Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Üç Boyutlu Hücre Kültürü Substratlarının UV-Fotodesenlenmesi ile Multicue Hücresel Mikro Ortamların Oluşturulması

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63988
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems, Eindhoven University of Technology

Summary

Geleneksel olarak, hücre kültürü, hücrelerin doğal ortamını in vivo olarak zayıf bir şekilde taklit eden düzlemsel substratlar üzerinde gerçekleştirilir. Burada, fizyolojik olarak ilgili kavisli geometrilere ve mikro desenli hücre dışı proteinlere sahip hücre kültürü substratları üretmek için bir yöntem tanımladık ve bu hücre dışı ipuçlarının hücresel olarak algılanmasına sistematik araştırmalara izin veriyoruz.

Abstract

Hücre dışı matris, hücre fonksiyonunun önemli bir düzenleyicisidir. Ligand dağılımı ve doku geometrisi gibi hücresel mikro çevrede var olan çevresel ipuçlarının, hücre fenotipini ve davranışını yönetmede kritik rol oynadığı giderek daha fazla gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu çevresel ipuçları ve hücreler üzerindeki etkileri genellikle bireysel ipuçlarını izole eden in vitro platformlar kullanılarak ayrı ayrı incelenir; bu, çoklu ipuçlarının karmaşık in vivo durumunu büyük ölçüde basitleştiren bir stratejidir. Mühendislik yaklaşımları, in vivo mikro ortamın karmaşıklığını yakalayan, ancak in vitro sistemlerin hassasiyet ve manipüle edilebilirlik derecesini koruyan deneysel kurulumlar geliştirerek bu boşluğu kapatmak için özellikle yararlı olabilir.

Bu çalışma, ultraviyole (UV) bazlı protein modellemesini ve litografi tabanlı substrat mikrofabrikasyonunu birleştiren ve birlikte çok işaretli ortamlarda hücre davranışlarına yönelik yüksek verimli araştırmalara olanak tanıyan bir yaklaşımı vurgulamaktadır. Maskesiz UV fotodeseni sayesinde, çeşitli iyi tanımlanmış geometrik ipuçları içeren çipler üzerindeki üç boyutlu (3D) hücre kültürü substratları üzerinde karmaşık, yapışkan protein dağılımları oluşturmak mümkündür. Önerilen teknik, farklı polimerik malzemelerden yapılmış kültür substratları için kullanılabilir ve çok çeşitli proteinlerin yapışkan desenli alanlarıyla birleştirilebilir. Bu yaklaşımla, tek hücreler ve tek katmanlar, desenli substratlar tarafından sunulan geometrik ipuçlarının ve temas kılavuz ipuçlarının kombinasyonlarına tabi tutulabilir. Çip malzemelerinin, protein modellerinin ve hücre tiplerinin kombinasyonlarını kullanan sistematik araştırmalar, çoklu işaret ortamlarına hücresel tepkiler hakkında temel bilgiler sağlayabilir.

Introduction

İn vivo, hücreler, hücre dışı matristen (ECM) kaynaklanan mekanik, fiziksel ve biyokimyasal nitelikte olabilen çok çeşitli çevresel ipuçlarına maruz kalır. Hücre davranışının düzenlenmesinde proliferasyon, farklılaşma ve göçgibi hayati rol oynayan çok sayıda çevresel ipucu tespit edilmiştir 1,2,3,4,5. En çok araştırılan fenomenlerden biri, hücre dışı substrat 6,7,8,9,10,11 üzerinde bulunan anizotropik biyokimyasal veya topografik paternler boyunca adezyon aracılıhücre hizalamasını tanımlayan temas rehberliğidir. Hücrelerin hizalanmasını yönlendirmenin ötesinde, temas rehberliği ipuçlarının hücre göçü, hücre içi proteinlerin organizasyonu, hücre şekli ve hücre kaderi12,13,14,15 gibi diğer hücre özelliklerini de etkilediği gösterilmiştir. Ek olarak, 3D hücresel ortamın geometrik mimarisi, hücre davranışı üzerindeki düzenleyici etkisi nedeniyle de kabul edilmiştir16,17. İnsan vücudunda, hücreler mikro ölçekli kollajen liflerinden, kılcal damarlara ve glomerüllere, mezoölçekli alveollere ve arterlere kadar değişen bir dizi kavisli geometriye maruz kalır18,19. İlginçtir ki, son zamanlarda yapılan in vitro çalışmalar, hücrelerin nano-ölçekten mezoölçek 20,21,22,23'e kadar bu tür fiziksel ipuçlarını algılayabildiğini ve bunlara cevap verebileceğini göstermiştir.

Bugüne kadar, çevresel ipuçlarına hücre tepkisini araştıran çoğu çalışma, büyük ölçüde tek ipuçlarını izole eden deneysel kurulumlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu yaklaşım, çevresel ipuçlarının hücresel olarak algılanmasının ardındaki temel mekanizmaların anlaşılmasında muazzam bir ilerlemeye izin vermiş olsa da, aynı anda birden fazla ipucu sunan in vivo ortamı zayıf bir şekilde özetlemektedir. Bu boşluğu kapatmak için, birden fazla çevresel ipucunun bağımsız ve aynı anda kontrol edilebileceği kültür platformları geliştirmek yararlıdır. Bu kavram, matris sertliği ve ligand yoğunluğu 26,27,28,29, substrat sertliği ve gözenekliliği 30, substrat sertliği ve 3D mikroniş hacmi 31, yüzey topografyası ve temas-rehberlik ipuçlarını 32,33,34 birleştiren çalışmalarla son zamanlarda 24,25 oranında artan bir çekiş kazanmıştır. ve mezoölçek eğrilik kılavuz ipuçları ile nano ölçekli temas-rehberlik ipuçları23. Bununla birlikte, temas rehberliği ipuçlarını çeşitli 3B geometrilerle kontrollü ve yüksek verimli bir şekilde birleştirmek zor olmaya devam etmektedir.

Bu araştırma protokolü bu zorluğu ele alır ve ECM proteinlerinin desenli yapışkan alanlarının (temas-rehberlik ipuçları) ve substrat eğriliğinin (geometrik ipuçları) kontrollü bir kombinasyonu ile hücre kültürü substratları oluşturmak için bir yöntem sunar. Bu yaklaşım, biyomimetik multicue ortamında hücre yanıtının sistematik ve yüksek verimli bir şekilde diseksiyonuna izin verir. Edinilen bilgi, karmaşık ortamlarda hücre davranışının daha iyi anlaşılmasına yardımcı olabilir ve hücre tepkilerini istenen bir sonuca yönlendiren özelliklere sahip öğretici malzemeler tasarlamak için kullanılabilir.

3D protein fotodeseni
ECM proteinlerinin yapışkan alanlarının (temas-kılavuzluk ipuçları) hücre kültürü materyalleri üzerinde oluşturulması, örneğin derin ultraviyole (derin-UV) modelleme veya mikrokontakt baskı35,36 gibi çeşitli teknikler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Derin-UV desenleme, hücre kültürü substratı üzerindeki belirli konumlarda pasivasyon polimerlerini parçalamak için polimerik bir malzeme üzerindeki bir maske aracılığıyla yansıtılan UV ışığını kullanır. Desenli substrat daha sonra ilgi çekici bir ligand ile inkübe edilir ve önceden tanımlanmış yerlerde hücre tutturmasını ve kültürünü destekleyen yapışkan alanlar elde edilir 12,37,38. Protein desenlerini tanıtmanın alternatif bir yolu, istenen şekli içeren elastomerik damgaların tercih edilen bir proteinle kaplandığı ve bir hücre kültürü substratı üzerine bastırıldığı, böylece hücrelerin yapışabileceği protein kaplamasının aktarıldığı mikrotemaslı baskı yoluylayapılır 35,37,39,40 . Ne yazık ki, her iki teknik de maske hazırlama ve yumuşak litografi yöntemlerine dayandığından, deneyler zaman alıcı ve emek yoğun olduğu kadar desen esnekliği açısından da sınırlıdır. Ek olarak, hem derin UV modelleme hem de mikrotemaslı baskı, düzlemsel malzemeler için en uygun olanıdır ve 3D ortamda ligandların desenlenmesi için imkansız olmasa da teknik olarak zordur.

Bu geleneksel yöntemleri geliştirmek için, Waterkotte ve ark. mikrodesenli 3D polimerik substratlar üretmek için maskesiz litografi, kimyasal buhar biriktirme ve termoformlamayı birleştirdi41. Bununla birlikte, bu teknik termoform polimer filmlerin kullanımına dayanır ve düşük protein paterni çözünürlüğü (7.5 μm) sunarken, hücrelerin 0.1 μm2,42 kadar küçük geometrik protein modellerine cevap verdiği bildirilmiştir. Sevcik ve ark., nano- ve mikrometre topografyaları içeren substratlar üzerindeki nanomodel ECM ligandlarına umut verici bir başka yöntem tanımladılar43. Mikrotemaslı baskı kullanılarak, ECM proteinleri polidimetilsiloksan (PDMS) damgalarından termoduyarlı bir poli(N-izopropilakrilamid (pNIPAM) substratına aktarıldı. Daha sonra, pNIPAM ağının termoduyarlı özelliği, iki boyutlu (2D) protein modelini topografik bir PDMS substratına (10-100 μm derin oluklar) aktarmalarına izin verdi, böylece topografik özellikler üzerindeki yapışma bölgelerinin lokalizasyonunu kontrol etti. Bununla birlikte, tüm olası mikrotopografyalar desenlenemez, çünkü ıslanabilirlik sorunları daha derin topografik substratların desenlenmesini zorlaştırır. Derinlik-genişlik en boy oranı 2,4 olan açmaların, deseni topografik substrat43'e başarılı bir şekilde aktarmak için nihai sınır olduğu bildirilmiştir. Ek olarak, değişen desenlerin esnekliği ve üretilen desenlerin çözünürlüğü, mikrotemaslı baskı gereksinimi nedeniyle zayıftır.

