Summary
Hart- en vaatziekten zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak. Vasculaire verkalking draagt substantieel bij aan de last van cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit. Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om vasculaire gladde spiercel-gemedieerde calciumprecipitatie in vitro te kwantificeren door fluorescentie beeldvorming.
Abstract
Vasculaire verkalking omvat een reeks degeneratieve pathologieën, waaronder ontsteking, veranderingen in cellulair fenotype, celdood en de afwezigheid van verkalkingsremmers, die tegelijkertijd leiden tot een verlies van vaatelasticiteit en functie. Vasculaire verkalking is een belangrijke bijdrage aan morbiditeit en mortaliteit in veel pathologieën, waaronder chronische nierziekte, diabetes mellitus en atherosclerose. De huidige onderzoeksmodellen om vasculaire verkalking te bestuderen zijn beperkt en zijn alleen levensvatbaar in de late stadia van de ontwikkeling van calcificatie in vivo. In vitro hulpmiddelen voor het bestuderen van vasculaire verkalking maken gebruik van eindpuntmetingen, waardoor de eisen aan biologisch materiaal toenemen en de introductie van variabiliteit in onderzoeksstudies riskeert. We demonstreren de toepassing van een nieuwe fluorescerend gelabelde sonde die zich bindt aan in vitro verkalkingsontwikkeling op menselijke vasculaire gladde spiercellen en de real-time ontwikkeling van in vitro verkalking bepaalt. In dit protocol beschrijven we de toepassing van onze nieuw ontwikkelde verkalkingstest, een nieuw hulpmiddel in ziektemodellering dat potentiële translationele toepassingen heeft. We denken dat deze test relevant is in een breder spectrum van mineraaldepositieonderzoek, inclusief toepassingen in bot-, kraakbeen- of tandheelkundig onderzoek.
Introduction
Vasculaire verkalking (VC) is een onafhankelijke risicofactor voor cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit 1,2,3. Lang beschouwd als een passief chemisch proces van ectopische minerale afzetting, lijkt het nu een aanpasbare weefselgenezingsrespons met de actieve bijdrage van verschillende cellen, waaronder geactiveerde vasculaire gladde spiercellen (hVSMC) als een aanjager van de ziekte 4,5. In vivo VC kan worden gemeten door multislice CT-scans als een beoordeling van atherosclerotische belasting 6,7,8. Momenteel is er een paradigmaverschuiving aan de gang, waarbij de ernst van VC wordt erkend als een risicofactor bij hart- en vaatziekten, diabetes type II, chronische nierziekte en veroudering 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMC's zijn het meest voorkomende celtype in het cardiovasculaire systeem en een belangrijke actor in de ontwikkeling van VC. In vitro hVSMC-geïnduceerde verkalking is een veelgebruikt ziektemodel om hart- en vaatziekten te bestuderen16,17. De meeste protocollen voor de detectie van in vitro verkalking maken echter gebruik van eindpuntmetingen die data-acquisitie kunnen beperken, meer gebruik van cellulair materiaal vereisen en onderzoek kunnen vertragen. Veelgebruikte methoden voor de detectie van in vitro hVSMC-verkalking omvatten de o-cresolphthaleïne-assay, die opgeloste calciumafzetting meet tegen totaal eiwit en cellyse vereist18. Ook wordt Alizarine Rode kleuring gebruikt, die zich rechtstreeks bindt aan calciumafzettingen op vaste cellen of weefsel19. Om hVSMC-verkalking in de loop van de tijd te bestuderen met o-cresolphthaleïne of Alizarin Red, zijn batches van replicaties per tijdspunt vereist, waardoor de vraag naar biologisch materiaal toeneemt en op zijn beurt de kans op variabiliteit toeneemt.
In dit artikel beschrijven we de methode voor de toepassing van een nieuwe test die hVSMC's gebruikt met een fluorescerende beeldvormingsonde om in vitro VC-progressie te bepalen en te functioneren als een enkelvoudige eindstadiumverkalkingstest. We hebben eerder aangetoond dat deze test direct vergelijkbaar is met de o-cresolphthaleïne en Alizarin Red-methoden en kan worden gebruikt om onderscheid te maken tussen verschillende kweekomstandigheden20. Naast real-time metingen kan deze test worden gebruikt om de neiging van serum- of plasmamonsters te bepalen als surrogaatmarker voor klinische VC-ontwikkeling20. Dit zal helpen bij de toepassing van biologische strategieën van cardiovasculaire wetenschappen en ziektemodellering. Een verdere toepassing van de test kan zijn als een translationeel BioHybrid-systeem om de ernst of progressie van VC van bloedbestanddelen zoals serum of plasma te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celzaaien, onderhoud en verkalkingsinductie
- Gebruik voor het kweken van primaire cellen een laminaire luchtstroomkast, handschoenen en steriele apparatuur. Desinfecteer handen en werkruimte voor en na het uitvoeren van werkzaamheden. Behandel alle primaire cellen en kweekmedia als een potentieel biorisico, tenzij het tegendeel wordt bewezen. Bij voorkeur overtollige cellen en media autoclaaferen voordat ze worden verwijderd. Niet chemisch inactiveren en autoclaaf, omdat hierdoor giftige dampen vrijkomen.
- Kweek hVSMC op ongecoate celkweekplaten.
- Onderhoud routinematig hVSMC in groeimedium bestaande uit M199-medium aangevuld met 10% -20% FBS en 1% Pen / Strep en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
- Splits de cellen op 70% -90% samenvloeiing.
- Om te splitsen, was de hVSMC's 2x met PBS. Voeg trypsine toe en incubeer gedurende 2-5 min bij 37 °C. Controleer op het loslaten van cellen onder de microscoop.
- Rem de trypsinereactie door serumbevattend medium toe te voegen. Centrifugeer de cellen op 350 x g gedurende 4 minuten en resuspenseer de pellet in onderhoudsmedium. hVSMC's volgen een 1:2 splitsingsschema.
- Om het verkalkingsexperiment te starten, bereidt u de cellen voor volgens de instructies voor een splitsing (stap 1.4.1). Tel bij resuspensie de cellen en het zaad in een 48-well plaat met een dichtheid van 10-15 x 103 cellen / cm2. Zaai de cellen en vermijd het gebruik van de buitenste putten, zoals aanbevolen in aanvullende figuur 1.
- Laat de cellen 24 uur ('s nachts) hechten en herstellen tijdens het broeden bij 37 °C en 5% CO2.
- Was de cellen voorzichtig 2x met PBS en zuig voorzichtig alle resterende PBS op na de2e wasbeurt.
- Voeg voorzichtig het verkalkingsmedium toe en incubeer verder bij 37 °C en 5% CO2. Verkalkingsmedium moet een verkalkingsprikkel bevatten, fluorescerend gelabeld fetuin-A (bijvoorbeeld met rood fluorescerend eiwit [RFP]) (1 μg/ml), en HOECHST 33342 (0,1 μg/ml) kernvlek of soortgelijke levende fluorescerende kernvlek. Gebruik GEEN DAPI, omdat dit niet-permeabel is.
- Controleer dagelijks met een lichtmicroscoop totdat verkalking optreedt.
OPMERKING: Voor opmerkingen over de celcultuur en het onderhoud van hVMSCs, zie Aanvullend bestand 1.
2. Verkalkingsdetectie via beeldvorming
OPMERKING: Het volgende protocol bevat de algemene stappen die moeten worden genomen bij de voorbereiding, beeldvorming en gegevensanalyse. Screenshots die de instructies voor elke stap ondersteunen met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingsplatform en bijbehorende beeldanalysesoftware (zie Materiaaltabel voor details) worden verstrekt in Aanvullend bestand 2 en Aanvullend bestand 3. Andere beeldverwerkingsinstrumenten en beeldverwerkingstools kunnen worden gebruikt om dit protocol toe te passen. Herhaalde beeldvorming op dezelfde locatie in elke put is echter cruciaal voor zinvolle data-acquisitie. Het maken van een protocol voor beeldverkalking en hergebruik bij elke beeldstap is noodzakelijk voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten. De eerste keer dat u de methode toepast, volgt u de onderstaande stappen om u voor te bereiden op de beeldvorming.
- Protocol instellen
- Open de software en selecteer protocollen en nieuwe maken.
- Selecteer Procedure en klik op Temperatuur instellen. Stel in het pop-upvenster de temperatuur in op 37 °C en het verloop op 1 °C en klik op OK. Selecteer het type bord naar keuze in het vervolgkeuzemenu. Voeg de afbeeldingsstap toe door op Afbeelding te klikken. Selecteer de omgekeerde imager en klik op OK.
- Voeg drie beeldkanalen toe en stel ze in op DAPI (377, 447 nm), RFP (531, 593 nm) en brightfield. Vink het vakje Montage aan en stel het gewenste aantal en de gewenste locatie van de afbeeldingen in. 2 x 2 voor een 48-well plaat is een veel voorkomende keuze. Wijzig de overlap om een betere dekking van elke put weer te geven. Selecteer welke putten moeten worden afgebeeld. Er wordt een nieuw venster geopend waarin de bronnen van belang kunnen worden geselecteerd.
- Klik op Focusopties om de focusmodus in te stellen. Er wordt een nieuw venster geopend. Stel elk kanaal afzonderlijk in. Gewoonlijk worden putten geautomatiseerd op het "DAPI" -kanaal. Stel alle andere kanalen in op vaste brandpuntshoogte vanaf het eerste kanaal en stel in door op OK te klikken. Sluit het venster.
- Start de stappen voor het vooraf instellen van gegevensreductie door op Gegevensreductie te klikken en Afbeeldingsvoorbewerking te selecteren. Als u deze stap instelt, wordt de fluorescentieachtergrond verminderd. Accepteer de standaardinstellingen door OK te selecteren. Er wordt een nieuwe set afbeeldingen gemaakt met het voorvoegsel "TSF". De originele beelden blijven behouden.
- Stel een stap in om de cellen te tellen door Cellulaire analyse te selecteren. Selecteer TSF DAPI-afbeeldingen in het vervolgkeuzemenu Kanaal . Stel verdere details in nadat de beeldvorming is uitgevoerd. Deze stap kan ook worden beschouwd als gegevensreductie; zorg er altijd voor dat u de originele afbeeldingen behoudt.
- Bereid de analyse van het RFP-signaal (calcification) voor door Statistieken te selecteren. Label stap in het pop-upvenster en selecteer TSF RFP als invoerkanaal. Vink de selectievakjes Bovenwaarde en Onderwaarde aan. Vink het vakje voor Totale oppervlakte in de onderste lijst aan. Selecteer Geen in de kolom Kleureffect. Klik in het pop-upvenster op Aangepast en vink het vakje Achtergrond aan. Dit kleurt de resultaten van laag-hoog voor een eenvoudige beoordeling. Druk op OK.
- Voor een eerlijke uitlezing normaliseert u het RFP-signaal per cel. Daarbij wordt een totale oppervlakte per cel verdeeld. Als u deze stap wilt instellen, drukt u op Ratio aan de linkerkant. Selecteer in het pop-upvenster voor gegevensinvoer 1 RFP Kwantificering: Totaal gebied in het vervolgkeuzemenu. Selecteer verder Cell Count als gegevensinvoer 2.
- Selecteer ten slotte een nieuwe gegevenssetnaam en druk nogmaals op OK en OK . Selecteer Kleureffect zoals eerder beschreven. Selecteer in de linkerbovenhoek Bestand en sla het bestand op als protocol (bestandstype .prt).
- Dagelijks na de eerste verkalking optreedt
- Herhaal deze stappen voor elk tijdstip. In de opstartsoftware, druk op Lees nu en Bestaand protocol .... Selecteer het protocol dat in de vorige stap is gemaakt. Het programma zal vragen om het experiment op te slaan. Dit kan bij deze stap worden gedaan, maar ook bij elke latere stap handmatig door linksboven op de knop Opslaan te klikken.
- Een pop-upvenster vraagt om te wachten tot het systeem is verwarmd. Zet de CO2-gasregelaar aan en stel deze in op 5%.
- Zodra het systeem de ingestelde temperatuur heeft bereikt, verschijnt er een prompt om een plaat in te brengen en af te lezen. Druk op Annuleren. Dit komt omdat voor elk tijdstip de belichting van elk fluorochroom afzonderlijk moet worden aangepast.
- Transporteer de plaat van de incubator naar de imager in een kluis die bestand is tegen breken en morsen en in overeenstemming is met de lokale bioveiligheidsvoorschriften voor het transport van levende cellen, in geval van een ongeval. Plaats de plaat in de plaatlezer.
- Klik na het annuleren op Procedure. Selecteer in het pop-upvenster De optie Afbeeldingsstap vooraf instellen. Pas eerst de focus en belichting op het DAPI-kanaal aan. Schakel het selectievakje Automatische belichting op alle kanalen uit. Klik vervolgens op het microscooppictogram naast het DAPI-kanaal . Er wordt een nieuw venster geopend.
- Selecteer het putje waarop u zich wilt concentreren. Gebruik een put met gemiddelde tot hoge verkalking voor deze stap. Als een signaal al zichtbaar is, klikt u eerst op Autofocus en vervolgens op Automatisch belichten. Zo niet, verhoog dan eerst de belichting en herhaal Autofocus en Autoexposure. Indien gewenst kan de belichting handmatig worden aangepast door het vervolgkeuzemenu belichting te selecteren. Controleer de instellingen op meerdere putten. Als u tevreden bent, slaat u de instellingen op.
- Pas de belichting op dezelfde manier aan voor alle kanalen.
LET OP: Richt je niet op andere kanalen; pas alleen de belichting aan. De focus moet voor alle kanalen hetzelfde zijn. - Sluit het procedurevenster. Selecteer de groene knop Nu lezen in de bovenste taakbalk. Sla het experiment op zoals aangegeven door de software.
OPMERKING: De software leest nu automatisch alle geselecteerde putten in de geselecteerde instellingen.
3. Data-analyse
OPMERKING: Voor gedetailleerde screenshots over het uitvoeren van de gegevensanalyse met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingsplatform en bijbehorende beeldanalysesoftware (zie Materiaaltabel voor meer informatie), raadpleegt u Aanvullend bestand 4. Als er alternatieve beeldvormende instrumenten of analysesoftware worden gebruikt, moeten de beelden worden geëxporteerd en in batches worden verwerkt, zodat de belichting, fluorescentiedrempel of intensiteit gelijkelijk worden aangepast voor alle afbeeldingen in een vergelijkende dataset.
- Terwijl het systeem de plaat leest, worden alle afbeeldingen automatisch op de achtergrond verwerkt. Pas de instellingen voor het aantal cellen aan door TSF DAPI-afbeeldingen te selecteren om weer te geven. Selecteer het putje naar keuze door te dubbelklikken. Er verschijnt een nieuw venster. Selecteer een van de afbeeldingen.
- Selecteer het tabblad Analyse . Selecteer in het pop-upvenster Cellulaire analyse: Aantal cellen. Klik op OK. Hef de selectie van de RFP- en brightfield-kanalen op. Schakel het selectievakje Objecten markeren in.
- Klik op Opties om het menu te openen. Pas de grootte en intensiteitsdrempel aan om alle kernen op te nemen, maar sluit puin uit. Klik op OK. Klik linksonder op Wijzigingen toepassen om de instellingen ook over te zetten naar alle andere afbeeldingen.
- Selecteer op dezelfde manier als voorheen een put en afbeelding met een gemiddelde tot hoge hoeveelheid verkalking om de signaal-ruisverhouding het beste aan te passen; klik op het tabblad Analyse in het taakmenu.
- Selecteer deze keer Afbeeldingsstatistieken. Hef de selectie van het DAPI- en brightfield-kanaal op. Klik op Opties om het menu te openen. Vink het vakje Drempeluitschieters aan. Pas de bovenste en onderste waarden van de drempel aan. Tel het signaal alleen als het zich boven de achtergrond bevindt en sluit uit als er puin / artefacten zijn.
- Als u een niet-subjectieve drempelwaarde wilt instellen voor het signaal boven de achtergrond, selecteert u het lijngereedschap op de taakbalk. Er verschijnt een venster. Trek een lijn door een signaal, maar zorg ervoor dat je ook een gebied met achtergrond opneemt.
OPMERKING: Er verschijnt een grafiek in het pop-upvenster met een piek die het signaal boven de achtergrondlijn vertegenwoordigt. De piekhoogtewaarde van 25% vertegenwoordigt de aanbevolen drempel. Het wordt ook aanbevolen om meerdere signaalpatches te meten om de juiste drempel te selecteren. Bij het selecteren van flarden signaal kan het selecteren van gebieden met een zeer hoge signaalsterkte resulteren in een drempel die gemiddelde en of lagere signalen verwaarloost. Het wordt daarom aanbevolen om patches van gemiddeld tot laag signaal boven de achtergrond te selecteren. Voorbeelden van te hoge, te lage en nauwkeurige drempels worden weergegeven in Aanvullend bestand 4. - Als u tevreden bent, klikt u op OK en Wijzigingen toepassen om de instellingen over te zetten naar alle andere bronnen. Controleer of de drempel nauwkeurig is geselecteerd in de andere putten.
- Zodra het aantal cellen en de RFP-drempels zijn ingesteld, exporteert u de gegevens. Selecteer het bord van interesse. In het vervolgkeuzemenu kunnen meerdere parameters worden geselecteerd voor export. Van belang kan het aantal cellen, het RFP-gebied en "gebied/cel" zijn, de statistiek die wordt gebruikt voor vergelijking tussen groepen. Klik op de Excel-knop naast het vervolgkeuzemenu om de gegevens rechtstreeks naar een spreadsheet te exporteren.
OPMERKING: In het vervolgkeuzemenu kunnen de berekende waarden voor het aantal cellen, het totale gebied van het RFP-signaal (dat het gebied van verkalking weerspiegelt) en de genormaliseerde verhouding van het totale gebied van het RFP-signaal per cel nu afzonderlijk worden geselecteerd en geëxporteerd naar een spreadsheet. Geef de resultaten weer als de verhouding van het totale gebied van het RFP-signaal per cel en visualiseer (bijvoorbeeld staafdiagrammen). Pas een ongepaarde student t-test toe om twee groepen te vergelijken of een ongepaarde ANOVA om verschillende groepen op hetzelfde tijdstip te vergelijken. Het vergelijken van dezelfde groep op verschillende tijdstippen kan gepaarde statistische analyse vereisen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het resultaat omvat originele afbeeldingen van HOECHST-gekleurde kernen, RFP-gelabelde verkalking en brightfield-afbeeldingen. Verschillende stadia van verkalking, variërend van laag (figuur 2) tot hoog (figuur 3), kunnen worden gedetecteerd en geanalyseerd. Verkalking kan meestal worden gezien als zwarte spikkels met behulp van lichtmicroscopie (figuur 2D en figuur 3B, pijlen geven verkalking aan), die nuttig zijn voor primaire beoordeling en om te bepalen wanneer met beeldvorming moet worden begonnen. Voor een verbeterde signaal-ruisverhouding moeten de verwerkte RFP-beelden worden geanalyseerd om verkalking te kwantificeren (figuur 2F en figuur 3D, pijlen geven verkalking aan). Ten slotte kunnen gegevens worden gepresenteerd als een staafdiagram waarin twee of meer omstandigheden op één tijdstip worden vergeleken, vergezeld van representatieve afbeeldingen (figuur 4A, B, C). Gegevens moeten worden weergegeven genormaliseerd naar celaantal (bijvoorbeeld als verkalkingsgebied per cel). Gegevens kunnen ook worden weergegeven als tijdreeksgegevens die dezelfde toestand op verschillende tijdstippen weergeven (figuur 4D).
Figuur 1: Visuele samenvatting van de stappen voor de semi-geautomatiseerde verkalkingsdetectie en -analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeld van verkalking in een vroeg stadium. (A)Het overlaybeeld kan worden weergegeven en geanalyseerd als (B) afzonderlijke DAPI (kernen), (C) RFP (verkalking) en (D) brightfield-afbeeldingen. (E) Kernen worden geïdentificeerd door de software en kunnen worden gemarkeerd als gele cirkels om de instellingen aan te passen. (F) Voor de analyse van het RFP-signaal worden beelden voorbewerkt om het achtergrondsignaal te verminderen en (G) vervolgens kan een drempel worden ingesteld om het signaal te meten. Pijlen geven verkalking aan in het (D) brightfield en (F &G) getransformeerde RFP-beelden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voorbeeld van verkalking in een later stadium. (A) Het overlaybeeld kan worden weergegeven en geanalyseerd als afzonderlijke (B) brightfield-, (C) RFP-afbeeldingen (verkalking) en (E) DAPI-afbeeldingen (kernen). (D) Voor de analyse van het RFP-signaal worden beelden voorbewerkt om het achtergrondsignaal te verminderen. Pijlen geven verkalking aan in het (B) brightfield en (D) getransformeerde RFP-beelden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve vergelijking tussen lage en hoge verkalking van hVSMC na 14 dagen in cultuur met verkalkingsmedium. Gewoonlijk kunnen gegevens worden weergegeven als een staafdiagram en geanalyseerd met behulp van de niet-geapaarde Student's t-test. Representatieve beelden van (A) lage verkalking en (B) hoge verkalking. Het rode signaal (RFP) reflecteert verkalking en het blauwe signaal (HOECHST) geeft kernen weer. (C) Verkalking gepresenteerd als fetuin A-RFP positief signaal (totale oppervlakte) per cel. (D) Voorbeeld van een in de loop van de tijd gemeten verkalkingstest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Voorbeeld van een reeks putten die worden gebruikt voor een verkalkingsexperiment met hVSMC's. De buitenste ring van de putten wordt niet gebruikt voor het verkalkingsexperiment, maar gevuld met vloeistof. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 1: Opmerkingen over de celcultuur en het onderhoud van hVMSC. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: Geautomatiseerd beeldvormingsprotocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 3: Protocol voor beeldanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 4: Protocol voor gegevensanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit manuscript beschrijven we een semi-geautomatiseerde methode voor in vitro verkalkingsbepaling. Voor deze methode moeten drie kritieke stappen van hVSMC-verkalking worden geoptimaliseerd. Ten eerste is cellulaire dichtheid van cruciaal belang voor de ontwikkeling van hVSMC-verkalking. Lage dichtheden van hVSMC's zullen resulteren in langzame of geen verkalking en celdood als gevolg van het ontbreken van cel-tot-cel contact en de stress die wordt geïnduceerd onder verkalkende omstandigheden21. Hoge cellulaire dichtheden resulteren in overconfluentie, waarna cellen senescent22 worden en de verkalkingsontwikkeling stopt. Het is van cruciaal belang om ongeveer 70% samenvloeiing in de putplaat te zaaien die zal worden gebruikt voor de daaropvolgende verkalkingsontwikkeling, waardoor proliferatieve capaciteit en cellulaire verbindingen van hVSMC's worden gegarandeerd.
Ten tweede moeten de celkweekmedia die worden gebruikt voor verkalkingsinductie worden geoptimaliseerd. Binnen vasculair verkalkingsonderzoek is gemeld dat een verscheidenheid aan aandoeningen en mediasamenstellingen hVSMC's23,24 verkalkt. Wij geloven dat de methode geschikt is om allerlei soorten in vitro gemedieerde verkalking te detecteren, en het is gebruikt om calcium-, fosfaat- of calciumfosfaat gestimuleerde afzettingen te detecteren. Ongeacht de modus voor verkalkingsinductie, is optimalisatie van de verkalkingsmedia cruciaal. In het gepresenteerde protocol hebben we de verkalkingsinductie geoptimaliseerd door M199 te gebruiken met een totale calciumconcentratie van 4,5 mM Ca2+ met 2,5% FBS.
Ten slotte zijn lokale verschillen in platen tijdens verkalking waargenomen. Het is van cruciaal belang om aselecte belasting van technische replica's toe te passen om steekproefbias te voorkomen. Bovendien moet het laden van de buitenste putbanen worden vermeden, omdat deze putten altijd sneller verkalken in de 48-well-instelling. Dit wordt mogelijk veroorzaakt door de ontregeling van de intraplate vochtigheid, waarbij het niet gebruiken van de buitenste putten en het laden van deze putten met grote hoeveelheden vloeistof helpt om dit te beheersen.
Hoewel de verkalkingstest zelf meerdere optimalisatiestappen kan vereisen om reproduceerbaarheid met een bepaalde opstelling te garanderen, wordt dit eenvoudig als dit eenmaal is uitgevoerd. Verkalkingstests kunnen gelijktijdig en herhaaldelijk onder vastgestelde omstandigheden worden uitgevoerd zonder dat verdere optimalisatie nodig is. hVSMC-gemedieerde verkalking kan een uitdaging zijn en vereist experimenten voordat de robuustheid van assays is bereikt. Een onderzoeker moet in staat zijn om de optimale timing te bepalen voordat hij begint met reguliere beeldvorming, wat tot 1 week kan duren. Een vast beeldschema kan vanaf het begin van het experiment worden vastgesteld, hoewel dit veel afbeeldingen kan opleveren zonder differentiële uitlezingen, een relatief grote hoeveelheid gegevensopslag voor afbeeldingen kan gebruiken en tijdrovend kan zijn bij de analyse.
De procedure die in dit protocol wordt beschreven, is een manier om de analyse van de verkalkingstest uit te voeren. Voor andere doeleinden moet de procedure dienovereenkomstig worden aangepast. Onze analyse met behulp van het geautomatiseerde beeldvormingsplatform waarnaar wordt verwezen, zorgt voor reproduceerbaarheid, hoewel de analyse kan worden uitgevoerd met behulp van elke levende cel en temperatuur- en CO2-gestuurd beeldvormingsapparaat. Bovendien zijn de bijbehorende commerciële softwarepakketten geoptimaliseerd voor cellulaire screening en analyse met een hoge inhoud, bij uitstek geschikt voor het meten van verkalkingsneigingsneigingen in de loop van de tijd. Andere softwareoplossingen, zoals de freeware ImageJ, kunnen ook beeldanalyse bieden en de ontwikkeling van verkalking kwantificeren.
De beeldvorming van verkalkingsplaten in een laat stadium kan moeilijk zijn vanwege problemen met autofocus als de cultuur zwevend puin tegenkomt, wat resulteert in een verminderd aantal scherpe beelden en replicaties. Beeldanalyse moet dienovereenkomstig worden aangepast en sommige oplossingen zijn ontwikkeld in de software die in dit protocol wordt gebruikt om de analyse te verbeteren en te vereenvoudigen.
Cellulaire heterogeniteit speelt een cruciale rol bij de kwantificering van verkalking in vitro. In dit platform gebruiken we hVSMC's als biosensoren voor de ontwikkeling van verkalking. Primaire hVSMC's zijn afgeleid van verschillende donoren met verschillende onderliggende vasculaire pathologieën; daarom is deze test nog steeds onderhevig aan hoge variabiliteit als gevolg van de heterogeniteit van VSMC-batches. Een mogelijke oplossing is het gebruik van vereeuwigde cellijnen of het gebruik van hVSMCs afgeleid van pluripotente stamcellen.
Een andere beperking is dat de kwantificeringsmethode nog gevoelig is voor subjectiviteit. Subjectiviteit in verkalkingstests ontstaat door eindpunttests, die tot voor kort alleen beschikbaar waren. Onderzoekers moeten beslissen wanneer ze het experiment stoppen en verkalking meten, waardoor de subjectiviteit van de test toeneemt. Wij geloven dat de methode die in dit manuscript wordt geïntroduceerd superieur is omdat we in de loop van de tijd meten en de verkalkingsontwikkeling in een bepaalde periode kunnen vergelijken. Hieraan gekoppeld moet de verlichtingsinstelling voor elk tijdstip afzonderlijk worden aangepast vanwege de afname van het signaal in de loop van de tijd. Hierdoor wordt de hoeveelheid signaal die in een foto wordt weergegeven nog steeds beïnvloed door de mening van een persoon. Het is van cruciaal belang dat de verlichting wordt uitgevoerd met de hoogste signaal-ruisverhoudingen, zodat post-image analyse zo objectief mogelijk kan worden uitgevoerd.
Hoewel we de subjectiviteit van deze test als een beperking zien, geloven we dat het superieur is aan andere in vitro verkalkingsmethoden. In tegenstelling tot de bestaande methoden heeft onze semi-geautomatiseerde verkalkingstest het voordeel dat beelden anoniem kunnen worden geanalyseerd, waardoor een onafhankelijk geblindeerd oordeel ontstaat. Bovendien kunnen de beelden in een later stadium worden geanalyseerd met dezelfde gedefinieerde instellingen in een dataset, waardoor de subjectiviteit wordt verminderd.
De huidige methoden voor verkalkingsbepaling zijn gebaseerd op eindpuntmetingen of missen de vasculaire component 25,26,27. Binnen de kliniek zijn hulpmiddelen zoals computertomografie, intravasculaire echografie en magnetische resonantiebeeldvorming duur en een last voor patiënten. Biomarkeronderzoek heeft zijn nut bewezen, maar weerspiegelt niet de verkalkingslast van patiënten. Wij geloven dat deze semi-geautomatiseerde test niet alleen één enkele biomarker gebruikt, maar een verzameling circulerende componenten, die de cardiovasculaire status van een patiënt weerspiegelen. Dit kan worden gebruikt om een verkalkingsreactie te meten als een biosensor. Mogelijke verdere toepassingen van de beschreven methode zijn onder meer de serumscreening van patiënten voor in vitro verkalkingsontwikkeling als surrogaatmarker voor gepersonaliseerde ontwikkeling van vasculaire verkalking. Het platform heeft zijn gevoeligheid voor dialyse en vitamine K-behandeling aangetoond, naast zowel metabole als niet-metabole ziekten die verband houden met patiënten met een slechte cardiovasculaire status en prognose20. Omdat het principe van de test is gebaseerd op de detectie van calciumkristallen, veronderstellen we dat het ook relevant kan zijn in andere onderzoeksgebieden waar mineralisatie van belang kan zijn, zoals artrose, osteoporose, botregeneratieve geneeskunde of tandheelkundig onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Leon Schurgers heeft institutionele subsidies ontvangen van Bayer, Boehringer Ingelheim, NattoPharma en IDS. Leon Schurgers bezit aandelen in Coagulation Profile. Willi Jahnen-Dechent is medeoprichter en aandeelhouder van CALCISCON AG.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door de Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma's van de Europese Unie onder de Marie Sklodowska-Curie subsidieovereenkomst nr. 722609 en 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Dit onderzoek werd ondersteund door BioSPX. WJ-D ontving financiering van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR219-project ID 322900939 en project ID 403041552
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
References
- Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
- Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
- Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
- Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
- Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
- Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
- Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
- Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
- Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
- Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
- Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
- Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
- Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
- Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
- Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
- Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
- Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
- Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
- Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
- Wang, X. -R., Zhang, J. -J., Xu, X. -X., Wu, Y. -G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
- Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
- Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
- Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
- Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
- Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).
