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Bioengineering

Generazione di microambienti cellulari multicue mediante fotopatterning UV di substrati tridimensionali di colture cellulari

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63988
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems, Eindhoven University of Technology

Summary

Tradizionalmente, la coltura cellulare viene eseguita su substrati planari che imitano male l'ambiente naturale delle cellule in vivo. Qui descriviamo un metodo per produrre substrati di coltura cellulare con geometrie curve fisiologicamente rilevanti e proteine extracellulari micropatternate, consentendo indagini sistematiche sul rilevamento cellulare di questi segnali extracellulari.

Abstract

La matrice extracellulare è un importante regolatore della funzione cellulare. I segnali ambientali esistenti nel microambiente cellulare, come la distribuzione dei ligandi e la geometria dei tessuti, hanno dimostrato sempre più di svolgere ruoli critici nel governo del fenotipo e del comportamento cellulare. Tuttavia, questi segnali ambientali e i loro effetti sulle cellule sono spesso studiati separatamente utilizzando piattaforme in vitro che isolano i singoli segnali, una strategia che semplifica pesantemente la complessa situazione in vivo di più segnali. Gli approcci ingegneristici possono essere particolarmente utili per colmare questa lacuna, sviluppando configurazioni sperimentali che catturano la complessità del microambiente in vivo , pur mantenendo il grado di precisione e manipolabilità dei sistemi in vitro .

Questo studio evidenzia un approccio che combina modelli proteici a base ultravioletta (UV) e microfabbricazione del substrato basata sulla litografia, che insieme consentono un'indagine ad alto rendimento sui comportamenti cellulari in ambienti multicue. Attraverso il fotopattering UV senza maschera, è possibile creare complesse distribuzioni proteiche adesive su substrati di coltura cellulare tridimensionali (3D) su chip che contengono una varietà di segnali geometrici ben definiti. La tecnica proposta può essere impiegata per substrati di coltura realizzati con diversi materiali polimerici e combinati con aree adesive modellate di una vasta gamma di proteine. Con questo approccio, le singole celle, così come i monostrati, possono essere sottoposti a combinazioni di segnali geometrici e segnali di guida di contatto presentati dai substrati modellati. La ricerca sistematica che utilizza combinazioni di materiali chip, modelli proteici e tipi di cellule può quindi fornire informazioni fondamentali sulle risposte cellulari agli ambienti multicue.

Introduction

In vivo, le cellule sono sottoposte a un'ampia varietà di segnali ambientali che possono essere di natura meccanica, fisica e biochimica che hanno origine dalla matrice extracellulare (ECM). Numerosi segnali ambientali sono stati identificati per svolgere ruoli vitali nella regolazione del comportamento cellulare, come la proliferazione, la differenziazione e la migrazione 1,2,3,4,5. Uno dei fenomeni più ampiamente studiati è la guida al contatto, che descrive l'allineamento cellulare mediato dall'adesione lungo modelli biochimici o topografici anisotropi presenti sul substrato extracellulare 6,7,8,9,10,11. Oltre a dirigere l'allineamento delle cellule, i segnali di guida del contatto hanno anche dimostrato di influenzare altre proprietà cellulari come la migrazione cellulare, l'organizzazione delle proteine intracellulari, la forma delle cellule e il destino cellulare 12,13,14,15. Inoltre, l'architettura geometrica dell'ambiente cellulare 3D è stata riconosciuta anche per la sua influenza regolatrice sul comportamento cellulare16,17. Nel corpo umano, le cellule sono esposte a una serie di geometrie curve, che vanno dalle fibre di collagene su microscala, capillari e glomeruli, fino agli alveoli e alle arterie a mesoscala18,19. È interessante notare che recenti studi in vitro hanno dimostrato che le cellule possono percepire e rispondere a tali segnali fisici, dal nano- alla mesoscala 20,21,22,23.

Ad oggi, la maggior parte degli studi che studiano la risposta cellulare ai segnali ambientali sono stati in gran parte eseguiti utilizzando configurazioni sperimentali che isolano i singoli segnali. Mentre questo approccio ha permesso enormi progressi nella comprensione dei meccanismi di base alla base del rilevamento cellulare dei segnali ambientali, ricapitola male l'ambiente in vivo che presenta contemporaneamente più segnali. Per colmare questo divario, è utile sviluppare piattaforme di cultura in cui più segnali ambientali possano essere controllati in modo indipendente e simultaneo. Questo concetto ha guadagnato una trazione crescente ultimamente24,25, con studi che combinano rigidità della matrice e densità del ligando 26,27,28,29, rigidità e porosità del substrato30, rigidità del substrato e microniche 3D volume31, topografia superficiale e segnali di guida del contatto 32,33,34 , e segnali di guida di contatto su scala nanometrica con segnali di guida alla curvatura a mesoscala23. Tuttavia, rimane difficile combinare i segnali di guida del contatto con una varietà di geometrie 3D in modo controllato e ad alta produttività.

Questo protocollo di ricerca affronta questa sfida e introduce un metodo per creare substrati di coltura cellulare con una combinazione controllata di aree adesive modellate di proteine ECM (segnali di guida al contatto) e curvatura del substrato (segnali geometrici). Questo approccio consente la dissezione della risposta cellulare in un ambiente biomimetico multicue in modo sistematico e ad alto rendimento. Le conoscenze acquisite possono aiutare a comprendere ulteriormente il comportamento cellulare in ambienti complessi e possono essere utilizzate per progettare materiali istruttivi con proprietà che guidano le risposte cellulari verso un risultato desiderato.

Fotopatterning proteico 3D
La creazione di aree adesive di proteine ECM (segnali di guida al contatto) su materiali di coltura cellulare può essere realizzata utilizzando una varietà di tecniche, ad esempio mediante pattern ultravioletti profondi (deep-UV) o stampa di microcontatti35,36. Il pattern UV profondo utilizza la luce UV che viene proiettata attraverso una maschera su un materiale polimerico per degradare i polimeri di passivazione in posizioni specifiche sul substrato della coltura cellulare. Il substrato modellato viene quindi incubato con un ligando di interesse, risultando in aree adesive che supportano l'attaccamento cellulare e la coltura in posizioni predefinite 12,37,38. Un modo alternativo per introdurre modelli proteici è mediante la stampa a microcontatto, in cui i timbri elastomerici contenenti una forma desiderata sono rivestiti con una proteina di scelta e vengono premuti su un substrato di coltura cellulare, trasferendo così il rivestimento proteico a cui le cellule possono aderire 35,37,39,40 . Sfortunatamente, poiché entrambe le tecniche si basano sulla preparazione della maschera e sui metodi di litografia morbida, gli esperimenti richiedono molto tempo e fatica, oltre che limitati in termini di flessibilità del modello. Inoltre, sia la modellazione UV profonda che la stampa a microcontatto sono più adatte per i materiali planari e sono tecnicamente difficili, se non impossibili, per modellare i ligandi in un ambiente 3D.