Bu makalede, yukarıda belirtilen darboğazların üstesinden gelen ve hücre kültürü için kullanılabilecek çok işaretli substratlar oluşturmak için esnek ve yüksek verimli bir yöntem sunan bir yöntem açıklanmaktadır (bkz. Şekil 1). Fizyolojik olarak ilgili geometriler (silindirler, kubbeler, elipsler ve eyer yüzeyleri) ĸ = 1/2500 ila ĸ = 1/125 μm-1 arasında değişen eğriliklerle PDMS yongalarında önceden tasarlanmış ve mikrofabrikasyona tabi tutulmuştur. Daha sonra, 1,5 μm44 kadar küçük bir çözünürlüğe sahip bir fotodesenleme tekniği kullanılarak çeşitli dijital desen tasarımları kullanılarak 3D geometrilerin üstünde temas kılavuzluğu ipuçları oluşturulur. Bu amaçla, PDMS çipleri başlangıçta hücrelerin ve proteinlerin yapışmasını önlemek için pasifleştirilir; Bu pasivasyon tabakası daha sonra fotobaşlatıcı 4-benzoilbenzil-trimetilamonyum klorür (PLPP) ve UV ışığına maruz kalma45'in kombinasyonu ile çıkarılabilir. Dijital maske, UV'ye maruz kalma konumlarını ve dolayısıyla pasivasyon tabakasının çıkarıldığı alanı belirtmek için tasarlanmıştır. Proteinler daha sonra bu bölgelere yapışabilir ve hücre bağlanmasını sağlar. Desenleme, dijital (fiziksel değil) bir maske kullanılarak gerçekleştirildiğinden, ek fotomaskelerin tasarlanması ve üretilmesiyle ilgili güçlük ve maliyet olmadan çeşitli desenler hızlı bir şekilde oluşturulabilir. Ek olarak, substrat üzerinde çeşitli ECM proteinleri (örneğin, kollajen tip I, jelatin ve fibronektin) desenlenebilir. Bu protokol PDMS'den yapılmış hücre kültürü çipleri kullanılarak gerçekleştirilmesine rağmen, ilke ilgilenilen diğer herhangi bir malzemeye uygulanabilir46.

Protocol

Bu protokolde açıklanan çalışmalarda primer insan keratositleri kullanılmıştır. Bu araştırma, Helsinki Deklarasyonu'nun ilkelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Primer keratositler, ETB-BISLIFE Çoklu Doku Merkezi (Beverwijk, Hollanda) Kornea Bölümü'nden alınan Descemet Membran Endotelyal Keratoplasti cerrahisinden arta kalan insan kadavra korneoskleral dokularından, ölen tüm donörlerin akrabalarından onay alındıktan sonra izole edildi.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler, ekipman ve yazılımlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. 3D hücre kültürü substratlarının imalatı

  1. İlgilenilen tüm özellikleri içeren negatif bir cam kalıbı (# 1) oluşturun, bu durumda, bir femtosaniye-lazer doğrudan yazma tekniği kullanılarak camdan yapılmıştır (bkz. Şekil 2).
  2. Negatif cam kalıbı (# 1) Petri kabının dibine dikkatlice yerleştirin.
  3. Bir teraziye boş bir 50 mL konik tüp yerleştirerek bir PDMS prepolimeri hazırlayın, teraziyi darmadağın edin ve istenen miktarda silikon elastomer tabanını tüpe dökün.
  4. Bir Pasteur pipet kullanarak kürleme maddesi ekleyin, böylece elastomer baz ve kürleme maddesinin nihai oranı 10:1 (w/w) olur.
  5. Konik tüpteki bileşenleri bir spatula kullanarak iyice karıştırın.
  6. Tüm hava kabarcıklarını gidermek için 70 sn boyunca 2.000 × g'da santrifüj.
  7. PDMS prepolimerini, Petri kabındaki negatif cam kalıbın (# 1) üzerine dökün ve tamamen örtün.
  8. Petri kabını negatif cam kalıp (# 1) ve PDMS prepolimeri ile vakum kurutucuya yerleştirin ve vakum pompasını çalıştırın. Bir vakuma ulaşıldıktan sonra, kalıp yüzeyi ile PDMS prepolimeri arasındaki arayüzde bulunan tüm kabarcıkları çıkarmak için 5 dakika bekleyin.
  9. Vakumu çıkarın ve Petri kabını kurutucudan çıkarın.
  10. PDMS prepolimerini fırında gece boyunca 65 °C'de kürleyin.
  11. Bir spatula kullanarak PDMS'nin kenarlarını kaldırarak yeni kürlenmiş pozitif PDMS çipini (# 2) negatif cam kalıptan (# 1) dikkatlice çıkarın. Pozitif PDMS çipi (# 2) negatif cam kalıbına (# 1) yapışma eğilimindeyse, kaldırırken baskının kenarlarına etanol veya su ekleyin.
    NOT: Sıvı iki katman arasında çalışacak ve negatif cam kalıbı (# 1) ve pozitif PDMS çipinin (# 2) ayrılmasını kolaylaştıracaktır.
  12. Bir bıçak kullanarak, pozitif PDMS çipinin kenarlarını (# 2) kesin, böylece dikdörtgen bir çip kalır.
  13. Pozitif PDMS çipini (# 2) bir silinant olan tridekafloro (1,1,2,2-tetrahidrooktil) triklorosilane damlacığı ile küçük bir şişenin yanına bir kurutucuya yerleştirin ve gece boyunca vakum altında bırakın.
    NOT: Silanizasyon, baskının protokolde daha sonra diğer PDMS katmanlarına bağlanmamasını sağlayacaktır. Diğer silanizasyon ajanları ve/veya yöntemleri de PDMS yongalarının yüzeylerinin diğer PDMS katmanlarına yapışmamasını sağlamak için işe yarayabilir.
    DİKKAT: Tridekafloro (1,1,2,2-tetrahidrooktil) triklorosilane yanıcıdır (H226) ve ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olur (H314). Kişisel koruyucu ekipman giyin, bir duman başlığında çalışın ve kullandıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın. Silanizasyon maddesini ısıdan, sıcak yüzeylerden, kıvılcımlardan, açık alevlerden ve diğer ateşleme kaynaklarından uzak tutun. 15 ila 30 °C arasında depolayın (P280, P210, P240, P403, P235, P310).
  14. Vakumu çıkarın ve pozitif PDMS çipini (# 2) Petri kabının altına yerleştirin. Birden fazla negatif PDMS kalıbı (# 3) üretmek için üstüne PDMS prepolimerini (10:1) dökün.
  15. Petri kabını, tüm kabarcıkları çıkarmak için 15 dakika boyunca kurutucuda vakum altına alın.
  16. PDMS prepolimerini gece boyunca 65 ° C'de kürleyin, bundan sonra negatif PDMS kalıbı (# 3) bir spatula kullanılarak pozitif PDMS çipinden (# 2) soyulabilir.
  17. Son negatif PDMS kalıbını (# 3) silanizasyon maddesini gece boyunca vakumlu bir kurutucuda kullanarak silanize edin.
  18. PDMS prepolimerini negatif PDMS kalıbına (# 3) dökerek, kurutucuyu kullanarak kabarcıkları gidererek ve 65 ° C'de 3 saat kürleyerek yaklaşık 5 mm kalınlığında çoklu hücre kültürü yongaları (# 4, bkz. Şekil 2) üretin. Bir tıraş bıçağı ile, çipi Şekil 2'de görselleştirildiği gibi son boyutuna kesin. Cipsleri oda sıcaklığında saklayın.
    NOT: Yüzey pürüzlülüğü hücresel yanıtı etkileyebilir. Gerekirse, yüzeyi pürüzsüzleştirmek için pozitif PDMS çipi (# 2) üzerinde bir kaplama olarak ek bir ince PDMS tabakası kullanılabilir. Bunu yapmak için, çip üzerine küçük bir PDMS prepolimer damlacığı dökün ve basınçlı hava kullanarak tüm çipin üzerine yayın. Kaplanmış talaş 65 °C'de 3 saat kürleyin ve adım 1.12 ile devam edin.

2. Düz PDMS numunelerinin imalatı (kontrol numuneleri)

  1. PDMS prepolimerini (10:1) 1.3-1.6 numaralı adımlara göre hazırlayın.
  2. Spin kaplayıcının ortasındaki yuvarlak vakum direğinin üzerine bir cam kapak kayması yerleştirin.
  3. Cam kapak kapağını makineye takmak için vakumu açın ve bir Pasteur pipet kullanarak kapak kapağının ortasına bir PDMS damlacığı pipetin.
  4. Yaklaşık 10 μm kalınlığında bir tabaka elde etmek için aşağıdaki protokolü kullanarak PDMS prepolimerini cam substrat üzerine dağıtın.
    1. 0,45 × g'da 10 sn için spincoat, ivmelenme: 0,2 × g / s.
    2. 44,8 × g'da 50 sn için spincoat, ivmelenme: 0,54 × g / s.
  5. Vakumu kapatın, cımbız kullanarak kapak kapağını spin kaplayıcıdan çıkarın ve bir Petri kabına yerleştirin. PDMS'yi fırında gece boyunca 65 ° C'de kürleyin ve daha sonra oda sıcaklığında saklayın.

3. 3D hücre kültürü substratlarının substrat pasivasyonu

  1. PDMS çipinin yüzeyindeki hidroksil gruplarını (#4) O2-plazma kullanarak aktive edin. Cımbız kullanarak, çipi plazma asherinin sepetine yerleştirin.
  2. 30 s için 20 W güç kullanarak bir külleme döngüsü çalıştırın. N2 kullanarak külleme odasını havalandırın.
  3. Çipi sepetten çıkarın ve küçük bir PDMS kabına yerleştirin (bkz. Şekil 1).
  4. Bir Pasteur pipet kullanarak, çipin üstüne 500 μL Poli-L-lizin (PLL,% 0,01) ekleyin, böylece tüm yüzey PLL çözeltisine daldırılır. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  5. 450 μL PLL'yi hücre kültürü yongasından bir pipet ile çıkarın ve çip yüzeyini 500 μL 0,1 M HEPES tamponu (8 < pH < 8,5) ile üç kez durulayın. Numunenin kurumasını önlemek için PDMS çipi üzerinde daima az miktarda sıvı bırakın, bu da nihai desen kalitesini düşürür.
  6. 50 mg/mL metoksipolietilen glikol-süksinimidil valerattan 500 μL yapın (mPEG-SVA; Hücre kültürü çipi başına 0,1 M HEPES tamponunda (8 < pH < 8,5) MW 5.000 Da) çözeltisi ve numune üzerinde 60 dakika boyunca inkübe edilmesine izin verin. mPEG-SVA'nın yarı ömrü 15 dakika olduğundan, kullanımdan hemen önce gerekli miktarı hazırladığınızdan emin olun.
    NOT: mPEG-SVA, çözelti tamamen şeffaf olduğunda çözülür.
  7. Bir mikropipet kullanarak mPEG-SVA çözeltisinin 450 μL'sini çıkarın ve talaş yüzeyini fosfat tamponlu salin (PBS) ile beş kez yıkayın. Tüm bağlanmamış mPEG-SVA'nın çıkarıldığından emin olmak için yıkama başına birkaç kez yukarı ve aşağı pipetlediğinizden emin olun. Numunenin kurumasını önlemek için, yıkama adımları arasındaki süreyi en aza indirin ve yıkama için fazla (500 μL veya daha fazla) PBS kullandığınızdan emin olun.
  8. Örnekleri PBS'ye daldırarak depolayın veya protokolün desen adımına devam edin.
    NOT: İstenirse, bir kültür dolabında çalışırken ve steril çözeltiler ve ekipmanlarla çalışırken steril koşullar altında pasivasyon yapılabilir.

4. Desenli hücre kültürü substratlarının depolanması

NOT: 3D hücre kültürü substratları, işlemdeki farklı adımlar sırasında saklanabilir.

  1. Kürlenmiş PDMS hücre kültürü yongalarını kuru koşullar altında oda sıcaklığında saklayın.
  2. Pasifleştirilmiş hücre kültürü çiplerini şu iki yoldan biriyle saklayın:
    1. PBS'de 4 °C'de 7 güne kadar saklayın.
    2. Birkaç aya kadar kuru koşullarda saklayın. Kuru numuneler elde etmek için PBS'yi çıkarın ve çift damıtılmış su (ddH2O) kullanarak birden çok kez durulayın. Bir azot veya hava tabancası kullanarak fön ile kurutun.

5. Fotodesenleme için kullanılan dijital maskelerin tasarımı

NOT: 3B substratların desenlenmesi tek veya birden fazla odak düzlemi kullanılarak gerçekleştirilebilir (bkz. Şekil 3). Tek bir odak düzlemi, birden büyük olmayan (DMD, yaklaşık 300 μm x 500 μm) ve çok uzun olmayan (50-100 μm) özelliklerde kullanılabilir. Bu durumda, TIFF modunu kullanarak dijital bir desen tasarlayın. Bir DMD'nin boyutlarını aşan ve nispeten uzun olan özellikler için, alt tabakanın desenini birden çok adıma bölün. Bu durumda, hepsi ayrı ayrı tek odak düzlemlerine odaklanan PDF modu kullanılarak birden fazla desen tasarlanmıştır.

  1. Tasarım yazılımı araçlarını kullanarak dijital bir maske tasarlayın.
    1. TIFF modunda desen oluşturma (piksel): 1.140 x 1.824 piksellik (1 DMD'nin tam boyutu, yaklaşık 300 μm x 500 μm) tamamen siyah bir çalışma yüzeyi oluşturun ve çalışma yüzeyini ilgilendiğiniz şekillerle doldurun. Çalışma yüzeyini 8 bit TIFF dosyası olarak dışa aktarın.
      NOT: Desen tasarımındaki farklı gri seviyeler, o konumda gerçekleştirilecek pozlama miktarını belirler.
    2. PDF modunda desen oluşturma (metrik birimler): mm cinsinden istenen boyutta siyah bir çalışma yüzeyi oluşturun ve çalışma yüzeyini ilgilendiğiniz herhangi bir şekille doldurun. 3B alt tabakanın birden çok odak düzlemi kullanılarak desenlenmesi gerekiyorsa, deseni birden çok dosyaya bölün. Çalışma yüzeyini PDF dosyası olarak kaydedin.
      NOT: Desen tasarımındaki farklı gri seviyeler, o konumda gerçekleştirilecek pozlama miktarını belirler.

