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Bioengineering

त्रि-आयामी सेल संस्कृति सब्सट्रेट के यूवी-फोटोपैटर्निंग द्वारा मल्टीक्यू सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट की पीढ़ी

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63988
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems, Eindhoven University of Technology

Summary

परंपरागत रूप से, सेल संस्कृति प्लानर सब्सट्रेट पर की जाती है जो विवो में कोशिकाओं के प्राकृतिक वातावरण की खराब नकल करती है। यहां हम शारीरिक रूप से प्रासंगिक घुमावदार ज्यामिति और माइक्रोपैटर्न्ड बाह्य प्रोटीन के साथ सेल संस्कृति सब्सट्रेट का उत्पादन करने की एक विधि का वर्णन करते हैं, जिससे इन बाह्य संकेतों के सेलुलर संवेदन में व्यवस्थित जांच की अनुमति मिलती है।

Abstract

बाह्य मैट्रिक्स सेल फ़ंक्शन का एक महत्वपूर्ण नियामक है। सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट में मौजूद पर्यावरणीय संकेत, जैसे कि लिगैंड वितरण और ऊतक ज्यामिति, सेल फेनोटाइप और व्यवहार को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए तेजी से दिखाए गए हैं। हालांकि, इन पर्यावरणीय संकेतों और कोशिकाओं पर उनके प्रभावों का अक्सर इन विट्रो प्लेटफार्मों का उपयोग करके अलग से अध्ययन किया जाता है जो व्यक्तिगत संकेतों को अलग करते हैं, एक रणनीति जो कई संकेतों की विवो स्थिति में जटिल को भारी रूप से सरल बनाती है। इंजीनियरिंग दृष्टिकोण इस अंतर को पाटने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकते हैं, प्रयोगात्मक सेटअप विकसित करके जो इन विवो माइक्रोएन्वायरमेंट की जटिलता को पकड़ते हैं, फिर भी इन विट्रो सिस्टम की सटीकता और मैनिपुलेबिलिटी की डिग्री को बनाए रखते हैं।

यह अध्ययन पराबैंगनी (यूवी) आधारित प्रोटीन पैटर्निंग और लिथोग्राफी-आधारित सब्सट्रेट माइक्रोफैब्रिकेशन के संयोजन के दृष्टिकोण पर प्रकाश डालता है, जो एक साथ बहु-प्रवाह वातावरण में सेल व्यवहार में उच्च-थ्रूपुट जांच को सक्षम करता है। मास्कलेस यूवी-फोटोपैटर्निंग के माध्यम से, चिप्स पर त्रि-आयामी (3 डी) सेल संस्कृति सब्सट्रेट पर जटिल, चिपकने वाला प्रोटीन वितरण बनाना संभव है जिसमें विभिन्न प्रकार के अच्छी तरह से परिभाषित ज्यामितीय संकेत होते हैं। प्रस्तावित तकनीक को विभिन्न बहुलक सामग्रियों से बने संस्कृति सब्सट्रेट के लिए नियोजित किया जा सकता है और प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला के चिपकने वाले पैटर्न वाले क्षेत्रों के साथ जोड़ा जा सकता है। इस दृष्टिकोण के साथ, एकल कोशिकाओं, साथ ही मोनोलेयर, पैटर्न वाले सब्सट्रेट द्वारा प्रस्तुत ज्यामितीय संकेतों और संपर्क मार्गदर्शन संकेतों के संयोजन के अधीन किया जा सकता है। चिप सामग्री, प्रोटीन पैटर्न और सेल प्रकारों के संयोजन का उपयोग करके व्यवस्थित अनुसंधान इस प्रकार बहुउपस्थित्व के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं में मौलिक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।

Introduction

विवो में, कोशिकाओं को विभिन्न प्रकार के पर्यावरणीय संकेतों के अधीन किया जाता है जो यांत्रिक, भौतिक और जैव रासायनिक प्रकृति के हो सकते हैं जो बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) से उत्पन्न होते हैं। सेल व्यवहार के विनियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए कई पर्यावरणीय संकेतों की पहचान की गई है, जैसे प्रसार, भेदभाव और प्रवासन 1,2,3,4,5। सबसे व्यापक रूप से जांच की गई घटनाओं में से एक संपर्क मार्गदर्शन है, जो बाह्य सब्सट्रेट 6,7,8,9,10,11 पर मौजूद अनिसोट्रोपिक जैव रासायनिक या स्थलाकृतिक पैटर्न के साथ आसंजन-मध्यस्थता सेल संरेखण का वर्णन करता है। कोशिकाओं के संरेखण को निर्देशित करने से परे, संपर्क मार्गदर्शन संकेतों को अन्य सेल गुणों जैसे सेल माइग्रेशन, इंट्रासेल्युलर प्रोटीन के संगठन, सेल आकार और सेल भाग्य12,13,14,15 को प्रभावित करने के लिए भी दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, 3 डी सेलुलर पर्यावरण की ज्यामितीय वास्तुकला को सेल व्यवहार16,17 पर इसके नियामक प्रभाव के लिए भी स्वीकार किया गया है। मानव शरीर में, कोशिकाओं को माइक्रोस्केल कोलेजन फाइबर, केशिकाओं और ग्लोमेरुली से लेकर मेसोस्केल एल्वियोली और धमनियों18,19 तक घुमावदार ज्यामिति की एक श्रृंखला के संपर्क में लाया जाता है। दिलचस्प बात यह है कि हाल के इन विट्रो अध्ययनों से पता चला है कि कोशिकाएं नैनो से मेसोस्केल20,21,22,23 तक ऐसे भौतिक संकेतों को समझ सकती हैं और प्रतिक्रिया दे सकती हैं।

आज तक, पर्यावरणीय संकेतों के लिए सेल प्रतिक्रिया की जांच करने वाले अधिकांश अध्ययन बड़े पैमाने पर प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग करके किए गए हैं जो एकल संकेतों को अलग करते हैं। हालांकि इस दृष्टिकोण ने पर्यावरणीय संकेतों के सेलुलर संवेदन के पीछे बुनियादी तंत्र को समझने में जबरदस्त प्रगति की अनुमति दी है, यह विवो पर्यावरण में खराब रूप से पुनरावृत्ति करता है जो एक साथ कई संकेत प्रस्तुत करता है। इस अंतर को पाटने के लिए, संस्कृति प्लेटफार्मों को विकसित करना उपयोगी है जिससे कई पर्यावरणीय संकेतों को स्वतंत्र रूप से और एक साथ नियंत्रित किया जा सकता है। मैट्रिक्स कठोरता और लिगैंड घनत्व 26,27,28,29, सब्सट्रेट कठोरता और सरंध्रता 30, सब्सट्रेट कठोरता और 3 डी माइक्रोनिच वॉल्यूम 31, सतह स्थलाकृति और संपर्क-मार्गदर्शन संकेत 32,33,34 के संयोजन के साथ इस अवधारणा ने हाल ही में 24,25 बढ़ते कर्षण प्राप्त किए हैं , और मेसोस्केल वक्रता मार्गदर्शन संकेतों के साथ नैनोस्केल संपर्क-मार्गदर्शन संकेत23. हालांकि, नियंत्रित और उच्च-थ्रूपुट तरीके से विभिन्न प्रकार के 3 डी ज्यामिति के साथ संपर्क-मार्गदर्शन संकेतों को संयोजित करना चुनौतीपूर्ण बना हुआ है।

यह शोध प्रोटोकॉल इस चुनौती को संबोधित करता है और ईसीएम प्रोटीन (संपर्क-मार्गदर्शन संकेत) और सब्सट्रेट वक्रता (ज्यामितीय संकेत) के पैटर्न वाले चिपकने वाले क्षेत्रों के नियंत्रित संयोजन के साथ सेल संस्कृति सब्सट्रेट बनाने के लिए एक विधि का परिचय देता है। यह दृष्टिकोण एक व्यवस्थित और उच्च थ्रूपुट तरीके से बायोमिमेटिक मल्टीक्यू वातावरण में सेल प्रतिक्रिया के विच्छेदन की अनुमति देता है। प्राप्त ज्ञान जटिल वातावरण में सेल व्यवहार की आगे की समझ में सहायता कर सकता है और इसका उपयोग उन गुणों के साथ शिक्षाप्रद सामग्रियों को डिजाइन करने के लिए किया जा सकता है जो सेल प्रतिक्रियाओं को वांछित परिणाम में चलाते हैं।

3 डी प्रोटीन फोटोपैटर्निंग
सेल संस्कृति सामग्री पर ईसीएम प्रोटीन (संपर्क-मार्गदर्शन संकेत) के चिपकने वाले क्षेत्रों का निर्माण विभिन्न तकनीकों का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, गहरे पराबैंगनी (गहरे-यूवी) पैटर्निंग या माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग35,36 द्वारा। डीप-यूवी पैटर्निंग यूवी-लाइट का उपयोग करता है जिसे सेल कल्चर सब्सट्रेट पर विशिष्ट स्थानों पर निष्क्रिय पॉलिमर को नीचा दिखाने के लिए बहुलक सामग्री पर एक मुखौटा के माध्यम से अनुमानित किया जाता है। पैटर्न वाले सब्सट्रेट को तब ब्याज के लिगैंड के साथ ऊष्मायन किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप चिपकने वाले क्षेत्र होते हैं जो पूर्वनिर्धारित स्थानों 12,37,38 पर सेल लगाव और संस्कृति का समर्थन करते हैं। प्रोटीन पैटर्न को पेश करने का एक वैकल्पिक तरीका माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग के माध्यम से है, जहां वांछित आकार वाले इलास्टोमेरिक टिकटों को पसंद के प्रोटीन के साथ लेपित किया जाता है और सेल कल्चर सब्सट्रेट पर दबाया जाता है, जिससे प्रोटीन कोटिंग को स्थानांतरित किया जाता है जिसमें कोशिकाएं 35,37,39,40 का पालन कर सकती हैं . दुर्भाग्य से, चूंकि दोनों तकनीकें मुखौटा तैयारी और नरम लिथोग्राफी विधियों पर भरोसा करती हैं, इसलिए प्रयोग समय लेने वाली और श्रम-गहन हैं, साथ ही पैटर्न लचीलेपन के मामले में सीमित हैं। इसके अलावा, डीप-यूवी पैटर्निंग और माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग दोनों प्लानर सामग्रियों के लिए सबसे उपयुक्त हैं और तकनीकी रूप से कठिन हैं, यदि असंभव नहीं है, तो 3 डी वातावरण में लिगेंड को पैटर्न करने के लिए।

इन पारंपरिक तरीकों में सुधार करने के लिए, वाटरकोट एट अल संयुक्त मास्कलेस लिथोग्राफी, रासायनिक वाष्प जमाव, और थर्मोफॉर्मिंग माइक्रोपैटर्न 3 डी पॉलिमरिक सब्सट्रेट41 उत्पन्न करने के लिए। हालांकि, यह तकनीक थर्मोफॉर्मेबल बहुलक फिल्मों के उपयोग पर निर्भर करती है और कम प्रोटीन-पैटर्न रिज़ॉल्यूशन (7.5 μm) प्रदान करती है, जबकि कोशिकाओं को ज्यामितीय प्रोटीन पैटर्न का जवाब देने के लिए 0.1 μm2,42 के रूप में छोटे होने की सूचना दी गई है। सेवसिक एट अल नैनो- और माइक्रोमीटर टोपोग्राफी वाले सब्सट्रेट पर नैनोपैटर्न ईसीएम लिगेंड के लिए एक और आशाजनक विधिका वर्णन किया 43. माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग का उपयोग करते हुए, ईसीएम प्रोटीन को पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) टिकटों से थर्मोरेस्पॉन्सिव पॉली (एन-आइसोप्रोपाइलाक्रिलामाइड) (पीएनआईपीएएम) सब्सट्रेट में स्थानांतरित किया गया था। इसके बाद, पीएनआईपीएएम नेटवर्क की थर्मोरेस्पॉन्सिव संपत्ति ने उन्हें स्थलाकृतिक पीडीएमएस सब्सट्रेट (10-100 μm गहरे खांचे) में द्वि-आयामी (2 डी) प्रोटीन पैटर्न को स्थानांतरित करने की अनुमति दी, जिससे स्थलाकृतिक विशेषताओं पर आसंजन साइटों के स्थानीयकरण को नियंत्रित किया जा सके। हालांकि, सभी संभव माइक्रोटोपोग्राफी को पैटर्न नहीं किया जा सकता है क्योंकि गीलेपन के मुद्दों में कमी से गहरे स्थलाकृतिक सब्सट्रेट को पैटर्न करना अधिक कठिन हो जाता है। 2.4 की गहराई से चौड़ाई पहलू अनुपात के साथ खाइयों को स्थलाकृतिक सब्सट्रेट43 में पैटर्न को सफलतापूर्वक स्थानांतरित करने की अंतिम सीमा होने की सूचना दी गई है। इसके अतिरिक्त, माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग की आवश्यकता के कारण अलग-अलग पैटर्न का लचीलापन और उत्पन्न पैटर्न का रिज़ॉल्यूशन खराब है।

यह पेपर एक ऐसी विधि का वर्णन करता है जो उपर्युक्त बाधाओं को दूर करता है और मल्टीक्यू सब्सट्रेट बनाने के लिए एक लचीली और उच्च-थ्रूपुट विधि प्रदान करता है जिसका उपयोग सेल संस्कृति के लिए किया जा सकता है ( चित्र 1 देखें)। शारीरिक रूप से प्रासंगिक ज्यामिति (सिलेंडर, गुंबद, दीर्घवृत्त, और काठी सतहों) से लेकर वक्रता के साथ ऽ = 1/2500 से ॐ = 1/125 μm-1 पीडीएमएस चिप्स में पूर्व-डिज़ाइन और माइक्रोफैब्रिकेटेड हैं। इसके बाद, संपर्क-मार्गदर्शन संकेत 1.5 μm44 के रूप में छोटे रिज़ॉल्यूशन के साथ एक फोटोपैटर्निंग तकनीक को नियोजित करके विभिन्न डिजिटल पैटर्न डिज़ाइनों का उपयोग करके 3 डी ज्यामिति के शीर्ष पर बनाए जाते हैं। यह अंत करने के लिए, पीडीएमएस चिप्स शुरू में कोशिकाओं और प्रोटीन का पालन करने से रोकने के लिए निष्क्रिय कर रहे हैं; इस निष्क्रियता परत को तब फोटोइनिशिएटर 4-बेंज़ोयलबेंजाइल-ट्राइमेथिलामोनियम क्लोराइड (पीएलपीपी) और यूवी-लाइट एक्सपोजर45 के संयोजन से हटाया जा सकता है। एक डिजिटल मास्क को यूवी-एक्सपोजर के स्थानों को निर्दिष्ट करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, और इस प्रकार, वह क्षेत्र जहां निष्क्रियता परत को हटा दिया जाता है। प्रोटीन बाद में इन क्षेत्रों का पालन कर सकते हैं, जिससे कोशिका लगाव सक्षम हो सकता है। चूंकि पैटर्निंग एक डिजिटल (भौतिक के बजाय) मास्क का उपयोग करके किया जाता है, इसलिए अतिरिक्त फोटोमास्क को डिजाइन करने और बनाने से जुड़ी परेशानी और लागत के बिना विभिन्न प्रकार के पैटर्न जल्दी से बनाए जा सकते हैं। इसके अलावा, ईसीएम प्रोटीन की एक विविध श्रृंखला (जैसे, कोलेजन प्रकार मैं, जिलेटिन, और फाइब्रोनेक्टिन) सब्सट्रेट पर पैटर्न किया जा सकता है। यद्यपि यह प्रोटोकॉल पीडीएमएस से बने सेल संस्कृति चिप्स का उपयोग करके किया जाता है, सिद्धांत को ब्याज की किसी भी अन्य सामग्री पर लागू किया जा सकताहै 46.

Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित अध्ययनों में, प्राथमिक मानव केराटोसाइट्स का उपयोग किया गया था। यह शोध हेलसिंकी की घोषणा के सिद्धांतों के अनुपालन में किया गया था। प्राथमिक केराटोसाइट्स को डेसेमेट मेम्ब्रेन एंडोथेलियल केराटोप्लास्टी सर्जरी से बचे हुए मानव कैडेवरिक कॉर्नियोस्क्लेरल ऊतकों से अलग किया गया था, जो सभी मृतक दाताओं के परिजनों से सहमति प्राप्त करने के बाद ईटीबी-बिस्लाइफ मल्टी-टिशू सेंटर (बेवरविजक, नीदरलैंड) के कॉर्निया विभाग से प्राप्त किए गए थे।

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों, उपकरणों और सॉफ़्टवेयर के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. 3 डी सेल संस्कृति सब्सट्रेट का निर्माण

  1. ब्याज की सभी विशेषताओं से युक्त एक नकारात्मक ग्लास मोल्ड (# 1) बनाएं, इस मामले में, एक फेम्टोसेकंड-लेजर डायरेक्ट-राइट तकनीक का उपयोग करके ग्लास से बना है ( चित्रा 2 देखें)।
  2. ध्यान से पेट्री डिश के तल पर नकारात्मक ग्लास मोल्ड (# 1) रखें।
  3. एक पैमाने पर एक खाली 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब रखकर एक पीडीएमएस प्रीपोलिमर तैयार करें, पैमाने को तारे करें, और ट्यूब में सिलिकॉन इलास्टोमर बेस की वांछित मात्रा डालें।
  4. पाश्चर पिपेट का उपयोग करके इलाज एजेंट जोड़ें ताकि इलास्टोमर बेस और इलाज एजेंट का अंतिम अनुपात 10: 1 (डब्ल्यू /
  5. एक स्पैटुला का उपयोग करके शंक्वाकार ट्यूब में घटकों को अच्छी तरह से मिलाएं।
  6. सभी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 70 एस के लिए 2,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  7. इसे पूरी तरह से कवर करने के लिए पेट्री डिश में नकारात्मक ग्लास मोल्ड (# 1) के शीर्ष पर पीडीएमएस प्रीपोलिमर डालें।
  8. वैक्यूम डिसिकेटर में नकारात्मक ग्लास मोल्ड (# 1) और पीडीएमएस प्रीपोलिमर के साथ पेट्री डिश रखें और वैक्यूम पंप शुरू करें। एक बार वैक्यूम तक पहुंचने के बाद, मोल्ड सतह और पीडीएमएस प्रीपोलिमर के बीच इंटरफ़ेस पर मौजूद सभी बुलबुले को हटाने के लिए 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  9. वैक्यूम निकालें और पेट्री डिश को डिसिकेटर से बाहर निकालें।
  10. 65 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रात भर पीडीएमएस प्रीपोलिमर का इलाज करें।
  11. स्पैटुला का उपयोग करके पीडीएमएस के किनारों को उठाकर नकारात्मक ग्लास मोल्ड (# 1) से नए ठीक सकारात्मक पीडीएमएस चिप (# 2) को सावधानीपूर्वक हटा दें। यदि सकारात्मक पीडीएमएस चिप (# 2) नकारात्मक ग्लास मोल्ड (# 1) से चिपक जाती है, तो उठाते समय छाप के किनारों पर इथेनॉल या पानी जोड़ें।
    नोट: तरल पदार्थ दो परतों के बीच चलेगा और नकारात्मक ग्लास मोल्ड (# 1) और सकारात्मक पीडीएमएस चिप (# 2) के पृथक्करण को कम करेगा।
  12. ब्लेड का उपयोग करके, सकारात्मक पीडीएमएस चिप (# 2) के किनारों को काट लें ताकि एक आयताकार चिप बनी रहे।
  13. सकारात्मक पीडीएमएस चिप (# 2) को ट्राइडेकाफ्लोरो (1,1,2,2-टेट्राहाइड्रोक्टिल) ट्राइक्लोरोसिलेन, एक सिलेनाइजेशन एजेंट की एक बूंद के साथ एक छोटी शीशी के बगल में एक डिसिकेटर में रखें, और रात भर वैक्यूम के नीचे छोड़ दें।
    नोट: सिलानाइजेशन यह सुनिश्चित करेगा कि छाप प्रोटोकॉल में बाद में अन्य पीडीएमएस परतों से नहीं बंधेगी। अन्य सिलेनाइजेशन एजेंट और / या विधियां यह सुनिश्चित करने के लिए भी काम कर सकती हैं कि पीडीएमएस चिप्स की सतहें अन्य पीडीएमएस परतों से चिपक नहीं जाएंगी।
    सावधानी: ट्राइडेकाफ्लोरो (1,1,2,2-टेट्राहाइड्रोक्टिल) ट्राइक्लोरोसिलेन ज्वलनशील (एच 226) है और गंभीर त्वचा जलने और आंखों की क्षति (एच 314) का कारण बनता है। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें, एक धूआं हुड में काम करें, और हैंडलिंग के बाद हाथों को अच्छी तरह से धो लें। सिलानाइजेशन एजेंट को गर्मी, गर्म सतहों, चिंगारी, खुली लपटों और अन्य प्रज्वलन स्रोतों से दूर रखें। 15 और 30 डिग्री सेल्सियस (पी 280, पी 210, पी 240, पी 403, पी 235, पी 310) के बीच स्टोर करें।
  14. वैक्यूम निकालें और पेट्री डिश के तल पर सकारात्मक पीडीएमएस चिप (# 2) रखें। कई नकारात्मक पीडीएमएस मोल्ड्स (# 3) का उत्पादन करने के लिए शीर्ष पर पीडीएमएस प्रीपोलिमर (10: 1) डालो।
  15. सभी बुलबुले को हटाने के लिए 15 मिनट के लिए डिसिकेटर में वैक्यूम के तहत पेट्री डिश रखो।
  16. पीडीएमएस प्रीपोलिमर को रात भर 65 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें, जिसके बाद नकारात्मक पीडीएमएस मोल्ड (# 3) को स्पैटुला का उपयोग करके सकारात्मक पीडीएमएस चिप (# 2) से छीला जा सकता है।
  17. रात भर वैक्यूम डिसिकेटर में सिलानाइजेशन एजेंट का उपयोग करके अंतिम नकारात्मक पीडीएमएस मोल्ड (# 3) को सिलेनाइज करें।
  18. नकारात्मक पीडीएमएस मोल्ड (# 3) में पीडीएमएस प्रीपोलिमर डालकर लगभग 5 मिमी मोटाई के कई सेल संस्कृति चिप्स (# 4, चित्रा 2 देखें) का उत्पादन करें, डिसिकेटर का उपयोग करके बुलबुले को हटादें और 65 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए इलाज करें। एक रेजर ब्लेड के साथ, चित्रा 2 में कल्पना के रूप में अंतिम आकार के लिए चिप काट लें। चिप्स को कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    नोट: सतह खुरदरापन सेलुलर प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकता है। यदि आवश्यक हो, तो पीडीएमएस की एक अतिरिक्त पतली परत का उपयोग सतह को चिकना करने के लिए सकारात्मक पीडीएमएस चिप (# 2) पर कोटिंग के रूप में किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, चिप पर पीडीएमएस प्रीपॉलिमर की एक छोटी बूंद डालें और दबाव वाली हवा का उपयोग करके इसे पूरी चिप पर फैलाएं। 3 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर लेपित चिप का इलाज करें और चरण 1.12 के साथ जारी रखें।

2. फ्लैट पीडीएमएस नमूनों का निर्माण (नियंत्रण नमूने)

  1. चरण 1.3-1.6 के अनुसार पीडीएमएस प्रीपोलिमर (10: 1) तैयार करें।
  2. स्पिन कोटर के केंद्र में गोल वैक्यूम पोस्ट पर एक ग्लास कवरस्लिप रखें।
  3. मशीन में ग्लास कवरस्लिप संलग्न करने के लिए वैक्यूम चालू करें और पाश्चर पिपेट का उपयोग करके कवरस्लिप के बीच में पीडीएमएस की एक बूंद को पाइप करें।
  4. लगभग 10 μm मोटी परत प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके ग्लास सब्सट्रेट पर पीडीएमएस प्रीपोलिमर वितरित करें।
    1. 0.45 × ग्राम पर 10 एस के लिए स्पिनकोट, त्वरण: 0.2 × जी /
    2. 44.8 × ग्राम पर 50 एस के लिए स्पिनकोट, त्वरण: 0.54 × जी /
  5. वैक्यूम बंद करें, चिमटी का उपयोग करके स्पिन कोटर से कवरस्लिप को हटा दें, और इसे पेट्री डिश में रखें। 65 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रात भर पीडीएमएस का इलाज करें और बाद में कमरे के तापमान पर स्टोर करें।

3. 3 डी सेल संस्कृति सब्सट्रेट के सब्सट्रेट निष्क्रियता

  1. ओ 2-प्लाज्मा का उपयोग करके पीडीएमएस चिप (# 4) की सतह पर हाइड्रॉक्सिलसमूहों को सक्रिय करें। चिमटी का उपयोग करके, चिप को प्लाज्मा एशर की टोकरी में रखें।
  2. 30 एस के लिए 20 डब्ल्यू की शक्ति का उपयोग करके एक ऐशिंग चक्र चलाएं। एन2 का उपयोग करके ऐशिंग चैंबर को वेंट करें।
  3. चिप को टोकरी से बाहर निकालें और इसे एक छोटे पीडीएमएस कंटेनर में रखें ( चित्र 1 देखें)।
  4. पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, चिप के शीर्ष पर पॉली-एल-लाइसिन (पीएलएल, 0.01%) के 500 μL जोड़ें ताकि पूरी सतह पीएलएल समाधान में डूब जाए। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. एक पिपेट के साथ सेल संस्कृति चिप से पीएलएल के 450 μL निकालें और चिप सतह को 0.1 एम एचईपीईएस बफर (8 < पीएच < 8.5) के 500 μL के साथ तीन बार कुल्लाएं। नमूने से सूखने से बचने के लिए पीडीएमएस चिप पर हमेशा तरल की एक छोटी मात्रा छोड़ दें, जो अंतिम पैटर्न की गुणवत्ता को कम कर देगा।
  6. एमएल मेथॉक्सीपॉलीथिलीन ग्लाइकोल-सक्सिनिमिडिल वैलेरेट (एमपीईजी-एसवीए) के 500 μL बनाएं; सेल संस्कृति चिप प्रति 0.1 एम एचईपीईएस बफर (8 < पीएच < 8.5) में मेगावाट 5,000 डीए) समाधान और इसे 60 मिनट के लिए नमूने पर इनक्यूबेट करने दें। चूंकि एमपीईजी-एसवीए में 15 मिनट का आधा जीवन है, इसलिए उपयोग से ठीक पहले आवश्यक राशि तैयार करना सुनिश्चित करें।
    नोट: समाधान पूरी तरह से पारदर्शी होने पर एमपीईजी-एसवीए भंग हो जाता है।
  7. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके एमपीईजी-एसवीए समाधान के 450 μL निकालें, और फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ चिप सतह को पांच बार धो लें। सभी अनबाउंड एमपीईजी-एसवीए को हटा दिया गया है, यह सुनिश्चित करने के लिए प्रति धोने में कई बार ऊपर और नीचे पाइप करना सुनिश्चित करें। नमूने को सूखने से रोकने के लिए, धोने के चरणों के बीच के समय को कम करें और धोने के लिए पीबीएस के अतिरिक्त (500 μL या अधिक) का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
  8. उन्हें पीबीएस में विसर्जित करके नमूनों को स्टोर करें या प्रोटोकॉल के पैटर्निंग चरण को जारी रखें।
    नोट: यदि वांछित है, तो संस्कृति कैबिनेट में काम करते समय और बाँझ समाधान और उपकरणों के साथ काम करते समय बाँझ परिस्थितियों में निष्क्रियता की जा सकती है।

4. पैटर्न सेल संस्कृति सब्सट्रेट का भंडारण

नोट: 3 डी सेल संस्कृति सब्सट्रेट प्रक्रिया में विभिन्न चरणों के दौरान संग्रहीत किया जा सकता है।

  1. कमरे के तापमान पर शुष्क परिस्थितियों में ठीक पीडीएमएस सेल संस्कृति चिप्स स्टोर करें।
  2. निष्क्रिय सेल संस्कृति चिप्स को इन दो तरीकों में से एक में स्टोर करें:
    1. 7 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में स्टोर करें।
    2. कई महीनों तक शुष्क परिस्थितियों में स्टोर करें। शुष्क नमूने प्राप्त करने के लिए, पीबीएस को हटा दें और डबल आसुत जल (डीडीएच2ओ) का उपयोग करके कई बार कुल्ला करें। नाइट्रोजन- या एयर-गन का उपयोग करके ब्लो-ड्राई।

5. फोटोपैटर्निंग के लिए उपयोग किए जाने वाले डिजिटल मास्क का डिजाइन

नोट: 3 डी सब्सट्रेट की पैटर्निंग एक एकल या एकाधिक फोकल विमानों का उपयोग करके किया जा सकता है ( चित्रा 3 देखें)। एक एकल फोकल प्लेन का उपयोग उन विशेषताओं पर किया जा सकता है जो एक डिजिटल मिरर डिवाइस (डीएमडी, लगभग 300 μm x 500 μm) से बड़े नहीं हैं और जो बहुत लंबा (50-100 μm) नहीं हैं। उस स्थिति में, टीआईएफएफ-मोड का उपयोग करके एक डिजिटल पैटर्न डिज़ाइन करें। उन विशेषताओं के लिए जो एक डीएमडी के आयामों से अधिक हैं और अपेक्षाकृत लंबे हैं, सब्सट्रेट के पैटर्निंग को कई चरणों में विभाजित करें। इस मामले में, पीडीएफ-मोड का उपयोग करके कई पैटर्न डिज़ाइन किए गए हैं जो सभी व्यक्तिगत रूप से एकल फोकल विमानों पर ध्यान केंद्रित करते हैं।

  1. डिजाइन सॉफ्टवेयर टूल का उपयोग करके एक डिजिटल मास्क डिज़ाइन करें।
    1. टीआईएफएफ-मोड (पिक्सेल) में पैटर्निंग: 1,140 x 1,824 पिक्सेल (1 डीएमडी का सटीक आकार, लगभग 300 μm x 500 μm) का पूरी तरह से काला आर्टबोर्ड बनाएं और आर्टबोर्ड को ब्याज के आकार से भरें। आर्टबोर्ड को 8-बिट TIFF-फ़ाइल के रूप में निर्यात करें।
      नोट: पैटर्न डिजाइन में विभिन्न ग्रे स्तर उस स्थान पर किए जाने वाले एक्सपोजर की मात्रा निर्धारित करते हैं।
    2. पीडीएफ मोड (मीट्रिक इकाइयों) में पैटर्निंग: मिमी में वांछित आकार का एक काला आर्टबोर्ड बनाएं और आर्टबोर्ड को ब्याज के किसी भी आकार से भरें। यदि 3 डी सब्सट्रेट को कई फोकल विमानों का उपयोग करके पैटर्न करने की आवश्यकता है तो पैटर्न को कई फ़ाइलों में विभाजित करें। आर्टबोर्ड को पीडीएफ-फाइल के रूप में सहेजें।
      नोट: पैटर्न डिजाइन में विभिन्न ग्रे स्तर उस स्थान पर किए जाने वाले एक्सपोजर की मात्रा निर्धारित करते हैं।

6. 3 डी सेल संस्कृति सब्सट्रेट के यूवी-फोटोपैटर्निंग

  1. अंशांकन
    नोट: ब्याज की सामग्री पर उचित ध्यान केंद्रित करने के लिए लेजर का अंशांकन किया जाता है। चूंकि पीडीएमएस सेल संस्कृति सब्सट्रेट पैटर्न के माध्यम से बहुत मोटे हैं, इसलिए एक ग्लास स्लाइड का उपयोग करें जिस पर चिप को उल्टा रखा गया है। चूंकि लेजर पहले ग्लास स्लाइड का सामना करता है, इसलिए लेजर को कैलिब्रेट करने के लिए ग्लास का उपयोग करें।
    1. एक ग्लास कवरस्लिप पर फ्लोरोसेंट हाइलाइटर लागू करें और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के चरण में ग्लास कवरस्लिप रखें। सुनिश्चित करें कि हाइलाइट की गई सतह ऊपर की ओर सामना कर रही है।
    2. माइक्रोस्कोप और प्राइमो उपकरण पर स्विच करें और 'प्लगइन्स' के तहत लियोनार्डो सॉफ्टवेयर तक पहुंचने के लिए माइक्रो-मैनेजर खोलें।
    3. प्रारंभिक मेनू में अंशांकन चुनें, माइक्रोस्कोप और सॉफ्टवेयर दोनों पर 20x उद्देश्य का चयन करने के बाद। नेक्स्ट पर क्लिक करें।
    4. माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल पथ में फ्लोरोसेंट हाइलाइटर के साथ ग्लास स्लाइड रखें। फ्लोरोसेंट मोड पर स्विच करें और दिखाई देने वाली प्राइमो छवि पर ध्यान केंद्रित करें, यह सुनिश्चित करें कि लोगो और टेक्स्ट दोनों फोकस में हैं। अंशांकन प्रक्रिया समाप्त करने के लिए अगला पर क्लिक करें।
    5. कैलिब्रेट करते समय चरण के जेड-स्थान को लिखें और प्रोटोकॉल में बाद में संदर्भ के रूप में इस स्थान का उपयोग करें।
      नोट: अंशांकन सामग्री प्रोटोकॉल में बाद में पैटर्निंग के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्री से मेल खाना चाहिए। उपरोक्त चरण सेल संस्कृति सब्सट्रेट के लिए आवश्यक अंशांकन का वर्णन करते हैं। फ्लैट पीडीएमएस नियंत्रण नमूनों के अंशांकन के लिए, एक अतिरिक्त फ्लैट पीडीएमएस नमूने के शीर्ष पर फ्लोरोसेंट हाइलाइटर लागू करें और चरण 6.1.2-6.1.5 का उपयोग करके कैलिब्रेट करें।
  2. एक एकल फोकल विमान का उपयोग करके पैटर्निंग 3 डी सुविधाएँ
    नोट: एक एकल फोकल विमान का उपयोग करके पैटर्निंग 3 डी सुविधाओं पर की जाती है जो एक डीएमडी (लगभग 300 μm x 500 μm) के आयामों से अधिक नहीं होती है। फोकल प्लेन सेटअप का एक योजनाबद्ध चित्रा 3 में सचित्र है।
    1. मंच से अंशांकन स्लाइड निकालें और मंच में फोटोइनिशिएटर (पीएलपीपी) की एक बूंद (~ 50 μL) युक्त एक ग्लास स्लाइड रखें।
      सावधानी: पीएलपीपी आंखों, श्वसन प्रणाली और त्वचा (आर 36-38) के लिए परेशान है। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें, इसे विस्फोटक सामग्री से दूर रखें, इस उत्पाद में कभी भी पानी न जोड़ें, स्थिर निर्वहन के खिलाफ एहतियाती उपाय करें, और सदमे और घर्षण (एस 26-36) से बचें।
    2. फोटोइनिशिएटर की बूंद में पीडीएमएस सेल संस्कृति सब्सट्रेट को उल्टा रखें। सुनिश्चित करें कि सेल संस्कृति सब्सट्रेट की सतह पर 3 डी विशेषताएं ग्लास स्लाइड का सामना करती हैं और उचित पैटर्निंग सुनिश्चित करने के लिए पीएलपीपी में पूरी तरह से डूबी हुई हैं।
    3. सॉफ़्टवेयर में पैटर्न का चयन करें।
    4. माइक्रोस्कोप पर ब्राइटफील्ड मोड पर स्विच करें और मंच को ब्याज की सुविधा में ले जाएं।
    5. क्रमशः उत्तल और अवतल संरचनाओं के ऊपर या नीचे ध्यान केंद्रित करें (चित्रा 3)।
    6. पसंद का एक पैटर्न सम्मिलित करने के लिए प्राइमो का चयन करें। लाइव ब्राइटफील्ड छवि के शीर्ष पर नारंगी में पैटर्न पूर्वावलोकन का निरीक्षण करें।
    7. सुविधा (स्थान, कोण, पुनरावृत्ति) के अनुसार पैटर्निंग सेटिंग्स समायोजित करें और 1,000 एमजे / मिमी2 की खुराक का चयन करें।
    8. लॉक पर क्लिक करें और फ्लोरोसेंट मोड के लिए माइक्रोस्कोप स्विच।
    9. पैटर्निंग शुरू करने के लिए स्क्रीन के दाईं ओर प्ले बटन पर क्लिक करें। एक बार समाप्त होने के बाद, हरे रंग में प्रदर्शित पैटर्न का निरीक्षण करें।
    10. एक बार सेल संस्कृति चिप पर सभी सुविधाओं के साथ समाप्त हो जाने के बाद, पैटर्निंग स्लाइड से चिप को हटा दें और 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में स्टोर करें।
  3. कई फोकल विमानों का उपयोग करके 3 डी सुविधाओं को पैटर्न करना
    नोट: कई फोकल विमानों का उपयोग करपैटर्निंग 3 डी सुविधाओं पर किया जाता है जो एक डीएमडी (लगभग 300 μm x 500 μm) से बड़े होते हैं या अपेक्षाकृत लंबे होते हैं। इस मामले में, 3 डी सुविधाओं को कई चरणों में पैटर्न करने की आवश्यकता है, अर्थात, पैटर्न डिजाइन को चित्रा 3 में उदाहरण के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए।
    1. मंच से अंशांकन स्लाइड निकालें और मंच में फोटोइनिशिएटर (पीएलपीपी) की एक बूंद (~ 50 μL) युक्त एक ग्लास स्लाइड रखें।
    2. चिमटी का उपयोग करके फोटोइनिशिएटर की छोटी बूंद में पीडीएमएस सेल संस्कृति चिप को उल्टा रखें।
    3. सॉफ़्टवेयर में पैटर्न का चयन करें। माइक्रोस्कोप पर ब्राइटफील्ड मोड पर स्विच करें और मंच को ब्याज की सुविधा में ले जाएं।
    4. सही स्थान पर चिप के क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करें। चूंकि पैटर्निंग एक एकल फोकल विमान में की जाती है और विशेषताएं एक डीएमडी से बड़ी होती हैं, इसलिए कई फोकल विमानों का उपयोग करें और इस प्रकार सुविधा की पूरी ऊंचाई और चौड़ाई के साथ पर्याप्त पैटर्न रिज़ॉल्यूशन सुनिश्चित करने के लिए प्रति 3 डी सब्सट्रेट पैटर्निंग के कई राउंड का उपयोग करें ( चित्रा 3 देखें)। उदाहरण के लिए, 150 μm की ऊंचाई वाली सुविधा के लिए, सुविधा के नीचे से 25 μm, 75 μm और 125 μm के आसपास ध्यान केंद्रित करते हुए, तीन राउंड (जेड-यात्रा के 50 μm प्रति 1 फोकल प्लेन ±) में सुविधा को पैटर्न करें। सुनिश्चित करें कि सुविधा का निचला भाग चरण 6.1.5 में लिखे गए मान के आसपास है।
    5. पसंद के पैटर्न को सम्मिलित करने के लिए प्राइमो का चयन करें। लाइव ब्राइटफील्ड छवि के शीर्ष पर नारंगी रंग में दिखाए गए पैटर्न पूर्वावलोकन का निरीक्षण करें।
    6. सुविधा (स्थान, कोण) के अनुसार पैटर्निंग सेटिंग्स समायोजित करें और 1,000 एमजे / मिमी2 की खुराक का चयन करें।
    7. लॉक पर क्लिक करें और फ्लोरोसेंट मोड के लिए माइक्रोस्कोप स्विच।
    8. पैटर्निंग शुरू करने के लिए स्क्रीन के दाईं ओर प्ले बटन पर क्लिक करें। एक बार समाप्त होने के बाद, हरे रंग में प्रदर्शित पैटर्न का निरीक्षण करें।
    9. कई फोकल विमानों का उपयोग किए जाने पर ब्याज की सुविधा पर चरण 6.3.4-6.3.8 दोहराएं।
    10. एक बार सेल संस्कृति चिप पर सभी सुविधाओं के साथ समाप्त होने के बाद, पैटर्निंग स्लाइड से चिप को हटा दें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में स्टोर करें।
      नोट: यदि वांछित है, तो बाँझ परिस्थितियों में यूवी-फोटोपैटर्निंग लागू करें, ग्लास-बॉटम पेट्री डिश का उपयोग करें और बाँझ संस्कृति अलमारियाँ में सभी सब्सट्रेट तैयार करें। कुछ हफ्तों तक पीबीएस में पैटर्न वाले नमूनों को स्टोर करें। जब डीडीएच2ओ के साथ धोया जाता है और दबाव वाली हवा का उपयोग करके सुखाया जाता है, तो नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर कुछ महीनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।

7. प्रोटीन इनक्यूबेशन

नोट: सेल संस्कृति के लिए ताजा प्रोटीन-इनक्यूबेटेड सब्सट्रेट का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। केवल प्रोटोकॉल के इस हिस्से के लिए आगे बढ़ें यदि सेल सीडिंग (चरण 8) सीधे बाद में किया जाता है।

  1. संस्कृति कैबिनेट में बाँझ पीडीएमएस कंटेनरों के लिए पैटर्न सेल संस्कृति चिप स्थानांतरित करें।
  2. बाँझ पीबीएस की अधिकता के साथ पैटर्न वाले सेल संस्कृति चिप्स 3x धो लें यदि पैटर्निंग बाँझ परिस्थितियों में नहीं किया गया था।
  3. पीबीएस में एक ताजा प्रोटीन समाधान तैयार करें।
    1. फाइब्रोनेक्टिन: 10 μg / mL की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए रोडामाइन-लेबल वाले फाइब्रोनेक्टिन के 20 μg की शीशी में माइक्रोपिपेट का उपयोग करके पीबीएस के 2 एमएल जोड़ें। प्रोटीन गुच्छों के गठन से बचने और प्रकाश से बचाने के लिए धीरे-धीरे पिपेट करें।
    2. जिलेटिन: भंग जिलेटिन-फ्लोरोसिन के 200 μL विभाज्य पिघलना। प्रकाश से रक्षा करें।
  4. माइक्रोपिपेट का उपयोग करके सेल संस्कृति चिप में प्रोटीन समाधान के 200-500 μL जोड़ें। पसंद के प्रोटीन के आधार पर इनक्यूबेशन समय और तापमान समायोजित करें: फाइब्रोनेक्टिन: कमरे के तापमान पर 5 मिनट, जिलेटिन: 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट। नमूना (उदाहरण के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ) को कवर करना सुनिश्चित करें।
  5. प्रोटीन समाधान निकालें और बाँझ पीबीएस के 500 μL के साथ 5x धो लें। किसी भी अनबाउंड प्रोटीन को हटाने के लिए सेल संस्कृति चिप की सभी प्रासंगिक विशेषताओं के ऊपर पीबीएस को कई बार ऊपर और नीचे पाइप करना सुनिश्चित करें।
    नोट: धोने के चरणों के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि नमूना कभी सूखता नहीं है। धोने के दौरान प्रोटीन समाधान या पीबीएस को हटाते समय, प्रोटीन गुच्छों को बनने से रोकने के लिए तुरंत नए पीबीएस जोड़ें ( चित्रा 4 देखें)। उत्तल विशेषताएं सुखाने के लिए विशेष रूप से संवेदनशील होती हैं क्योंकि वे सब्सट्रेट सतह से ऊपर उठती हैं।
  6. वैकल्पिक: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत प्रोटीन पैटर्न की समीक्षा करें। नमूने बाँझ रखें और पीबीएस में डूबे रहें।

8. सेल बोना

नोट: यह प्रोटोकॉल मानव प्राथमिक केराटोसाइट्स और मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करता है। सामग्री के माध्यमिक उपयोग के लिए डच दिशानिर्देशों के अनुरूप, रोगियों से मानव कॉर्नियल ऊतक से केराटोसाइट्स काटा गया था, और पहले केराटोसाइट्स47 के रूप में विशेषता थी। इन कोशिकाओं को डीएमईएम में 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस), और 1 एमएम एल-एस्कॉर्बिक एसिड 2-फॉस्फेट सेस्क्विनेजियम नमक हाइड्रेट (विटामिन सी) के साथ अधिकतम चार मार्गों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संवर्धित किया जाता है। मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट खरीदे गए और डीएमईएम में सुसंस्कृत किए गए थे, जो अधिकतम 15 मार्गों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% एफबीएस और 1% पी / फोटोपैटर्न सेल कल्चर चिप पर केराटोसाइट्स और त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट दोनों के बीजारोपण के लिए, प्रति चिप 20,000 कोशिकाओं का उपयोग किया गया था।

  1. ब्याज की कोशिकाओं को अलग करें (उदाहरण के लिए, ट्रिप्सिन का उपयोग करके) और प्रति चिप संस्कृति माध्यम में ± 10,000-50,000 कोशिकाओं / एमएल के सेल निलंबन के 1 एमएल तैयार करें। सेल आकार और वांछित रीडआउट के आधार पर प्रति सब्सट्रेट जोड़े गए कोशिकाओं की सटीक संख्या समायोजित करें।
  2. सेल संस्कृति चिप से पीबीएस निकालें और सेल निलंबन के 1 एमएल जोड़ें।
  3. धीरे इनक्यूबेटर के लिए कोशिकाओं के साथ सेल संस्कृति चिप परिवहन और 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के तहत पैटर्न सेल संस्कृति चिप पर कोशिकाओं के आसंजन की जाँच करें। लाइन पैटर्न के मामले में लम्बी सेल आकृति विज्ञान की तलाश करें ( चित्रा 5 देखें)। यदि कोशिकाओं ने पैटर्न वाले क्षेत्र के बाहर भी पालन करना शुरू कर दिया है, तो सब्सट्रेट पर कोशिकाओं के ऊपर सीधे ऊपर और नीचे मध्यम पाइपिंग करके इन्हें हटा दें।
    नोट: पैटर्न वाले क्षेत्र से जुड़ी कोशिकाएं संलग्न रहेंगी, जबकि पैटर्न वाले क्षेत्रों के बाहर की कोशिकाएं अलग हो जाएंगी।
  5. पीडीएमएस कंटेनर से सेल संस्कृति चिप निकालें और संस्कृति माध्यम के ~ 5 मिलीलीटर से भरे 6-अच्छी तरह से प्लेट में डालने के लिए बाँझ चिमटी का उपयोग करें।
  6. समय की वांछित लंबाई के लिए कोशिकाओं संस्कृति। सेल संस्कृति माध्यम को हर 2-3 दिनों में बदलें। सेल संस्कृति के बाद प्रोटीन पैटर्न के दृश्य को सुनिश्चित करने के लिए, संस्कृति के दौरान प्रकाश के लिए नमूने के जोखिम की मात्रा को कम करें।

9. धुंधला, छवि अधिग्रहण, और विश्लेषण

  1. निर्धारण और धुंधला होना
    1. संस्कृति की वांछित लंबाई के बाद, लगभग सभी माध्यमों को हटा दें और अतिरिक्त पीबीएस के साथ तीन बार धो लें। अगला, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 3.7% फॉर्मलिन के साथ सेते हैं, इसके बाद कमरे के तापमान पर 5 मिनट प्रति धोने के लिए पीबीएस के साथ तीन धोने के कदम उठाए जाते हैं। सैंपल को कभी सूखने न दें।
      चेतावनी: फॉर्मलिन हानिकारक है अगर निगल लिया जाता है या यदि साँस ली जाती है (एच 302, एच 332), एलर्जी त्वचा की प्रतिक्रिया (एच 317) का कारण बन सकती है, आनुवंशिक दोष (एच 341) पैदा करने का संदेह है, और कैंसर (एच 350) का कारण बन सकता है। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें और एक धूआं हुड में काम करें।
    2. वांछित धुंधला एजेंटों या एंटीबॉडी के साथ सेल संस्कृति सब्सट्रेट दाग। धुंधला एजेंटों की मात्रा को कम करने के लिए, सेल संस्कृति चिप्स को ग्लास स्लाइड पर पाइप किए गए धुंधला समाधान की एक बूंद में उल्टा रखें।
    3. पीबीएस (अल्पकालिक) में नमूनों को स्टोर करें या 4 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ते मध्यम (दीर्घकालिक) का उपयोग करके कवरस्लिप से जुड़ा हुआ है।
  2. छवि अधिग्रहण
    1. एक ग्लास स्लाइड पर पीबीएस की एक बूंद में दाग नमूना उल्टा रखें। नमूने को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के चरण में रखें।
    2. विवरण के आवश्यक स्तर के आधार पर, उचित छवि अधिग्रहण सुनिश्चित करने के लिए उपयुक्त उद्देश्य (10x, 20x, या 40x) और Z-रिक्ति के साथ Z-स्टैक बनाएं।
  3. छवि विश्लेषण और दृश्य
    1. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में कच्ची छवि फ़ाइलों को खोलें और जांचें कि छवि गुण (जैसे, आयाम, रिज़ॉल्यूशन) सही हैं।
    2. यदि आवश्यक हो तो प्रति चैनल चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें।
    3. पैटर्न और कोशिकाओं युक्त ब्याज के क्षेत्र फसल।
    4. वैकल्पिक: यदि आवश्यक हो तो एक डिकॉन्वोल्यूशन चरण करें।
    5. 3 डी रेंडरिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके जेड-स्टैक का 3 डी रेंडर बनाएं।
    6. प्रत्येक व्यक्तिगत चैनल के लिए कंट्रास्ट और लाभ सेटिंग्स का अनुकूलन करें।
    7. 3 डी रेंडर की छवि बनाने के लिए, एक स्नैपशॉट बनाएं और इस रूप में निर्यात करें। टीआईएफएफ फ़ाइल।
    8. 3 डी रेंडर की एक फिल्म बनाने के लिए, फिल्म को पंजीकृत करने से पहले स्टार्ट और अंतिम फ्रेम के साथ-साथ समय सीमा भी निर्धारित करें। .avi के रूप में निर्यात करें।

Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल के माध्यम से, 3 डी पीडीएमएस सेल संस्कृति सब्सट्रेट सेल लगाव के लिए उपयुक्त सटीक और उच्च थ्रूपुट चिपकने वाला क्षेत्रों को बनाने के लिए यूवी-फोटोपैटर्न किया जा सकता है। इस तरह, कोशिकाओं को एक साथ प्रासंगिक सब्सट्रेट ज्यामिति और चिपकने वाला लिगैंड पैटर्न दोनों के अधीन किया जाता है। अभिविन्यास, सेल क्षेत्र और फोकल आसंजनों की संख्या जैसे सेल गुणों की आसानी से निगरानी की जा सकती है और विवो जैसे वातावरण में जटिल में सेल व्यवहार को बेहतर ढंग से समझने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

3 डी पीडीएमएस सब्सट्रेट पर पैटर्निंग घटनाओं को सत्यापित करने के लिए, प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों में सामग्री की परमाणु सतह रचनाओं को परमाणु एक्स-रे फोटोइलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी (एक्सपीएस) 48 का उपयोग करके मापा गया है। संक्षेप में, एक्सपीएस माप ने निष्क्रिय नमूनों पर बढ़े हुए कार्बन सिग्नल के साथ खूंटी श्रृंखलाओं की उपस्थिति दिखाई, जिसे फोटोपैटर्निंग के बाद कम कर दिया गया था। फाइब्रोनेक्टिन के साथ इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप कार्बन सिग्नल में वृद्धि हुई, फिर से सेल संस्कृति चिप की सतह पर सफल प्रोटीन आसंजन का संकेत मिलता है। अगला, 3 डी सुविधाओं पर पैटर्न रिज़ॉल्यूशन और संरेखण को विभिन्न प्रकार के सर्कल-पैटर्न वाले, अवतल गड्ढों पर विशेषता दी गई थी (ॐ = 1/250 μm-1, ॐ = 1/1,000 μm-1, और ॐ = 1/3,750 μm-1, चित्रा 6 देखें)। अधिकतम तीव्रता अनुमानों से, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि प्रोटीन पैटर्न सभी तीन 3 डी सुविधाओं पर सफलतापूर्वक पैटर्न किया गया था। चित्रा 6 ए में तीव्रता प्रोफ़ाइल पैटर्न और गैर-पैटर्न वाले क्षेत्रों के बीच तेज संक्रमण के साथ उच्च पैटर्न रिज़ॉल्यूशन दिखाती है। इसके अतिरिक्त, गड्ढे में पूर्ण पैटर्न में लगातार प्रोटीन तीव्रता प्राप्त की गई थी।

ॐ = 1/250 μm-1 के साथ अवतल गड्ढे को एकल फोकल प्लेन विधि (एक पैटर्न) का उपयोग करके पैटर्न किया गया था, जबकि ॐ = 1/1,000 μm-1 और ω = 1/3,750 μm-1 के साथ गड्ढों को क्रमशः दो और तीन फोकल विमानों (पैटर्न) का उपयोग करके पैटर्न किया गया था। जैसा कि चित्रा 6 में अधिकतम तीव्रता अनुमानों में देखा जा सकता है, दोनों विधियों के परिणामस्वरूप सुविधाओं के शीर्ष पर पैटर्न का सही संरेखण होता है। दो अलग-अलग फोकल विमानों और पैटर्न के बीच कोई गलत संक्रमण नहीं देखा जा सकता है।

वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, प्रोटीन पैटर्न डिजाइन की एक विस्तृत श्रृंखला ज्यामिति की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है ( चित्रा 7 और वीडियो 1 देखें)। इस पद्धति की बहुमुखी प्रतिभा को स्पष्ट करने के लिए, अर्धवृत्त (उत्तल और अवतल), एक काठी की सतह और गड्ढे को विभिन्न चौड़ाई की रेखाओं और हलकों का उपयोग करके पैटर्न किया गया था। फोटोपैटर्न सामग्री का उपयोग बाद में सेल संस्कृति के लिए किया जा सकता है ( चित्रा 7, चित्रा 8, वीडियो 2, वीडियो 3 और वीडियो 4 देखें)। एक पैटर्न (फाइब्रोनेक्टिन लाइनों, लाल, 5 μm चौड़ा, और 5 μm अंतराल) पर सुसंस्कृत त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट का एक उदाहरण चित्रा 8, चित्रा 9, और वीडियो 4 में दिखाया गया है। प्रयोग के दौरान, कोशिकाएं मल्टीक्यू सेल संस्कृति सब्सट्रेट को समझती हैं और पालन करती हैं और समय के साथ व्यवहार्य रहती हैं। जैसा कि चित्रा 8 में इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला से देखा जा सकता है, कोशिकाएं मुख्य रूप से फाइब्रोनेक्टिन लाइनों पर फोकल आसंजन (विनकुलिन क्लस्टर) बनाती हैं।

इन सेल संस्कृति सामग्रियों का उपयोग करने वाला एक और उदाहरण अध्ययन हाल ही में हमारे समूह48 द्वारा प्रकाशित किया गया था। इस अध्ययन में, मानव मायोफिब्रोब्लास्ट और एंडोथेलियल कोशिकाओं को संपर्क मार्गदर्शन संकेतों और ज्यामितीय स्थलाकृतियों के संयोजन के अधीन किया गया था। विवो में, दोनों प्रकार की कोशिकाएं मानव वास्कुलचर जैसे देशी ऊतकों में वक्रता- और संपर्क-मार्गदर्शन संकेतों का अनुभव करती हैं। इन विट्रो में कोशिकाओं को एक ऐसे वातावरण के अधीन करके जो दोनों पर्यावरणीय संकेतों को जोड़ता है, इन विवो स्थिति को दोहराया जा सकता है, जो सेल व्यवहार पर माइक्रोएनवायरनमेंट की भूमिका की गहरी समझ प्रदान करता है। मानव मायोफिब्रोब्लास्ट्स को अवतल बेलनाकार सब्सट्रेट48 पर संपर्क मार्गदर्शन संकेतों (समानांतर फाइब्रोनेक्टिन लाइनों) के साथ संरेखित करने के लिए दिखाया गया था। हालांकि, बढ़ती वक्रता के साथ उत्तल संरचनाओं पर, ज्यामितीय संकेतों ने जैव रासायनिक संकेतों को खारिज कर दिया, यह सुझाव देते हुए कि मायोफिब्रोब्लास्ट वक्रता की डिग्री और संकेत दोनों को समझ सकते हैं। दिलचस्प बात यह है कि एंडोथेलियल कोशिकाएं केवल अवतल मल्टीक्यू सब्सट्रेट का पालन कर सकती हैं और उत्तल पीडीएमएस सब्सट्रेट का नहीं। अवतल, प्रोटीन-पैटर्न वाले सब्सट्रेट पर, एंडोथेलियल कोशिकाएं संपर्क मार्गदर्शन क्यू की दिशा में उन्मुख होती हैं। इन विट्रो ज्ञान में यह मौलिक संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में शारीरिक प्रासंगिकता है और अंततः स्मार्ट ऊतक इंजीनियरिंग निर्माणों के डिजाइन में सहायता कर सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: 3 डी सेल संस्कृति सब्सट्रेट पर संपर्क मार्गदर्शन संकेतों को लागू करने की प्रयोगात्मक समयरेखा। सबसे पहले, सकारात्मक सेल संस्कृति चिप्स एक नकारात्मक पीडीएमएस मोल्ड से उत्पादित होते हैं जिसमें ज्यामिति की एक श्रृंखला होती है। अनक्योर्ड पीडीएमएस को मोल्ड में डाला जाता है और 65 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए ठीक किया जाता है। इसके बाद, पीडीएमएस को ओ2-प्लाज्मा के साथ इलाज किया जाता है और सेल संस्कृति सब्सट्रेट की सतह को निष्क्रिय करने के लिए पीएलएल और एमपीईजी-एसवीए (नीला, लेबल) के साथ ऊष्मायन किया जाता है। धोने के बाद, सब्सट्रेट को फोटोइनिशिएटर (पीएलपीपी, हरा, लेबल) की एक बूंद में उल्टा-सीधा फ़्लिप किया जाता है और एलआईएमएपी दृष्टिकोण का उपयोग करके यूवी-फोटोपैटर्न किया जाता है। यहां, परिभाषित स्थानों पर निष्क्रियता परत को क्लीव करने के लिए उपयोगकर्ता-परिभाषित पैटर्न के साथ एक डिजिटल मास्क का उपयोग किया जाता है। अगला, एक प्रोटीन समाधान (लाल, लेबल) को ऊष्मायन किया जा सकता है और केवल उन स्थानों का पालन करेगा जहां निष्क्रियता परत को हटा दिया जाता है। सब्सट्रेट पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं को ज्यामिति और प्रोटीन पैटर्न दोनों के अधीन किया जाता है, जो विवो-नकल वातावरण में जटिल में सेल व्यवहार में अनुसंधान को सक्षम बनाता है। संक्षिप्त नाम: पीडीएमएस = पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन; एमपीईजी-एसवीए = मेथॉक्सीपॉलीथिलीन ग्लाइकोल-सक्सिनिमिडिल वैलेरेट; पीएलपीपी = 4-बेंजोइलबेंजिल-ट्राइमेथिलमोनियम क्लोराइड; एलआईएमएपी = प्रोटीन का प्रकाश प्रेरित आणविक सोखना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: 3 डी सेल संस्कृति सब्सट्रेट के उत्पादन और निष्क्रियता के दौरान विभिन्न चरणों। नकारात्मक ग्लास मोल्ड (# 1) कंप्यूटर असिस्टेड डिज़ाइन सॉफ़्टवेयर के साथ डिज़ाइन किया गया है और फेम्टोसेकंड-लेजर डायरेक्ट-राइट तकनीक का उपयोग करके उत्पादित किया गया है। इस मोल्ड का उपयोग मध्यवर्ती सकारात्मक पीडीएमएस चिप (# 2) और नकारात्मक पीडीएमएस मोल्ड (# 3) का उत्पादन करने के लिए किया जाता है, जिसका उपयोग बाद में अंतिम सेल संस्कृति चिप (# 4) का उत्पादन करने के लिए किया जाता है। संक्षिप्त नाम: पीडीएमएस = पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: दो पैटर्निंग विधियों का योजनाबद्ध चित्रण। बाएं: यूवी-फोटोपैटर्निंग एक एकल फोकल प्लेन और पैटर्न का उपयोग करके छोटी सुविधाओं (लगभग एक डीएमडी) पर किया जाता है। नतीजतन, पूरी सुविधा एक बार में पैटर्न है। दाएं: जब बड़ी सुविधाओं का उपयोग किया जाता है (एक डीएमडी से बड़ा), तो पैटर्निंग को कई फोकल विमानों और पैटर्न पर विभाजित किया जाता है। संक्षिप्त नाम: डीएमडी = डिजिटल दर्पण डिवाइस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एक सामान्य और सूखे प्रोटीन-इनक्यूबेटेड सब्सट्रेट का एक विशिष्ट उदाहरण। सामान्य और सूखे प्रोटीन-इनक्यूबेटेड सब्सट्रेट के अधिकतम तीव्रता अनुमान (एक्सवाई) और ऑर्थोगोनल दृश्य (एक्सजेड)। प्रोटीन समाधान के साथ इनक्यूबेशन के बाद एक पैटर्न वाले सेल संस्कृति सब्सट्रेट को धोते समय, नमूना हमेशा गीला रखना महत्वपूर्ण है। यद्यपि पैटर्न सुविधाओं पर सभी छवियों में समान है (ॐ = 1/1,000 μm-1), जिलेटिन-फ्लोरोसिन (हरा) एक प्रमुख क्लंप बनाते हुए एकत्रित होता है जब नमूना कुछ सेकंड के लिए सूखने के लिए छोड़ दिया जाता था। यदि नमूना हमेशा गीला रहता है, तो सही प्रोटीन पैटर्न देखा जा सकता है। स्केल सलाखों = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: बोने के बाद ब्राइटफील्ड छवियां। प्राथमिक केराटोसाइट्स (बाएं) और त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स (दाएं) 3 डी ज्यामितीय विशेषताओं पर बोने के बाद 4 घंटे (अवतल गड्ढे = 1/1,000 μm-1 और अर्धवृत्ताकार = 1/500, 1/375, 1/250, 1/175, और 1/125 μm-1)। ऊपरी-बाएं आवेषण ज्यामिति के पैटर्निंग के लिए उपयोग किए जाने वाले लाइन पैटर्न का प्रतिनिधित्व करते हैं। सफेद तीर उन कोशिकाओं को फैलाने का संकेत देते हैं जो पहले से ही संरेखण दिखाते हैं। स्केल सलाखों = 250 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: अवतल गड्ढों पर परिपत्र पैटर्न की विशेषता( ए) एलआईएमएपी (लाइनविड्थ: 20 μm, गैप चौड़ाई: 20 μm) का उपयोग करके पैटर्न किए गए अकोंकव गड्ढे के अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (XY) और ऑर्थोगोनल दृश्य (XZ) और जिलेटिन-फ्लोरोसिन (हरे) के साथ ऊष्मायन किया गया। सफेद रेखा के साथ तीव्रता प्रोफ़ाइल को दूरी के खिलाफ प्लॉट किया गया है, जो एक सुसंगत पैटर्न गुणवत्ता और रिज़ॉल्यूशन दिखा रहा है। (बी) अवतल गड्ढों पर किए गए अतिरिक्त पैटर्निंग के साथ § = 1/1,000 μm-1 और ॐ = 1/3750 μm-1, ज्यामितीय विशेषताओं के संदर्भ में लचीलापन दिखा रहा है जिसका उपयोग पैटर्निंग के लिए किया जा सकता है। फिर, अधिकतम तीव्रता अनुमान (एक्सवाई) और ऑर्थोगोनल दृश्य (एक्सजेड) दोनों की कल्पना की जाती है। स्केल सलाखों = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: पैटर्न संरचनाओं के 3 डी माइक्रोस्कोपी डेटा। फोटोपैटर्निंग और सेल संस्कृति के बाद 3 डी पैटर्न वाली सेल संस्कृति सामग्री के विशिष्ट उदाहरण, 3 डी रेंडरिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कल्पना की गई। (ए) उत्तल अर्धवृत्ताकार 10 μm चौड़ी लाइनों (रोडामाइन-फाइब्रोनेक्टिन, लाल) और 10 μm चौड़े अंतराल के साथ पैटर्न। स्केल बार = 5 μm. (B) त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स एफ-एक्टिन (हरा) के लिए दाग अवतल अर्धवृत्ताकार पर सुसंस्कृत 20 μm चौड़ी लाइनों (रोडामाइन-फाइब्रोनेक्टिन, लाल) और 20 μm चौड़े अंतराल के साथ पैटर्न। स्केल बार = 5 μm. (C) 20 μm चौड़ी लाइनों (रोडामाइन-फाइब्रोनेक्टिन, लाल) और 20 μm चौड़े अंतराल के साथ पैटर्न वाली काठी सतह। स्केल बार = 5 μm. (D) अवतल गड्ढे 20 μm चौड़ी लाइनों (जिलेटिन-फ्लोरोसिन, हरा) और 20 μm चौड़े अंतराल के संकेंद्रित हलकों के साथ पैटर्न। मानव केराटोसाइट्स के एफ-एक्टिन साइटोस्केलेटन को फालोइडिन का उपयोग करके दाग दिया जाता है और लाल रंग में कल्पना की जाती है। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: एक फोटोपैटर्न, अवतल अर्धवृत्ताकार पर मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना( ए) मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स के अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एक्सवाई) और ऑर्थोगोनल वर्गों (एक्सजेड और वाईजेड) एक पैटर्न (फाइब्रोनेक्टिन लाइनों, लाल, 5 μm चौड़ा, और 5 μm अंतराल) पर 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत कोशिकाओं को एफ-एक्टिन (मैजेंटा), विनकुलिन (हरा), और नाभिक (नीला) के लिए दाग दिया जाता है। स्केल बार = 100 μm. (B) मल्टीक्यू वातावरण का पालन करने वाले सेल का ज़ूम-इन। स्केल सलाखों = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: एक पैटर्न, अवतल सिलेंडर पर मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट की ब्राइटफील्ड टाइमलैप्स छवियां। अवतल अर्धवृत्ताकार (ॐ = 1/250 μm-1) को समानांतर रेखाओं (5 μm चौड़ा और 5 μm अंतराल) के साथ पैटर्न किया गया था और सेल बोने से पहले रोडामाइन-फाइब्रोनेक्टिन के साथ ऊष्मायन किया गया था। टाइमलैप्स इमेजिंग प्रारंभिक सेल बोने (बाएं, 0 मिनट) के बाद 1 घंटे शुरू की जाती है, जब कोशिकाएं अभी भी गोल और गैर-अनुयायी (तीर) होती हैं। लगभग 24 घंटे (मध्य, 1,420 मिनट) के बाद, कोशिकाओं ने मल्टीक्यू सब्सट्रेट का पालन किया और संपर्क मार्गदर्शन पैटर्न के अनुसार एक संरेखण प्रतिक्रिया दिखाई। संरेखण प्रतिक्रिया और सेल व्यवहार्यता दोनों को पूरी संस्कृति अवधि (दाएं, 3,180 मिनट) में बनाए रखा जाता है। स्केल सलाखों = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: एक 3 डी बेलनाकार सब्सट्रेट पर पैटर्न उदाहरण। रोडामाइन-फाइब्रोनेक्टिन (लाल) के साथ पैटर्न वाले उत्तल सिलेंडर का 3 डी प्रतिनिधित्व। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 2: एक पैटर्न, 3 डी बेलनाकार सब्सट्रेट पर सुसंस्कृत त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स का 3 डी प्रतिनिधित्व (ॐ = 1/500 μm-1)। त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट एक पैटर्न (फाइब्रोनेक्टिन लाइनों, लाल, 10 μm चौड़ा, और 10 μm अंतराल) उत्तल अर्धवृत्ताकार पर 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत। कोशिकाओं को एफ-एक्टिन (मैजेंटा), विनकुलिन (हरा), और नाभिक (नीला) के लिए दाग दिया जाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 3: एक पैटर्न, 3 डी गड्ढे पर सुसंस्कृत मानव केराटोसाइट्स का 3 डी प्रतिनिधित्व (ॐ = 1/3,750 μm-1)। एक अवतल, पैटर्न वाले गड्ढे (जिलेटिन सर्कल, हरा, 20 μm चौड़ा, और 20 μm अंतराल) में 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत मानव केराटोसाइट्स का 3 डी प्रतिनिधित्व। कोशिकाओं को एफ-एक्टिन (लाल) के लिए दाग दिया जाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 4: एक पैटर्न, अवतल सिलेंडर पर मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स की ब्राइटफील्ड टाइमलैप्स इमेजिंग। अवतल अर्धवृत्ताकार (ॐ = 1/250 μm-1) को समानांतर रेखाओं (5 μm चौड़ा और 5 μm अंतराल) के साथ पैटर्न किया गया था और सेल बोने से पहले रोडामाइन-फाइब्रोनेक्टिन के साथ ऊष्मायन किया गया था। प्रारंभिक सेल सीडिंग के 1 घंटे बाद टाइमलैप्स इमेजिंग शुरू की जाती है, जब कोशिकाएं मल्टीक्यू वातावरण के लिए प्रारंभिक पालन दिखाती हैं। पूर्ण टाइमलैप्स के दौरान, कोशिकाएं मुख्य रूप से संपर्क मार्गदर्शन संकेतों के साथ उन्मुख होती हैं, जबकि सेल व्यवहार्यता बनाए रखी जाती है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

आजकल, सेल व्यवहार का अध्ययन अक्सर फ्लैट संस्कृति सब्सट्रेट पर किया जाता है जिसमें देशी सेल माइक्रोएन्वायरमेंट की जटिलता की कमी होती है। मचान और हाइड्रोगेल जैसे 3 डी वातावरण का उपयोग विकल्प के रूप में किया जाता है। यद्यपि ये सेल संस्कृति वातावरण विवो प्रासंगिकता में सुधार करते हैं, सेल व्यवहार के व्यवस्थित अध्ययन और रीडआउट विधियों की व्यवहार्यता दोनों चुनौतीपूर्ण रहते हैं। प्रतिनिधि संस्कृति सब्सट्रेट पर सेल व्यवहार की व्यवस्थित रूप से जांच करने के लिए, सूक्ष्म रीडआउट की अनुमति देने वाले लगातार मल्टीक्यू सब्सट्रेट की आवश्यकता होती है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, हम शारीरिक रूप से प्रासंगिक ज्यामिति और पैटर्न वाले ईसीएम प्रोटीन के साथ मल्टीक्यू सेल संस्कृति सब्सट्रेट बनाने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। इन विट्रो प्लेटफार्मों पर ऊतक ज्यामिति और संपर्क-मार्गदर्शन संकेतों जैसे पर्यावरणीय संकेतों के संयोजन में मुख्य चुनौती काफी हद तक तकनीकी प्रकृति की है। सेल संस्कृति सामग्री के लिए संपर्क-मार्गदर्शन संकेतों (जैसे, नरम लिथोग्राफी, डीप-यूवी पैटर्निंग और माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग35,36) को लागू करने के पारंपरिक तरीकों को प्लानर सब्सट्रेट के लिए अनुकूलित किया गया है। संपर्क मार्गदर्शन संकेतों के साथ संयुक्त 3 डी सेल संस्कृति सामग्री की आवश्यकता ने कई तकनीकी चुनौतियों पर प्रकाश डाला, जैसे कि खराब पैटर्न संरेखण, संकल्प और लचीलापन। इन चुनौतियों को दूर करने के लिए, एक उच्च-थ्रूपुट, मास्कलेस, प्रकाश-आधारित पैटर्निंग विधि का उपयोग45,49 किया जा सकता है। यहां, एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप सटीक पैटर्न संरेखण और माइक्रोमीटर के क्रम में एक संकल्प को सक्षम बनाता है (चित्रा 6 देखें)। इसके अलावा, डिजिटल मास्क का उपयोग शोधकर्ताओं को श्रम-गहन भौतिक मास्क बनाने की आवश्यकता के बिना पैटर्न की एक विस्तृत श्रृंखला पर सेल व्यवहार का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है।

यूवी-फोटोपैटर्निंग दृष्टिकोण का उपयोग विभिन्न प्रकार की 3 डी ज्यामिति (जैसे, सिलेंडर, काठी, गुंबद, गड्ढे) के साथ संयोजन में किया जा सकता है जो सामग्री48 की एक श्रृंखला से उत्पादित होता है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले 3 डी सेल संस्कृति सब्सट्रेट पीडीएमएस से बने होते हैं; हालाँकि, अन्य सामग्रियों का भी उपयोग किया जा सकता है। ब्याज की विशेषताओं वाले अंतिम सेल संस्कृति सब्सट्रेट का उत्पादन करने के लिए इसके लिए विभिन्न चरणों की आवश्यकता हो सकती है। चूंकि कोशिकाओं को सेल संस्कृति सामग्री की सतह खुरदरापन के प्रति संवेदनशील दिखाया गया है, इसलिए एक चिकनी सतह के साथ सेल संस्कृति चिप्स बनाना महत्वपूर्ण है ताकि मनाया कोशिकाओं की प्रतिक्रिया पूरी तरह से 3 डी ज्यामिति और संपर्क-मार्गदर्शनसंकेत50,51 के लिए जिम्मेदार हो सके। सतह खुरदरापन को मापने के लिए ऑप्टिकल प्रोफिलोमेट्री, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या परमाणु बल माइक्रोस्कोपी जैसे माप विधियों का उपयोग किया जा सकता है। सेल संस्कृति सामग्री के निर्माण के बाद, कोई ब्याज की सुविधा के विशिष्ट आयामों पर निर्भर एक या कई फोकल विमानों के आधार पर एक पैटर्निंग विधि का चयन कर सकता है (चित्रा 3 देखें)। आमतौर पर, एक एकल फोकल विमान का उपयोग लगभग 50 μm की Z-सीमा के भीतर एक क्षेत्र को पैटर्न करने के लिए किया जाता है। पैटर्न रिज़ॉल्यूशन को अंगूठे के इस नियम का उपयोग करके सुसंगत दिखाया गया था (चित्रा 6 देखें)। हालांकि, इस पद्धति का एक नकारात्मक पक्ष कई फोकल विमानों और पैटर्न की शुरूआत के साथ बढ़ा हुआ पैटर्निंग समय है। हमारे हाथ में, कई फोकल विमानों का उपयोग करते हुए, 16 मिमी x 16 मिमी x 0.17 मिमी (एक्स एक्स वाई एक्स जेड) तक 3 डी ज्यामितीय विशेषताओं को उच्च पैटर्न गुणवत्ता के साथ सफलतापूर्वक पैटर्न किया गया है।

इसके अतिरिक्त, यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि ज्यामितीय विशेषताओं की ऊंचाई (जेड-अक्ष) जिसका उपयोग इस प्रोटोकॉल के साथ संयोजन में किया जा सकता है, सीमित है। चूंकि यूवी-फोटोपैटर्निंग और कई सेलुलर रीडआउट दोनों माइक्रोस्कोपी सेटअप पर भरोसा करते हैं, इसलिए उद्देश्यों की कामकाजी दूरी एक सुविधा की अधिकतम ऊंचाई निर्धारित करती है। हमारे हाथ में, 300 μm की ऊंचाई से अधिक ज्यामिति अभी भी यूवी-फोटोपैटर्न की जा सकती है, और रीडआउट 40x उद्देश्यों के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया गया है। इस प्रकार, वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर से सेलुलर और ऊतक तराजू तक मैकेनोबायोलॉजिकल अनुसंधान संभव है।

एक अन्य कारक जिसे ध्यान में रखा जाना चाहिए, यूवी-फोटोपैटर्निंग49 के दौरान या बाद में नमूनों के सूखने का जोखिम है। 3 डी ज्यामिति का उपयोग करते समय यह विशेष रूप से प्रासंगिक है, क्योंकि उत्तल अक्सर सेल संस्कृति सामग्री के बाहर उजागर होते हैं। जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, इसके परिणामस्वरूप ब्याज की विशेषता के शीर्ष पर बनने वाले प्रोटीन समुच्चय के साथ असमान पैटर्न हो सकते हैं। प्रोटीन इनक्यूबेशन के बाद और सेल संस्कृति के दौरान सेल संस्कृति चिप्स की धुलाई 3 डी ज्यामिति की उचित कोटिंग के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, सेल संस्कृति चिप के शीर्ष पर हमेशा एक कामकाजी समाधान (पीबीएस, पीएलपीपी, प्रोटीन समाधान, सेल संस्कृति माध्यम) की छोटी मात्रा छोड़ने की सलाह दी जाती है।

अब तक, कई प्रोटीन कोटिंग्स (फाइब्रोनेक्टिन, कोलेजन प्रकार I और IV, जिलेटिन, एफएनसी) और सेल प्रकार (मानव अस्थि मज्जा स्ट्रोमल कोशिकाएं, मानव मायोफिब्रोब्लास्ट, मानव एंडोथेलियल कोशिकाएं, मानव केराटोसाइट्स और त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट) संरचित सेल संस्कृति सामग्री पर वर्णित फोटोपैटर्निंग दृष्टिकोण के संयोजन में उपयोग किए गए हैं। जैसा कि पिछले अध्ययन48 में दिखाया गया है, प्रोटीन इनक्यूबेशन मापदंडों का अनुकूलन नए सेल प्रकारों में व्यवस्थित जांच के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, नए प्रोटीन या कोशिकाओं के साथ एक नया प्रयोग करने से पहले, प्रोटीन सांद्रता, इनक्यूबेशन तापमान और इनक्यूबेशन समय की एक श्रृंखला का परीक्षण करने की सलाह दी जाती है। 'सामान्य' सेल संस्कृति स्थितियों के तहत सेल आकृति विज्ञान के साथ सजातीय, पैटर्न वाले फ्लैट क्षेत्रों पर प्रारंभिक आसंजन के बाद सेल आकृति विज्ञान की तुलना करके, प्रयोगात्मक मापदंडों का एक अनुकूलित सेट प्राप्त किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक सेल प्रकार को एक विशिष्ट मल्टीक्यू वातावरण पर एक पहचानने योग्य आसंजन आकृति विज्ञान दिखाने के लिए बोने के बाद अलग-अलग समय की आवश्यकता हो सकती है ( चित्रा 5 देखें)। यह अंत करने के लिए, चरण 8.4 में धोने के दौरान पैटर्न वाले क्षेत्र पर संपर्क घटनाओं को प्रस्तुत करने के लिए प्रति सेल प्रकार आवश्यक समय का अनुकूलन करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, हमने देखा कि लाइन पैटर्न पर, मानव केराटोसाइट्स बोने के बाद पहले 30 मिनट के भीतर लम्बी आकृति विज्ञान दिखाते हैं, जबकि एंडोथेलियल कोशिकाओं और त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स को आसंजन आकृति विज्ञान में बदलाव दिखाने से पहले कई घंटों की आवश्यकता होती है। प्रोटीन इनक्यूबेशन (चरण 7) और सेल सीडिंग (चरण 8) के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक पैरामीटर इस प्रकार प्रोटीन और सेल प्रकार की पसंद पर निर्भर हो सकते हैं।

3 डी ज्यामिति पर संपर्क मार्गदर्शन संकेतों को लागू करने के लिए प्रस्तुत दृष्टिकोण जटिल मल्टीक्यू वातावरण में सेल व्यवहार की गहरी समझ बनाने में सहायता कर सकता है। इसमें इंट्रासेल्युलर घटकों, जैसे फोकल आसंजन और नाभिक में जांच शामिल हो सकती है, और प्रस्तावित विधि का उपयोग करके एक बड़े, सेल या ऊतक पैमाने पर किए गए प्रयोगों को भी शामिल किया जा सकता है। आखिरकार, यह अनुमान लगाया जाता है कि प्राप्त ज्ञान का उपयोग ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के डिजाइन में किया जा सकता है, जहां जटिल सेलुलर वातावरण को वांछित परिणाम की ओर सेल व्यवहार को चलाने के लिए डिज़ाइन किया गया है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम मानव प्राथमिक केराटोसाइट्स प्रदान करने के लिए डॉ नेलो फॉर्मिसानो (एमईआरएलएन इंस्टीट्यूट फॉर टेक्नोलॉजी-इंस्पायर्ड रीजनरेटिव मेडिसिन) को धन्यवाद देते हैं। इस काम को केमेलोट इनसाइट (प्रोजेक्ट बीएम 3.02) द्वारा समर्थित किया गया है; यूरोपीय अनुसंधान परिषद (अनुदान 851960); और गुरुत्वाकर्षण कार्यक्रम 024.003.013 "सामग्री संचालित उत्थान" के लिए शिक्षा, संस्कृति और विज्ञान मंत्रालय। लेखक अपने पत्राचार, सहायता और समस्या निवारण के लिए अल्वेल को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-vinculin antibody, mouse monoclonal IgG1 Sigma V9131 Dilution: 1/600
Bovine Serum albumin, Fraction V Roche 10735086001
DMEM, high glucose, pyruvate Gibco 41966029
DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x) Gibco 10565018
DMi8 epifluorescent microscope Leica Microsystems
Ethanol Biosolve 0005250210BS
Fetal Bovine Serum Serana 758093
Fiji/ImageJ, version v1.53k www.imageJ.nih.gov
Fluorescent highlighter Stabilo 4006381333627
Fluorescin-labeled gelatin Invitrogen G13187 Concentration: 0.01%
Formaldehyde solution Merck F8775
Glass coverslips 24 x 60 mm, #1 VWR 631-1575
Glass coverslips, ø = 32 mm, #1 Menzel-Gläser
HCX PL fluotar L 20X/0.40na microscope objective Leica 11506242
HEPES Gibco 15630080
Human dermal fibroblasts Lonza CC-2511
Human primary keratocytes MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine
Illustrator, Version 26.0.1 Adobe
Laboratory oven Carbolite
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Leica Application Suite X software, version 3.5.7.23225 Leica Microsystems
Leonardo software, version 4.16 Alvéole
Micro-manager, version 1.4.23 Open imaging
Mowiol 4-88 Sigma-Aldrich 81381 mounting medium
mPEG-succinimidyl valerate MW 5,000 Da Laysan Bio MPEG-SVA-5000 Concentration: 50 mg/mL
Negative glass mold FEMTOprint
NucBlue Live Readyprobes Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen R37605 2 drops/mL
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140163
Petri dish (ø=100 mm) Greiner Bio-one 664160
Phalloidin Atto 647N Sigma 65906 Dilution: 1/250
Phosphate Buffered Saline Sigma P4417
Plasma asher Emitech K1050X
PLPP (photoinitiator) Alvéole
Poly-L-lysine, sterile-filtered Sigma-Aldrich P4707 Concentration: 0.01%
PRIMO Alvéole
Rhodamine-labeled fibronectin Cytoskeletn, Inc. FNR01 Concentration: 10 µg/mL
Secondary antibody with Alexa 488, Goat anti-mouse IgG1 (H) Molecular Probes A21121 Dilution: 1/300
Secondary antibody with Alexa 555, Goat anti-mouse IgG1 (H) Molecular Probes A21127 Dilution: 1/300
Spin coater Leurell Technologies Corporation model WS-650MZ-23NPPB
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 1673921
TCS SP8X confocal microscope Leica Microsystems
tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane ABCR AB111444
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red Gibco 12604013
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054

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