Per migliorare questi metodi convenzionali, Waterkotte et al. hanno combinato litografia senza maschera, deposizione chimica da vapore e termoformatura per generare substrati polimerici 3D micropatterned41. Tuttavia, questa tecnica si basa sull'uso di film polimerici termoformabili e offre una bassa risoluzione del modello proteico (7,5 μm), mentre le cellule sono state segnalate per rispondere a modelli geometrici di proteine piccole come 0,1 μm 2,42. Sevcik et al. hanno descritto un altro metodo promettente per nanopattern ligandi ECM su substrati contenenti topografie nano- e micrometriche43. Utilizzando la stampa a microcontatto, le proteine ECM sono state trasferite dai timbri di polidimetilsilossano (PDMS) a un substrato poli(N-isopropilacrilammide) termoreattivo (pNIPAM). Successivamente, la proprietà termoresponsiva della rete pNIPAM ha permesso loro di trasferire il modello proteico bidimensionale (2D) su un substrato PDMS topografico (scanalature profonde 10-100 μm), controllando così la localizzazione dei siti di adesione su caratteristiche topografiche. Tuttavia, non tutte le possibili microtopografie possono essere modellate poiché i problemi di bagnabilità ridotti rendono più difficile modellare substrati topografici più profondi. Le trincee con un rapporto profondità-larghezza di 2,4 sono state segnalate come il limite ultimo per trasferire con successo il modello al substrato topografico43. Inoltre, la flessibilità dei modelli variabili e la risoluzione dei modelli generati sono scarsi a causa della necessità di stampa a microcontatto.

Questo documento descrive un metodo che supera i colli di bottiglia sopra menzionati e offre un metodo flessibile e ad alto rendimento per creare substrati multicue che possono essere utilizzati per la coltura cellulare (vedere la Figura 1). Geometrie fisiologicamente rilevanti (cilindri, cupole, ellissi e superfici di sella) con curvature che vanno da ĸ = 1/2500 a ĸ = 1/125 μm-1 sono preprogettate e microfabbricate in chip PDMS. Successivamente, i segnali di guida dei contatti vengono creati sopra le geometrie 3D utilizzando una varietà di modelli digitali utilizzando una tecnica di fotopatterning con una risoluzione di 1,5 μm44. A tal fine, i chip PDMS vengono inizialmente passivati per impedire l'adesione di cellule e proteine; questo strato di passivazione può quindi essere rimosso combinando il fotoiniziatore 4-benzoilbenzil-trimetilammonio cloruro (PLPP) e l'esposizione alla luce UV45. Una maschera digitale è progettata per specificare le posizioni di esposizione ai raggi UV e, quindi, l'area in cui viene rimosso lo strato di passivazione. Le proteine possono successivamente aderire a queste aree, consentendo l'attaccamento cellulare. Poiché la modellazione viene eseguita utilizzando una maschera digitale (piuttosto che fisica), è possibile creare rapidamente una varietà di modelli senza il fastidio e i costi associati alla progettazione e alla fabbricazione di fotomaschere aggiuntive. Inoltre, una vasta gamma di proteine ECM (ad esempio, collagene di tipo I, gelatina e fibronectina) può essere modellata sul substrato. Sebbene questo protocollo venga eseguito utilizzando chip di coltura cellulare in PDMS, il principio può essere applicato a qualsiasi altro materiale di interesse46.

Protocol

Negli studi descritti in questo protocollo, sono stati utilizzati cheratociti umani primari. Questa ricerca è stata eseguita in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki. I cheratociti primari sono stati isolati dai tessuti corneosclerali cadaverici umani rimanenti dalla chirurgia di cheratoplastica endoteliale della membrana Descemet, che sono stati ottenuti dal Dipartimento cornea del Centro multitessile ETB-BISLIFE (Beverwijk, Paesi Bassi) dopo aver ottenuto il consenso dei parenti più prossimi di tutti i donatori deceduti.

NOTA: vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, i reagenti, le apparecchiature e il software utilizzati in questo protocollo.

1. Fabbricazione di substrati di colture cellulari 3D

  1. Creare uno stampo di vetro negativo (#1) contenente tutte le caratteristiche di interesse, in questo caso, realizzato in vetro utilizzando una tecnica di scrittura diretta laser a femtosecondi (vedere figura 2).
  2. Posizionare con attenzione lo stampo di vetro negativo (#1) sul fondo di una capsula di Petri.
  3. Preparare un prepolimero PDMS posizionando un tubo conico vuoto da 50 ml su una bilancia, tarare la bilancia e versare la quantità desiderata di base di elastomero siliconico nel tubo.
  4. Aggiungere l'agente polimerizzante utilizzando un pipetto Pasteur in modo che il rapporto finale tra base di elastomero e agente polimerizzante sia 10:1 (p/p).
  5. Mescolare accuratamente i componenti nel tubo conico usando una spatola.
  6. Centrifugare a 2.000 × g per 70 s per rimuovere tutte le bolle d'aria.
  7. Versare il prepolimero PDMS sopra lo stampo di vetro negativo (#1) nella piastra di Petri per coprirlo completamente.
  8. Posizionare la capsula di Petri con lo stampo in vetro negativo (#1) e il prepolimero PDMS nell'essiccatore sottovuoto e avviare la pompa per vuoto. Una volta raggiunto il vuoto, attendere 5 minuti per rimuovere tutte le bolle presenti all'interfaccia tra la superficie dello stampo e il prepolimero PDMS.
  9. Rimuovere il vuoto e togliere la capsula di Petri dall'essiccatore.
  10. Polimerizzare il prepolimero PDMS durante la notte in forno a 65 °C.
  11. Rimuovere con attenzione il chip PDMS positivo appena polimerizzato (#2) dallo stampo di vetro negativo (#1) sollevando i bordi del PDMS usando una spatola. Se il chip PDMS positivo (#2) tende ad aderire allo stampo di vetro negativo (#1), aggiungere etanolo o acqua ai bordi dell'impronta durante il sollevamento.
    NOTA: il fluido scorrerà tra i due strati e faciliterà la separazione dello stampo di vetro negativo (#1) e del chip PDMS positivo (#2).
  12. Usando una lama, tagliare i lati del chip PDMS positivo (# 2) in modo che rimanga un chip rettangolare.
  13. Posizionare il chip PDMS positivo (#2) in un essiccatore accanto a un piccolo flaconcino con una goccia di tridecafluoro (1,1,2,2-tetraidroottil)triclorosilano, un agente di silanizzazione, e lasciare sotto vuoto durante la notte.
    NOTA: la silanizzazione assicurerà che l'impronta non si leghi ad altri livelli PDMS più avanti nel protocollo. Altri agenti e/o metodi di silanizzazione possono anche funzionare per garantire che le superfici dei chip PDMS non si attacchino ad altri strati PDMS.
    ATTENZIONE: Tridecafluoro(1,1,2,2-tetraidroottil)triclorosilano è infiammabile (H226) e provoca gravi ustioni cutanee e danni agli occhi (H314). Indossare dispositivi di protezione individuale, lavorare in una cappa aspirante e lavarsi accuratamente le mani dopo la manipolazione. Tenere l'agente di silanizzazione lontano da calore, superfici calde, scintille, fiamme libere e altre fonti di accensione. Conservare tra 15 e 30 °C (P280, P210, P240, P403, P235, P310).
  14. Rimuovere il vuoto e posizionare il chip PDMS positivo (#2) sul fondo di una capsula di Petri. Versare il prepolimero PDMS (10:1) sulla parte superiore per produrre più stampi PDMS negativi (#3).
  15. Mettere la capsula di Petri sotto vuoto nell'essiccatore per 15 minuti per rimuovere tutte le bolle.
  16. Polimerizzare il prepolimero PDMS a 65 °C durante la notte, dopo di che lo stampo PDMS negativo (#3) può essere staccato dal chip PDMS positivo (#2) usando una spatola.
  17. Silanizzare lo stampo PDMS negativo finale (#3) usando l'agente di silanizzazione in un essiccatore sottovuoto durante la notte.
  18. Produrre più chip di coltura cellulare (#4, vedi Figura 2) di circa 5 mm di spessore versando il prepolimero PDMS nello stampo PDMS negativo (#3), rimuovendo le bolle usando l'essiccatore e polimerizzando per 3 ore a 65 °C. Con una lama di rasoio, tagliare il chip fino alla dimensione finale come visualizzato nella Figura 2. Conservare i chip a temperatura ambiente.
    NOTA: la rugosità superficiale può influenzare la risposta cellulare. Se necessario, un ulteriore strato sottile di PDMS può essere utilizzato come rivestimento sul chip PDMS positivo (n. 2) per levigare la superficie. Per fare ciò, versare una piccola goccia di prepolimero PDMS sul chip e distribuirla sul chip completo utilizzando aria pressurizzata. Polimerizzare il truciolo rivestito a 65 °C per 3 ore e continuare con il passaggio 1.12.

2. Fabbricazione di campioni PDMS piatti (campioni di controllo)

  1. Preparare il prepolimero PDMS (10:1) secondo i passaggi 1.3-1.6.
  2. Posizionare una copertura di vetro sul palo del vuoto arrotondato al centro della centrifuga.
  3. Accendere il vuoto per fissare il coperchio di vetro alla macchina e pipettare una goccia di PDMS nel mezzo del coperchio utilizzando un pipetto Pasteur.
  4. Distribuire il prepolimero PDMS sul substrato di vetro utilizzando il seguente protocollo per ottenere uno strato di circa 10 μm di spessore.
    1. Spincoat per 10 s a 0,45 × g, accelerazione: 0,2 × g/s.
    2. Spincoat per 50 s a 44,8 × g, accelerazione: 0,54 × g/s.
  5. Spegnere l'aspirapolvere, rimuovere il coperchio dalla cappa di centrifuga usando una pinzetta e metterlo in una capsula di Petri. Polimerizzare il PDMS durante la notte in forno a 65 °C e conservare successivamente a temperatura ambiente.

3. Passivazione del substrato dei substrati di coltura cellulare 3D

  1. Attivare i gruppi ossidrilici sulla superficie del chip PDMS (#4) usando O2-plasma. Usando una pinzetta, posiziona il chip nel cestello dell'asher al plasma.
  2. Eseguire un ciclo di incenerimento utilizzando una potenza di 20 W per 30 s. Sfiatare la camera di cenere utilizzando N2.
  3. Estrarre il chip dal cestello e metterlo in un piccolo contenitore PDMS (vedere la Figura 1).
  4. Utilizzando un pipetto Pasteur, aggiungere 500 μL di Poli-L-lisina (PLL, 0,01%) sulla parte superiore del chip in modo che l'intera superficie sia immersa nella soluzione PLL. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
  5. Rimuovere 450 μL di PLL dal chip di coltura cellulare con un pipetto e risciacquare la superficie del truciolo tre volte con 500 μL di tampone HEPES da 0,1 M (8 < pH < 8,5). Lasciare sempre un piccolo volume di liquido sul chip PDMS per evitare l'essiccazione del campione, il che ridurrà la qualità del modello finale.
  6. Produrre 500 μL di un 50 mg/mL metossipolietilenglicole-succinimidil valerato (mPEG-SVA; MW 5.000 Da) in tampone HEPES da 0,1 M (8 < pH < 8,5) per chip di coltura cellulare e lasciarlo incubare sul campione per 60 min. Poiché mPEG-SVA ha un'emivita di 15 minuti, assicurarsi di preparare la quantità richiesta appena prima dell'uso.
    NOTA: mPEG-SVA viene sciolto quando la soluzione è completamente trasparente.
  7. Rimuovere 450 μL della soluzione mPEG-SVA utilizzando un micropipetto e lavare la superficie del truciolo cinque volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Assicurarsi di pipettare su e giù più volte per lavaggio per assicurarsi che tutti gli mPEG-SVA non legati vengano rimossi. Per evitare che il campione si secchi, ridurre al minimo il tempo tra le fasi di lavaggio e assicurarsi di utilizzare un eccesso (500 μL o più) di PBS per il lavaggio.
  8. Conservare i campioni immergendoli in PBS o continuare fino alla fase di creazione del modello del protocollo.
    NOTA: se lo si desidera, la passivazione può essere eseguita in condizioni sterili quando si lavora in un armadio di coltura e si lavora con soluzioni e attrezzature sterili.

4. Conservazione di substrati di coltura cellulare modellati

NOTA: i substrati di coltura cellulare 3D possono essere memorizzati durante le diverse fasi del processo.

  1. Conservare i chip di coltura cellulare PDMS polimerizzati in condizioni asciutte a temperatura ambiente.
  2. Conservare i chip di coltura cellulare passivata in uno dei due modi seguenti:
    1. Conservare in PBS a 4 °C per un massimo di 7 giorni.
    2. Conservare in condizioni asciutte per un massimo di diversi mesi. Per ottenere campioni asciutti, rimuovere il PBS e risciacquare più volte con acqua doppia distillata (ddH2O). Asciugare con una pistola ad azoto o ad aria compressa.

5. Progettazione di maschere digitali utilizzate per il photopatterning

NOTA: la modellazione di substrati 3D può essere eseguita utilizzando uno o più piani focali (vedere la Figura 3). Un singolo piano focale può essere utilizzato su caratteristiche che non sono più grandi di un dispositivo a specchio digitale (DMD, circa 300 μm x 500 μm) e che non sono troppo alte (50-100 μm). In tal caso, progettare un modello digitale utilizzando la modalità TIFF. Per le feature che superano le dimensioni di una DMD e sono relativamente alte, dividere il pattern del substrato in più passaggi. In questo caso, più modelli vengono progettati utilizzando la modalità PDF che si concentrano tutti individualmente su singoli piani focali.

  1. Progetta una maschera digitale utilizzando strumenti software di progettazione.
    1. Creazione di motivi in modalità TIFF (pixel): crea una tavola da disegno completamente nera di 1.140 x 1.824 pixel (la dimensione esatta di 1 DMD, circa 300 μm x 500 μm) e riempi la tavola da disegno con le forme di interesse. Esportare la tavola da disegno come file TIFF a 8 bit.
      NOTA: diversi livelli di grigio nella progettazione del modello determinano la quantità di esposizione che verrà eseguita in quella posizione.
    2. Creazione di motivi in modalità PDF (unità metriche): crea una tavola da disegno nera della dimensione desiderata in mm e riempi la tavola da disegno con qualsiasi forma di interesse. Dividere il modello in più file se il substrato 3D deve essere modellato utilizzando più piani focali. Salvare la tavola da disegno come file PDF.
      NOTA: diversi livelli di grigio nella progettazione del modello determinano la quantità di esposizione che verrà eseguita in quella posizione.

6. Fotopattering UV di substrati di colture cellulari 3D

  1. Taratura
    NOTA: La calibrazione del laser viene eseguita per ottenere la corretta messa a fuoco sul materiale di interesse. Poiché i substrati di coltura cellulare PDMS sono troppo spessi per essere modellati, utilizzare un vetrino su cui il chip è posizionato a testa in giù. Poiché il laser incontra prima la diapositiva di vetro, utilizzare il vetro per calibrare il laser.
    1. Applicare l'evidenziatore fluorescente su una coverlip di vetro e posizionare il coverslip di vetro nella fase del microscopio fluorescente. Assicuratevi che la superficie evidenziata sia rivolta verso l'alto.
    2. Accendi il microscopio e l'apparecchiatura PRIMO e apri Micro-manager per accedere al software Leonardo sotto 'plugin'.
    3. Scegli Calibrazione nel menu iniziale, quindi seleziona l'obiettivo 20x sia sul microscopio che nel software. Fare clic su Avanti.
    4. Posizionare il vetrino con evidenziatore fluorescente nel percorso ottico del microscopio. Passa alla modalità fluorescente e concentrati attentamente sull'immagine PRIMO che appare, assicurandoti che sia il logo che il testo siano a fuoco. Fare clic su Avanti per completare la procedura di calibrazione.
    5. Annotare la posizione Z dello stadio durante la calibrazione e utilizzare questa posizione come riferimento più avanti nel protocollo.
      NOTA: il materiale di calibrazione deve corrispondere al materiale utilizzato per la creazione di modelli più avanti nel protocollo. I passaggi precedenti descrivono la calibrazione necessaria per i substrati di coltura cellulare. Per la calibrazione di campioni di controllo PDMS piatti, applicare un evidenziatore fluorescente sopra un ulteriore campione PDMS piatto e calibrare utilizzando i passaggi 6.1.2-6.1.5.
  2. Creazione di serie di feature 3D utilizzando un singolo piano focale
    NOTA: la creazione di serie utilizzando un singolo piano focale viene eseguita su feature 3D che non superano le dimensioni di una DMD (circa 300 μm x 500 μm). Uno schema della configurazione del piano focale è illustrato nella Figura 3.
    1. Rimuovere il vetrino di calibrazione dallo stadio e posizionare un vetrino contenente una goccia (~ 50 μL) di fotoiniziatore (PLPP) nello stadio.
      ATTENZIONE: PLPP è irritante per gli occhi, il sistema respiratorio e la pelle (R36-38). Indossare dispositivi di protezione individuale, tenerli lontani da materiali esplosivi, non aggiungere mai acqua a questo prodotto, adottare misure precauzionali contro le scariche statiche ed evitare urti e attriti (S26-36).
    2. Posizionare il substrato di coltura cellulare PDMS capovolto nella goccia del fotoiniziatore. Assicurarsi che le caratteristiche 3D sulla superficie del substrato di coltura cellulare siano rivolte verso il vetrino e siano completamente immerse in PLPP per garantire una corretta modellazione.
    3. Selezionare Pattern nel software.
    4. Passare alla modalità brightfield sul microscopio e spostare il palco sulla caratteristica di interesse.
    5. Concentrarsi sulla parte superiore o inferiore delle strutture convesse e concave rispettivamente (Figura 3).
    6. Selezionate PRIMO per inserire un pattern a scelta. Osservate l'anteprima del modello in arancione sopra l'immagine in chiaro dal vivo.
    7. Regolate le impostazioni di pattern in base alla feature (posizione, angolo, ripetizioni) e selezionate una dose di 1.000 mJ/mm2.
    8. Fare clic su Blocca e passare il microscopio alla modalità fluorescente .
    9. Fai clic sul pulsante Riproduci nella parte inferiore destra dello schermo per avviare la creazione di modelli. Una volta terminato, osserva il motivo visualizzato in verde.
    10. Una volta terminato con tutte le caratteristiche su un chip di coltura cellulare, rimuovere il chip dalla diapositiva di creazione del modello e conservarlo in PBS a 4 °C.
  3. Creazione di serie di feature 3D utilizzando più piani focali
    NOTA: la creazione di serie utilizzando più piani focali viene eseguita su feature 3D più grandi di una DMD (circa 300 μm x 500 μm) o relativamente alte. In questo caso, le feature 3D devono essere modellate in più passaggi, ovvero il design del pattern deve essere adattato in base all'esempio riportato nella Figura 3.
    1. Rimuovere il vetrino di calibrazione dallo stadio e posizionare un vetrino contenente una goccia (~ 50 μL) di fotoiniziatore (PLPP) nello stadio.
    2. Posizionare il chip di coltura cellulare PDMS capovolto nella goccia del fotoiniziatore usando una pinzetta.
    3. Selezionare Pattern nel software. Passare alla modalità brightfield sul microscopio e spostare il palco sulla caratteristica di interesse.
    4. Concentrati sull'area del chip nella giusta posizione. Poiché la creazione di serie viene eseguita su un singolo piano focale e le feature sono più grandi di una singola DMD, utilizzare più piani focali e quindi più cicli di creazione di serie per substrato 3D per garantire una risoluzione sufficiente della serie lungo l'altezza e la larghezza complete della feature (vedere la Figura 3). Ad esempio, per una feature con un'altezza di 150 μm, create una serie della feature in tre arrotondamenti (± 1 piano focale per 50 μm di corsa Z), concentrando la messa a fuoco intorno a 25 μm, 75 μm e 125 μm dalla parte inferiore della feature. Assicurarsi che la parte inferiore della feature sia intorno al valore annotato nel passaggio 6.1.5.
    5. Selezionate PRIMO per inserire il pattern scelto. Osservate l'anteprima del modello mostrata in arancione sopra l'immagine in chiaro dal vivo.
    6. Regolare le impostazioni di pattern in base alla feature (posizione, angolo) e selezionare una dose di 1.000 mJ/mm2.
    7. Fare clic su Blocca e passare il microscopio alla modalità fluorescente .
    8. Fai clic sul pulsante Riproduci nella parte inferiore destra dello schermo per avviare la creazione di modelli. Una volta terminato, osserva il motivo visualizzato in verde.
    9. Ripetere i passaggi 6.3.4-6.3.8 sulla caratteristica di interesse quando vengono utilizzati più piani focali.
    10. Una volta terminato con tutte le caratteristiche su un chip di coltura cellulare, rimuovere il chip dalla diapositiva di creazione del modello e conservarlo in PBS a 4 °C.
      NOTA: Se lo si desidera, applicare il fotopatterning UV in condizioni sterili, facendo uso di piastre di Petri con fondo di vetro e preparare tutti i substrati in armadi di coltura sterili. Conservare i campioni modellati in PBS per un massimo di un paio di settimane. Se lavati con ddH2O e asciugati con aria pressurizzata, i campioni possono essere conservati fino a pochi mesi a 4 °C.

7. Incubazione delle proteine

NOTA: Si consiglia di utilizzare substrati appena incubati da proteine per la coltura cellulare. Procedere a questa parte del protocollo solo se la semina cellulare (passaggio 8) viene eseguita direttamente dopo.

  1. Trasferire il chip di coltura cellulare modellato in contenitori PDMS sterili nell'armadio di coltura.
  2. Lavare i chip di coltura cellulare modellati 3 volte con un eccesso di PBS sterile se il pattern non è stato eseguito in condizioni sterili.
  3. Preparare una soluzione proteica fresca in PBS.
    1. Fibronectina: aggiungere 2 mL di PBS utilizzando un micropipetto a un flaconcino di 20 μg di fibronectina marcata con rodamina per ottenere una concentrazione di 10 μg/mL. Pipettare delicatamente per evitare la formazione di grumi proteici e proteggere dalla luce.
    2. Gelatina: scongelare un'aliquota di 200 μL di gelatina-fluoresceina disciolta. Proteggere dalla luce.
  4. Aggiungere 200-500 μL della soluzione proteica al chip di coltura cellulare utilizzando un micropipetto. Regolare il tempo di incubazione e la temperatura a seconda della proteina scelta: Fibronectina: 5 min a temperatura ambiente, Gelatina: 15 min a 37 °C. Assicurati di coprire il campione (ad esempio, con un foglio di alluminio).
  5. Rimuovere la soluzione proteica e lavare 5 volte con 500 μL di PBS sterile. Assicurati di pipettare il PBS su e giù più volte sopra tutte le caratteristiche rilevanti del chip di coltura cellulare per rimuovere qualsiasi proteina non legata.
    NOTA: durante le fasi di lavaggio, è fondamentale che il campione non si asciughi mai. Quando si rimuove la soluzione proteica o PBS durante il lavaggio, aggiungere immediatamente nuovo PBS per evitare la formazione di grumi proteici (vedere Figura 4). Le caratteristiche convesse sono particolarmente sensibili all'essiccazione in quanto sono elevate sopra la superficie del substrato.
  6. Facoltativo: rivedere i modelli proteici al microscopio a fluorescenza. Mantenere i campioni sterili e immersi in PBS.

8. Semina cellulare

NOTA: Questo protocollo utilizza cheratociti primari umani e fibroblasti dermici umani. I cheratociti sono stati prelevati da tessuto corneale umano da pazienti, in linea con le linee guida olandesi per l'uso secondario dei materiali, e precedentemente caratterizzati come cheratociti47. Queste cellule vengono coltivate in DMEM integrato con il 5% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di penicillina/streptomicina (P/S) e 1 mM di acido L-ascorbico 2-fosfato sesquimagnesio sale idrato (vitamina C) a 37 °C per un massimo di quattro passaggi. I fibroblasti dermici umani sono stati acquistati e coltivati in DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di P/S a 37 °C per un massimo di 15 passaggi. Per la semina di cheratociti e fibroblasti dermici sul chip di coltura cellulare fotopatterato, sono state utilizzate 20.000 cellule per chip.

  1. Staccare le cellule di interesse (ad esempio, usando la tripsina) e preparare 1 mL di una sospensione cellulare di ± 10.000-50.000 cellule / mL in terreno di coltura per chip. Regolare il numero esatto di celle aggiunte per substrato in base alle dimensioni della cella e alla lettura desiderata.
  2. Rimuovere il PBS dal chip di coltura cellulare e aggiungere 1 mL di sospensione cellulare.
  3. Trasportare delicatamente il chip di coltura cellulare con le cellule all'incubatore e incubare per 60 minuti a 37 °C.
  4. Controllare l'adesione delle cellule sul chip di coltura cellulare modellato al microscopio a campo luminoso. Cercare morfologie cellulari allungate nel caso di schemi lineari (vedi Figura 5). Se le cellule hanno iniziato ad aderire anche al di fuori dell'area modellata, rimuoverle pipettando il mezzo su e giù direttamente sopra le cellule sul substrato.
    NOTA: le celle attaccate all'area di cui è stata creata una serie rimarranno attaccate, mentre le celle al di fuori delle aree di cui è stata creata una serie verranno scollegate.
  5. Rimuovere il chip di coltura cellulare dal contenitore PDMS e utilizzare pinzette sterili per metterlo in una piastra a 6 pozzetti riempita con ~ 5 ml di terreno di coltura.
  6. Coltiva le cellule per il periodo di tempo desiderato. Sostituire il terreno di coltura cellulare ogni 2-3 giorni. Per garantire la visualizzazione del modello proteico dopo la coltura cellulare, ridurre la quantità di esposizione del campione alla luce durante la coltura.

9. Colorazione, acquisizione e analisi delle immagini

  1. Fissazione e colorazione
    1. Dopo la lunghezza desiderata della coltura, rimuovere quasi tutto il mezzo e lavare tre volte con PBS in eccesso. Successivamente, incubare con formalina al 3,7% per 15 minuti a temperatura ambiente seguita da tre fasi di lavaggio con PBS per 5 minuti per lavaggio a temperatura ambiente. Non lasciare mai asciugare il campione.
      ATTENZIONE: La formalina è dannosa se ingerita o se inalata (H302, H332), può causare una reazione allergica cutanea (H317), è sospettata di causare difetti genetici (H341) e può causare il cancro (H350). Indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare in una cappa aspirante.
    2. Macchiare il substrato di coltura cellulare con gli agenti o gli anticorpi coloranti desiderati. Per ridurre i volumi di agenti coloranti, posizionare i chip di coltura cellulare capovolti in una goccia di soluzione colorante pipettata su un vetrino.
    3. Conservare i campioni in PBS (a breve termine) o attaccati a un coperchio utilizzando un mezzo di montaggio (a lungo termine) a 4 °C.
  2. Acquisizione di immagini
    1. Posizionare il campione colorato a testa in giù in una goccia di PBS su un vetrino. Metti il campione nella fase di un microscopio confocale.
    2. A seconda del livello di dettaglio richiesto, crea Z-stack con un obiettivo adatto (10x, 20x o 40x) e una spaziatura Z per garantire una corretta acquisizione delle immagini.
  3. Analisi e visualizzazione delle immagini
    1. Aprire i file di immagine raw nel software di analisi delle immagini e verificare che le proprietà dell'immagine (ad esempio, dimensioni, risoluzione) siano corrette.
    2. Regola la luminosità e il contrasto per canale, se necessario.
    3. Ritaglia la regione di interesse contenente il modello e le celle.
    4. Facoltativo: eseguire una fase di deconvoluzione, se necessario.
    5. Creare un rendering 3D dello Z-stack utilizzando un software di rendering 3D.
    6. Ottimizza le impostazioni di contrasto e guadagno per ogni singolo canale.
    7. Per creare un'immagine del rendering 3D, create un'istantanea ed esportatela come . TIFF.
    8. Per creare un filmato del rendering 3D, impostate il fotogramma iniziale e finale, nonché l'intervallo di tempo prima di registrare il filmato. Esporta come .avi.

Representative Results

Per mezzo del protocollo descritto, i substrati di coltura cellulare 3D PDMS possono essere fotopatterizzati UV per creare aree adesive precise e ad alta produttività adatte per il fissaggio cellulare. In questo modo, le cellule sono sottoposte contemporaneamente sia a geometrie rilevanti del substrato che a modelli di ligando adesivo. Le proprietà cellulari come l'orientamento, l'area cellulare e il numero di aderenze focali possono essere facilmente monitorate e utilizzate per comprendere meglio il comportamento cellulare in ambienti complessi e simili a quelli in vivo.

Per verificare gli eventi di patterning sui substrati 3D PDMS, le composizioni superficiali atomiche del materiale in diverse fasi del protocollo sono state misurate utilizzando la spettroscopia fotoelettronica a raggi X atomici (XPS)48. In sintesi, le misurazioni XPS hanno mostrato la presenza di catene PEG con un aumento del segnale di carbonio su campioni passivati, che è stato ridotto dopo la fotopattering. L'incubazione con fibronectina ha comportato un aumento del segnale di carbonio, indicando ancora una volta un'adesione proteica riuscita sulla superficie del chip di coltura cellulare. Successivamente, la risoluzione del modello e l'allineamento sulle caratteristiche 3D sono stati caratterizzati su una varietà di fosse concave a forma di cerchio (ĸ = 1/250 μm-1, ĸ = 1/1.000 μm-1 e ĸ = 1/3.750 μm-1, vedi Figura 6). Dalle proiezioni di massima intensità, si può concludere che il modello proteico è stato modellato con successo su tutte e tre le caratteristiche 3D. Il profilo di intensità nella Figura 6A mostra un'alta risoluzione del modello con transizioni nitide tra aree modellate e non modellate. Inoltre, è stata ottenuta un'intensità proteica costante in tutto il modello completo nella fossa.

La fossa concava con ĸ = 1/250 μm-1 è stata modellata usando il metodo del piano focale singolo (un modello), mentre le fosse con ĸ = 1/1.000 μm-1 e ĸ = 1/3.750 μm-1 sono state modellate usando rispettivamente due e tre piani focali (modelli). Come si può vedere nelle proiezioni di massima intensità nella Figura 6, entrambi i metodi si traducono in un perfetto allineamento dei modelli sopra le feature. Non si possono osservare transizioni disallineate tra i due diversi piani focali e modelli.

Utilizzando il protocollo descritto, è possibile applicare una vasta gamma di modelli proteici a una varietà di geometrie (vedere figura 7 e video 1). Per illustrare la versatilità di questo metodo, i semicilindri (convessi e concavi), una superficie della sella e una fossa sono stati modellati utilizzando linee e cerchi di varie larghezze. I materiali fotopatterati possono essere successivamente utilizzati per la coltura cellulare (vedere Figura 7, Figura 8, Video 2, Video 3 e Video 4). Un esempio di fibroblasti dermici coltivati su un semicilindro concavo modellato (linee di fibronectina, rosso, largo 5 μm e spazi vuoti di 5 μm) è mostrato in Figura 8, Figura 9 e Video 4. Durante l'esperimento, le cellule percepiscono e aderiscono al substrato di coltura cellulare multicue e rimangono vitali nel tempo. Come si può vedere dalla colorazione immunofluorescente in Figura 8, le cellule formano aderenze focali (grappoli di vinculina) principalmente sulle linee di fibronectina.

Un altro esempio di studio che fa uso di questi materiali di coltura cellulare è stato recentemente pubblicato dal nostro gruppo48. In questo studio, i miofibroblasti umani e le cellule endoteliali sono stati sottoposti alla combinazione di segnali di guida di contatto e topografie geometriche. In vivo, entrambi i tipi di cellule sperimentano segnali di guida alla curvatura e al contatto nei tessuti nativi come nella vascolarizzazione umana. Sottoponendo le cellule in vitro a un ambiente che combina entrambi i segnali ambientali, la situazione in vivo può essere ricapitolata, fornendo una comprensione più profonda del ruolo del microambiente sul comportamento cellulare. I miofibroblasti umani hanno dimostrato di allinearsi con i segnali di guida di contatto (linee parallele di fibronectina) su substrati cilindrici concavi48. Tuttavia, su strutture convesse con curvature crescenti, i segnali geometrici hanno annullato i segnali biochimici, suggerendo che i miofibroblasti possono percepire sia il grado che il segno di curvatura. È interessante notare che le cellule endoteliali potrebbero aderire solo ai substrati multicuo concavi e non ai substrati PDMS convessi. Su substrati concavi modellati su proteine, le cellule endoteliali sono orientate nella direzione del segnale di guida del contatto. Questa fondamentale conoscenza in vitro ha rilevanza fisiologica nel campo dell'ingegneria dei tessuti vascolari e può eventualmente aiutare nella progettazione di costrutti di ingegneria tissutale intelligente.

Figure 1
Figura 1: La sequenza temporale sperimentale dell'applicazione dei segnali di guida del contatto su substrati di coltura cellulare 3D. In primo luogo, i chip di coltura cellulare positivi sono prodotti da uno stampo PDMS negativo contenente una gamma di geometrie. Il PDMS non polimerizzato viene versato nello stampo e indurito per 3 ore a 65 °C. Successivamente, il PDMS viene trattato con O2-plasma e incubato con PLL e mPEG-SVA (blu, etichettato) per passivare la superficie del substrato di coltura cellulare. Dopo il lavaggio, il substrato viene capovolto in una goccia di fotoiniziatore (PLPP, verde, etichettato) e fotopatterato UV utilizzando l'approccio LIMAP. Qui, una maschera digitale con un modello definito dall'utente viene utilizzata per fendere il livello di passivazione in posizioni definite. Successivamente, una soluzione proteica (rossa, etichettata) può essere incubata e aderirà solo alle posizioni in cui viene rimosso lo strato di passivazione. Le cellule seminate sul substrato sono sottoposte sia alla geometria che ai modelli proteici, il che consente la ricerca sul comportamento cellulare in ambienti complessi che imitano in vivo. Abbreviazioni: PDMS = polidimetilsilossano; mPEG-SVA = metossipolietilenglicole-succinimidil valerato; PLPP = cloruro di 4-benzoilbenzil-trimetilammonio; LIMAP = Adsorbimento molecolare indotto dalla luce delle proteine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Diverse fasi durante la produzione e la passivazione del substrato di coltura cellulare 3D. Lo stampo in vetro negativo (#1) è progettato con software di progettazione assistita da computer e prodotto utilizzando una tecnica di scrittura diretta laser a femtosecondi. Questo stampo viene utilizzato per produrre il chip PDMS positivo intermedio (#2) e lo stampo PDMS negativo (#3), che vengono successivamente utilizzati per produrre il chip di coltura cellulare finale (#4). Abbreviazione: PDMS = polidimetilsilossano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Illustrazione schematica dei due metodi di patterning. A sinistra: il fotopatterning UV viene eseguito su feature più piccole (circa una DMD) utilizzando un singolo piano focale e un singolo pattern. Di conseguenza, la feature completa viene modellata in una volta sola. A destra: quando vengono utilizzate feature più grandi (più grandi di una DMD), la creazione di serie viene divisa su più piani focali e modelli. Abbreviazione: DMD = dispositivo specchio digitale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Un tipico esempio di substrato normale e essiccato di proteine incubate. Proiezioni di massima intensità (XY) e viste ortogonali (XZ) di substrati incubati proteici normali e essiccati. Quando si lava un substrato di coltura cellulare modellato dopo l'incubazione con una soluzione proteica, è fondamentale mantenere sempre il campione bagnato. Sebbene il modello sia identico in tutte le immagini sulle caratteristiche (ĸ = 1/1.000 μm-1), la gelatina-fluoresceina (verde) si è aggregata formando un grande grumo quando il campione è stato lasciato asciugare per alcuni secondi. Se il campione rimane sempre bagnato, è possibile osservare modelli proteici corretti. Barre di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Immagini Brightfield dopo la semina. Cheratociti primari (a sinistra) e fibroblasti dermici (a destra) 4 ore dopo la semina su caratteristiche geometriche 3D (fossa concava di ĸ = 1/1.000 μm-1 e semicilindri di ĸ = 1/500, 1/375, 1/250, 1/175 e 1/125 μm-1). Gli inserti in alto a sinistra rappresentano il modello di linea utilizzato per la creazione di serie delle geometrie. Le frecce bianche indicano le celle di diffusione che già mostrano l'allineamento. Barre di scala = 250 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Caratterizzazione di modelli circolari su pozzi concavi. (A) La proiezione di massima intensità (XY) e la vista ortogonale (XZ) di una fossa concava (ĸ = 1/250 μm-1) modellata utilizzando LIMAP (larghezza della linea: 20 μm, larghezza dello spazio: 20 μm) e incubata con gelatina-fluoresceina (verde). Il profilo di intensità lungo la linea bianca viene tracciato rispetto alla distanza, mostrando una qualità e una risoluzione del modello coerenti. (B) Patterning aggiuntivo eseguito su pozzi concavi con ĸ = 1/1.000 μm-1 e ĸ = 1/3750 μm-1, mostrando flessibilità in termini di caratteristiche geometriche che possono essere utilizzate per la modellazione. Anche in questo caso, vengono visualizzate sia le proiezioni di massima intensità (XY) che le viste ortogonali (XZ). Barre di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Dati al microscopio 3D di strutture modellate. Esempi tipici di materiali di coltura cellulare modellati in 3D dopo fotopattering e coltura cellulare, visualizzati utilizzando un software di rendering 3D. (A) Semicilindro convesso modellato con linee larghe 10 μm (rodamina-fibronectina, rosso) e spazi ampi 10 μm. Barra di scala = 5 μm. (B) Fibroblasti dermici colorati per F-actina (verde) coltivati su semicilindro concavo modellato con linee larghe 20 μm (rodamina-fibronectina, rosso) e 20 μm di spazi ampi. Barra della scala = 5 μm. (C) Superficie della sella modellata con linee larghe 20 μm (rodamina-fibronectina, rosso) e spazi ampi 20 μm. Barra della scala = 5 μm. (D) Fossa concava modellata con cerchi concentrici di linee larghe 20 μm (gelatina-fluoresceina, verde) e spazi vuoti larghi 20 μm. Il citoscheletro F-actina dei cheratociti umani viene colorato usando falloidina e visualizzato in rosso. Barra della scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Colorazione immunofluorescente di fibroblasti dermici umani su un semicilindro concavo fotopatterato. (A) Proiezione di intensità massima (XY) e sezioni ortogonali (XZ e YZ) di fibroblasti dermici umani coltivati per 24 ore su un semicilindro concavo modellato (linee di fibronectina, rosso, larghezza 5 μm e lacune di 5 μm). Le cellule sono colorate per F-actina (magenta), vinculina (verde) e nuclei (blu). Barra di scala = 100 μm. (B) Zoom-in di una cella aderente all'ambiente multicue. Barre di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Immagini timelapse Brightfield di fibroblasti dermici umani su un cilindro concavo modellato. Il semicilindro concavo (ĸ = 1/250 μm-1) è stato modellato con linee parallele (5 μm di larghezza e 5 μm di spazi vuoti) e incubato con rodamina-fibronectina prima della semina cellulare. L'imaging timelapse viene avviato 1 ora dopo la semina iniziale delle cellule (a sinistra, 0 min), quando le cellule sono ancora arrotondate e non aderenti (frecce). Dopo circa 24 ore (al centro, 1.420 minuti), le cellule hanno aderito al substrato multicue e mostrano una risposta di allineamento secondo il modello di guida del contatto. Sia la risposta di allineamento che la vitalità cellulare vengono mantenute per tutta la durata della coltura (a destra, 3.180 min). Barre di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Esempio di pattern su un substrato cilindrico 3D. Rappresentazione 3D di un cilindro convesso modellato con rodamina-fibronectina (rosso). Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Rappresentazione 3D di fibroblasti dermici coltivati su un substrato cilindrico 3D modellato (ĸ = 1/500 μm-1). Fibroblasti dermici coltivati per 24 ore su un semicilindro convesso modellato (linee di fibronectina, rosso, larghezza 10 μm e spazi vuoti di 10 μm). Le cellule sono colorate per F-actina (magenta), vinculina (verde) e nuclei (blu). Clicca qui per scaricare questo video.

Video 3: Rappresentazione 3D di cheratociti umani coltivati su una fossa 3D modellata (ĸ = 1/3.750 μm-1). Rappresentazione 3D di cheratociti umani coltivati per 24 ore in una fossa concava e modellata (cerchi di gelatina, verdi, larghezza 20 μm e spazi vuoti di 20 μm). Le cellule sono colorate per F-actina (rosso). Clicca qui per scaricare questo video.

Video 4: Imaging timelapse Brightfield di fibroblasti dermici umani su un cilindro concavo modellato. Il semicilindro concavo (ĸ = 1/250 μm-1) è stato modellato con linee parallele (5 μm di larghezza e 5 μm di spazi vuoti) e incubato con rodamina-fibronectina prima della semina cellulare. L'imaging timelapse viene avviato 1 ora dopo la semina cellulare iniziale, quando le cellule mostrano aderenza iniziale all'ambiente multicue. Durante il timelapse completo, le cellule si orientano prevalentemente lungo i segnali di guida del contatto, mentre la vitalità cellulare viene mantenuta. Clicca qui per scaricare questo video.

Discussion

Al giorno d'oggi, il comportamento cellulare è spesso studiato su substrati di coltura piatti che mancano della complessità del microambiente cellulare nativo. Ambienti 3D come scaffold e idrogel sono utilizzati come alternativa. Sebbene questi ambienti di coltura cellulare migliorino la rilevanza in vivo, sia gli studi sistematici sul comportamento cellulare che la fattibilità dei metodi di lettura rimangono impegnativi. Per studiare sistematicamente il comportamento cellulare su substrati di coltura rappresentativi, sono necessari substrati multicue coerenti che consentano la lettura microscopica. Pertanto, in questo protocollo, descriviamo un metodo per creare substrati di coltura cellulare multicue con geometrie fisiologicamente rilevanti e proteine ECM modellate. La sfida principale nel combinare segnali ambientali come la geometria dei tessuti e i segnali di guida al contatto su piattaforme in vitro è in gran parte di natura tecnologica. I metodi convenzionali per applicare segnali di guida al contatto (ad esempio, litografia morbida, pattern UV profondo e stampa a microcontatto35,36) ai materiali di coltura cellulare sono stati ottimizzati per substrati planari. La necessità di materiali di coltura cellulare 3D combinati con segnali di guida al contatto ha evidenziato diverse sfide tecnologiche, come lo scarso allineamento del modello, la risoluzione e la flessibilità. Per superare queste sfide, è possibile utilizzare un metodo di patterning ad alta produttività, senza maschera e basato sulla luce45,49. Qui, un microscopio ottico consente un preciso allineamento del modello e una risoluzione nell'ordine dei micrometri (vedi Figura 6). Inoltre, l'uso di una maschera digitale consente ai ricercatori di studiare il comportamento cellulare su una vasta gamma di modelli senza la necessità di fabbricare maschere fisiche ad alta intensità di lavoro.

L'approccio UV-photopatterning può essere utilizzato in combinazione con una varietà di geometrie 3D (ad esempio, cilindri, selle, cupole, pozzi) prodotte da una gamma di materiali48. I substrati di coltura cellulare 3D utilizzati in questo studio sono realizzati in PDMS; tuttavia, possono essere utilizzati anche altri materiali. Ciò potrebbe richiedere diversi passaggi per produrre il substrato di coltura cellulare finale contenente le caratteristiche di interesse. Poiché le cellule hanno dimostrato di essere sensibili alla rugosità superficiale dei materiali di coltura cellulare, è importante creare i chip di coltura cellulare con una superficie liscia in modo che la risposta delle cellule osservate possa essere pienamente attribuibile alla geometria 3D e ai segnali di guida del contatto50,51. Metodi di misurazione come la profilometria ottica, la microscopia elettronica a scansione o la microscopia a forza atomica possono essere utilizzati per misurare la rugosità superficiale. Dopo la fabbricazione del materiale di coltura cellulare, è possibile selezionare un metodo di pattern basato su uno o più piani focali dipendenti dalle dimensioni specifiche della caratteristica di interesse (vedere figura 3). Tipicamente, un singolo piano focale viene utilizzato per modellare un'area all'interno di un intervallo Z di circa 50 μm. La risoluzione del modello si è dimostrata coerente utilizzando questa regola empirica (vedere la Figura 6). Tuttavia, uno svantaggio di questo metodo è l'aumento del tempo di patterning con l'introduzione di più piani focali e modelli. Nella nostra mano, utilizzando più piani focali, le caratteristiche geometriche 3D fino a 16 mm x 16 mm x 0,17 mm (X x Y x Z) sono state modellate con successo con alta qualità del modello.

Inoltre, è importante ricordare che l'altezza (asse Z) delle feature geometriche che possono essere utilizzate in combinazione con questo protocollo è limitata. Poiché sia il fotopattering UV che molte letture cellulari si basano su una configurazione al microscopio, la distanza di lavoro degli obiettivi determina l'altezza massima di una caratteristica. Nella nostra mano, le geometrie che superano un'altezza di 300 μm possono ancora essere fotopatternate UV e le letture sono state eseguite utilizzando un microscopio confocale con obiettivi 40x. Pertanto, la ricerca meccanobiologica che va dalle scale intracellulari a quelle cellulari e tissutali è possibile utilizzando il protocollo descritto.

Un altro fattore che deve essere preso in considerazione è il rischio che i campioni si secchino durante o dopo il fotopattering UV49. Ciò è particolarmente rilevante quando si utilizzano geometrie 3D, poiché le convessità sono spesso esposte al di fuori dei materiali di coltura cellulare. Come mostrato nella Figura 4, ciò potrebbe comportare modelli non uniformi con aggregati proteici che si formano in cima alla caratteristica di interesse. Il lavaggio dei chip di coltura cellulare dopo l'incubazione delle proteine e durante la coltura cellulare è fondamentale per il corretto rivestimento delle geometrie 3D. Pertanto, si consiglia di lasciare sempre piccoli volumi di una soluzione di lavoro (PBS, PLPP, soluzione proteica, terreno di coltura cellulare) sopra il chip di coltura cellulare.

Finora, diversi rivestimenti proteici (fibronectina, collagene di tipo I e IV, gelatina, FNC) e tipi di cellule (cellule stromali del midollo osseo umano, miofibroblasti umani, cellule endoteliali umane, cheratociti umani e fibroblasti dermici) sono stati utilizzati in combinazione con l'approccio di fotopatterning descritto su materiali strutturati di coltura cellulare. Come dimostrato in un precedente studio48, l'ottimizzazione dei parametri di incubazione delle proteine è fondamentale per l'indagine sistematica in nuovi tipi di cellule. Pertanto, prima di eseguire un nuovo esperimento con nuove proteine o cellule, si consiglia di testare una gamma di concentrazioni proteiche, temperature di incubazione e tempi di incubazione. Confrontando la morfologia cellulare dopo l'adesione iniziale su aree piane omogenee e modellate con la morfologia cellulare in condizioni di coltura cellulare "normali", è possibile ottenere un insieme ottimizzato di parametri sperimentali. Inoltre, ogni tipo di cellula potrebbe richiedere una diversa quantità di tempo dopo la semina per mostrare una morfologia di adesione riconoscibile su uno specifico ambiente multicue (vedere la Figura 5). A tal fine, è fondamentale ottimizzare il tempo necessario per tipo di cella per presentare eventi di contatto sull'area modellata durante il lavaggio nel passaggio 8.4. Ad esempio, abbiamo osservato che i modelli in linea, i cheratociti umani mostrano morfologie allungate entro i primi 30 minuti dopo la semina, mentre le cellule endoteliali e i fibroblasti dermici richiedono più ore prima di mostrare un cambiamento nella morfologia dell'adesione. I parametri sperimentali richiesti per l'incubazione delle proteine (fase 7) e la semina cellulare (fase 8) potrebbero quindi dipendere dalla proteina e dal tipo di cellula scelta.

L'approccio presentato per applicare segnali di guida di contatto su geometrie 3D può aiutare a creare una comprensione più profonda del comportamento cellulare in ambienti multicue complessi. Ciò può includere indagini su componenti intracellulari, come aderenze focali e nuclei, e può anche comportare esperimenti eseguiti su una scala più ampia, cellulare o tissutale utilizzando il metodo proposto. Alla fine, si prevede che le conoscenze acquisite possano essere utilizzate nella progettazione di applicazioni di ingegneria tissutale, in cui ambienti cellulari complessi sono progettati per guidare il comportamento cellulare verso un risultato desiderato.

Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgments

Ringraziamo il Dr. Nello Formisano (MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine) per aver fornito cheratociti primari umani. Questo lavoro è stato sostenuto dal Chemelot InSciTe (progetto BM3.02); il Consiglio europeo della ricerca (sovvenzione 851960); e il Ministero dell'Istruzione, della Cultura e della Scienza per il Programma di Gravitazione 024.003.013 "Rigenerazione guidata dai materiali". Gli autori desiderano ringraziare Alvéole per la corrispondenza, l'aiuto e la risoluzione dei problemi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-vinculin antibody, mouse monoclonal IgG1 Sigma V9131 Dilution: 1/600
Bovine Serum albumin, Fraction V Roche 10735086001
DMEM, high glucose, pyruvate Gibco 41966029
DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x) Gibco 10565018
DMi8 epifluorescent microscope Leica Microsystems
Ethanol Biosolve 0005250210BS
Fetal Bovine Serum Serana 758093
Fiji/ImageJ, version v1.53k www.imageJ.nih.gov
Fluorescent highlighter Stabilo 4006381333627
Fluorescin-labeled gelatin Invitrogen G13187 Concentration: 0.01%
Formaldehyde solution Merck F8775
Glass coverslips 24 x 60 mm, #1 VWR 631-1575
Glass coverslips, ø = 32 mm, #1 Menzel-Gläser
HCX PL fluotar L 20X/0.40na microscope objective Leica 11506242
HEPES Gibco 15630080
Human dermal fibroblasts Lonza CC-2511
Human primary keratocytes MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine
Illustrator, Version 26.0.1 Adobe
Laboratory oven Carbolite
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Leica Application Suite X software, version 3.5.7.23225 Leica Microsystems
Leonardo software, version 4.16 Alvéole
Micro-manager, version 1.4.23 Open imaging
Mowiol 4-88 Sigma-Aldrich 81381 mounting medium
mPEG-succinimidyl valerate MW 5,000 Da Laysan Bio MPEG-SVA-5000 Concentration: 50 mg/mL
Negative glass mold FEMTOprint
NucBlue Live Readyprobes Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen R37605 2 drops/mL
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140163
Petri dish (ø=100 mm) Greiner Bio-one 664160
Phalloidin Atto 647N Sigma 65906 Dilution: 1/250
Phosphate Buffered Saline Sigma P4417
Plasma asher Emitech K1050X
PLPP (photoinitiator) Alvéole
Poly-L-lysine, sterile-filtered Sigma-Aldrich P4707 Concentration: 0.01%
PRIMO Alvéole
Rhodamine-labeled fibronectin Cytoskeletn, Inc. FNR01 Concentration: 10 µg/mL
Secondary antibody with Alexa 488, Goat anti-mouse IgG1 (H) Molecular Probes A21121 Dilution: 1/300
Secondary antibody with Alexa 555, Goat anti-mouse IgG1 (H) Molecular Probes A21127 Dilution: 1/300
Spin coater Leurell Technologies Corporation model WS-650MZ-23NPPB
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 1673921
TCS SP8X confocal microscope Leica Microsystems
tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane ABCR AB111444
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red Gibco 12604013
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054

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References

  1. Wang, Y., Wang, G., Luo, X., Qiu, J., Tang, C. Substrate stiffness regulates the proliferation, migration, and differentiation of epidermal cells. Burns. 38, 414-420 (2012).
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Bioingegneria Numero 184 Stampaggio PDMS geometria del substrato fotopattering UV senza maschera guida ai contatti curvatura microambiente cellulare multi-cue rivestimento proteico
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van der Putten, C., D’Urso, M., Bril, M., Woud, T. E., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A. Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates. J. Vis. Exp. (184), e63988, doi:10.3791/63988 (2022).

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