6. 3D hücre kültürü substratlarının UV fotodeseni

  1. Kalibrasyon
    NOT: Lazerin kalibrasyonu, ilgilenilen malzemeye doğru odaklanma sağlamak için yapılır. PDMS hücre kültürü substratları desen için çok kalın olduğundan, çipin baş aşağı yerleştirildiği bir cam slayt kullanın. Lazer önce cam slaytla karşılaştığından, lazeri kalibre etmek için cam kullanın.
    1. Bir cam kapak kapağına floresan vurgulayıcı uygulayın ve cam kapak kapağını floresan mikroskobun aşamasına yerleştirin. Vurgulanan yüzeyin yukarı baktığından emin olun.
    2. Mikroskopu ve PRIMO ekipmanını açın ve Leonardo yazılımına 'eklentiler' altında erişmek için Micro-manager'ı açın.
    3. İlk menüden Kalibrasyon'u seçin, ardından hem mikroskopta hem de yazılımda 20x hedefini seçin. İleri'ye tıklayın.
    4. Cam slaytı floresan vurgulayıcı ile mikroskopun optik yoluna yerleştirin. Floresan moduna geçin ve görüntülenen PRIMO görüntüsüne dikkatlice odaklanarak hem logonun hem de metnin odakta olduğundan emin olun. Kalibrasyon prosedürünü tamamlamak için İleri'ye tıklayın.
    5. Kalibre ederken sahne alanının Z-konumunu not edin ve bu konumu protokolün ilerleyen kısımlarında referans olarak kullanın.
      NOT: Kalibrasyon malzemesi, protokolün ilerleyen kısımlarında desenleme için kullanılan malzemeyle eşleşmelidir. Yukarıdaki adımlar, hücre kültürü substratları için gereken kalibrasyonu açıklamaktadır. Düz PDMS kontrol numunelerinin kalibrasyonu için, ek bir düz PDMS numunesinin üzerine floresan vurgulayıcı uygulayın ve Adım 6.1.2-6.1.5'i kullanarak kalibre edin.
  2. Tek bir odak düzlemi kullanarak 3B özelliklerin modellenmesi
    NOT: Tek bir odak düzlemi kullanılarak modelleme, bir DMD'nin boyutlarını (yaklaşık 300 μm x 500 μm) aşmayan 3D özelliklerde yapılır. Odak düzlemi kurulumunun bir şeması Şekil 3'te gösterilmiştir.
    1. Kalibrasyon slaytını sahne alanından çıkarın ve sahne alanına bir damlacık (~50 μL) fotobaşlatıcı (PLPP) içeren bir cam slayt yerleştirin.
      DİKKAT: PLPP gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder (R36-38). Kişisel koruyucu ekipman giyin, patlayıcı maddelerden uzak tutun, bu ürüne asla su eklemeyin, statik boşalmalara karşı ihtiyati tedbirler alın ve şok ve sürtünmeden kaçının (S26-36).
    2. PDMS hücre kültürü substratını fotobaşlatıcının damlacığına baş aşağı yerleştirin. Hücre kültürü substratının yüzeyindeki 3D özelliklerin cam slayta baktığından ve doğru desenlemeyi sağlamak için PLPP'ye tamamen batırıldığından emin olun.
    3. Yazılımda Desen'i seçin.
    4. Mikroskopta parlak alan moduna geçin ve sahne alanını ilgilendiğiniz özelliğe taşıyın.
    5. Dışbükey ve içbükey yapıların sırasıyla üstüne veya altına odaklanın (Şekil 3).
    6. Tercih edilen bir desen eklemek için PRIMO öğesini seçin. Canlı parlak alan görüntüsünün üstündeki turuncu renkteki desen önizlemesini izleyin.
    7. Desen ayarlarını özelliğe göre ayarlayın (konum, açı, tekrarlar) ve 1.000 mJ/mm2'lik bir doz seçin.
    8. Kilitle'ye tıklayın ve mikroskobu floresan moduna geçirin.
    9. Desenlemeyi başlatmak için ekranın sağ altındaki Oynat düğmesine tıklayın. İşiniz bittiğinde, yeşil renkte görüntülenen deseni gözlemleyin.
    10. Bir hücre kültürü yongasındaki tüm özellikleri tamamladıktan sonra, çipi desen slaytından çıkarın ve PBS'de 4 °C'de saklayın.
  3. Çoklu odak düzlemleri kullanarak 3B özelliklerin modellenmesi
    NOT: Birden fazla odak düzlemi kullanılarak modelleme, bir DMD'den (yaklaşık 300 μm x 500 μm) daha büyük veya nispeten uzun olan 3B özelliklerde yapılır. Bu durumda, 3B özelliklerin birden fazla adımda desenlenmesi gerekir, yani desen tasarımı Şekil 3'teki örneğe göre uyarlanmalıdır.
    1. Kalibrasyon slaytını sahne alanından çıkarın ve sahne alanına bir damlacık (~50 μL) fotobaşlatıcı (PLPP) içeren bir cam slayt yerleştirin.
    2. PDMS hücre kültürü çipini cımbız kullanarak fotobaşlatıcının damlacığına baş aşağı yerleştirin.
    3. Yazılımda Desen'i seçin. Mikroskopta parlak alan moduna geçin ve sahne alanını ilgilendiğiniz özelliğe taşıyın.
    4. Çipin doğru konumdaki alanına odaklanın. Modelleme tek bir odak düzleminde gerçekleştirildiğinden ve özellikler tek bir DMD'den daha büyük olduğundan, özelliğin tam yüksekliği ve genişliği boyunca yeterli desen çözünürlüğünü sağlamak için birden fazla odak düzlemi ve dolayısıyla 3B alt tabaka başına birden fazla desen turu kullanın (bkz. Şekil 3). Örneğin, 150 μm yüksekliğe sahip bir özellik için, özelliğin altından yaklaşık 25 μm, 75 μm ve 125 μm odaklanarak özelliği üç turda (50 μm Z-hareketi başına 1 odak düzlemi ±) modelleyin. Özelliğin alt kısmının, adım 6.1.5'te yazılan değerin etrafında olduğundan emin olun.
    5. Tercih edilen deseni eklemek için PRIMO öğesini seçin. Canlı parlak alan görüntüsünün üstünde turuncu renkle gösterilen desen önizlemesini izleyin.
    6. Desen ayarlarını özelliğe (konum, açı) göre ayarlayın ve 1.000 mJ/mm2'lik bir doz seçin.
    7. Kilitle'ye tıklayın ve mikroskobu floresan moduna geçirin.
    8. Desenlemeyi başlatmak için ekranın sağ altındaki Oynat düğmesine tıklayın. İşiniz bittiğinde, yeşil renkte görüntülenen deseni gözlemleyin.
    9. Birden çok odak düzlemi kullanıldığında ilgilenilen özellik ile ilgili 6.3.4-6.3.8 arasındaki adımları yineleyin.
    10. Bir hücre kültürü yongasındaki tüm özellikleri tamamladıktan sonra, çipi desen slaytından çıkarın ve 4 °C'de PBS'de saklayın.
      NOT: İstenirse, UV fotodesenlemeyi steril koşullar altında uygulayın, cam tabanlı Petri kaplarını kullanın ve tüm substratları steril kültür dolaplarında hazırlayın. Desenli örnekleri PBS'de birkaç haftaya kadar saklayın. ddH2O ile yıkandığında ve basınçlı hava kullanılarak kurutulduğunda, numuneler 4 ° C'de birkaç aya kadar saklanabilir.

7. Protein inkübasyonu

NOT: Hücre kültürü için taze protein inkübe edilmiş substratların kullanılması tavsiye edilir. Sadece hücre tohumlaması (adım 8) doğrudan daha sonra yapılırsa protokolün bu bölümüne geçin.

  1. Desenli hücre kültürü çipini kültür kabinindeki steril PDMS kaplarına aktarın.
  2. Desenli hücre kültürü yongalarını, desenleme steril koşullar altında yapılmadıysa, fazla steril PBS ile 3 kat yıkayın.
  3. PBS'de taze bir protein çözeltisi hazırlayın.
    1. Fibronektin: 10 μg / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için 20 μg rodamin etiketli fibronektin şişesine bir mikropipet kullanarak 2 mL PBS ekleyin. Pipet, protein kümelerinin oluşumunu önlemek ve ışıktan korumak için nazikçe kullanılır.
    2. Jelatin: 200 μL'lik çözünmüş jelatin-floresein alikotunu çözün. Işıktan koruyun.
  4. Bir mikropipet kullanarak hücre kültürü çipine 200-500 μL protein çözeltisi ekleyin. Kuluçka süresini ve sıcaklığını seçtiğiniz proteine bağlı olarak ayarlayın: Fibronektin: Oda sıcaklığında 5 dakika, Jelatin: 37 ° C'de 15 dakika. Numuneyi örttüğünüzden emin olun (örneğin, alüminyum folyo ile).
  5. Protein çözeltisini çıkarın ve 500 μL steril PBS ile 5 kat yıkayın. Herhangi bir bağlanmamış proteini çıkarmak için PBS'yi hücre kültürü çipinin tüm ilgili özelliklerinin üzerinde birkaç kez yukarı ve aşağı pipetlediğinizden emin olun.
    NOT: Yıkama adımları sırasında, numunenin asla kurumaması çok önemlidir. Yıkama sırasında protein çözeltisini veya PBS'yi çıkarırken, protein kümelerinin oluşmasını önlemek için hemen yeni PBS ekleyin (bkz. Şekil 4). Dışbükey özellikler, substrat yüzeyinin üzerinde yükseldikleri için kurumaya karşı özellikle hassastır.
  6. İsteğe bağlı: Protein modellerini floresan mikroskop altında gözden geçirin. Numuneleri steril tutun ve PBS'ye batırın.

8. Hücre tohumlama

NOT: Bu protokol insan primer keratositlerini ve insan dermal fibroblastlarını kullanır. Keratositler, materyallerin ikincil kullanımı için Hollanda kılavuzlarına uygun olarak hastalardan insan kornea dokusundan toplandı ve daha önce keratositler47 olarak karakterize edildi. Bu hücreler, maksimum dört pasaj için 37 °C'de% 5 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 1 penisilin / streptomisin (P / S) ve 1 mM L-askorbik asit 2-fosfat sesquimagnezyum tuz hidrat (C vitamini) ile desteklenmiş DMEM'de kültürlenir. İnsan dermal fibroblastları DMEM'de satın alındı ve maksimum 15 pasaj için 37 ° C'de% 10 FBS ve% 1 P / S ile desteklendi. Fotodesenli hücre kültürü çipi üzerinde hem keratositlerin hem de dermal fibroblastların tohumlanması için, çip başına 20.000 hücre kullanılmıştır.

  1. İlgilenilen hücreleri ayırın (örneğin, tripsin kullanarak) ve çip başına kültür ortamında 10.000-50.000 hücre / mL'± 1 mL'lik bir hücre süspansiyonunun 1 mL'sini hazırlayın. Hücre boyutuna ve istenen okumaya bağlı olarak substrat başına eklenen hücrelerin tam sayısını ayarlayın.
  2. PBS'yi hücre kültürü yongasından çıkarın ve hücre süspansiyonunun 1 mL'sini ekleyin.
  3. Hücre kültürü çipini hücrelerle birlikte yavaşça inkübatöre taşıyın ve 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.
  4. Desenli hücre kültürü çipi üzerindeki hücrelerin yapışmasını parlak alan mikroskobu altında kontrol edin. Çizgi desenleri durumunda uzatılmış hücre morfolojilerini arayın (bkz. Şekil 5). Hücreler desenli alanın dışına da yapışmaya başlamışsa, bunları substrat üzerindeki hücrelerin hemen üzerinde yukarı ve aşağı doğru pipetleyerek çıkarın.
    NOT: Desenli alana iliştirilmiş hücreler bağlı kalırken, desenli alanların dışındaki hücreler ayrılır.
  5. Hücre kültürü çipini PDMS kabından çıkarın ve ~ 5 mL kültür ortamı ile doldurulmuş 6 delikli bir plakaya koymak için steril cımbız kullanın.
  6. Hücreleri istenen süre boyunca kültürleyin. Hücre kültürü ortamını her 2-3 günde bir değiştirin. Hücre kültüründen sonra protein paterninin görselleştirilmesini sağlamak için, numunenin kültür sırasında ışığa maruz kalma miktarını azaltın.

