Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generering af multicue cellulære mikromiljøer ved UV-fotopatterning af tredimensionelle cellekultursubstrater

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63988
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems, Eindhoven University of Technology

Summary

Traditionelt udføres cellekultur på plane substrater, der dårligt efterligner cellernes naturlige miljø in vivo. Her beskriver vi en metode til at producere cellekultursubstrater med fysiologisk relevante buede geometrier og mikropatternede ekstracellulære proteiner, hvilket muliggør systematiske undersøgelser af cellulær sensing af disse ekstracellulære signaler.

Abstract

Den ekstracellulære matrix er en vigtig regulator af cellefunktionen. Miljømæssige signaler, der findes i det cellulære mikromiljø, såsom ligandfordeling og vævsgeometri, har i stigende grad vist sig at spille kritiske roller i styring af cellefænotype og adfærd. Imidlertid studeres disse miljømæssige signaler og deres virkninger på celler ofte separat ved hjælp af in vitro-platforme , der isolerer individuelle signaler, en strategi, der stærkt forenkler den komplekse in vivo-situation med flere signaler. Tekniske tilgange kan være særligt nyttige til at bygge bro over dette hul ved at udvikle eksperimentelle opsætninger, der fanger kompleksiteten af in vivo-mikromiljøet , men alligevel bevarer graden af præcision og manipulerbarhed af in vitro-systemer .

Denne undersøgelse fremhæver en tilgang, der kombinerer ultraviolet (UV) -baseret proteinmønstre og litografibaseret substratmikrofabrikation, som sammen muliggør undersøgelse af celleadfærd med høj kapacitet i multicue-miljøer. Ved hjælp af maskeløs UV-fotopatterning er det muligt at skabe komplekse, klæbende proteinfordelinger på tredimensionelle (3D) cellekultursubstrater på chips, der indeholder en række veldefinerede geometriske signaler. Den foreslåede teknik kan anvendes til kultursubstrater fremstillet af forskellige polymere materialer og kombineret med klæbende mønstrede områder af en bred vifte af proteiner. Med denne tilgang kan enkeltceller såvel som monolag udsættes for kombinationer af geometriske signaler og kontaktvejledningssignaler præsenteret af de mønstrede substrater. Systematisk forskning ved hjælp af kombinationer af chipmaterialer, proteinmønstre og celletyper kan således give grundlæggende indsigt i cellulære reaktioner på multicue-miljøer.

Introduction

In vivo udsættes celler for en lang række miljømæssige signaler, der kan være af mekanisk, fysisk og biokemisk karakter, der stammer fra den ekstracellulære matrix (ECM). Talrige miljømæssige signaler er blevet identificeret til at spille afgørende roller i reguleringen af celleadfærd, såsom spredning, differentiering og migration 1,2,3,4,5. Et af de mest undersøgte fænomener er kontaktvejledning, der beskriver adhæsionsmedieret cellejustering langs anisotrope biokemiske eller topografiske mønstre, der findes på det ekstracellulære substrat 6,7,8,9,10,11. Ud over at styre justeringen af celler har kontaktvejledningssignaler også vist sig at påvirke andre celleegenskaber såsom cellemigration, organisering af intracellulære proteiner, celleform og celleskæbne 12,13,14,15. Derudover er den geometriske arkitektur i det 3D-cellulære miljø også blevet anerkendt for dets regulatoriske indflydelse på celleadfærd 16,17. I menneskekroppen udsættes celler for en række buede geometrier, der spænder fra mikroskala kollagenfibre, kapillærer og glomeruli, op til mesoskala alveoler og arterier18,19. Interessant nok har nylige in vitro-undersøgelser vist, at celler kan fornemme og reagere på sådanne fysiske signaler, fra nano- til mesoskala 20,21,22,23.

Til dato er de fleste undersøgelser, der undersøger cellerespons på miljøsignaler, stort set blevet udført ved hjælp af eksperimentelle opsætninger, der isolerer enkelte signaler. Mens denne tilgang har muliggjort enorme fremskridt i forståelsen af de grundlæggende mekanismer bag cellulær sensing af miljøsignaler, rekapitulerer den dårligt in vivo-miljøet, der samtidig præsenterer flere signaler. For at bygge bro over denne kløft er det nyttigt at udvikle kulturplatforme, hvor flere miljøsignaler kan kontrolleres uafhængigt og samtidigt. Dette koncept har fået stigende trækkraft på det seneste24,25, med undersøgelser, der kombinerer matrixstivhed og ligandtæthed 26,27,28,29, substratstivhed og porøsitet 30, substratstivhed og 3D mikronichevolumen31, overfladetopografi og kontaktstyringssignaler 32,33,34 og nanoskala kontaktvejledningssignaler med mesoskala krumningsvejledningssignaler23. Det er dog stadig udfordrende at kombinere kontaktstyringssignaler med en række 3D-geometrier på en kontrolleret og høj gennemstrømnings måde.

Denne forskningsprotokol adresserer denne udfordring og introducerer en metode til at skabe cellekultursubstrater med en kontrolleret kombination af mønstrede klæbende områder af ECM-proteiner (kontaktstyringssignaler) og substratkrumning (geometriske signaler). Denne tilgang muliggør dissektion af cellerespons i et biomimetisk multicue-miljø på en systematisk og høj gennemstrømningsmåde. Den erhvervede viden kan hjælpe med yderligere forståelse af celleadfærd i komplekse miljøer og kan bruges til at designe lærerige materialer med egenskaber, der styrer celleresponser til et ønsket resultat.

Fotopatlering af 3D-protein
Oprettelse af klæbende områder af ECM-proteiner (kontaktstyringssignaler) på cellekulturmaterialer kan opnås ved hjælp af en række forskellige teknikker, for eksempel ved dyb-ultraviolet (dyb-UV) mønster eller mikrokontaktudskrivning35,36. Dyb UV-mønster gør brug af UV-lys, der projiceres gennem en maske på et polymert materiale for at nedbryde passiveringspolymerer på bestemte steder på cellekultursubstratet. Det mønstrede substrat inkuberes derefter med en ligand af interesse, hvilket resulterer i klæbende områder, der understøtter cellefastgørelse og kultur på foruddefinerede steder 12,37,38. En alternativ måde at introducere proteinmønstre på er ved hjælp af mikrokontakttryk, hvor elastomere frimærker indeholdende en ønsket form er belagt med et protein efter eget valg og presses på et cellekultursubstrat og derved overfører proteinbelægningen, som cellerne kan klæbe til 35,37,39,40 . Desværre, da begge teknikker er afhængige af maskeforberedelse og bløde litografimetoder, er eksperimenterne tidskrævende og arbejdskrævende såvel som begrænsede med hensyn til mønsterfleksibilitet. Derudover er både dyb-UV-mønster og mikrokontaktprint mest velegnede til plane materialer og er teknisk vanskelige, hvis ikke umulige, til at mønstre ligander i et 3D-miljø.

For at forbedre disse konventionelle metoder kombinerede Waterkotte et al. maskeløs litografi, kemisk dampaflejring og termoformning for at generere mikropatternede 3D polymere substrater41. Denne teknik er imidlertid afhængig af brugen af termoformbare polymerfilm og tilbyder lav proteinmønsteropløsning (7,5 μm), mens celler er rapporteret at reagere på geometriske proteinmønstre så små som 0,1 μm 2,42. Sevcik et al. beskrev en anden lovende metode til nanopattern ECM ligander på substrater indeholdende nano- og mikrometer topografier43. Ved hjælp af mikrokontakttryk blev ECM-proteiner overført fra polydimethylsiloxan (PDMS) stempler til et termoresponsivt poly (N-isopropylacrylamid) (pNIPAM) substrat. Derefter tillod den termoresponsive egenskab af pNIPAM-netværket dem at overføre det todimensionale (2D) proteinmønster til et topografisk PDMS-substrat (10-100 μm dybe riller) og derved kontrollere lokaliseringen af vedhæftningssteder på topografiske egenskaber. Imidlertid kan ikke alle mulige mikrotopografier mønstres, da nedsatte befugtningsproblemer gør det vanskeligere at mønstre dybere topografiske substrater. Grøfter med et dybde-til-bredde-billedformat på 2,4 er blevet rapporteret at være den ultimative grænse for vellykket overførsel af mønsteret til det topografiske substrat43. Derudover er fleksibiliteten i forskellige mønstre og opløsningen af de genererede mønstre dårlig på grund af kravet om mikrokontaktudskrivning.

Dette papir beskriver en metode, der overvinder ovennævnte flaskehalse og tilbyder en fleksibel metode med høj kapacitet til at skabe multicue-substrater, der kan bruges til cellekultur (se figur 1). Fysiologisk relevante geometrier (cylindre, kupler, ellipser og sadeloverflader) med krumninger fra ĸ = 1/2500 til ĸ = 1/125 μm-1 er prædesignet og mikrofabrikeret i PDMS-chips . Efterfølgende oprettes kontaktvejledningssignaler oven på 3D-geometrierne ved hjælp af en række digitale mønsterdesign ved at anvende en fotopattering-teknik med en opløsning så lille som 1,5 μm44. Til dette formål passiveres PDMS-chipsene oprindeligt for at forhindre celler og proteiner i at klæbe; dette passiveringslag kan derefter fjernes ved kombination af fotoinitiatoren 4-benzoylbenzyl-trimethylammoniumchlorid (PLPP) og UV-lyseksponering45. En digital maske er designet til at specificere placeringen af UV-eksponering og dermed det område, hvor passiveringslaget fjernes. Proteiner kan efterfølgende klæbe til disse områder, hvilket muliggør cellebinding. Da mønsteret udføres ved hjælp af en digital (snarere end en fysisk) maske, kan der hurtigt oprettes en række mønstre uden besværet og omkostningerne forbundet med at designe og fremstille yderligere fotomasker. Derudover kan en bred vifte af ECM-proteiner (f.eks. Kollagen type I, gelatine og fibronectin) mønstres på substratet. Selvom denne protokol udføres ved hjælp af cellekulturchips lavet af PDMS, kan princippet anvendes på ethvert andet materiale af interesse46.

Protocol

I de undersøgelser, der er beskrevet i denne protokol, blev primære humane keratocytter anvendt. Denne forskning blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Primære keratocytter blev isoleret fra resterende humane kadaveriske hornhindevæv fra Descemet Membrane Endothelial Keratoplasty kirurgi, som blev opnået fra Hornhindeafdelingen på ETB-BISLIFE Multi-Tissue Center (Beverwijk, Holland) efter at have opnået samtykke fra pårørende til alle afdøde donorer.

BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer om alle materialer, reagenser, udstyr og software, der anvendes i denne protokol.

1. Fremstilling af 3D-cellekultursubstrater

  1. Opret en negativ glasform (# 1), der indeholder alle funktioner af interesse, i dette tilfælde lavet af glas ved hjælp af en femtosekund-laser direkte skriveteknik (se figur 2).
  2. Læg forsigtigt den negative glasform på bunden af et petriskål.
  3. Forbered en PDMS-præpolymer ved at placere et tomt 50 ml konisk rør på en skala, tare skalaen og hæld den ønskede mængde silikone elastomerbase i røret.
  4. Tilsæt hærdningsmiddel ved hjælp af et Pasteur-rør, så det endelige forhold mellem elastomerbase og hærdningsmiddel er 10: 1 (w / w).
  5. Bland komponenterne grundigt i det koniske rør ved hjælp af en spatel.
  6. Centrifuger ved 2.000 × g i 70 s for at fjerne alle luftbobler.
  7. Hæld PDMS-præpolymeren oven på den negative glasform (nr. 1) i petriskålen for at dække den helt.
  8. Anbring petriskålen med den negative glasform (nr. 1) og PDMS-præpolymeren i vakuumdissikkatoren, og start vakuumpumpen. Når et vakuum er nået, skal du vente i 5 minutter for at fjerne alle bobler, der er til stede ved grænsefladen mellem formoverfladen og PDMS-præpolymeren.
  9. Fjern støvsugeren og tag petriskålen ud af ekssikkatoren.
  10. PDARM-præpolymeren hærdes natten over i ovnen ved 65 °C.
  11. Fjern forsigtigt den nyligt hærdede positive PDMS-chip (# 2) fra den negative glasform (# 1) ved at løfte kanterne på PDMS ved hjælp af en spatel. Hvis den positive PDMS-chip (#2) har tendens til at klæbe til den negative glasform (#1), tilsættes ethanol eller vand til kanterne af aftrykket, mens du løfter.
    BEMÆRK: Væsken løber ind mellem de to lag og letter adskillelsen af den negative glasform (# 1) og den positive PDMS-chip (# 2).
  12. Brug et blad til at afskære siderne af den positive PDMS-chip (nr. 2), så der forbliver en rektangulær chip.
  13. Den positive PDMS-chip (nr. 2) anbringes i en ekssikkator ved siden af et lille hætteglas med en dråbe tridecafluor(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorsilan, et silaniseringsmiddel, og lad det stå under vakuum natten over.
    BEMÆRK: Silanisering vil sikre, at aftrykket ikke binder til andre PDMS-lag senere i protokollen. Andre silaniseringsmidler og / eller metoder kan også fungere for at sikre, at overfladerne på PDMS-chipsene ikke klæber til andre PDMS-lag.
    FORSIGTIG: Tridecafluor(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorsilan er brandfarlig (H226) og forårsager alvorlige hudforbrændinger og øjenskader (H314). Brug personlige værnemidler, arbejd i en røghætte, og vask hænderne grundigt efter håndtering. Hold silaniseringsmidlet væk fra varme, varme overflader, gnister, åben ild og andre antændelseskilder. Opbevares mellem 15 og 30 °C (P280, P210, P240, P403, P235, P310).
  14. Fjern vakuumet og læg den positive PDMS-chip (nr. 2) på bunden af en petriskål. Hæld PDMS-præpolymer (10: 1) ovenpå for at producere flere negative PDMS-forme (# 3).
  15. Sæt petriskålen under vakuum i ekssikkatoren i 15 minutter for at fjerne alle bobler.
  16. Bedøm PDMS-præpolymeren ved 65 °C natten over, hvorefter den negative PDMS-form (#3) kan skrælles af den positive PDMS-chip (#2) ved hjælp af en spatel.
  17. Silaniser den endelige negative PDMS-form (nr. 3) ved hjælp af silaniseringsmiddel i en vakuumsikkator natten over.
  18. Fremstil flere cellekulturchips (#4, se figur 2) med ca. 5 mm tykkelse ved at hælde PDMS-præpolymer i den negative PDMS-form (#3), fjerne bobler ved hjælp af tørremaskinen og hærde i 3 timer ved 65 °C. Skær chippen til den endelige størrelse som visualiseret i figur 2 med et barberblad. Opbevar chipsene ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Overfladeruhed kan påvirke den cellulære respons. Hvis det er nødvendigt, kan et ekstra tyndt lag PDMS bruges som belægning på den positive PDMS-chip (nr. 2) for at udjævne overfladen. For at gøre det skal du hælde en lille dråbe PDMS-prepolymer på chippen og sprede den over hele chippen ved hjælp af trykluft. Den overtrukne chip hærdes ved 65 °C i 3 timer, og fortsæt med trin 1.12.

2. Fremstilling af flade PDMS-prøver (kontrolprøver)

  1. PDMS-præpolymer (10:1) fremstilles i henhold til trin 1.3-1.6.
  2. Placer en glasdæksler på den afrundede vakuumstolpe i midten af spincoateren.
  3. Tænd for vakuumet for at fastgøre glasdækslet til maskinen, og rør en dråbe PDMS midt på dækslen ved hjælp af et Pasteur-rør.
  4. Fordel PDMS-præpolymeren over glassubstratet ved hjælp af følgende protokol for at få et ca. 10 μm tykt lag.
    1. Spincoat til 10 s ved 0,45 × g, acceleration: 0,2 × g/s.
    2. Spincoat til 50 s ved 44,8 × g, acceleration: 0,54 × g/s.
  5. Sluk for støvsugeren, fjern dækslippen fra spincoateren ved hjælp af en pincet, og læg den i en petriskål. P PDMS'en hærdes natten over i ovnen ved 65 °C og opbevares ved stuetemperatur bagefter.

3. Substrat passivering af 3D-cellekultursubstrater

  1. Aktiver hydroxylgrupperne på overfladen af PDMS-chippen (#4) ved hjælp afO2-plasma. Brug pincet til at placere chippen i kurven på plasma asher.
  2. Kør en askecyklus ved hjælp af en effekt på 20 W i 30 s. Udluft askekammeret ved hjælp af N2.
  3. Tag chippen ud af kurven og læg den i en lille PDMS-beholder (se figur 1).
  4. Ved hjælp af et Pasteur-rør tilsættes 500 μL Poly-L-lysin (PLL, 0,01%) på toppen af chippen, så hele overfladen nedsænkes i PLL-opløsningen. Inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
  5. 450 μL PLL fjernes fra cellekulturchippen med et pipette, og spånoverfladen skylles tre gange med 500 μL 0,1 M HEPES-buffer (8 < pH-< 8,5). Efterlad altid et lille volumen væske på PDMS-chippen for at undgå udtørring af prøven, hvilket reducerer den endelige mønsterkvalitet.
  6. Der fremstilles 500 μL af et 50 mg/ml methoxypolyethylenglycol-succinimidylvalerat (mPEG-SVA; MW 5.000 Da) opløsning i 0,1 M HEPES-buffer (8 < pH-< 8,5) pr. cellekulturchip, og lad den inkubere på prøven i 60 minutter. Da mPEG-SVA har en halveringstid på 15 minutter, skal du sørge for at forberede den nødvendige mængde lige før brug.
    BEMÆRK: mPEG-SVA opløses, når opløsningen er helt gennemsigtig.
  7. Fjern 450 μL af mPEG-SVA-opløsningen ved hjælp af et mikropipet, og vask spånoverfladen fem gange med fosfatbufferet saltvand (PBS). Sørg for at pippe op og ned flere gange pr. vask for at sikre, at al ubundet mPEG-SVA fjernes. For at forhindre, at prøven tørrer ud, skal du minimere tiden mellem vasketrin og sørge for at bruge et overskud (500 μL eller mere) PBS til vask.
  8. Opbevar prøverne ved at nedsænke dem i PBS, eller fortsæt til protokollens mønstertrin.
    BEMÆRK: Hvis det ønskes, kan passivering udføres under sterile forhold, når du arbejder i et kulturskab og arbejder med sterile opløsninger og udstyr.

4. Opbevaring af mønstrede cellekultursubstrater

BEMÆRK: 3D-cellekultursubstrater kan opbevares under forskellige trin i processen.

  1. Opbevar hærdede PDMS-cellekulturchips under tørre forhold ved stuetemperatur.
  2. Opbevar de passiverede cellekulturchips på en af disse to måder:
    1. Opbevares i PBS ved 4 °C i op til 7 dage.
    2. Opbevares under tørre forhold i op til flere måneder. For at opnå tørre prøver skal PBS fjernes OG SKYLLES flere gange med dobbeltdestilleret vand (ddH2O). Føntør med en nitrogen- eller luftpistol.

5. Design af digitale masker, der bruges til fotopatterning

BEMÆRK: Mønstre af 3D-substrater kan udføres ved hjælp af et enkelt eller flere fokalplaner (se figur 3). Et enkelt brændplan kan bruges på funktioner, der ikke er større end en digital spejlenhed (DMD, ca. 300 μm x 500 μm), og som ikke er for høje (50-100 μm). I så fald skal du designe et digitalt mønster ved hjælp af TIFF-tilstanden. For funktioner, der overstiger dimensionerne af en DMD og er relativt høje, skal du opdele substratets mønster i flere trin. I dette tilfælde er flere mønstre designet ved hjælp af PDF-tilstanden, der alle individuelt fokuserer på enkelte fokusplaner.

  1. Design en digital maske ved hjælp af designsoftwareværktøjer.
    1. Mønstre i TIFF-tilstand (pixels): Opret et helt sort tegnebræt på 1.140 x 1.824 pixels (den nøjagtige størrelse på 1 DMD, ca. 300 μm x 500 μm) og fyld tegnebrættet med de former, der er af interesse. Eksporter tegnebrættet som en 8-bit TIFF-fil.
      BEMÆRK: Forskellige grå niveauer i mønsterdesignet bestemmer mængden af eksponering, der skal udføres på det pågældende sted.
    2. Mønstre i PDF-tilstand (metriske enheder): Opret et sort tegnebræt af den ønskede størrelse i mm, og fyld tegnebrættet med enhver form af interesse. Opdel mønsteret i flere filer, hvis 3D-substratet skal mønstres ved hjælp af flere fokalplaner. Gem tegnebrættet som en PDF-fil.
      BEMÆRK: Forskellige grå niveauer i mønsterdesignet bestemmer mængden af eksponering, der skal udføres på det pågældende sted.

6. UV-fotopatterning af 3D-cellekultursubstrater

  1. Kalibrering
    BEMÆRK: Kalibrering af laseren udføres for at få korrekt fokus på materialet af interesse. Da PDMS-cellekultursubstraterne er for tykke til at mønstre igennem, skal du bruge et glasglas, hvorpå chippen placeres på hovedet. Da laseren møder glasglasset først, skal du bruge glas til at kalibrere laseren.
    1. Påfør fluorescerende highlighter på en glasdæksel, og placer glasdækslet i stadiet i det fluorescerende mikroskop. Sørg for, at den fremhævede overflade vender opad.
    2. Tænd for mikroskopet og PRIMO-udstyret, og åbn Micro-manager for at få adgang til Leonardo-softwaren under 'plugins'.
    3. Vælg Kalibrering i den indledende menu efterfulgt af valg af 20x-målet både på mikroskopet og i softwaren. Klik på Næste.
    4. Placer glasglasset med fluorescerende highlighter i mikroskopets optiske vej. Skift til fluorescerende tilstand, og fokuser omhyggeligt på det PRIMO-billede, der vises, og sørg for, at både logo og tekst er i fokus. Klik på Næste for at afslutte kalibreringsproceduren.
    5. Skriv ned Z-placeringen af trinnet, når du kalibrerer, og brug denne placering som reference senere i protokollen.
      BEMÆRK: Kalibreringsmaterialet skal matche det materiale, der bruges til mønster senere i protokollen. Ovenstående trin beskriver den kalibrering, der er nødvendig for cellekultursubstraterne. Til kalibrering af flade PDMS-kontrolprøver påføres fluorescerende highlighter oven på en ekstra flad PDMS-prøve og kalibreres ved hjælp af trin 6.1.2-6.1.5.
  2. Mønstrende 3D-funktioner ved hjælp af et enkelt brændplan
    BEMÆRK: Mønstre ved hjælp af et enkelt brændplan udføres på 3D-funktioner, der ikke overstiger dimensionerne på en DMD (ca. 300 μm x 500 μm). En skematisk oversigt over opsætningen af fokusplanet er illustreret i figur 3.
    1. Fjern kalibreringsglasset fra scenen, og placer et glasglas indeholdende en dråbe (~ 50 μL) fotoinitiator (PLPP) i scenen.
      FORSIGTIG: PLPP er irriterende for øjnene, åndedrætssystemet og huden (R36-38). Brug personlige værnemidler, hold det væk fra eksplosive materialer, tilsæt aldrig vand til dette produkt, tag forholdsregler mod statiske udladninger og undgå stød og friktion (S26-36).
    2. Placer PDMS-cellekultursubstratet på hovedet i dråben af fotoinitiator. Sørg for, at 3D-funktionerne på overfladen af cellekultursubstratet vender mod glasglasset og er helt nedsænket i PLPP for at sikre korrekt mønster.
    3. Vælg Mønster i softwaren.
    4. Skift til brightfield-tilstand på mikroskopet og flyt scenen til funktionen af interesse.
    5. Fokus på toppen eller bunden af henholdsvis konvekse og konkave strukturer (figur 3).
    6. Vælg PRIMO for at indsætte et valgt mønster. Se mønstereksemplet i orange oven på det dynamiske brightfieldbillede.
    7. Juster mønsterindstillingerne i henhold til funktionen (placering, vinkel, gentagelser), og vælg en dosis på 1.000 mJ/mm2.
    8. Klik på Lås og skift mikroskopet til fluorescerende tilstand.
    9. Klik på knappen Afspil nederst til højre på skærmen for at starte mønsteret. Når du er færdig, skal du observere mønsteret, der vises i grønt.
    10. Når du er færdig med alle funktioner på en cellekulturchip, skal du fjerne chippen fra mønsterslideglasset og opbevare den i PBS ved 4 °C.
  3. Mønstrende 3D-funktioner ved hjælp af flere fokusplaner
    BEMÆRK: Mønstre ved hjælp af flere fokalplaner udføres på 3D-funktioner, der er større end en DMD (ca. 300 μm x 500 μm) eller er relativt høje. I dette tilfælde skal 3D-funktionerne mønstres i flere trin, det vil sige mønsterdesignet skal tilpasses i henhold til eksemplet i figur 3.
    1. Fjern kalibreringsglasset fra scenen, og placer et glasglas indeholdende en dråbe (~ 50 μL) fotoinitiator (PLPP) i scenen.
    2. Placer PDMS-cellekulturchippen på hovedet i dråben af fotoinitiator ved hjælp af pincet.
    3. Vælg Mønster i softwaren. Skift til brightfield-tilstand på mikroskopet og flyt scenen til funktionen af interesse.
    4. Fokuser på chipområdet på det rigtige sted. Da mønsterning udføres i et enkelt brændplan, og funktionerne er større end en enkelt DMD, skal du bruge flere brændplaner og dermed flere runder af mønstre pr. 3D-substrat for at sikre tilstrækkelig mønsteropløsning langs hele funktionens højde og bredde (se figur 3). For eksempel for en funktion med en højde på 150 μm, mønster funktionen i tre runder (± 1 brændplan pr. 50 μm Z-vandring), der fokuserer omkring 25 μm, 75 μm og 125 μm fra bunden af funktionen. Sørg for, at bunden af funktionen er omkring den værdi, der er nedskrevet i trin 6.1.5.
    5. Vælg PRIMO for at indsætte det valgte mønster. Se mønstereksemplet, der vises med orange oven på det dynamiske brightfieldbillede.
    6. Juster mønsterindstillingerne i henhold til funktionen (placering, vinkel), og vælg en dosis på 1.000 mJ/mm2.
    7. Klik på Lås og skift mikroskopet til fluorescerende tilstand.
    8. Klik på knappen Afspil nederst til højre på skærmen for at starte mønsteret. Når du er færdig, skal du observere mønsteret, der vises i grønt.
    9. Gentag trin 6.3.4-6.3.8 om funktionen af interesse, når der anvendes flere fokusplaner.
    10. Når du er færdig med alle funktioner på en cellekulturchip, skal du fjerne chippen fra mønstersliden og opbevare den i PBS ved 4 °C.
      BEMÆRK: Påfør evt. UV-fotopatterning under sterile forhold, brug af petriskåle med glasbund og tilbered alle underlag i sterile kulturskabe. Opbevar de mønstrede prøver i PBS i op til et par uger. Når prøverne vaskes med ddH2O og tørres med trykluft, kan de opbevares op til et par måneder ved 4 °C.

7. Protein inkubation

BEMÆRK: Det anbefales at anvende frisk proteininkuerede substrater til cellekultur. Fortsæt kun til denne del af protokollen, hvis cellesåningen (trin 8) udføres direkte bagefter.

  1. Overfør den mønstrede cellekulturchip til sterile PDMS-beholdere i kulturskabet.
  2. De mønstrede cellekulturchips vaskes 3x med et overskud af steril PBS, hvis mønsterningen ikke blev udført under sterile forhold.
  3. Tilbered en frisk proteinopløsning i PBS.
    1. Fibronectin: Der tilsættes 2 ml PBS ved hjælp af et mikropipet til et hætteglas på 20 μg rhodaminmærket fibronectin for at opnå en koncentration på 10 μg/ml. Pipette forsigtigt for at undgå dannelse af proteinklumper og beskytte mod lys.
    2. Gelatine: optø en 200 μL aliquot opløst gelatine-fluorescein. Beskyt mod lys.
  4. Tilsæt 200-500 μL af proteinopløsningen til cellekulturchippen ved hjælp af et mikropipet. Juster inkubationstiden og temperaturen afhængigt af det valgte protein: Fibronectin: 5 min ved stuetemperatur, Gelatine: 15 min ved 37 °C. Sørg for at dække prøven (f.eks. med aluminiumsfolie).
  5. Proteinopløsningen fjernes, og 5x vaskes med 500 μL steril PBS. Sørg for at pipettere PBS op og ned flere gange frem for alle relevante funktioner i cellekulturchippen for at fjerne ethvert ubundet protein.
    BEMÆRK: Under vasketrinnene er det afgørende, at prøven aldrig tørrer ud. Når proteinopløsningen eller PBS fjernes under vask, tilsættes straks nyt PBS for at forhindre dannelse af proteinklumper (se figur 4). Konvekse træk er særligt følsomme over for udtørring, da de er forhøjet over substratoverfladen.
  6. Valgfrit: gennemgå proteinmønstrene under et fluorescensmikroskop. Holde prøverne sterile og nedsænket i PBS.

8. Cellesåning

BEMÆRK: Denne protokol bruger humane primære keratocytter og humane dermale fibroblaster. Keratocytterne blev høstet fra humant hornhindevæv fra patienter i overensstemmelse med hollandske retningslinjer for sekundær anvendelse af materialer og tidligere karakteriseret som keratocytter47. Disse celler dyrkes i DMEM suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin (P / S) og 1 mM L-ascorbinsyre 2-phosphat sesquimagnesium salthydrat (C-vitamin) ved 37 ° C i højst fire passager. Humane dermale fibroblaster blev købt og dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS og 1% P/S ved 37 °C i højst 15 passager. Til såning af både keratocytter og dermale fibroblaster på den fotopatternede cellekulturchip blev der anvendt 20.000 celler pr. Chip.

  1. Løsrive cellerne af interesse (f.eks. ved hjælp af trypsin) og tilbered 1 ml af en cellesuspension på ± 10.000-50.000 celler / ml i kulturmedium pr. Chip. Juster det nøjagtige antal celler, der tilføjes pr. substrat, afhængigt af cellestørrelsen og den ønskede udlæsning.
  2. Fjern PBS fra cellekulturchippen, og tilsæt 1 ml af cellesuspensionen.
  3. Transporter forsigtigt cellekulturchippen med cellerne til inkubatoren og inkuberes i 60 minutter ved 37 °C.
  4. Kontroller vedhæftningen af cellerne på den mønstrede cellekulturchip under et brightfieldmikroskop. Se efter aflange cellemorfologier i tilfælde af linjemønstre (se figur 5). Hvis celler også er begyndt at klæbe uden for det mønstrede område, skal du fjerne disse ved at pipettere medium op og ned direkte over cellerne på substratet.
    BEMÆRK: Celler, der er fastgjort til det mønstrede område, forbliver fastgjort, mens celler uden for de mønstrede områder løsnes.
  5. Fjern cellekulturchippen fra PDMS-beholderen, og brug steril pincet til at lægge den i en 6-brønds plade fyldt med ~ 5 ml kulturmedium.
  6. Kultur cellerne i den ønskede tid. Udskift cellekulturmediet hver 2-3 dage. For at sikre visualisering af proteinmønsteret efter cellekultur skal du reducere mængden af eksponering af prøven for lys under dyrkning.

9. Farvning, billedoptagelse og analyse

  1. Fiksering og farvning
    1. Efter den ønskede kulturlængde fjernes næsten hele mediet og vaskes tre gange med overskydende PBS. Derefter inkuberes med 3,7% formalin i 15 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af tre vasketrin med PBS i 5 minutter pr. vask ved stuetemperatur. Lad aldrig prøven tørre ud.
      FORSIGTIG: Formalin er skadeligt ved indtagelse eller ved indånding (H302, H332), kan forårsage en allergisk hudreaktion (H317), mistænkes for at forårsage genetiske defekter (H341) og kan forårsage kræft (H350). Brug personlige værnemidler og arbejd i en røghætte.
    2. Pletter cellekultursubstratet med de ønskede farvningsmidler eller antistoffer. For at reducere mængderne af farvningsmidler skal du placere cellekulturchipsene på hovedet i en dråbe farvningsopløsning, der er rørt på et glasglas.
    3. Prøverne opbevares i PBS (kortvarigt) eller fastgøres til en dækslip ved hjælp af monteringsmedium (langtids) ved 4 °C.
  2. Erhvervelse af billeder
    1. Anbring den farvede prøve på hovedet i en dråbe PBS på et glasglas. Sæt prøven i scenen af et konfokalt mikroskop.
    2. Afhængigt af det krævede detaljeringsniveau skal du lave Z-stakke med et passende mål (10x, 20x eller 40x) og Z-afstand for at sikre korrekt billedoptagelse.
  3. Billedanalyse og visualisering
    1. Åbn de rå billedfiler i billedanalysesoftwaren, og kontroller, at billedegenskaberne (f.eks. Dimensioner, opløsning) er korrekte.
    2. Juster lysstyrken og kontrasten pr. kanal, hvis det er nødvendigt.
    3. Beskær det område af interesse, der indeholder mønsteret og cellerne.
    4. Valgfrit: Udfør et dekonvolutionstrin, hvis det er nødvendigt.
    5. Opret en 3D-gengivelse af Z-stakken ved hjælp af 3D-gengivelsessoftware.
    6. Optimer kontrast- og forstærkningsindstillingerne for hver enkelt kanal.
    7. Hvis du vil oprette et billede af 3D-gengivelsen, skal du oprette et øjebliksbillede og eksportere som . TIFF-fil.
    8. Hvis du vil oprette en film af 3D-gengivelsen, skal du indstille start- og slutrammen samt tidsrammen, før du registrerer filmen. Eksporter som .avi.

Representative Results

Ved hjælp af den beskrevne protokol kan 3D PDMS-cellekultursubstrater UV-fotopatteres for at skabe præcise klæbende områder med høj kapacitet, der er egnede til cellefastgørelse. På denne måde udsættes celler for både relevante substratgeometrier og klæbende ligandmønstre samtidigt. Celleegenskaber såsom orientering, celleområde og antal fokale adhæsioner kan let overvåges og bruges til bedre at forstå celleadfærd i komplekse, in vivo-lignende miljøer.

For at verificere mønsterhændelserne på 3D PDMS-substraterne er atomoverfladesammensætninger af materialet i forskellige faser af protokollen blevet målt ved hjælp af atomrøntgenfotoelektronspektroskopi (XPS)48. Sammenfattende viste XPS-målingerne tilstedeværelsen af PEG-kæder med et øget kulstofsignal på passiverede prøver, som blev reduceret efter fotopatterning. Inkubation med fibronectin resulterede i en stigning i carbonsignalet, hvilket igen indikerer vellykket proteinadhæsion på overfladen af cellekulturchippen. Dernæst blev mønsteropløsning og justering på 3D-funktioner karakteriseret på en række cirkelmønstrede, konkave gruber (ĸ = 1/250 μm-1, ĸ = 1/1.000 μm-1 og ĸ = 1/3.750 μm-1, se figur 6). Ud fra fremskrivningerne af maksimal intensitet kan det konkluderes, at proteinmønsteret med succes blev mønstret på alle tre 3D-funktioner. Intensitetsprofilen i figur 6A viser høj mønsteropløsning med skarpe overgange mellem mønstrede og ikke-mønstrede områder. Derudover blev der opnået ensartet proteinintensitet på tværs af det komplette mønster i gruben.

Den konkave grube med ĸ = 1/250 μm-1 blev mønstret ved hjælp af enkeltbrændplansmetoden (et mønster), mens gruberne med ĸ = 1/1.000 μm-1 og ĸ = 1/3.750 μm-1 blev mønstret ved hjælp af henholdsvis to og tre brændplaner (mønstre). Som det fremgår af fremskrivningerne af maksimal intensitet i figur 6, resulterer begge metoder i perfekt justering af mønstrene oven på funktionerne. Der kan ikke observeres forkert justerede overgange mellem de to forskellige fokusplaner og mønstre.

Ved hjælp af den beskrevne protokol kan en bred vifte af proteinmønsterdesign anvendes på en række geometrier (se figur 7 og video 1). For at illustrere alsidigheden af denne metode blev semicylinders (konvekse og konkave), en sadeloverflade og pit mønstret ved hjælp af linjer og cirkler af forskellig bredde. De fotopatternede materialer kan efterfølgende bruges til cellekultur (se figur 7, figur 8, video 2, video 3 og video 4). Et eksempel på dermale fibroblaster dyrket på en mønstret (fibronectin linjer, rød, 5 μm bred og 5 μm huller) konkav semicylinder er vist i figur 8, figur 9 og video 4. Under eksperimentet sanser og klæber celler til multicue-cellekultursubstratet og forbliver levedygtige over tid. Som det fremgår af den immunfluorescerende farvning i figur 8, danner celler fokale adhæsioner (vinculinklynger) hovedsageligt på fibronectinlinjerne.

Et andet eksempel på undersøgelse, der gør brug af disse cellekulturmaterialer, blev for nylig offentliggjort af vores gruppe48. I denne undersøgelse blev humane myofibroblaster og endotelceller udsat for kombinationen af kontaktvejledningssignaler og geometriske topografier. In vivo oplever begge typer celler krumnings- og kontaktvejledningssignaler i indfødte væv, såsom i den humane vaskulatur. Ved at udsætte cellerne in vitro for et miljø, der kombinerer begge miljømæssige signaler, kan in vivo-situationen rekapituleres, hvilket giver en dybere forståelse af mikromiljøets rolle på celleadfærd. Humane myofibroblaster viste sig at flugte med kontaktvejledningssignaler (parallelle fibronectinlinjer) på konkave cylindriske substrater48. På konvekse strukturer med stigende krumninger tilsidesatte de geometriske signaler imidlertid de biokemiske signaler, hvilket tyder på, at myofibroblaster kan mærke både graden og tegnet på krumning. Interessant nok kunne endotelceller kun klæbe til de konkave multicue substrater og ikke til de konvekse PDMS-substrater. På konkave, proteinmønstrede substrater er endotelcellerne orienteret i retning af kontaktvejledningssignalet. Denne grundlæggende in vitro-viden har fysiologisk relevans inden for vaskulær vævsteknik og kan i sidste ende hjælpe med design af smarte vævstekniske konstruktioner.

Figure 1
Figur 1: Den eksperimentelle tidslinje for anvendelse af kontaktvejledningssignaler på 3D-cellekultursubstrater. For det første fremstilles positive cellekulturchips fra en negativ PDMS-form indeholdende en række geometrier. Uhærdet PDMS hældes i formen og hærdes i 3 timer ved 65 °C. Derefter behandles PDMS medO2-plasma og inkuberes med PLL og mPEG-SVA (blå, mærket) for at passivere overfladen af cellekultursubstratet. Efter vask vendes substratet på hovedet i en dråbe fotoinitiator (PLPP, grøn, mærket) og UV-fotopatterned ved hjælp af LIMAP-tilgangen. Her bruges en digital maske med et brugerdefineret mønster til at spalte passiveringslaget på definerede steder. Dernæst kan en proteinopløsning (rød, mærket) inkuberes og vil kun klæbe til de steder, hvor passiveringslaget fjernes. Celler podet på substratet udsættes for både geometri og proteinmønstre, hvilket muliggør forskning i celleadfærd i komplekse, in vivo-efterlignende miljøer. Forkortelser: PDMS = polydimethylsiloxan; mPEG-SVA = methoxypolyethylenglycol-succinimidylvalerat; PLPP = 4-benzoylbenzyl-trimethylammoniumchlorid; LIMAP = Lysinduceret molekylær adsorption af proteiner. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Forskellige stadier under produktion og passivering af 3D-cellekultursubstratet. Den negative glasform (# 1) er designet med computerassisteret designsoftware og produceret ved hjælp af en femtosekund-laser direkte skriveteknik. Denne form bruges til at producere den mellemliggende positive PDMS-chip (# 2) og negativ PDMS-form (# 3), som efterfølgende bruges til at producere den endelige cellekulturchip (# 4). Forkortelse: PDMS = polydimethylsiloxan. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Skematisk illustration af de to mønstremetoder. Til venstre: UV-fotopatterning udføres på mindre funktioner (ca. en DMD) ved hjælp af et enkelt brændplan og mønster. Som et resultat er den komplette funktion mønstret på én gang. Til højre: Når der bruges større funktioner (større end en DMD), er mønstret opdelt over flere fokusplaner og mønstre. Forkortelse: DMD = digital spejlenhed. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Et typisk eksempel på et normalt og udtørret proteininkuberet substrat. Fremskrivninger med maksimal intensitet (XY) og ortogonale visninger (XZ) af normale og udtørrede proteininkuberede substrater. Når du vasker et mønstret cellekultursubstrat efter inkubation med en proteinopløsning, er det afgørende altid at holde prøven våd. Selvom mønsteret er identisk på alle billeder på funktionerne (ĸ = 1/1.000 μm-1), aggregerede gelatine-fluorescein (grøn) en større klump, da prøven blev efterladt til tørring i et par sekunder. Hvis prøven altid forbliver våd, kan der observeres korrekte proteinmønstre. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Brightfield-billeder efter seedning. Primære keratocytter (venstre) og dermale fibroblaster (højre) 4 timer efter såning på 3D geometriske træk (konkav pit af ĸ = 1/1.000 μm-1 og semicylinders af ĸ = 1/500, 1/375, 1/250, 1/175 og 1/125 μm-1). De øverste venstre indsatser repræsenterer det linjemønster, der bruges til mønsteret af geometrierne. Hvide pile angiver spredningsceller, der allerede viser justering. Skalabjælker = 250 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Karakterisering af cirkulære mønstre på konkave gruber. (A) Den maksimale intensitetsprojektion (XY) og ortogonale visning (XZ) af aconcave pit (ĸ = 1/250 μm-1) mønstret ved hjælp af LIMAP (linjebredde: 20 μm, mellemrumsbredde: 20 μm) og inkuberet med gelatine-fluorescein (grøn). Intensitetsprofilen langs den hvide linje er plottet mod afstanden og viser en ensartet mønsterkvalitet og opløsning. (B) Yderligere mønstre udført på konkave gruber med ĸ = 1/1.000 μm-1 og ĸ = 1/3750 μm-1, der viser fleksibilitet med hensyn til geometriske træk, der kan bruges til mønster. Igen visualiseres både de maksimale intensitetsfremskrivninger (XY) og ortogonale visninger (XZ). Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: 3D-mikroskopidata af mønstrede strukturer. Typiske eksempler på 3D-mønstrede cellekulturmaterialer efter fotopatterning og cellekultur, visualiseret ved hjælp af 3D-gengivelsessoftware. (A) Konveks semicylinder mønstret med 10 μm brede linjer (rhodamin-fibronectin, rød) og 10 μm brede huller. Skalabjælke = 5 μm. (B) Dermale fibroblaster farvet til F-actin (grøn) dyrket på konkav semicylinder mønstret med 20 μm brede linjer (rhodamin-fibronectin, rød) og 20 μm brede huller. Skalabjælke = 5 μm. (C) Sadeloverflade mønstret med 20 μm brede linjer (rhodamin-fibronectin, rød) og 20 μm brede huller. Skalastang = 5 μm. (D) Konkav grube mønstret med koncentriske cirkler af 20 μm brede linjer (gelatine-fluorescein, grøn) og 20 μm brede huller. F-actincytoskelettet af de humane keratocytter farves ved anvendelse af phalloidin og visualiseres i rødt. Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Immunofluorescerende farvning af humane dermale fibroblaster på en fotopatterned, konkav semicylinder. (A) Maksimal intensitetsprojektion (XY) og ortogonale sektioner (XZ og YZ) af humane dermale fibroblaster dyrket i 24 timer på en mønstret (fibronectin linjer, rød, 5 μm bred og 5 μm huller) konkav semicylinder. Celler er farvet for F-actin (magenta), vinculin (grøn) og kerner (blå). Skalalinje = 100 μm. (B) Zoom ind i en celle, der klæber til multicue-miljøet. Skalabjælker = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Brightfield timelapse billeder af humane dermal fibroblaster på en mønstret, konkav cylinder. Den konkave semicylinder (ĸ = 1/250 μm-1) blev mønstret med parallelle linjer (5 μm brede og 5 μm huller) og inkuberet med rhodamin-fibronectin før cellesåning. Timelapse-billeddannelsen startes 1 time efter indledende cellesåning (venstre, 0 min), når cellerne stadig er afrundede og ikke-klæbende (pile). Efter ca. 24 timer (i midten, 1.420 min.) klæbede cellerne til multicue-substratet og viser et justeringsrespons i henhold til kontaktvejledningsmønsteret. Både justeringsresponsen og cellelevedygtigheden opretholdes gennem hele kulturens varighed (højre, 3.180 min). Skalabjælker = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Video 1: Mønstereksempel på et cylindrisk 3D-substrat. 3D-repræsentation af en konveks cylinder mønstret med rhodamin-fibronectin (rød). Klik her for at downloade denne video.

Video 2: 3D-repræsentation af dermale fibroblaster dyrket på et mønstret, 3D cylindrisk substrat (ĸ = 1/500 μm-1). Dermale fibroblaster dyrket i 24 timer på en mønstret (fibronectin linjer, rød, 10 μm bred og 10 μm huller) konveks semicylinder. Celler er farvet for F-actin (magenta), vinculin (grøn) og kerner (blå). Klik her for at downloade denne video.

Video 3: 3D-repræsentation af humane keratocytter dyrket på en mønstret 3D-pit (ĸ = 1/3.750 μm-1). 3D-repræsentation af humane keratocytter dyrket i 24 timer i en konkav, mønstret pit (gelatinecirkler, grønne, 20 μm brede og 20 μm huller). Celler er farvet til F-actin (rød). Klik her for at downloade denne video.

Video 4: Brightfield timelapse billeddannelse af humane dermale fibroblaster på en mønstret, konkav cylinder. Den konkave semicylinder (ĸ = 1/250 μm-1) blev mønstret med parallelle linjer (5 μm brede og 5 μm huller) og inkuberet med rhodamin-fibronectin før cellesåning. Timelapse-billeddannelsen startes 1 time efter indledende cellesåning, når celler viser indledende overholdelse af multicue-miljøet. Under den komplette timelapse orienterer cellerne sig overvejende langs kontaktvejledningssignalerne, mens cellelevedygtigheden opretholdes. Klik her for at downloade denne video.

Discussion

I dag studeres celleadfærd ofte på flade kultursubstrater, der mangler kompleksiteten af det oprindelige cellemikromiljø. 3D-miljøer som stilladser og hydrogeler bruges som et alternativ. Selvom disse cellekulturmiljøer forbedrer in vivo-relevansen, er både systematiske undersøgelser af celleadfærd og gennemførligheden af udlæsningsmetoder fortsat udfordrende. For systematisk at undersøge celleadfærd på repræsentative kultursubstrater er der behov for konsistente multicue substrater, der muliggør mikroskopisk aflæsning. Derfor beskriver vi i denne protokol en metode til at skabe multicue cellekultursubstrater med fysiologisk relevante geometrier og mønstrede ECM-proteiner. Den største udfordring ved at kombinere miljøsignaler som vævsgeometri og kontaktvejledningssignaler på in vitro-platforme er i vid udstrækning af teknologisk karakter. Konventionelle metoder til at anvende kontaktstyringssignaler (f.eks. Blød litografi, dyb UV-mønster og mikrokontaktudskrivning35,36) på cellekulturmaterialer er optimeret til plane substrater. Behovet for 3D-cellekulturmaterialer kombineret med kontaktvejledningssignaler fremhævede flere teknologiske udfordringer, såsom dårlig mønsterjustering, opløsning og fleksibilitet. For at overvinde disse udfordringer kan en høj kapacitet, maskeløs, lysbaseret mønstermetode bruges45,49. Her muliggør et optisk mikroskop præcis mønsterjustering og en opløsning i størrelsesordenen mikrometer (se figur 6). Desuden gør brugen af en digital maske det muligt for forskere at studere celleadfærd på en lang række mønstre uden behov for at fremstille arbejdskrævende fysiske masker.

UV-fotopatterning-tilgangen kan anvendes i kombination med en række 3D-geometrier (f.eks. cylindre, sadler, kupler, gruber) fremstillet af en række forskellige materialer48. De 3D-cellekultursubstrater, der anvendes i denne undersøgelse, er fremstillet af PDMS; dog kan andre materialer også bruges. Dette kan kræve forskellige trin for at producere det endelige cellekultursubstrat, der indeholder de interessante funktioner. Da celler har vist sig at være følsomme over for overfladeruhed af cellekulturmaterialer, er det vigtigt at skabe cellekulturchips med en glat overflade, så de observerede cellers respons fuldt ud kan tilskrives 3D-geometrien og kontaktstyringssignalerne50,51. Målemetoder såsom optisk profilometri, scanningselektronmikroskopi eller atomkraftmikroskopi kan bruges til at måle overfladeruhed. Efter fremstilling af cellekulturmaterialet kan man vælge en mønstermetode baseret på et eller flere fokusplaner afhængigt af de specifikke dimensioner af funktionen af interesse (se figur 3). Typisk bruges et enkelt brændplan til at mønstre et område inden for et Z-område på ca. 50 μm. Mønsteropløsningen viste sig at være konsistent ved hjælp af denne tommelfingerregel (se figur 6). En ulempe ved denne metode er imidlertid den øgede mønstertid med introduktionen af flere fokusplaner og mønstre. I vores hånd, ved hjælp af flere fokalplaner, er 3D geometriske funktioner op til 16 mm x 16 mm x 0,17 mm (X x Y x Z) med succes blevet mønstret med høj mønsterkvalitet.

Derudover er det vigtigt at nævne, at højden (Z-aksen) af geometriske træk, der kan bruges i kombination med denne protokol, er begrænset. Da både UV-fotopatterning og mange cellulære aflæsninger er afhængige af en mikroskopiopsætning, bestemmer målenes arbejdsafstand den maksimale højde af en funktion. I vores hånd kan geometrier, der overstiger en højde på 300 μm, stadig UV-fotopatterneres, og aflæsninger er udført ved hjælp af et konfokalt mikroskop med 40x mål. Således er mekanobiologisk forskning lige fra intracellulære til cellulære og vævsskalaer mulig ved anvendelse af den beskrevne protokol.

En anden faktor, der skal tages højde for, er risikoen for, at prøver tørrer ud under eller efter UV-fotopatterning49. Dette er især relevant ved brug af 3D-geometrier, da konveksiteter ofte udsættes uden for cellekulturmaterialer. Som vist i figur 4 kan dette resultere i ujævne mønstre med proteinaggregater, der dannes oven på interessefunktionen. Vask af cellekulturchips efter proteininkubation og under cellekultur er afgørende for korrekt belægning af 3D-geometrier. Derfor anbefales det altid at efterlade små mængder af en arbejdsløsning (PBS, PLPP, proteinopløsning, cellekulturmedium) oven på cellekulturchippen.

Indtil videre er flere proteinbelægninger (fibronectin, kollagen type I og IV, gelatine, FNC) og celletyper (humane knoglemarvstromale celler, humane myofibroblaster, humane endotelceller, humane keratocytter og dermale fibroblaster) blevet anvendt i kombination med den beskrevne fotopatteringsmetode på strukturerede cellekulturmaterialer. Som vist i en tidligere undersøgelse48 er optimering af proteininkubationsparametre nøglen til systematisk undersøgelse i nye celletyper. Derfor anbefales det at teste en række proteinkoncentrationer, inkubationstemperaturer og inkubationstider, inden der udføres et nyt eksperiment med nye proteiner eller celler. Ved at sammenligne cellemorfologi efter indledende adhæsion på homogene, mønstrede flade områder med cellemorfologi under 'normale' cellekulturbetingelser kan der opnås et optimeret sæt eksperimentelle parametre. Derudover kan hver celletype kræve en anden tid efter såning for at vise en genkendelig vedhæftningsmorfologi på et specifikt multicue-miljø (se figur 5). Til dette formål er det afgørende at optimere den tid, der kræves pr. celletype for at præsentere kontakthændelser på det mønstrede område under vask i trin 8.4. For eksempel observerede vi, at humane keratocytter på linjemønstre viser langstrakte morfologier inden for de første 30 minutter efter såning, mens endotelceller og dermale fibroblaster kræver flere timer, før de viser en ændring i adhæsionsmorfologi. De eksperimentelle parametre, der kræves til proteininkubation (trin 7) og cellesåning (trin 8), kan således afhænge af det valgte protein og den valgte celletype.

Den præsenterede tilgang til at anvende kontaktvejledningssignaler på 3D-geometrier kan hjælpe med at skabe en dybere forståelse af celleadfærd i komplekse multicue-miljøer. Dette kan omfatte undersøgelser af intracellulære komponenter, såsom fokale adhæsioner og kerner, og kan også involvere eksperimenter udført på en større celle- eller vævsskala ved anvendelse af den foreslåede metode. Til sidst forventes det, at den opnåede viden kan bruges i design af vævstekniske applikationer, hvor komplekse cellulære miljøer er designet til at styre celleadfærd mod et ønsket resultat.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Nello Formisano (MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine) for at levere humane primære keratocytter. Dette arbejde er blevet støttet af Chemelot InSciTe (projekt BM3.02); Det Europæiske Forskningsråd (bevilling 851960) og Ministeriet for Uddannelse, Kultur og Videnskab for Gravitationsprogrammet 024.003.013 "Materialedrevet regenerering". Forfatterne vil gerne takke Alvéole for deres korrespondance, hjælp og fejlfinding.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-vinculin antibody, mouse monoclonal IgG1 Sigma V9131 Dilution: 1/600
Bovine Serum albumin, Fraction V Roche 10735086001
DMEM, high glucose, pyruvate Gibco 41966029
DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x) Gibco 10565018
DMi8 epifluorescent microscope Leica Microsystems
Ethanol Biosolve 0005250210BS
Fetal Bovine Serum Serana 758093
Fiji/ImageJ, version v1.53k www.imageJ.nih.gov
Fluorescent highlighter Stabilo 4006381333627
Fluorescin-labeled gelatin Invitrogen G13187 Concentration: 0.01%
Formaldehyde solution Merck F8775
Glass coverslips 24 x 60 mm, #1 VWR 631-1575
Glass coverslips, ø = 32 mm, #1 Menzel-Gläser
HCX PL fluotar L 20X/0.40na microscope objective Leica 11506242
HEPES Gibco 15630080
Human dermal fibroblasts Lonza CC-2511
Human primary keratocytes MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine
Illustrator, Version 26.0.1 Adobe
Laboratory oven Carbolite
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Leica Application Suite X software, version 3.5.7.23225 Leica Microsystems
Leonardo software, version 4.16 Alvéole
Micro-manager, version 1.4.23 Open imaging
Mowiol 4-88 Sigma-Aldrich 81381 mounting medium
mPEG-succinimidyl valerate MW 5,000 Da Laysan Bio MPEG-SVA-5000 Concentration: 50 mg/mL
Negative glass mold FEMTOprint
NucBlue Live Readyprobes Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen R37605 2 drops/mL
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140163
Petri dish (ø=100 mm) Greiner Bio-one 664160
Phalloidin Atto 647N Sigma 65906 Dilution: 1/250
Phosphate Buffered Saline Sigma P4417
Plasma asher Emitech K1050X
PLPP (photoinitiator) Alvéole
Poly-L-lysine, sterile-filtered Sigma-Aldrich P4707 Concentration: 0.01%
PRIMO Alvéole
Rhodamine-labeled fibronectin Cytoskeletn, Inc. FNR01 Concentration: 10 µg/mL
Secondary antibody with Alexa 488, Goat anti-mouse IgG1 (H) Molecular Probes A21121 Dilution: 1/300
Secondary antibody with Alexa 555, Goat anti-mouse IgG1 (H) Molecular Probes A21127 Dilution: 1/300
Spin coater Leurell Technologies Corporation model WS-650MZ-23NPPB
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 1673921
TCS SP8X confocal microscope Leica Microsystems
tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane ABCR AB111444
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red Gibco 12604013
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y., Wang, G., Luo, X., Qiu, J., Tang, C. Substrate stiffness regulates the proliferation, migration, and differentiation of epidermal cells. Burns. 38, 414-420 (2012).
  2. Viswanathan, P., et al. 3D surface topology guides stem cell adhesion and differentiation. Biomaterials. 52, 140-147 (2015).
  3. Peyton, S. R., et al. Marrow-derived stem cell motility in 3D synthetic scaffold is governed by geometry along with adhesivity and stiffness. Biotechnology and Bioengineering. 108 (5), 1181-1193 (2011).
  4. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
  5. Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J., Shenoy, V. B. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584, 535-546 (2020).
  6. Guido, S., Tranquillo, R. T. A methodology for the systematic and quantitative study of cell contact guidance in oriented collagen gels. Correlation of fibroblast orientation and gel birefringence. Journal of Cell Science. 105 (2), 317-331 (1993).
  7. Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116, 1881-1892 (2003).
  8. Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS Nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
  9. Buskermolen, A. B. C., et al. Cellular contact guidance emerges from gap avoidance. Cell Reports Physical Science. 1 (5), 100055 (2020).
  10. Thrivikraman, G., et al. Cell contact guidance via sensing anisotropy of network mechanical resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (29), 1-11 (2021).
  11. Buskermolen, A. B. C., et al. Entropic forces drive cellular contact guidance. Biophysical Journal. 116 (10), 1994-2008 (2019).
  12. Vignaud, T., et al. Reprogramming cell shape with laser nano-patterning. Journal of Cell Science. 125 (9), 2134-2140 (2012).
  13. Pouthas, F., et al. In migrating cells, the Golgi complex and the position of the centrosome depend on geometrical constraints of the substratum. Journal of Cell Science. 121 (14), 2406-2414 (2008).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Théry, M., et al. Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internal organization and orientation of polarity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19771-19776 (2006).
  16. Huang, G., et al. Functional and biomimetic materials for engineering of the three-dimensional cell microenvironment. Chemical Reviews. 117 (20), 12764-12850 (2017).
  17. Callens, S. J. P., Uyttendaele, R. J. C., Fratila-Apachitei, L. E., Zadpoor, A. A. Substrate curvature as a cue to guide spatiotemporal cell and tissue organization. Biomaterials. 232, 119739 (2020).
  18. Yilmaz, C. O., Xu, Z. S., Gracias, D. H. Curved and Folded Micropatterns in 3D Cell Culture and Tissue Engineering. Methods in Cell Biology. 121, Elsevier Inc (2014).
  19. Silver, F. H., Freeman, J. W., Seehra, G. P. Collagen self-assembly and the development of tendon mechanical properties. Journal of Biomechanics. 36 (10), 1529-1553 (2003).
  20. Werner, M., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. Cellular geometry sensing at different length scales and its implications for scaffold design. Materials. 13 (4), 963 (2020).
  21. Di Cio, S., Bøggild, T. M. L., Connelly, J., Sutherland, D. S., Gautrot, J. E. Differential integrin expression regulates cell sensing of the matrix nanoscale geometry. Acta Biomaterialia. 50, 280-292 (2017).
  22. Fioretta, E. S., Simonet, M., Smits, A. I. P. M., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. Differential response of endothelial and endothelial colony forming cells on electrospun scaffolds with distinct microfiber diameters. Biomacromolecules. 15 (3), 821-829 (2014).
  23. Werner, M., Kurniawan, N. A., Korus, G., Bouten, C. V. C., Petersen, A. Mesoscale substrate curvature overrules nanoscale contact guidance to direct bone marrow stromal cell migration. Journal of The Royal Society Interface. 15 (145), 20180162 (2018).
  24. Ruprecht, V., et al. How cells respond to environmental cues - insights from bio-functionalized substrates. Journal of Cell Science. 130 (1), 51-61 (2017).
  25. Bao, M., Xie, J., Huck, W. T. S. Recent advances in engineering the stem cell microniche in 3D. Advanced Science. 5 (1800448), 1-16 (2018).
  26. Zhan, X. Effect of matrix stiffness and adhesion ligand density on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 108 (3), 675-683 (2020).
  27. Jiang, T., et al. Untangling the response of bone tumor cells and bone forming cells to matrix stiffness and adhesion ligand density by means of hydrogels. Biomaterials. 188, 130-143 (2019).
  28. Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33, 4460-4468 (2012).
  29. Rape, A. D., Zibinsky, M., Murthy, N., Kumar, S. A synthetic hydrogel for the high-throughput study of cell-ECM interactions. Nature Communications. 6 (8129), 1-9 (2015).
  30. Camarero-Espinosa, S., et al. 3D printed dual-porosity scaffolds: the combined effect of stiffness and porosity in the modulation of macrophage polarization. Advanced Healthcare Materials. 11 (2101415), 1-16 (2022).
  31. Bao, M., et al. Cellular volume and matrix stiffness direct stem cell behavior in a 3D microniche. ACS Applied Materials and Interfaces. 11 (2), 1754-1759 (2019).
  32. Charest, J. L., Eliason, M. T., García, A. J., King, W. P. Combined microscale mechanical topography and chemical patterns on polymer cell culture substrates. Biomaterials. 27, 2487-2494 (2006).
  33. Bilem, I., et al. Interplay of Geometric Cues and RGD/BMP-2 crosstalk in directing stem cell fate. ACS Biomaterials Science and Engineering. 3 (10), 2514-2523 (2017).
  34. Nam, K. -H., et al. Multiscale cues drive collective cell migration. Scientific Reports. 6, 29749 (2016).
  35. Alom Ruiz, S., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  36. Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein Micropatterns. A Direct Printing Protocol Using Deep UVs. Methods in Cell Biology. 97, Academic Press. (2010).
  37. Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
  38. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640 (2009).
  39. Offenhäusser, A., et al. Microcontact printing of proteins for neuronal cell guidance. Soft Matter. 3 (3), 290-298 (2007).
  40. Ricoult, S. G., Sanati Nezhad, A., Knapp-Mohammady, M., Kennedy, T. E., Juncker, D. Humidified microcontact printing of proteins: universal patterning of proteins on both low and high energy surfaces. Langmuir. 30 (40), 12002-12010 (2014).
  41. Waterkotte, B., et al. Biofunctional Micropatterning of Thermoformed 3D Substrates. Advanced Functional Materials. 24 (4), 442-450 (2014).
  42. Lehnert, D., et al. Cell behaviour on micropatterned substrata: Limits of extracellular matrix geometry for spreading and adhesion. Journal of Cell Science. 117 (1), 41-52 (2004).
  43. Sevcik, E. N., Szymanski, J. M., Jallerat, Q., Feinberg, A. W. Patterning on topography for generation of cell culture substrates with independent nanoscale control of chemical and topographical extracellular matrix cues. Current Protocols in Cell Biology. 75, 1-25 (2017).
  44. Micropatterning: Surface functionalization. Alvéole. , Available from: https://www.alveolelab.com/technology/micropatterning-surface-functionalization/ (2022).
  45. Strale, P. O., et al. Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
  46. van Gaal, R. C., Miltenburg, R. P. R. S., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C., Dankers, P. Y. W. Renal epithelial cell responses to supramolecular thermoplastic elastomeric concave and convex structures. Advanced Materials Interfaces. 8 (1), 2001490 (2021).
  47. Foster, J. W., Gouveia, R. M., Connon, C. J. Low-glucose enhances keratocyte-characteristic phenotype from corneal stromal cells in serum-free conditions. Scientific Reports. 5, 1-16 (2015).
  48. Van Der Putten, C., et al. Protein micropatterning in 2.5D: an approach to investigate cellular responses in multi-cue environments. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (22), 25589-25598 (2021).
  49. Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).
  50. Hou, Y., et al. Surface roughness gradients reveal topography-specific mechanosensitive responses in human mesenchymal stem cells. Small. 16 (10), 1905422 (2020).
  51. Bourkoula, A., et al. Roughness threshold for cell attachment and proliferation on plasma micro-nanotextured polymeric surfaces: The case of primary human skin fibroblasts and mouse immortalized 3T3 fibroblasts. Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (30), 304002 (2016).

Tags

Bioengineering Udgave 184 PDMS-støbning substratgeometri maskeløs UV-fotopatterning kontaktvejledning krumning multi-cue cellulært mikromiljø proteinbelægning
Generering af multicue cellulære mikromiljøer ved UV-fotopatterning af tredimensionelle cellekultursubstrater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Putten, C., D’Urso,… More

van der Putten, C., D’Urso, M., Bril, M., Woud, T. E., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A. Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates. J. Vis. Exp. (184), e63988, doi:10.3791/63988 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter