Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

שיטה חצי אוטומטית וניתנת לשחזור ביולוגית לכימות תצהיר סידן במבחנה

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/64029
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 2, 1,3
1Department of Biochemistry, Cardiovascular Research Institute Maastricht (CARIM), Maastricht University, 2Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, Biointerface Group, RWTH Aachen University, 3Institute of Experimental Medicine and Systems Biology, RWTH Aachen University
* These authors contributed equally

Summary

מחלות לב וכלי דם הן סיבת המוות המובילה בעולם. הסתיידות כלי הדם תורמת באופן משמעותי לנטל התחלואה והתמותה. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לכימות משקעי סידן בתיווך תאי שריר חלקים במבחנה על ידי הדמיה פלואורסצנטית.

Abstract

הסתיידות כלי הדם כוללת סדרה של פתולוגיות ניווניות, כולל דלקת, שינויים בפנוטיפ התאים, מוות של תאים והיעדר מעכבי הסתיידות, שמובילים במקביל לאובדן גמישות ותפקוד כלי הדם. הסתיידות כלי הדם תורמת תרומה חשובה לתחלואה ולתמותה בפאתולוגיות רבות, כולל מחלת כליות כרונית, סוכרת וטרשת עורקים. מודלי המחקר הנוכחיים לחקר הסתיידות כלי הדם מוגבלים וניתנים ליישום רק בשלבים מאוחרים של התפתחות ההסתיידות in vivo. כלים במבחנה לחקר הסתיידות כלי דם משתמשים במדידות נקודת קצה, מגדילים את הדרישות מחומר ביולוגי ומסתכנים בהכנסת שונות למחקרים. אנו מדגימים את היישום של בדיקה חדשנית המסומנת באופן פלואורסצנטי הנקשרת להתפתחות הסתיידות במבחנה על תאי שריר חלק של כלי דם אנושיים וקובעת את ההתפתחות בזמן אמת של הסתיידות חוץ גופית . בפרוטוקול זה אנו מתארים את היישום של בדיקת ההסתיידות החדשה שפיתחנו, כלי חדשני במידול מחלות שיש לו יישומים תרגומיים פוטנציאליים. אנו צופים כי בדיקה זו תהיה רלוונטית במגוון רחב יותר של מחקרי תצהיר מינרלים, כולל יישומים במחקר עצמות, סחוס או שיניים.

Introduction

הסתיידות כלי דם (VC) היא גורם סיכון עצמאי לתחלואה קרדיווסקולרית ותמותה 1,2,3. הוא נחשב זה מכבר לתהליך כימי פסיבי של תצהיר מינרלים חוץ רחמיים, וכעת הוא נראה כתגובת ריפוי רקמות הניתנת לשינוי הכוללת תרומה אקטיבית של תאים שונים, כולל תאי שריר חלק של כלי הדם המופעלים (hVSMC) כגורם למחלה 4,5. In vivo ניתן למדוד VC על ידי סריקות CT מרובות פרוסות כהערכה של עומס טרשת עורקים 6,7,8. כיום, מתרחש שינוי פרדיגמה, שבו חומרת VC הופכת להיות מוכרת כגורם סיכון למחלות לב וכלי דם, סוכרת מסוג II, מחלת כליות כרונית והזדקנות 9,10,11,12,13,14,15.

hVSMCs הם סוג התא הנפוץ ביותר במערכת הלב וכלי הדם ושחקן מרכזי בפיתוח VC. הסתיידות המושרה על-ידי hVMC במבחנה היא מודל מחלות נפוץ לחקר מחלות לב וכלי דם16,17. עם זאת, רוב הפרוטוקולים לזיהוי הסתיידות חוץ גופית משתמשים במדידות נקודת קצה שיכולות להגביל את רכישת הנתונים, דורשות שימוש רב יותר בחומר תאי ויכולות להאט את המחקר. שיטות נפוצות לזיהוי הסתיידות hVSMC במבחנה כוללות את בדיקת o-cresolphthalein, המודדת תצהיר סידן מסיס כנגד סך החלבון ודורשת תזה18. כמו כן, מכתים אדומים Alizarin משמש, אשר נקשר ישירות משקעי סידן על תאים קבועים או רקמות19. כדי לחקור הסתיידות hVSMC לאורך זמן עם o-cresolphthalein או Alizarin אדום דורש קבוצות של שכפולים לכל נקודת זמן, להגדיל את הביקוש על חומר ביולוגי, בתורו, להגדיל את הסיכוי של השתנות.

במאמר זה אנו מפרטים את השיטה ליישום בדיקה חדשנית המשתמשת ב- hVSMCs עם בדיקת הדמיה פלואורסצנטית כדי לקבוע התקדמות VC במבחנה , כמו גם לתפקד כבדיקת הסתיידות חד-שלבית סופית. הוכחנו בעבר כי בדיקה זו דומה באופן ישיר לשיטות o-cresolphthalein ו- Alizarin Red וניתן להשתמש בה כדי להבחין בין תנאי תרבית משתנים20. בנוסף למדידות בזמן אמת, ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לקבוע את הנטייה של דגימות סרום או פלזמה כסמן פונדקאי לפיתוח VC קליני20. זה יסייע ביישום אסטרטגיות ביולוגיות של מדעי הלב וכלי הדם ומידול מחלות. יישום נוסף של הבדיקה עשוי להיות כמערכת BioHybrid תרגומית להערכת חומרת VC או התקדמות ממרכיבי דם כגון סרום או פלזמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. זריעת תאים, תחזוקה והסתיידות

  1. לגידול תאים ראשוניים, השתמש בארון זרימת אוויר למינרי, כפפות וציוד סטרילי. יש לחטא את הידיים ואת סביבת העבודה לפני ואחרי ביצוע כל עבודה. התייחסו לכל התאים הראשוניים ואמצעי התרבית כאל ביו-האזרד פוטנציאלי, אלא אם כן הוכח אחרת. רצוי אוטוקלאב תאים עודפים ומדיה לפני ההשלכה. אין להשבית כימית ואוטוקלאב מכיוון שהדבר ישחרר אדים רעילים.
  2. תרבית hVSMC על צלחות תרבית תאים לא מצופים.
  3. שמור באופן שגרתי על hVSMC במדיום צמיחה המורכב ממדיום M199 בתוספת 10%-20% FBS ו-1% Pen/Strep ודגירה ב-37 °C ו-5% CO2.
  4. פצל את התאים במפגש של 70%-90%.
    1. כדי לפצל, לשטוף את hVSMCs 2x עם PBS. מוסיפים טריפסין ודוגרים במשך 2-5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. בדוק את ניתוק התאים מתחת למיקרוסקופ.
    2. לעכב את תגובת הטריפסין על ידי הוספת מדיום המכיל סרום. צנטריפוגה של התאים ב 350 x גרם במשך 4 דקות ולהשהות את הכדור במדיום תחזוקה. hVSMCs עוקבים אחר ערכת פיצול 1:2.
  5. כדי להתחיל את ניסוי ההסתיידות, הכן את התאים לפי ההוראות הבאות לפיצול (שלב 1.4.1). לאחר ההדחה, סופרים את התאים והזרעים לצלחת של 48 בארות בצפיפות של 10-15 x 103 תאים לס"מ2. זרעו את התאים תוך הימנעות משימוש בבארות החיצוניות, כפי שמומלץ באיור משלים 1.
  6. תנו לתאים להיצמד ולהתאושש במשך 24 שעות (למשך הלילה) תוך כדי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
  7. יש לשטוף בעדינות את התאים פי 2 עם PBS, תוך שאיפה זהירה של כל ה-PBS הנותרים לאחר השטיפההשנייה .
  8. הוסיפו בעדינות מדיום הסתיידות ודגירה נוספת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. מדיום הסתיידות חייב להכיל גירוי הסתיידות, המסומן באופן פלואורסצנטי fetuin-A (למשל, עם חלבון פלואורסצנטי אדום [RFP]) (1 מיקרוגרם/מ"ל), וכתם גרעיני HOECHST 33342 (0.1 מיקרוגרם/מ"ל) או כתם גרעיני פלואורסצנטי חי דומה. אין להשתמש ב- DAPI, מכיוון שהוא אינו חדיר.
  9. יש לבדוק מדי יום במיקרוסקופ אור עד להתרחשות ההסתיידות.
    הערה: להערות על תרבית תאים ותחזוקה של hVMSCs, ראה קובץ משלים 1.