9. Boyama, görüntü yakalama ve analiz

  1. Fiksasyon ve boyama
    1. İstenilen kültür uzunluğundan sonra, hemen hemen tüm ortamı çıkarın ve aşırı PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 3.7 formalin ile inkübe edin, ardından oda sıcaklığında yıkama başına 5 dakika boyunca PBS ile üç yıkama adımı uygulayın. Numunenin kurumasına asla izin vermeyin.
      DİKKAT: Formalin yutulduğunda veya solunduğunda zararlıdır (H302, H332), alerjik cilt reaksiyonuna neden olabilir (H317), genetik bozukluklara neden olduğundan şüphelenilir (H341) ve kansere neden olabilir (H350). Kişisel koruyucu ekipman giyin ve bir duman başlığında çalışın.
    2. Hücre kültürü substratını istenen boyama ajanları veya antikorları ile lekeleyin. Boyama ajanlarının hacimlerini azaltmak için, hücre kültürü yongalarını bir cam slayt üzerine borulanmış bir boyama çözeltisi damlacığına baş aşağı yerleştirin.
    3. Numuneleri PBS'de (kısa süreli) veya 4 °C'de montaj ortamı (uzun vadeli) kullanarak bir kapak kapağına tutturulmuş olarak saklayın.
  2. Görüntü alma
    1. Lekeli numuneyi cam bir slayt üzerindeki PBS damlacığına baş aşağı yerleştirin. Numuneyi konfokal mikroskop aşamasına getirin.
    2. Gerekli ayrıntı düzeyine bağlı olarak, uygun görüntü yakalamayı sağlamak için uygun bir hedefe (10x, 20x veya 40x) ve Z aralığına sahip Z yığınları yapın.
  3. Görüntü analizi ve görselleştirme
    1. Ham görüntü dosyalarını görüntü analiz yazılımında açın ve görüntü özelliklerinin (ör. boyutlar, çözünürlük) doğru olup olmadığını kontrol edin.
    2. Gerekirse kanal başına parlaklığı ve kontrastı ayarlayın.
    3. Deseni ve hücreleri içeren ilgi alanını kırpın.
    4. İsteğe bağlı: gerekirse bir dekonvolüsyon adımı gerçekleştirin.
    5. 3B oluşturma yazılımını kullanarak Z-yığınının 3B görüntüsünü oluşturun.
    6. Her bir kanal için kontrast ve kazanç ayarlarını optimize edin.
    7. 3B işlemenin bir görüntüsünü oluşturmak için bir anlık görüntü oluşturun ve . TIFF dosyası.
    8. 3B render filmi oluşturmak için, filmi kaydetmeden önce başlangıç ve bitiş karesini ve zaman dilimini ayarlayın. .avi olarak dışa aktarın.

Representative Results

Açıklanan protokol sayesinde, 3D PDMS hücre kültürü substratları, hücre bağlantısı için uygun hassas ve yüksek verimli yapışkan alanlar oluşturmak için UV fotodesenli olabilir. Bu şekilde, hücreler aynı anda hem ilgili substrat geometrilerine hem de yapışkan ligand desenlerine maruz kalır. Oryantasyon, hücre alanı ve fokal adezyon sayısı gibi hücre özellikleri, karmaşık, in vivo benzeri ortamlarda hücre davranışını daha iyi anlamak için kolayca izlenebilir ve kullanılabilir.

3D PDMS substratlarındaki modelleme olaylarını doğrulamak için, protokolün farklı aşamalarındaki malzemenin atomik yüzey bileşimleri, atomik X-ışını fotoelektron spektroskopisi (XPS)48 kullanılarak ölçülmüştür. Özetle, XPS ölçümleri, pasifleştirilmiş numunelerde artmış karbon sinyaline sahip PEG zincirlerinin varlığını gösterdi ve bu da fotodesenlemeden sonra azaldı. Fibronektin ile inkübasyon, karbon sinyalinin artmasına neden oldu ve yine hücre kültürü çipinin yüzeyinde başarılı protein yapışmasını gösterdi. Daha sonra, 3B özelliklerdeki desen çözünürlüğü ve hizalaması, çeşitli daire desenli, içbükey çukurlarda karakterize edildi (ĸ = 1/250 μm-1, ĸ = 1/1.000 μm-1 ve ĸ = 1/3.750 μm-1, bkz. Şekil 6). Maksimum yoğunluklu projeksiyonlardan, protein paterninin üç 3D özelliğin hepsinde başarılı bir şekilde desenlendiği sonucuna varılabilir. Şekil 6A'daki yoğunluk profili, desenli ve desensiz alanlar arasında keskin geçişlerle yüksek desen çözünürlüğü göstermektedir. Ek olarak, çukurdaki tüm desen boyunca tutarlı protein yoğunluğu elde edildi.

ĸ = 1/250 μm-1 olan içbükey çukur, tek odak düzlemi yöntemi (bir desen) kullanılarak desenlenirken, ĸ = 1/1.000 μm-1 ve ĸ = 1/3.750 μm-1 olan çukurlar sırasıyla iki ve üç odak düzlemi (desenler) kullanılarak desenlenmiştir. Şekil 6'daki maksimum yoğunluklu projeksiyonlarda görülebileceği gibi, her iki yöntem de özelliklerin üstündeki desenlerin mükemmel bir şekilde hizalanmasını sağlar. İki farklı odak düzlemi ve desen arasında yanlış hizalanmış geçişler gözlenemez.

Açıklanan protokolü kullanarak, çeşitli geometrilere çok çeşitli protein desen tasarımları uygulanabilir (bkz. Şekil 7 ve Video 1). Bu yöntemin çok yönlülüğünü göstermek için, yarı silindirler (dışbükey ve içbükey), bir eyer yüzeyi ve çukur, çeşitli genişliklerde çizgiler ve daireler kullanılarak desenlenmiştir. Fotodesenli malzemeler daha sonra hücre kültürü için kullanılabilir (bkz. Şekil 7, Şekil 8, Video 2, Video 3 ve Video 4). Desenli (fibronektin çizgileri, kırmızı, 5 μm genişliğinde ve 5 μm boşluklu) içbükey yarı silindir üzerinde kültürlenen dermal fibroblastların bir örneği Şekil 8, Şekil 9 ve Video 4'te gösterilmiştir. Deney sırasında, hücreler çok işaretli hücre kültürü substratını algılar ve bunlara yapışır ve zamanla canlı kalır. Şekil 8'deki immünofloresan boyamadan da görülebileceği gibi, hücreler esas olarak fibronektin hatları üzerinde fokal adezyonlar (vinkülin kümeleri) oluştururlar.

Bu hücre kültürü materyallerini kullanan bir başka örnek çalışma yakın zamanda grubumuz48 tarafından yayınlandı. Bu çalışmada, insan miyofibroblastları ve endotel hücreleri, temas kılavuz ipuçları ve geometrik topografyaların kombinasyonuna tabi tutulmuştur. İn vivo, her iki hücre tipi de insan vaskülatüründe olduğu gibi doğal dokularda eğrilik ve temas rehberliği ipuçları yaşar. Hücreleri in vitro olarak her iki çevresel ipucunu birleştiren bir ortama maruz bırakarak, in vivo durum özetlenebilir ve mikro çevrenin hücre davranışı üzerindeki rolünün daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar. İnsan miyofibroblastlarının, içbükey silindirik substratlar48 üzerindeki temas kılavuz ipuçlarıyla (paralel fibronektin çizgileri) hizalandığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, artan eğriliklere sahip dışbükey yapılarda, geometrik ipuçları biyokimyasal ipuçlarını geçersiz kıldı ve miyofibroblastların eğriliğin hem derecesini hem de belirtisini algılayabildiğini düşündürdü. İlginçtir ki, endotel hücreleri dışbükey PDMS substratlarına değil, sadece içbükey multicue substratlarına yapışabilir. İçbükey, protein desenli substratlarda, endotel hücreleri temas kılavuz ipucu yönünde yönlendirilir. Bu temel in vitro bilgi, vasküler doku mühendisliği alanında fizyolojik öneme sahiptir ve sonunda akıllı doku mühendisliği yapılarının tasarımına yardımcı olabilir.

Figure 1
Şekil 1: 3D hücre kültürü substratlarına temas rehberliği ipuçlarının uygulanmasının deneysel zaman çizelgesi. İlk olarak, pozitif hücre kültürü çipleri, bir dizi geometri içeren negatif bir PDMS kalıbından üretilir. Kürlenmemiş PDMS kalıba dökülür ve 65 °C'de 3 saat kürlenir. Daha sonra, PDMSO2-plazma ile muamele edilir ve hücre kültürü substratının yüzeyini pasifleştirmek için PLL ve mPEG-SVA (mavi, etiketli) ile inkübe edilir. Yıkandıktan sonra, substrat bir fotobaşlatıcı damlacığı (PLPP, yeşil, etiketli) içinde baş aşağı çevrilir ve LIMAP yaklaşımı kullanılarak UV fotodesenli hale getirilir. Burada, pasivasyon katmanını tanımlanmış konumlarda ayırmak için kullanıcı tanımlı bir desene sahip dijital bir maske kullanılır. Daha sonra, bir protein çözeltisi (kırmızı, etiketli) inkübe edilebilir ve sadece pasivasyon tabakasının çıkarıldığı yerlere yapışır. Substrat üzerine tohumlanan hücreler hem geometri hem de protein modellerine tabi tutulur, bu da kompleks, in vivo-taklit ortamlarında hücre davranışının araştırılmasını sağlar. Kısaltmalar: PDMS = polidimetilsiloksan; mPEG-SVA = metoksipolietilen glikol-süksinimidil valerat; PLPP = 4-benzoilbenzil-trimetilammonyum klorür; LIMAP = Proteinlerin Işık Kaynaklı Moleküler Adsorpsiyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: 3D hücre kültürü substratının üretimi ve pasivasyonu sırasında farklı aşamalar. Negatif cam kalıp (# 1) bilgisayar destekli tasarım yazılımı ile tasarlanmış ve femtosaniye-lazer doğrudan yazma tekniği kullanılarak üretilmiştir. Bu kalıp, daha sonra nihai hücre kültürü çipini (# 4) üretmek için kullanılan ara pozitif PDMS çipini (# 2) ve negatif PDMS kalıbını (# 3) üretmek için kullanılır. Kısaltma: PDMS = polidimetilsiloksan. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: İki modelleme yönteminin şematik gösterimi. Solda: UV fotodesenleme, tek bir odak düzlemi ve desen kullanılarak daha küçük özellikler (yaklaşık bir DMD) üzerinde gerçekleştirilir. Sonuç olarak, tüm özellik tek seferde desenlenir. Sağ: Daha büyük özellikler kullanıldığında (bir DMD'den daha büyük), modelleme birden çok odak düzlemine ve desene bölünür. Kısaltma: DMD = dijital ayna cihazı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Normal ve kurumuş protein inkübe edilmiş substratın tipik bir örneği. Normal ve kurutulan protein inkübe substratların maksimum yoğunluklu projeksiyonları (XY) ve ortogonal görünümleri (XZ). Desenli bir hücre kültürü substratını bir protein çözeltisi ile inkübasyondan sonra yıkarken, numuneyi daima ıslak tutmak çok önemlidir. Desen, özelliklerdeki tüm görüntülerde aynı olmasına rağmen (ĸ = 1/1.000 μm-1), jelatin-floresein (yeşil), numune birkaç saniye kurumaya bırakıldığında büyük bir küme oluşturur. Numune her zaman ıslak kalırsa, doğru protein kalıpları gözlemlenebilir. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Tohumlamadan sonraki parlak alan görüntüleri. Primer keratositler (solda) ve dermal fibroblastlar (sağda) 3D geometrik özellikler üzerinde tohumlamadan 4 saat sonra (ĸ = 1/1.000 μm-1 içbükey çukuru ve ĸ = 1/500, 1/375, 1/250, 1/175 ve 1/125 μm-1 yarı silindirleri). Sol üstteki ekler, geometrilerin desenlenmesi için kullanılan çizgi desenini temsil eder. Beyaz oklar, zaten hizalanma gösteren yayılan hücreleri gösterir. Ölçek çubukları = 250 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: İçbükey çukurlarda dairesel desenlerin karakterizasyonu. (A) LIMAP (çizgi genişliği: 20 μm, boşluk genişliği: 20 μm) kullanılarak desenlenmiş ve jelatin-floresein (yeşil) ile inkübe edilmiş aconcave çukurunun (ĸ = 1/250 μm-1) maksimum yoğunluklu projeksiyonu (XY) ve ortogonal görünümü (XZ). Beyaz çizgi boyunca yoğunluk profili, tutarlı bir desen kalitesi ve çözünürlüğü göstererek mesafeye göre çizilir. (B) İçbükey çukurlarda ĸ = 1/1.000 μm-1 ve ĸ = 1/3750 μm-1 ile gerçekleştirilen ve desenleme için kullanılabilecek geometrik özellikler açısından esneklik gösteren ek modelleme. Yine, hem maksimum yoğunluk projeksiyonları (XY) hem de ortogonal görünümler (XZ) görselleştirilir. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Desenli yapıların 3D mikroskopi verileri. Fotodesenleme ve hücre kültüründen sonra 3D desenli hücre kültürü malzemelerinin tipik örnekleri, 3D oluşturma yazılımı kullanılarak görselleştirilmiştir. (A) 10 μm genişliğinde çizgilerle (rodamin-fibronektin, kırmızı) ve 10 μm genişliğinde boşluklarla desenli dışbükey yarı silindir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (B) 20 μm genişliğinde çizgiler (rodamin-fibronektin, kırmızı) ve 20 μm genişliğinde boşluklarla desenli içbükey yarı silindir üzerinde kültürlenmiş F-aktin (yeşil) için boyanmış dermal fibroblastlar. Ölçek çubuğu = 5 μm. (C) 20 μm genişliğinde çizgiler (rodamin-fibronektin, kırmızı) ve 20 μm genişliğinde boşluklarla desenli eyer yüzeyi. Ölçek çubuğu = 5 μm. (D) 20 μm genişliğinde çizgilerden (jelatin-floresein, yeşil) ve 20 μm genişliğinde boşluklardan oluşan eşmerkezli dairelerle desenli içbükey çukur. İnsan keratositlerinin F-aktin sitoiskeleti faloidin kullanılarak boyanır ve kırmızı renkte görselleştirilir. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: İnsan dermal fibroblastlarının fotodesenli, içbükey bir yarı silindir üzerinde immünofloresan boyanması. (A) Desenli (fibronektin çizgileri, kırmızı, 5 μm genişliğinde ve 5 μm boşluklu) içbükey yarı silindir üzerinde 24 saat boyunca kültürlenmiş insan dermal fibroblastlarının maksimum yoğunluklu projeksiyonu (XY) ve ortogonal bölümleri (XZ ve YZ). Hücreler F-aktin (macenta), vinkülin (yeşil) ve çekirdekler (mavi) için boyanır. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Çok işaretli ortama yapışan bir hücrenin yakınlaştırılması. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: Desenli, içbükey bir silindir üzerinde insan dermal fibroblastlarının parlak alan zaman atlamalı görüntüleri. İçbükey yarı silindir (ĸ = 1/250 μm-1) paralel çizgilerle (5 μm genişliğinde ve 5 μm boşluklar) desenlenmiş ve hücre tohumlamadan önce rodamin-fibronektin ile inkübe edilmiştir. Zaman atlamalı görüntüleme, ilk hücre tohumlamasından 1 saat sonra (solda, 0 dakika), hücreler hala yuvarlakken ve yapışmaz olduğunda (oklar) başlatılır. Yaklaşık 24 saat sonra (orta, 1.420 dakika), hücreler multicue substratına yapışır ve temas kılavuz modeline göre bir hizalama tepkisi gösterir. Hem hizalama yanıtı hem de hücre canlılığı tüm kültür süresi boyunca korunur (sağda, 3.180 dakika). Ölçek çubukları = 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: 3B silindirik alt tabaka üzerindeki desen örneği. Rodamin-fibronektin (kırmızı) ile desenli dışbükey bir silindirin 3D gösterimi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video 2: Desenli, 3D silindirik substrat (ĸ = 1/500 μm-1) üzerinde kültürlenmiş dermal fibroblastların 3D gösterimi. Dermal fibroblastlar, desenli (fibronektin çizgileri, kırmızı, 10 μm genişliğinde ve 10 μm boşluklu) dışbükey yarı silindir üzerinde 24 saat boyunca kültürlenir. Hücreler F-aktin (macenta), vinkülin (yeşil) ve çekirdekler (mavi) için boyanır. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video 3: Desenli, 3D bir çukur üzerinde kültürlenmiş insan keratositlerinin 3D temsili (ĸ = 1/3,750 μm-1). İçbükey, desenli bir çukurda (jelatin daireler, yeşil, 20 μm genişliğinde ve 20 μm boşluklar) 24 saat boyunca kültürlenen insan keratositlerinin 3D gösterimi. Hücreler F-aktin (kırmızı) için boyanır. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video 4: Desenli, içbükey bir silindir üzerinde insan dermal fibroblastlarının parlak alan zaman atlamalı görüntülemesi. İçbükey yarı silindir (ĸ = 1/250 μm-1) paralel çizgilerle (5 μm genişliğinde ve 5 μm boşluklar) desenlenmiş ve hücre tohumlamadan önce rodamin-fibronektin ile inkübe edilmiştir. Zaman atlamalı görüntüleme, ilk hücre tohumlamasından 1 saat sonra, hücreler multicue ortamına ilk bağlılığı gösterdiğinde başlatılır. Tam zaman atlaması sırasında, hücreler ağırlıklı olarak temas rehberliği ipuçları boyunca yönlendirilirken, hücre canlılığı korunur. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Günümüzde, hücre davranışı genellikle doğal hücre mikro ortamının karmaşıklığından yoksun düz kültür substratları üzerinde çalışılmaktadır. Alternatif olarak iskeleler ve hidrojeller gibi 3D ortamlar kullanılır. Bu hücre kültürü ortamları in vivo alaka düzeyini artırsa da, hem hücre davranışının sistematik çalışmaları hem de okuma yöntemlerinin fizibilitesi zor olmaya devam etmektedir. Temsili kültür substratları üzerindeki hücre davranışını sistematik olarak araştırmak için, mikroskobik okumaya izin veren tutarlı çok işaretli substratlara ihtiyaç vardır. Bu nedenle, bu protokolde, fizyolojik olarak ilgili geometrilere ve desenli ECM proteinlerine sahip çok işaretli hücre kültürü substratları oluşturmak için bir yöntem tanımlamaktayız. Doku geometrisi ve temas kılavuzluğu ipuçları gibi çevresel ipuçlarını in vitro platformlarda birleştirmedeki ana zorluk büyük ölçüde teknolojik bir niteliktedir. Hücre kültürü malzemelerine temas-kılavuz ipuçlarını (örneğin, yumuşak litografi, derin UV modelleme ve mikrokontak baskı35,36) uygulamak için geleneksel yöntemler, düzlemsel substratlar için optimize edilmiştir. Temas kılavuzu ipuçlarıyla birlikte 3D hücre kültürü materyallerine duyulan ihtiyaç, zayıf desen hizalaması, çözünürlük ve esneklik gibi çeşitli teknolojik zorlukları vurguladı. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, yüksek verimli, maskesiz, ışık tabanlı bir modelleme yöntemi kullanılabilir45,49. Burada, optik mikroskop hassas desen hizalamasını ve mikrometre sırasına göre bir çözünürlük sağlar (bkz. Şekil 6). Ayrıca, dijital bir maskenin kullanılması, araştırmacıların emek yoğun fiziksel maskeler üretmeye gerek kalmadan hücre davranışını çok çeşitli desenler üzerinde incelemelerini sağlar.

UV fotodesenleme yaklaşımı, çeşitli malzemelerden üretilen çeşitli 3D geometrilerle (örneğin, silindirler, eyerler, kubbeler, çukurlar) birlikte kullanılabilir48. Bu çalışmada kullanılan 3D hücre kültürü substratları PDMS'den yapılmıştır; ancak diğer malzemeler de kullanılabilir. Bu, ilgilenilen özellikleri içeren nihai hücre kültürü substratını üretmek için farklı adımlar gerektirebilir. Hücrelerin hücre kültürü materyallerinin yüzey pürüzlülüğüne duyarlı olduğu gösterildiğinden, gözlemlenen hücrelerin tepkisinin 3D geometriye ve temas rehberliği ipuçlarına tamamen atfedilebilmesi için hücre kültürü çiplerinin pürüzsüz bir yüzeye sahip olması önemlidir50,51. Yüzey pürüzlülüğünü ölçmek için optik profilometri, taramalı elektron mikroskobu veya atomik kuvvet mikroskobu gibi ölçüm yöntemleri kullanılabilir. Hücre kültürü malzemesinin imalatından sonra, ilgilenilen özelliğin spesifik boyutlarına bağlı olarak bir veya daha fazla odak düzlemine dayanan bir modelleme yöntemi seçilebilir (bkz. Şekil 3). Tipik olarak, yaklaşık 50 μm'lik bir Z-aralığında bir alanı modellemek için tek bir odak düzlemi kullanılır. Desen çözünürlüğünün bu temel kural kullanılarak tutarlı olduğu gösterilmiştir (bkz. Şekil 6). Bununla birlikte, bu yöntemin bir dezavantajı, çoklu odak düzlemlerinin ve desenlerinin tanıtılmasıyla artan modelleme süresidir. Elimizde çoklu odak düzlemleri kullanılarak, 16 mm x 16 mm x 0,17 mm'ye (X x Y x Z) kadar 3D geometrik özellikler yüksek desen kalitesi ile başarılı bir şekilde desenlenmiştir.

Ek olarak, bu protokolle birlikte kullanılabilecek geometrik özelliklerin yüksekliğinin (Z ekseni) sınırlı olduğunu belirtmek önemlidir. Hem UV fotodesenleme hem de birçok hücresel okuma mikroskopi kurulumuna dayandığından, hedeflerin çalışma mesafesi bir özelliğin maksimum yüksekliğini belirler. Elimizde, 300 μm yüksekliği aşan geometriler hala UV fotodesenli olabilir ve okumalar 40x hedefli bir konfokal mikroskop kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Böylece, açıklanan protokol kullanılarak hücre içinden hücresel ve doku ölçeklerine kadar değişen mekanobiyolojik araştırmalar mümkündür.

Dikkate alınması gereken bir diğer faktör, UV-fotodesenleme49 sırasında veya sonrasında numunelerin kuruma riskidir. Bu, özellikle 3D geometriler kullanıldığında geçerlidir, çünkü dışbükeylikler genellikle hücre kültürü materyallerinin dışında açığa çıkar. Şekil 4'te gösterildiği gibi, bu, ilgilenilen özelliğin üstünde protein agregalarının oluştuğu düzensiz desenlere neden olabilir. Protein inkübasyonunu takiben ve hücre kültürü sırasında hücre kültürü yongalarının yıkanması, 3D geometrilerin uygun şekilde kaplanması için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, hücre kültürü çipinin üzerine her zaman küçük hacimlerde bir çalışma çözeltisi (PBS, PLPP, protein çözeltisi, hücre kültürü ortamı) bırakılması önerilir.

Şimdiye kadar, çeşitli protein kaplamaları (fibronektin, kollajen tip I ve IV, jelatin, FNC) ve hücre tipleri (insan kemik iliği stromal hücreleri, insan miyofibroblastları, insan endotel hücreleri, insan keratositleri ve dermal fibroblastları), yapılandırılmış hücre kültürü materyalleri üzerinde tarif edilen fotodesenleme yaklaşımı ile birlikte kullanılmıştır. Önceki bir çalışmada gösterildiği gibi48, protein inkübasyon parametrelerinin optimizasyonu, yeni hücre tiplerinde sistematik araştırma için anahtardır. Bu nedenle, yeni proteinler veya hücrelerle yeni bir deney yapmadan önce, bir dizi protein konsantrasyonunun, kuluçka sıcaklıklarının ve inkübasyon sürelerinin test edilmesi önerilir. Homojen, desenli düz alanlarda ilk yapışmadan sonra hücre morfolojisi ile 'normal' hücre kültürü koşulları altında hücre morfolojisi karşılaştırılarak, optimize edilmiş bir dizi deneysel parametre elde edilebilir. Ek olarak, her hücre tipi, belirli bir çoklu işaret ortamında tanınabilir bir yapışma morfolojisi göstermek için tohumlamadan sonra farklı bir süre gerektirebilir (bkz. Şekil 5). Bu amaçla, adım 8.4'teki yıkama sırasında desenli alanda temas olaylarını sunmak için hücre tipi başına gereken süreyi optimize etmek çok önemlidir. Örneğin, çizgi paternlerinde, insan keratositlerinin tohumlamadan sonraki ilk 30 dakika içinde uzamış morfolojiler gösterdiğini, endotel hücrelerinin ve dermal fibroblastların adezyon morfolojisinde bir değişiklik göstermeden önce birkaç saat gerektirdiğini gözlemledik. Protein inkübasyonu (adım 7) ve hücre tohumlaması (adım 8) için gerekli deneysel parametreler, seçilen protein ve hücre tipine bağlı olabilir.

3B geometrilere temas kılavuzu ipuçlarını uygulamak için sunulan yaklaşım, karmaşık çoklu işaret ortamlarında hücre davranışının daha derin bir şekilde anlaşılmasına yardımcı olabilir. Bu, fokal adezyonlar ve çekirdekler gibi hücre içi bileşenlere yönelik araştırmaları içerebilir ve ayrıca önerilen yöntemi kullanarak daha büyük, hücre veya doku ölçeğinde yapılan deneyleri de içerebilir. Sonunda, elde edilen bilgilerin, hücre davranışını istenen bir sonuca yönlendirmek için karmaşık hücresel ortamların tasarlandığı doku mühendisliği uygulamalarının tasarımında kullanılabileceği tahmin edilmektedir.

Disclosures

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Dr. Nello Formisano'ya (MERLN Teknolojiden İlham Alan Rejeneratif Tıp Enstitüsü) insan primer keratositleri sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma Chemelot InSciTe (BM3.02 projesi) tarafından desteklenmiştir; Avrupa Araştırma Konseyi (hibe 851960); ve Eğitim, Kültür ve Bilim Bakanlığı Yerçekimi Programı 024.003.013 "Malzeme Tahrikli Rejenerasyon". Yazarlar yazışmaları, yardımları ve sorun giderme çalışmaları için Alvéole'ye teşekkür eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-vinculin antibody, mouse monoclonal IgG1 Sigma V9131 Dilution: 1/600
Bovine Serum albumin, Fraction V Roche 10735086001
DMEM, high glucose, pyruvate Gibco 41966029
DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x) Gibco 10565018
DMi8 epifluorescent microscope Leica Microsystems
Ethanol Biosolve 0005250210BS
Fetal Bovine Serum Serana 758093
Fiji/ImageJ, version v1.53k www.imageJ.nih.gov
Fluorescent highlighter Stabilo 4006381333627
Fluorescin-labeled gelatin Invitrogen G13187 Concentration: 0.01%
Formaldehyde solution Merck F8775
Glass coverslips 24 x 60 mm, #1 VWR 631-1575
Glass coverslips, ø = 32 mm, #1 Menzel-Gläser
HCX PL fluotar L 20X/0.40na microscope objective Leica 11506242
HEPES Gibco 15630080
Human dermal fibroblasts Lonza CC-2511
Human primary keratocytes MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine
Illustrator, Version 26.0.1 Adobe
Laboratory oven Carbolite
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Leica Application Suite X software, version 3.5.7.23225 Leica Microsystems
Leonardo software, version 4.16 Alvéole
Micro-manager, version 1.4.23 Open imaging
Mowiol 4-88 Sigma-Aldrich 81381 mounting medium
mPEG-succinimidyl valerate MW 5,000 Da Laysan Bio MPEG-SVA-5000 Concentration: 50 mg/mL
Negative glass mold FEMTOprint
NucBlue Live Readyprobes Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen R37605 2 drops/mL
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140163
Petri dish (ø=100 mm) Greiner Bio-one 664160
Phalloidin Atto 647N Sigma 65906 Dilution: 1/250
Phosphate Buffered Saline Sigma P4417
Plasma asher Emitech K1050X
PLPP (photoinitiator) Alvéole
Poly-L-lysine, sterile-filtered Sigma-Aldrich P4707 Concentration: 0.01%
PRIMO Alvéole
Rhodamine-labeled fibronectin Cytoskeletn, Inc. FNR01 Concentration: 10 µg/mL
Secondary antibody with Alexa 488, Goat anti-mouse IgG1 (H) Molecular Probes A21121 Dilution: 1/300
Secondary antibody with Alexa 555, Goat anti-mouse IgG1 (H) Molecular Probes A21127 Dilution: 1/300
Spin coater Leurell Technologies Corporation model WS-650MZ-23NPPB
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 1673921
TCS SP8X confocal microscope Leica Microsystems
tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane ABCR AB111444
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red Gibco 12604013
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y., Wang, G., Luo, X., Qiu, J., Tang, C. Substrate stiffness regulates the proliferation, migration, and differentiation of epidermal cells. Burns. 38, 414-420 (2012).
  2. Viswanathan, P., et al. 3D surface topology guides stem cell adhesion and differentiation. Biomaterials. 52, 140-147 (2015).
  3. Peyton, S. R., et al. Marrow-derived stem cell motility in 3D synthetic scaffold is governed by geometry along with adhesivity and stiffness. Biotechnology and Bioengineering. 108 (5), 1181-1193 (2011).
  4. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
  5. Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J., Shenoy, V. B. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584, 535-546 (2020).
  6. Guido, S., Tranquillo, R. T. A methodology for the systematic and quantitative study of cell contact guidance in oriented collagen gels. Correlation of fibroblast orientation and gel birefringence. Journal of Cell Science. 105 (2), 317-331 (1993).
  7. Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116, 1881-1892 (2003).
  8. Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS Nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
  9. Buskermolen, A. B. C., et al. Cellular contact guidance emerges from gap avoidance. Cell Reports Physical Science. 1 (5), 100055 (2020).
  10. Thrivikraman, G., et al. Cell contact guidance via sensing anisotropy of network mechanical resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (29), 1-11 (2021).
  11. Buskermolen, A. B. C., et al. Entropic forces drive cellular contact guidance. Biophysical Journal. 116 (10), 1994-2008 (2019).
  12. Vignaud, T., et al. Reprogramming cell shape with laser nano-patterning. Journal of Cell Science. 125 (9), 2134-2140 (2012).
  13. Pouthas, F., et al. In migrating cells, the Golgi complex and the position of the centrosome depend on geometrical constraints of the substratum. Journal of Cell Science. 121 (14), 2406-2414 (2008).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Théry, M., et al. Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internal organization and orientation of polarity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19771-19776 (2006).
  16. Huang, G., et al. Functional and biomimetic materials for engineering of the three-dimensional cell microenvironment. Chemical Reviews. 117 (20), 12764-12850 (2017).
  17. Callens, S. J. P., Uyttendaele, R. J. C., Fratila-Apachitei, L. E., Zadpoor, A. A. Substrate curvature as a cue to guide spatiotemporal cell and tissue organization. Biomaterials. 232, 119739 (2020).
  18. Yilmaz, C. O., Xu, Z. S., Gracias, D. H. Curved and Folded Micropatterns in 3D Cell Culture and Tissue Engineering. Methods in Cell Biology. 121, Elsevier Inc (2014).
  19. Silver, F. H., Freeman, J. W., Seehra, G. P. Collagen self-assembly and the development of tendon mechanical properties. Journal of Biomechanics. 36 (10), 1529-1553 (2003).
  20. Werner, M., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. Cellular geometry sensing at different length scales and its implications for scaffold design. Materials. 13 (4), 963 (2020).
  21. Di Cio, S., Bøggild, T. M. L., Connelly, J., Sutherland, D. S., Gautrot, J. E. Differential integrin expression regulates cell sensing of the matrix nanoscale geometry. Acta Biomaterialia. 50, 280-292 (2017).
  22. Fioretta, E. S., Simonet, M., Smits, A. I. P. M., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. Differential response of endothelial and endothelial colony forming cells on electrospun scaffolds with distinct microfiber diameters. Biomacromolecules. 15 (3), 821-829 (2014).
  23. Werner, M., Kurniawan, N. A., Korus, G., Bouten, C. V. C., Petersen, A. Mesoscale substrate curvature overrules nanoscale contact guidance to direct bone marrow stromal cell migration. Journal of The Royal Society Interface. 15 (145), 20180162 (2018).
  24. Ruprecht, V., et al. How cells respond to environmental cues - insights from bio-functionalized substrates. Journal of Cell Science. 130 (1), 51-61 (2017).
  25. Bao, M., Xie, J., Huck, W. T. S. Recent advances in engineering the stem cell microniche in 3D. Advanced Science. 5 (1800448), 1-16 (2018).
  26. Zhan, X. Effect of matrix stiffness and adhesion ligand density on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 108 (3), 675-683 (2020).
  27. Jiang, T., et al. Untangling the response of bone tumor cells and bone forming cells to matrix stiffness and adhesion ligand density by means of hydrogels. Biomaterials. 188, 130-143 (2019).
  28. Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33, 4460-4468 (2012).
  29. Rape, A. D., Zibinsky, M., Murthy, N., Kumar, S. A synthetic hydrogel for the high-throughput study of cell-ECM interactions. Nature Communications. 6 (8129), 1-9 (2015).
  30. Camarero-Espinosa, S., et al. 3D printed dual-porosity scaffolds: the combined effect of stiffness and porosity in the modulation of macrophage polarization. Advanced Healthcare Materials. 11 (2101415), 1-16 (2022).
  31. Bao, M., et al. Cellular volume and matrix stiffness direct stem cell behavior in a 3D microniche. ACS Applied Materials and Interfaces. 11 (2), 1754-1759 (2019).
  32. Charest, J. L., Eliason, M. T., García, A. J., King, W. P. Combined microscale mechanical topography and chemical patterns on polymer cell culture substrates. Biomaterials. 27, 2487-2494 (2006).
  33. Bilem, I., et al. Interplay of Geometric Cues and RGD/BMP-2 crosstalk in directing stem cell fate. ACS Biomaterials Science and Engineering. 3 (10), 2514-2523 (2017).
  34. Nam, K. -H., et al. Multiscale cues drive collective cell migration. Scientific Reports. 6, 29749 (2016).
  35. Alom Ruiz, S., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  36. Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein Micropatterns. A Direct Printing Protocol Using Deep UVs. Methods in Cell Biology. 97, Academic Press. (2010).
  37. Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
  38. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640 (2009).
  39. Offenhäusser, A., et al. Microcontact printing of proteins for neuronal cell guidance. Soft Matter. 3 (3), 290-298 (2007).
  40. Ricoult, S. G., Sanati Nezhad, A., Knapp-Mohammady, M., Kennedy, T. E., Juncker, D. Humidified microcontact printing of proteins: universal patterning of proteins on both low and high energy surfaces. Langmuir. 30 (40), 12002-12010 (2014).
  41. Waterkotte, B., et al. Biofunctional Micropatterning of Thermoformed 3D Substrates. Advanced Functional Materials. 24 (4), 442-450 (2014).
  42. Lehnert, D., et al. Cell behaviour on micropatterned substrata: Limits of extracellular matrix geometry for spreading and adhesion. Journal of Cell Science. 117 (1), 41-52 (2004).
  43. Sevcik, E. N., Szymanski, J. M., Jallerat, Q., Feinberg, A. W. Patterning on topography for generation of cell culture substrates with independent nanoscale control of chemical and topographical extracellular matrix cues. Current Protocols in Cell Biology. 75, 1-25 (2017).
  44. Micropatterning: Surface functionalization. Alvéole. , Available from: https://www.alveolelab.com/technology/micropatterning-surface-functionalization/ (2022).
  45. Strale, P. O., et al. Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
  46. van Gaal, R. C., Miltenburg, R. P. R. S., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C., Dankers, P. Y. W. Renal epithelial cell responses to supramolecular thermoplastic elastomeric concave and convex structures. Advanced Materials Interfaces. 8 (1), 2001490 (2021).
  47. Foster, J. W., Gouveia, R. M., Connon, C. J. Low-glucose enhances keratocyte-characteristic phenotype from corneal stromal cells in serum-free conditions. Scientific Reports. 5, 1-16 (2015).
  48. Van Der Putten, C., et al. Protein micropatterning in 2.5D: an approach to investigate cellular responses in multi-cue environments. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (22), 25589-25598 (2021).
  49. Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).
  50. Hou, Y., et al. Surface roughness gradients reveal topography-specific mechanosensitive responses in human mesenchymal stem cells. Small. 16 (10), 1905422 (2020).
  51. Bourkoula, A., et al. Roughness threshold for cell attachment and proliferation on plasma micro-nanotextured polymeric surfaces: The case of primary human skin fibroblasts and mouse immortalized 3T3 fibroblasts. Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (30), 304002 (2016).

Tags

Biyomühendislik Sayı 184 PDMS kalıplama substrat geometrisi maskesiz UV fotodesenleme temas kılavuzu eğrilik çok işaretli hücresel mikro çevre protein kaplama
Üç Boyutlu Hücre Kültürü Substratlarının UV-Fotodesenlenmesi ile Multicue Hücresel Mikro Ortamların Oluşturulması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Putten, C., D’Urso,… More

van der Putten, C., D’Urso, M., Bril, M., Woud, T. E., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A. Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates. J. Vis. Exp. (184), e63988, doi:10.3791/63988 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter