
  8. 将样品浸没在 PBS 中保存，或直接进入实验方案的图案化步骤。
    ​注意：如需要，可在细胞培养操作柜中使用无菌溶液和无菌设备，在无菌条件下完成钝化处理。

4. 图案化细胞培养基底的保存

注意：3D 细胞培养基质可在该流程的不同步骤中储存。

  1. 将固化后的PDMS细胞培养芯片在室温下干燥保存。
  2. 将钝化处理后的细胞培养芯片按以下两种方式之一保存：
    1. 在4 °C的PBS中保存，最长可达7天。
    2. 在干燥条件下保存，最长可达数月。为获得干燥样品，需移除PBS，并使用双蒸水（ddH2O）多次冲洗，然后用氮气枪或空气枪吹干。

5. 用于光图案化的数字掩模设计

注意：可使用单个或多个焦平面进行三维基底的图案化（见图3）。当特征尺寸不超过一个数字微镜器件（DMD，约300 µm × 500 µm）且高度不高（50–100 µm）时，可采用单个焦平面。此时，使用TIFF模式设计数字图案。当特征尺寸超过单个DMD范围且相对较高时，需将基底的图案化分为多个步骤。此时，使用PDF模式设计多个图案，每个图案分别在独立的焦平面上聚焦 。

  1. 使用设计软件工具设计数字掩膜。
    1. 以TIFF模式（像素）进行图案化：创建一个1,140 x 1,824像素的全黑画布（即1个DMD的精确尺寸，约为300 µm x 500 µm），并在画布上填充所需形状。将画布导出为8位TIFF文件。
      注意：图案设计中的不同灰度级别决定了该位置将接受的曝光量。
    2. 以PDF模式（公制单位）进行图案化：创建一个所需尺寸（毫米）的黑色画布，并在画布上填充任意所需形状。如果需要使用多个焦平面在3D基底上进行图案化，则将图案分割为多个文件。将画布保存为PDF文件。
      ​注意：图案设计中的不同灰度级别决定了该位置将接受的曝光量。

6. 三维细胞培养基底的紫外光图案化

  1. 校准
    注意：激光校准的目的是确保对目标材料实现正确聚焦。由于PDMS细胞培养基底过厚，无法直接穿透成像，需将芯片倒置放置在载玻片上进行操作。由于激光首先穿过载玻片，因此应使用玻璃进行激光校准。
    1. 将荧光标记剂涂抹在玻璃盖玻片上，然后将盖玻片放置于荧光显微镜的载物台上，确保标记面朝上。
    2. 打开显微镜和 PRIMO 设备，启动 Micro-manager，然后在“plugins”中访问 Leonardo 软件。
    3. 选择 校准 在初始菜单中，选择显微镜上的20倍物镜以及软件中的20倍物镜，然后单击 下一步.
    4. 将带有荧光标记的玻璃载玻片置于显微镜的光路中。切换至 荧光的 模式，并仔细对焦出现的 PRIMO 图像，确保徽标和文字均清晰对焦。单击 下一步 完成校准程序。
    5. 校准过程中记录载物台的Z轴位置，并在后续实验步骤中将此位置作为参考。
      注意：校准材料应与后续实验步骤中用于图案化的材料一致。上述步骤描述了细胞培养基底所需的校准过程。对于平坦PDMS对照样品的校准，需将荧光标记剂涂覆在额外的平坦PDMS样品表面，并按照步骤6.1.2–6.1.5进行校准。
  2. 使用单一焦平面构建三维结构
    注意：使用单个焦平面进行图案化时，适用于不超过一个DMD尺寸（约300 µm × 500 µm）的三维结构。焦平面设置的示意图如图所示。 图3.
    1. 从载物台上取下校准玻片，将含有光引发剂（PLPP）液滴（约 50 µL）的玻片放置于载物台上。
      警告：焦磷酸吡哆醛（PLPP）对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性（R36-38）。操作时须佩戴个人防护装备，远离易燃易爆物质，切勿将水加入本产品，采取防静电措施，并避免震动和摩擦（S26-36）。
    2. 将PDMS细胞培养基底倒置放入光引发剂液滴中。确保细胞培养基底表面的3D结构朝向载玻片，并完全浸没于PLPP中，以保证图案化效果。
    3. 选择 模式 在软件中。
    4. 切换至 明场 在显微镜上切换至相应模式，并移动载物台至目标特征位置。
    5. 分别聚焦于凸面和凹面结构的顶部或底部图3).
    6. 选择 PRIMO 选择要插入的图案。在实时明场图像上方观察以橙色显示的图案预览。
    7. 根据特征（位置、角度、重复次数）调整图案化设置，并选择 1,000 mJ/mm 的剂量2.
    8. 点击 锁定 并切换显微镜至 荧光的 模式。
    9. 点击 播放 点击屏幕右下角的按钮以开始图案化。完成后，观察以绿色显示的图案。
    10. 完成细胞培养芯片上的所有操作后，将芯片从图案化载片上取下，并置于4 °C的PBS中保存。
  3. 使用多个焦平面构建三维结构
    注意：使用多个焦平面进行图案化时，适用于大于一个DMD（约300 µm × 500 µm）或相对较高的三维结构。在此情况下，三维结构需分步进行图案化，即图案设计应根据示例进行调整 图3.
    1. 从载物台上取下校准玻片，将含有光引发剂（PLPP）液滴（约50 µL）的玻璃玻片放置于载物台上。
    2. 使用镊子将PDMS细胞培养芯片倒置放入光引发剂液滴中。
    3. 选择 模式 在软件中。切换到 明场 在显微镜上选择相应模式，并移动载物台至目标特征位置。
    4. 聚焦于芯片右侧的指定区域。由于图案化是在单一焦平面上进行的，而特征尺寸大于单个DMD的范围，因此需对每个3D基底使用多个焦平面，进行多轮图案化，以确保在整个特征高度和宽度方向上具有足够的图案分辨率（参见 图3）。例如，对于高度为150 µm的结构，需分三轮进行图案化（每50 µm的Z轴行程对应±1个焦平面），分别在距结构底部约25 µm、75 µm和125 µm处进行聚焦。确保该结构的底部位置与步骤6.1.5中记录的数值相符。
    5. 选择 PRIMO 插入所需图案。观察叠加在实时明场图像上方以橙色显示的图案预览。
    6. 根据特征（位置、角度）调整图案化设置，并选择 1,000 mJ/mm 的剂量2.
    7. 点击 锁定 并切换显微镜至 荧光的 模式。
    8. 点击 播放 点击屏幕右下角的按钮以开始图案化。完成后，观察以绿色显示的图案。
    9. 当使用多个焦平面时，在目标特征上重复步骤 6.3.4–6.3.8。
    10. 完成细胞培养芯片上的所有操作后，将芯片从图案化载玻片上取下，并置于 PBS 中于 4 °C 保存。
      注意：如有需要，可在无菌条件下进行紫外光图案化处理，使用玻璃底培养皿，并在无菌超净工作台中制备所有基底。将图案化后的样品置于磷酸盐缓冲液（PBS）中保存，最长可保存数周。使用去离子水（ddH₂O）冲洗后2O，并用加压空气干燥后，样品可在4 °C下保存数月。

7. 蛋白质孵育

注意：建议使用新近与蛋白质孵育的基质进行细胞培养。只有在接下来直接进行细胞接种（步骤 8）的情况下，才继续进行本方案的此部分操作。

  1. 在培养柜中将已图案化的细胞培养芯片转移至无菌的PDMS容器中。
  2. 如果图案化过程未在无菌条件下进行，则使用过量的无菌PBS对已图案化的细胞培养芯片清洗3次。
  3. 在PBS中配制新鲜的蛋白溶液。
    1. 纤连蛋白：用微量移液器将2 mL PBS加入含有20 µg罗丹明标记纤连蛋白的试剂瓶中，配制成浓度为10 µg/mL的溶液。轻轻吹打以避免蛋白聚集，并避光保存。
    2. 明胶：解冻一份200 µL已溶解的荧光素标记明胶。避光保存。
  4. 使用微量移液器向细胞培养芯片中加入200–500 µL蛋白溶液。根据所选蛋白调整孵育时间和温度：纤连蛋白为室温孵育5分钟，明胶为37 °C孵育15分钟。确保样品被覆盖（例如使用铝箔）。
  5. 移除蛋白溶液，并用500 µL无菌PBS清洗5次。确保在细胞培养芯片所有相关结构上方反复吹打PBS多次，以去除未结合的蛋白。
    注意：在洗涤过程中，必须确保样品始终不干燥。在去除蛋白溶液或PBS时，应立即加入新的PBS，以防止蛋白聚集形成（见图4）。凸起结构尤其容易干燥，因其高于基底表面。
  6. 可选步骤：在荧光显微镜下检查蛋白图案。保持样品无菌并浸没于PBS中。

8. 细胞接种

注意：本方案使用人原代角膜细胞和人皮肤成纤维细胞。角膜细胞取自患者的角膜组织，符合荷兰关于材料二次使用的指南，并已先前被鉴定为角膜细胞47。这些细胞在添加了5%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（P/S）和1 mM L-抗坏血酸-2-磷酸三镁盐水合物（维生素C）的DMEM培养基中，于37 °C培养，最多传代四次。人皮肤成纤维细胞为商业购买，使用含10% FBS和1% P/S的DMEM培养基，在37 °C培养，最多传代15次。在光图案化细胞培养芯片上接种角膜细胞和皮肤成纤维细胞时，每芯片使用20,000个细胞。

  1. 消化目标细胞（例如使用胰蛋白酶），并用培养基制备细胞悬液，每芯片加入约 1 mL，细胞浓度为 ± 10,000–50,000 个细胞/mL。根据细胞大小和所需的检测结果，调整每种基底所加细胞的确切数量。
  2. 从细胞培养芯片中移除 PBS，加入 1 mL 细胞悬液。
  3. 轻柔地将含有细胞的培养芯片转移至培养箱中，在 37 °C 下孵育 60 分钟。
  4. 在明场显微镜下检查细胞在图案化细胞培养芯片上的贴附情况。若为线条图案，应观察到细胞呈伸长形态（见图 5）。若发现细胞也开始在图案区域外贴附，可用移液器在基底上方直接反复吹打培养基以去除这些细胞。
    注意：附着在图案化区域内的细胞将保持贴附状态，而位于图案区域外的细胞则会脱落。
  5. 将细胞培养芯片从 PDMS 容器中取出，使用无菌镊子将其转移至含有约 5 mL 培养基的 6 孔板中。
  6. 根据实验需求培养细胞至相应时间，每 2–3 天更换一次培养基。为确保细胞培养后仍能清晰观察到蛋白图案，请在培养过程中尽量减少样品的光照暴露。

9. 染色、图像采集与分析

  1. 固定与染色
    1. 在完成所需时间的培养后，吸除几乎全部培养基，用过量 PBS 洗涤三次。随后在室温下用 3.7% 甲醛溶液固定 15 分钟，再于室温下用 PBS 每次洗涤 5 分钟，共洗涤三次。切勿让样品干燥。
      注意：甲醛若吞咽或吸入有害（H302，H332），可能引起过敏性皮肤反应（H317），怀疑可导致遗传性缺陷（H341），并可能致癌（H350）。操作时须佩戴个人防护装备，并在通风橱中进行。
    2. 使用所需的染色剂或抗体对细胞培养基底进行染色。为减少染色剂用量，可将细胞培养芯片倒置，置于载玻片上滴加的染色液液滴中。
    3. 将样品短期保存于 PBS 中，或长期保存时用封片剂将样品封固于盖玻片上，置于 4 °C 保存。
  2. 图像采集
    1. 将染色后的样品倒置放入载玻片上的 PBS 液滴中，并将样品置于共聚焦显微镜的载物台上。
    2. 根据所需的细节水平，使用合适的物镜（10x、20x 或 40x）和 Z 轴步进间距采集 Z 层扫描图像，以确保获得适当的图像数据。
  3. 图像分析与可视化
    1. 在图像分析软件中打开原始图像文件，并检查图像属性（如尺寸、分辨率）是否正确。
    2. 根据需要调整各通道的亮度和对比度。
    3. 裁剪出包含图案和细胞的感兴趣区域。
    4. 可选：如有需要，可进行去卷积处理。
    5. 使用 3D 渲染软件对 Z 层扫描图像生成 3D 重建图像。
    6. 优化每个独立通道的对比度和增益设置。
    7. 如需生成 3D 渲染图像，可创建快照 并导出为 .TIFF 文件。
    8. 如需生成 3D 渲染动画，需设定起始帧、结束帧及时间间隔后再进行录制，导出为 .avi 文件。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过所述方案，可对三维PDMS细胞培养基质进行紫外光刻图案化，以创建精确且高通量的黏附区域，适用于细胞附着。通过该方法，细胞可同时暴露于特定的基质几何形貌和黏附配体图案中。细胞的取向、细胞面积以及黏着斑数量等特性可被便捷地监测，并用于深入理解细胞在复杂环境中的行为。 体内类环境。

为了验证3D PDMS基底上的图案化过程，采用X射线光电子能谱（XPS）测定了实验流程不同阶段材料的原子表面组成48。总体而言，XPS检测结果显示，钝化样品上存在PEG链，碳信号增强，而在光图案化后该信号降低。与纤连蛋白孵育后，碳信号再次升高，表明细胞培养芯片表面成功实现了蛋白质黏附。接下来，在多种圆形图案化的凹面微坑（ĸ = 1/250 µm-1，ĸ = 1/1,000 µm-1 和 ĸ = 1/3,750 µm-1，见图6）上对3D结构上的图案分辨率和对准情况进行了表征。通过最大强度投影图可以看出，蛋白质图案在所有三种3D结构上均成功形成。图6A中的强度分布曲线显示图案分辨率较高，图案区域与非图案区域之间的过渡清晰锐利。此外，在微坑内整个图案上获得了均匀一致的蛋白质信号强度。

使用单焦平面法（一种图案）制备曲率κ = 1/250 µm-1的凹形凹坑，而κ = 1/1,000 µm-1和κ = 1/3,750 µm-1的凹坑则分别采用两个和三个焦平面（图案）进行制备。从图6中的最大强度投影可以看出，两种方法均实现了图案在特征顶部的完美对齐。在两个不同焦平面和图案之间未观察到任何错位的过渡区域。

利用所述方案，可在多种几何形状上实现广泛的蛋白质图案设计（见图7和视频1）。为展示该方法的多功能性，使用不同宽度的线条和圆形对半圆柱体（凸面和凹面）、马鞍面以及凹坑进行了图案化。光图案化材料随后可用于细胞培养（见图7、图8、视频2、视频3和视频4）。在图案化（纤连蛋白线条，红色，宽5 µm，间隔5 µm）的凹面半圆柱体上培养的真皮成纤维细胞示例见于图8、图9和视频4。实验过程中，细胞感知并黏附于多信号细胞培养基底，并在长时间内保持活性。由图8中的免疫荧光染色可见，细胞主要在纤连蛋白线条上形成黏着斑（vinculin簇）。

我们课题组最近发表了一项利用这些细胞培养材料的示例性研究48。在该研究中，人源肌成纤维细胞和内皮细胞被置于接触引导信号与几何形貌特征相结合的环境中。体内，这两类细胞在天然组织（如人体血管系统）中均会受到曲率和接触引导信号的影响。通过在体外将细胞暴露于同时包含这两种环境信号的条件中，可模拟体内微环境，从而更深入地理解微环境对细胞行为的影响。研究显示，人源肌成纤维细胞在凹面圆柱形基底上会沿着接触引导信号（平行排列的纤连蛋白线条）排列48。然而，在曲率逐渐增大的凸面结构上，几何形貌信号会主导生化信号，表明肌成纤维细胞能够感知曲率的程度和方向（凹凸性）。有趣的是，内皮细胞仅能黏附于凹面多信号基底，而无法在凸面PDMS基底上黏附。在凹面且具有蛋白图案化的基底上，内皮细胞的排列方向与接触引导信号一致。这一基础性的体外研究成果在血管组织工程领域具有重要的生理学意义，并有望最终推动智能型组织工程构建物的设计。

3D cell culture process diagram with PDMS chip, UV-photopatterning, protein incubation, staining.
图1应用接触引导线索于三维细胞培养基质的实验时间线。 首先，利用含有多种几何形状的负性PDMS模具制备正向细胞培养芯片。将未固化的PDMS倒入模具中，在65 °C下固化3 h。随后，用O₂等离子体处理PDMS2-血浆并加入PLL和mPEG-SVA（蓝色，标记）以钝化细胞培养基底表面。洗涤后，将基底倒置放入光引发剂（PLPP，绿色，标记）液滴中，并采用LIMAP方法进行紫外光图案化。在此过程中，使用带有用户自定义图案的数字掩膜，在特定位置切断钝化层。随后加入蛋白溶液（红色，标记），该溶液仅吸附于钝化层被去除的区域。将细胞接种至基底时，同时受到几何形状和蛋白图案的影响，从而可开展复杂环境下细胞行为的研究 体内-模拟环境。缩写：PDMS = 聚二甲基硅氧烷；mPEG-SVA = 甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基戊酸酯；PLPP = 4-苯甲酰基苄基-三甲基氯化铵；LIMAP = 蛋白质光诱导分子吸附。 请点击此处以查看此图的放大版本。

微加工工艺：玻璃/PDMS模具、细胞培养芯片；材料科学实验。
图2：三维细胞培养基底制备与钝化过程中的不同阶段。 负型玻璃模具（#1）通过计算机辅助设计软件设计，并采用飞秒激光直写技术制备。该模具用于制备中间正型PDMS芯片（#2）和负型PDMS模具（#3），随后用于制备最终的细胞培养芯片（#4）。缩写：PDMS = 聚二甲基硅氧烷。 请点击此处查看该图的放大版本。

紫外光刻图案示意图、三维基底、焦平面变化、光学图案化、结果对比。
图3：两种图案化方法的示意图。 左图：在较小特征（约一个DMD大小）上使用单一焦平面和图案进行紫外光刻图案化。因此，整个特征可一次性完成图案化。右图：当使用较大特征（大于一个DMD）时，图案化过程需分多个焦平面和图案进行。缩写：DMD = digital mirror device。 请点击此处查看该图的放大版本。

同心圆模式分析；光学效应，干燥状态，正常状态；示意图，显微镜结果。
图4：正常及干燥蛋白孵育基底的典型示例。 正常与干燥蛋白孵育基底的最大强度投影（XY）及正交视图（XZ）。在用蛋白溶液孵育后清洗图案化细胞培养基底时，必须始终确保样品保持湿润。尽管所有图像中的图案特征相同（ĸ = 1/1,000 µm-1），但当样品干燥数秒后，明胶-荧光素（绿色）发生聚集，形成明显团块。若样品始终保持湿润，则可观察到正确的蛋白图案。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

用于流体动力学研究的微通道制造显微图像，显示圆柱形结构。
图5：接种后的明场图像。 角膜原代成纤维细胞（左）和真皮成纤维细胞（右）在具有3D几何结构（曲率κ = 1/1,000 µm-1的凹坑，以及κ = 1/500、1/375、1/250、1/175和1/125 µm-1的半圆柱形结构）上接种4小时后的形态。左上角插图为用于几何图案化的线条模式。白色箭头指示已开始铺展并呈现定向排列的细胞。比例尺 = 250 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜下的同心环图案，包含数据图，显示衍射分析和灰度值曲线。
图6：凹陷坑上圆形图案的表征。 （A）使用LIMAP技术在凹陷坑（ĸ = 1/250 µm-1）上制备的图案（线宽：20 µm，间隙宽度：20 µm），并孵育了明胶-荧光素（绿色）后的最大强度投影（XY）和正交视图（XZ）。沿白色线的强度分布随距离绘制，显示出一致的图案质量和分辨率。（B）在曲率分别为 ĸ = 1/1,000 µm-1 和 ĸ = 1/3750 µm-1 的凹陷坑上进行的额外图案化，表明该方法在可用于图案化的几何特征方面具有灵活性。同样展示了最大强度投影（XY）和正交视图（XZ）。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

纤维连接蛋白和F-肌动蛋白的三维细胞成像示意图、共聚焦显微镜、蛋白质分布。
图7：图案化结构的三维显微成像数据。 经光图案化和细胞培养后典型的三维图案化细胞培养材料，通过三维渲染软件可视化呈现。(A) 凸半圆柱形结构，图案化为10 µm宽的线条（罗丹明标记的纤维连接蛋白，红色）和10 µm宽的间隙。比例尺 = 5 µm。(B) 培养于凹半圆柱形结构上的真皮成纤维细胞，该结构图案化为20 µm宽的线条（罗丹明标记的纤维连接蛋白，红色）和20 µm宽的间隙，F-肌动蛋白染色呈绿色。比例尺 = 5 µm。(C) 鞍形表面，图案化为20 µm宽的线条（罗丹明标记的纤维连接蛋白，红色）和20 µm宽的间隙。比例尺 = 5 µm。(D) 凹坑结构，图案化为20 µm宽的同心圆线条（荧光素标记的明胶，绿色）和20 µm宽的间隙。人角膜细胞的F-肌动蛋白细胞骨架经鬼笔环肽染色后呈红色。比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

共聚焦显微镜，成纤维细胞在纤连蛋白上，多通道荧光成像，细胞结构分析。
图8：人真皮成纤维细胞在光图案化凹面半圆柱体上的免疫荧光染色。 （A）人真皮成纤维细胞在图案化（纤连蛋白条带，红色，宽5 µm，间隔5 µm）的凹面半圆柱体上培养24小时后的最大强度投影（XY）及正交截面（XZ和YZ）。细胞经F-actin（品红色）、vinculin（绿色）和细胞核（蓝色）染色。比例尺 = 100 µm。（B）细胞在多线索环境中贴附区域的放大图。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

细胞生长阶段的显微镜图像；时间进程显示为0、1,420和3,180分钟。
图9：人真皮成纤维细胞在具有图案化凹面圆柱体上的明场延时图像。 凹面半圆柱体（ĸ = 1/250 µm-1）上制备有平行线条图案（线宽5 µm，间隙5 µm），并在接种细胞前用罗丹明标记的纤连蛋白孵育。延时成像始于初次接种细胞后1小时（左图，0分钟），此时细胞仍呈圆形且未贴壁（箭头所示）。约24小时后（中图，1,420分钟），细胞已贴附于多线索基底，并根据接触引导图案表现出取向排列反应。在整个培养期间（右图，3,180分钟），细胞的取向排列反应和活力均得以维持。比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

视频 1：三维圆柱形基底上的图案示例。 用罗丹明-纤维连接蛋白（红色）在凸圆柱体上进行图案化的三维示意图。请点击此处下载该视频。

视频 2：在具有图案化的三维圆柱形基底（ĸ = 1/500 µm-1）上培养的真皮成纤维细胞的三维表征。 真皮成纤维细胞在具有图案化结构（纤连蛋白线条，红色，宽 10 µm，间隔 10 µm）的凸面半圆柱体上培养 24 小时。细胞经染色显示 F-肌动蛋白（品红色）、纽蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）。请点击此处下载该视频。

视频 3：在图案化三维凹坑（ĸ = 1/3,750 µm-1）上培养的人角膜细胞的三维图像。 人角膜细胞在凹面、图案化凹坑（明胶圆环，绿色，宽 20 µm，间隔 20 µm）中培养 24 小时后的三维图像。细胞经 F-actin 染色（红色）。请点击此处下载该视频。

视频 4：在具有图案化的凹面圆柱体上的人类皮肤成纤维细胞的明场延时成像。 该凹面半圆柱体（ĸ = 1/250 µm-1）上制备了平行线条图案（线宽 5 µm，间隙 5 µm），并在接种细胞前用罗丹明标记的纤连蛋白孵育。延时成像始于细胞接种后 1 小时，此时细胞已初步黏附于多线索环境中。在整个延时成像过程中，细胞主要沿接触引导线索定向排列，同时保持细胞活力。请点击此处下载该视频。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

如今，细胞行为的研究通常在缺乏天然细胞微环境复杂性的平面培养基质上进行。三维环境（如支架和水凝胶）被用作替代方案。尽管这些细胞培养环境改善了 体内 相关性，对细胞行为的系统性研究以及读出方法的可行性仍然具有挑战性。为了系统地研究细胞在代表性培养基质上的行为，需要能够实现显微观察的、具有一致性的多信号基质。因此，在本方案中，我们描述了一种制备具有生理相关几何结构和图案化细胞外基质（ECM）蛋白的多信号细胞培养基质的方法。将组织几何结构和接触引导信号等环境刺激因素相结合的主要挑战在于 体外 平台的技术性质在很大程度上属于技术层面。传统施加接触引导线索的方法（例如软光刻、深紫外光刻和微接触印刷）35,36) 对细胞培养材料的优化主要针对平面基底。三维细胞培养材料与接触引导信号相结合的需求凸显了若干技术挑战，例如图案对准性差、分辨率低以及灵活性不足。为克服这些挑战，可采用一种高通量、无掩模、基于光的图案化方法45,49此处，光学显微镜可实现精确的图案对准，分辨率达到微米级（参见 图6此外，使用数字掩膜使研究人员能够研究细胞在多种图案上的行为，而无需制备费时费力的物理掩膜。

紫外光图案化方法可与多种由不同材料制成的三维几何结构（例如圆柱体、马鞍形、穹顶形、凹坑）结合使用48。本研究中使用的三维细胞培养基底由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成；然而，也可使用其他材料。这可能需要采用不同的步骤来制备最终包含目标特征的细胞培养基底。由于已有研究表明细胞对细胞培养材料的表面粗糙度敏感，因此创建具有光滑表面的细胞培养芯片至关重要，以确保所观察到的细胞反应完全归因于三维几何结构和接触引导信号50,51。可采用光学轮廓仪、扫描电子显微镜或原子力显微镜等测量方法来评估表面粗糙度。在细胞培养材料制备完成后，可根据目标特征的具体尺寸选择基于单个或多个焦平面的图案化方法（见图3）。通常，使用单个焦平面可在约50 µm的Z轴范围内对某一区域进行图案化。实践表明，采用这一经验法则可保持图案分辨率的一致性（见图6）。然而，该方法的一个缺点是引入多个焦平面和图案后会显著增加图案化时间。在我们的实验中，利用多个焦平面，已成功实现了尺寸达16 mm × 16 mm × 0.17 mm（X × Y × Z）的三维几何特征的高质量图案化。

此外，需要指出的是，本方案可结合使用的几何特征的高度（Z轴方向）存在一定的限制。由于紫外光刻和许多细胞检测均依赖显微镜系统，物镜的工作距离决定了特征结构的最大高度。在我们的实验条件下，高度超过300 µm的几何结构仍可进行紫外光刻，并已使用配备40倍物镜的共聚焦显微镜完成检测。因此，利用本方案可实现从细胞内、细胞水平到组织尺度的 mechanobiological（机械生物学）研究。

另一个需要考虑的因素是样品在紫外光刻过程中或之后发生干燥的风险49。当使用三维结构时，这一问题尤为突出，因为凸起部分通常暴露在细胞培养材料之外。如图4所示，这可能导致图案不均匀，并在目标结构表面形成蛋白质聚集体。在蛋白质孵育后以及细胞培养期间对细胞培养芯片进行清洗，对于实现三维结构的均匀包被至关重要。因此，建议始终在细胞培养芯片表面保留少量工作溶液（如PBS、PLPP、蛋白质溶液或细胞培养基）。

迄今为止，已有多种蛋白质包被材料（纤连蛋白、I型和IV型胶原蛋白、明胶、FNC）以及多种细胞类型（人骨髓基质细胞、人肌成纤维细胞、人内皮细胞、人角膜细胞和真皮成纤维细胞）与所述的光图案化方法结合，应用于结构化的细胞培养材料。如先前一项研究48所示，优化蛋白质孵育参数对于在新细胞类型中进行系统性研究至关重要。因此，在使用新的蛋白质或细胞开展新实验之前，建议测试一系列蛋白质浓度、孵育温度和孵育时间。通过比较细胞在均一的、图案化平坦区域上初始黏附后的形态与在“常规”细胞培养条件下的细胞形态，可以获得一组优化的实验参数。此外，不同细胞类型可能需要不同的接种后时间，才能在特定的多信号环境中呈现出可识别的黏附形态（见图5）。为此，在步骤8.4的洗涤过程中，优化每种细胞类型在图案化区域上呈现接触事件所需的时间至关重要。例如，我们观察到，在条纹图案上，人角膜细胞在接种后30分钟内即表现出伸长的形态，而内皮细胞和真皮成纤维细胞则需要数小时才能显示出黏附形态的变化。因此，蛋白质孵育（步骤7）和细胞接种（步骤8）所需的实验参数可能取决于所选用的蛋白质和细胞类型。

在三维几何结构上施加接触引导信号的研究方法有助于深入理解细胞在复杂多信号环境中的行为。该方法可应用于对细胞内组分（如黏着斑和细胞核）的研究，也可用于在较大尺度上开展细胞或组织水平的实验。最终，有望将获得的知识应用于组织工程设计，通过构建复杂的细胞微环境来引导细胞行为，实现预期的生物学效应。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 Nello Formisano 博士（MERLN 再生医学技术研究所）提供人原代角膜细胞。本工作得到了 Chemelot InSciTe（项目 BM3.02）；欧洲研究理事会（资助编号 851960）；以及荷兰教育、文化和科学部对“材料驱动再生”重力计划 024.003.013 "Materials Driven Regeneration" 的支持。作者谨向 Alvéole 公司致谢，感谢他们的沟通、协助与技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗连环蛋白抗体，小鼠单克隆 IgG1SigmaV9131稀释比例：1/600
牛血清白蛋白，第五组分Roche10735086001
DMEM，高糖，含丙酮酸钠Gibco41966029
DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x)Gibco10565018
DMi8 正置荧光显微镜Leica Microsystems
乙醇Biosolve0005250210BS
胎牛血清Serana758093
Fiji/ImageJ，版本 v1.53kwww.imageJ.nih.gov
荧光标记笔Stabilo4006381333627
荧光素标记明胶InvitrogenG13187浓度：0.01%
甲醛溶液MerckF8775
玻璃盖玻片 24 x 60 mm，#1VWR631-1575
玻璃盖玻片，ø = 32 mm，#1Menzel-Gläser
HCX PL fluotar L 20X/0.40na 显微镜物镜Leica11506242
HEPESGibco15630080
人皮肤成纤维细胞LonzaCC-2511
人原代角质形成细胞MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine
Illustrator，版本 26.0.1Adobe
实验室烘箱Carbolite
L-抗坏血酸-2-磷酸镁盐水合物Sigma-AldrichA8960
Leica Application Suite X 软件，版本 3.5.7.23225Leica Microsystems
Leonardo 软件，版本 4.16Alvéole
Micro-manager，版本 1.4.23Open imaging
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich81381封片剂
mPEG-琥珀酰亚胺基戊酸酯，分子量 5,000 DaLaysan BioMPEG-SVA-5000浓度：50 mg/mL
负型玻璃模具FEMTOprint
NucBlue Live ReadyProbes 试剂（Hoechst 33342）InvitrogenR376052 滴/mL
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Gibco15140163
培养皿（ø=100 mm）Greiner Bio-one664160
鬼笔环肽 Atto 647NSigma65906稀释比例：1/250
磷酸盐缓冲液SigmaP4417
等离子体刻蚀仪EmitechK1050X
PLPP（光引发剂）Alvéole
聚-L-赖氨酸，无菌过滤Sigma-AldrichP4707浓度：0.01%
PRIMOAlvéole
罗丹明标记纤连蛋白Cytoskeleton, Inc.FNR01浓度：10 µg/mL
Alexa 488 标记二抗，山羊抗小鼠 IgG1 (H)Molecular ProbesA21121稀释比例：1/300
Alexa 555 标记二抗，山羊抗小鼠 IgG1 (H)Molecular ProbesA21127稀释比例：1/300
旋涂仪Leurell Technologies Corporation型号 WS-650MZ-23NPPB
SYLGARD 184 硅橡胶弹性体试剂盒DOW1673921
TCS SP8X 共聚焦显微镜Leica Microsystems
十三氟-（1,1,2,2-四氢辛基）三氯硅烷ABCRAB111444
TrypLE Express 酶（1x），无酚红Gibco12604013
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红Gibco25300054

参考文献

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