2. זיהוי הסתיידות באמצעות הדמיה

הערה: הפרוטוקול הבא מספק את הצעדים הכלליים שיש לנקוט בהכנה, הדמיה וניתוח נתונים. צילומי מסך התומכים בהוראות עבור כל שלב באמצעות פלטפורמת הדמיה אוטומטית ותוכנת ניתוח תמונות מתאימה (ראה טבלת חומרים לפרטים) מסופקים בקובץ משלים 2 ובקובץ משלים 3. ניתן להשתמש במכשירי הדמיה וכלי עיבוד תמונה אחרים כדי להחיל פרוטוקול זה. עם זאת, הדמיה חוזרת ונשנית באותו מיקום בכל באר היא חיונית לקליטת נתונים משמעותית. יצירת פרוטוקול להסתיידות תמונה ושימוש חוזר בכל שלב הדמיה היא הכרחית לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור. בפעם הראשונה ליישם את השיטה, בצע את השלבים הבאים כדי להתכונן לפני ההדמיה.

  1. הגדרת פרוטוקול
    1. פתח את התוכנה ולאחר מכן בחר פרוטוקולים וצור חדש.
    2. בחר הליך ולחץ על הגדר טמפרטורה. בחלון המוקפץ, הגדר את הטמפרטורה ל- 37 °C ואת מעבר הצבע ל- 1 °C, ולחץ על OK. בחר את סוג הצלחת שבחרת מהתפריט הנפתח. הוסף את שלב ההדמיה על-ידי לחיצה על תמונה. בחרו בתמונה ההפוכה ולחצו על הלחצן 'אשר'.
    3. הוסף שלושה ערוצי הדמיה והגדר אותם ל- DAPI (377, 447 ננומטר), RFP (531, 593 ננומטר) וברייטפילד. סמן את תיבת מונטאז ' והגדר את המספר והמיקום הרצויים של התמונות. 2 x 2 עבור צלחת 48 באר היא בחירה נפוצה. שנה את החפיפה כדי לייצג כיסוי טוב יותר של כל באר. בחר אילו בארות יש לדמות. ייפתח חלון חדש שבו ניתן יהיה לבחור את הבארות המעניינות.
    4. לחצו על ' אפשרויות מיקוד' כדי להגדיר את מצב המיקוד. חלון חדש ייפתח. הגדר כל ערוץ בנפרד. בדרך כלל, בארות ממוקדות אוטומטית בערוץ "DAPI". הגדר את כל הערוצים האחרים לגובה מוקד קבוע מהערוץ הראשון והגדר על-ידי לחיצה על אישור. סגור את החלון.
    5. התחל את שלבי הפחתת הנתונים המוגדרים מראש על-ידי לחיצה על הפחתת נתונים ובחר עיבוד מקדים של תמונות. הגדרת שלב זה מפחיתה את הרקע הפלואורסצנטי. קבל את הגדרות ברירת המחדל על-ידי בחירה באפשרות אישור. קבוצה חדשה של תמונות תיווצר עם הקידומת "TSF". התמונות המקוריות יישמרו.
    6. הגדר שלב לספירת התאים על-ידי בחירה באפשרות ניתוח סלולארי. בחר תמונות TSF DAPI מהתפריט הנפתח ערוץ . הגדר פרטים נוספים לאחר ביצוע ההדמיה. שלב זה יכול להיחשב גם להפחתת נתונים; הקפידו תמיד לשמור על התמונות המקוריות.
    7. הכן את הניתוח של אות ה- RFP (הסתיידות) על-ידי בחירה באפשרות סטטיסטיקה. בחלון המוקפץ, תייג שלב ובחר TSF RFP כערוץ הקלט. סמן את התיבות ערך עליון וערך תחתון. סמן את התיבה עבור שטח כולל ברשימה התחתונה. בחרו 'ללא' בעמודה 'אפקט צבע'. בחלון המוקפץ, לחץ על מותאם אישית וסמן את התיבה רקע. פעולה זו תצבע את התוצאות מנמוך-גבוה להערכה קלה. לחץ על OK.
    8. לקריאה הוגנת, נרמל את אות ה- RFP לכל תא. בכך, שטח כולל מחולק לכל תא. כדי להגדיר שלב זה, לחץ על Ratio בצד ימין. בחלון המוקפץ, בחר עבור קלט נתונים 1 כימות RFP: שטח כולל מהתפריט הנפתח. בהמשך בחר ספירת תאים כקלט נתונים 2.
    9. לבסוף, בחר שם ערכת נתונים חדש ולחץ שוב על אישור ואישור. בחר אפקט צבע כפי שתואר קודם לכן. בפינה הימנית העליונה, בחר קובץ ושמור את הקובץ כפרוטוקול (סוג קובץ .prt).
  2. מדי יום לאחר ההסתיידות הראשונה מתרחשת
    1. עבור כל נקודת זמן, חזור על שלבים אלה. בתוכנת האתחול, לחץ על קרא כעת ועל פרוטוקול קיים.... בחר את הפרוטוקול שנוצר בשלב הקודם. התוכנית תבקש להציל את הניסוי. ניתן לעשות זאת בשלב זה אך גם בכל שלב מאוחר יותר באופן ידני על ידי לחיצה על להציל כפתור בפינה השמאלית העליונה.
    2. חלון קופץ יבקש להמתין עד שהמערכת תתחמם. הפעל את בקר הגז CO2 והגדר אותו ל -5%.
    3. לאחר שהמערכת הגיעה לטמפרטורה שנקבעה, תופיע הנחיה להכניס צלחת ולקרוא. לחץ על ביטול. הסיבה לכך היא שעבור כל נקודת זמן, יש להתאים את החשיפה של כל פלואורוכרום בנפרד.
    4. העבירו את הצלחת מהאינקובטור אל ההדמיה בכספת המתנגדת לשבירה ולשפיכה ותואמת את תקנות הבטיחות הביולוגית המקומיות להובלת תאים חיים, במקרה של תאונה. הכניסו את הצלחת לקורא הצלחות.
    5. לאחר הביטול, לחץ על הליך. בחלון המוקפץ, בחרו ' שלב הדמיה מוגדר מראש'. התאם תחילה את המיקוד והחשיפה בערוץ DAPI . נקה את התיבה חשיפה אוטומטית בכל הערוצים. לאחר מכן, לחץ על סמל המיקרוסקופ לצד ערוץ DAPI . חלון חדש ייפתח.
    6. בחר את הבאר להתמקד בה. השתמש באר עם הסתיידות בינונית עד גבוהה עבור שלב זה. אם אות כבר גלוי, לחץ תחילה על מיקוד אוטומטי ולאחר מכן על חשיפה אוטומטית. אם לא, תחילה הגדל את החשיפה וחזור על המיקוד האוטומטי ועל החשיפה האוטומטית. אם תרצה, ניתן לכוונן את החשיפה באופן ידני על ידי בחירת התפריט הנפתח של החשיפה. בדוק את ההגדרות במספר בארות. לאחר שתהיה מרוצה, שמור את ההגדרות.
    7. התאם את החשיפה באותו אופן לכל הערוצים.
      התראה: אל תתמקד בערוצים אחרים; התאימו את החשיפה בלבד. מישור המיקוד צריך להיות זהה עבור כל הערוצים.
    8. סגור את חלון ההליך. בחר בלחצן הירוק 'קרא כעת' בשורת המשימות העליונה. שמור את הניסוי כפי שצוין על ידי התוכנה.
      הערה: התוכנה תקרא כעת באופן אוטומטי את כל הבארות שנבחרו בהגדרות שנבחרו.

3. ניתוח נתונים

הערה: לקבלת צילומי מסך מפורטים על אופן ביצוע ניתוח הנתונים באמצעות פלטפורמת הדמיה אוטומטית ותוכנת ניתוח תמונה מתאימה (ראה טבלת חומרים לפרטים), ראה קובץ משלים 4. אם משתמשים במכשירי הדמיה או בתוכנת ניתוח חלופיים, יש לייצא את התמונות ולעבד אותן באצווה כדי להבטיח שהחשיפה, סף הפלואורסצנטיות או העוצמה יותאמו באופן שווה לכל התמונות בערכת נתונים השוואתית.

  1. בזמן שהמערכת קוראת את הצלחת, כל התמונות מעובדות באופן אוטומטי ברקע. התאם את ההגדרות עבור ספירת התאים על-ידי בחירת תמונות TSF DAPI להצגה. בחר את הבאר המועדפת על-ידי לחיצה כפולה. חלון חדש יופיע. בחרו אחת מהתמונות.
  2. בחר בכרטיסיה ניתוח . בחלון המוקפץ, בחר ניתוח סלולארי: ספירת תאים. לחץ על OK. בטלו את הבחירה בערוצי RFP וב-brightfield. סמן את התיבה סמן אובייקטים .
  3. לחץ על אפשרויות כדי לפתוח את התפריט. התאם את סף הגודל והעוצמה כך שיכלול את כל הגרעינים, אך אל תכלול לכלוך. לחץ על OK. לחצו על 'החל שינויים' בפינה הימנית התחתונה כדי להעביר את ההגדרות גם לכל התמונות האחרות.
  4. באופן דומה לקודם, בחר באר ותמונה עם כמות בינונית עד גבוהה של הסתיידות כדי להתאים בצורה הטובה ביותר את יחס האות לרעש; לחץ על הכרטיסיה ניתוח בתפריט המשימה.
    1. הפעם בחר סטטיסטיקת תמונות. בטלו את הבחירה בערוץ DAPI ובערוץ brightfield. לחץ על אפשרויות כדי לפתוח את התפריט. סמן את התיבה חריגות סף. התאם את הערכים העליונים והתחתונים של הסף. לספור את האות רק אם הוא מעל הרקע ולא לכלול אם יש פסולת / חפצים.
    2. כדי להגדיר ערך סף לא סובייקטיבי עבור האות שמעל הרקע, בחר בכלי הקו משורת המשימות. חלון יופיע. שרטט קו דרך טלאי של אות, אך הקפד לכלול גם אזור רקע.
      הערה: גרף יופיע בחלון המוקפץ, ויציג שיא המייצג את האות מעל קו הרקע. ערך שיא הגובה של 25% מייצג את הסף המומלץ. מומלץ גם למדוד מספר טלאי אות כדי להבטיח את בחירת הסף הנכון. בעת בחירת טלאים של אות, בחירת אזורים עם עוצמת אות גבוהה מאוד עלולה לגרום לסף שמזניח אותות בינוניים או נמוכים יותר. לכן, מומלץ לבחור טלאים של אות בינוני עד נמוך מעל הרקע. דוגמאות לסף גבוה מדי, נמוך מדי ומדויק מוצגות בקובץ משלים 4.
    3. לאחר שתהיה מרוצה, לחץ על אישור והחל שינויים כדי להעביר את ההגדרות לכל הבארות האחרות. בדוק אם הסף נבחר במדויק בבארות האחרות.
  5. לאחר הגדרת ספירת התאים וסף ה- RFP, יצא את הנתונים. בחר את צלחת העניין. בתפריט הנפתח, ניתן לבחור פרמטרים מרובים לייצוא. רלוונטיים עשויים להיות ספירת תאים, אזור RFP ו"אזור/תא" שהוא המדד המשמש להשוואה בין קבוצות. לחץ על לחצן Excel לצד התפריט הנפתח כדי לייצא את הנתונים ישירות לגיליון אלקטרוני.
    הערה: בתפריט הנפתח, ניתן לבחור בנפרד את הערכים המחושבים עבור ספירת התאים, את השטח הכולל של אות RFP (המשקף את שטח ההסתיידות), וכן את היחס המנורמל של השטח הכולל של אות RFP לתא ולייצא אותם לגיליון אלקטרוני. הצג את התוצאות כיחס בין השטח הכולל של אות RFP לתא והצג אותן באופן חזותי (לדוגמה, תרשימי עמודות). החל מבחן t של סטודנט לא מותאם כדי להשוות בין שתי קבוצות או ANOVA לא מזווג כדי להשוות בין קבוצות שונות באותה נקודת זמן. השוואה בין אותה קבוצה בנקודות זמן שונות עשויה לדרוש ניתוח סטטיסטי זוגי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאה כוללת תמונות מקוריות של גרעינים מוכתמים ב-HOECHST, הסתיידות עם תווית RFP ותמונות שדה בהיר. ניתן לזהות ולנתח שלבים שונים של הסתיידות הנעים בין נמוך (איור 2) לגבוה (איור 3). בדרך כלל ניתן לזהות הסתיידות ככתמים שחורים באמצעות מיקרוסקופיית אור (איור 2D ואיור 3B, חצים מצביעים על הסתיידות), שהם שימושיים להערכה ראשונית ולקביעת מתי להתחיל בהדמיה. לקבלת יחס אות לרעש משופר, יש לנתח את תמונות ה-RFP המעובדות כדי לכמת את ההסתיידות (איור 2F ואיור 3D, חצים מצביעים על הסתיידות). לבסוף, ניתן להציג את הנתונים כגרף עמודות המשווה בין שני תנאים או יותר בנקודת זמן אחת, בליווי תמונות מייצגות (איור 4A,B,C). יש להציג נתונים מנורמלים לספירת תאים (לדוגמה, כאזור הסתיידות לכל תא). נתונים עשויים להיות מוצגים גם כנתונים מסדרות זמן המציגים את אותו מצב בנקודות זמן שונות (איור 4D).

Figure 1
איור 1: תקציר חזותי המסכם את השלבים לזיהוי וניתוח הסתיידות חצי אוטומטיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: דוגמה להסתיידות בשלב מוקדם. (A) ניתן להציג ולנתח את תמונת הכיסוי כ- (B) תמונות DAPI (גרעינים), (C) RFP (הסתיידות) ו- (D) נפרדות. (E) גרעינים מזוהים על ידי התוכנה וניתן לסמן אותם כעיגולים צהובים כדי להתאים את ההגדרות. (F) לצורך ניתוח אות ה-RFP, התמונות מעובדות מראש כדי להפחית את אות הרקע, ו-(G) לאחר מכן, ניתן להגדיר סף למדידת האות. החצים מציינים הסתיידות בתמונות השדה הבהיר (D) ובתמונות ה-RFP שעברו שינוי צורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: דוגמה להסתיידות בשלב מאוחר יותר. (A) ניתן להציג ולנתח את תמונת הכיסוי כתמונות נפרדות (B) שדה בהיר, (C) RFP (הסתיידות) ו- (E) DAPI (גרעינים). (D) לצורך ניתוח אות ה-RFP, התמונות מעובדות מראש כדי להפחית את אות הרקע. חצים מציינים הסתיידות בתמונות השדה הבהיר (B) ו- (D) שעברו שינוי צורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: השוואה מייצגת בין הסתיידות נמוכה וגבוהה של hVSMC לאחר 14 יום בתרבית עם הסתיידות בינונית. בדרך כלל, נתונים עשויים להיות מוצגים כגרף עמודות ולנתח אותם תוך שימוש במבחן t של סטודנט לא משויך. תמונות מייצגות של (A) הסתיידות נמוכה ו- (B) הסתיידות גבוהה. האות האדום (RFP) משקף הסתיידות, והאות הכחול (HOECHST) מציג גרעינים. (C) הסתיידות המוצגת כאות חיובי של פטואין A-RFP (שטח כולל) לכל תא. (D) דוגמה לבדיקת הסתיידות שנמדדה לאורך זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: דוגמה למגוון בארות המשמשות לניסוי הסתיידות עם hVSMCs. הטבעת החיצונית של הבארות אינה משמשת לניסוי ההסתיידות אלא מלאה בנוזל. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1: הערות על תרבית תאים ותחזוקה של hVMSC. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: פרוטוקול הדמיה אוטומטי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: פרוטוקול ניתוח תמונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 4: פרוטוקול ניתוח נתונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בכתב יד זה אנו מתארים שיטה חצי אוטומטית לקביעת הסתיידות במבחנה . עבור שיטה זו, יש לייעל שלושה שלבים קריטיים של הסתיידות hVSMC. ראשית, צפיפות התאים היא קריטית להתפתחות הסתיידות hVSMC. צפיפות נמוכה של hVSMCs תגרום להסתיידות איטית או ללא הסתיידות ולמוות של תאים עקב היעדר מגע בין תא לתא והלחץ המושרה בתנאי הסתיידות21. צפיפות תאים גבוהה גורמת למפגש יתר, שלאחריו התאים הופכים לסנסנטיים22 והתפתחות ההסתיידות נעצרת. זה קריטי לזרוע בערך 70% מפגש בלוח הבאר שישמש לפיתוח הסתיידות לאחר מכן, מה שמבטיח יכולת שגשוג וחיבורים תאיים של hVSMCs.

שנית, המדיה של תרבית התאים שתשמש להשראת הסתיידות דורשת אופטימיזציה. במסגרת מחקר הסתיידות כלי הדם, דווח על מגוון מצבים והרכבי מדיה שגורמים ל-23,24 ל-hVSMCsל-23,24. אנו מאמינים שהשיטה מתאימה לאיתור כל מיני הסתיידויות בתיווך מבחנה, והיא שימשה לאיתור משקעי סידן, פוספט או סידן-פוספט. ללא קשר למצב של אינדוקציה הסתיידות, אופטימיזציה של המדיה ההסתיידת היא מרכזית. בפרוטוקול המוצג, ייעלנו את אינדוקציה ההסתיידות באמצעות M199 עם ריכוז סידן כולל של 4.5 mM Ca2+ עם 2.5% FBS.

לבסוף, הבדלים מקומיים בצלחות במהלך הסתיידות נצפו. זה קריטי ליישם טעינה אקראית של משכפלים טכניים כדי למנוע הטיה לדוגמה. בנוסף, יש להימנע מהעמסה של נתיבי הבאר החיצוניים מכיוון שבארות אלה תמיד מסתכמות במהירות רבה יותר בסביבה של 48 בארות. זה עלול להיגרם על ידי dysregulation של לחות intraplate, שבו לא להשתמש בבארות החיצוניות ביותר לטעון בארות אלה עם כמויות גדולות של נוזל מסייע לשלוט על זה.

בעוד שבדיקת ההסתיידות עצמה יכולה לדרוש מספר שלבי אופטימיזציה כדי להבטיח יכולת שכפול עם הגדרה מסוימת, ברגע שהיא פועלת זה הופך להיות פשוט. מבחני הסתיידות יכולים להיות מופעלים בו זמנית ושוב ושוב בתנאים שנקבעו ללא צורך באופטימיזציה נוספת. הסתיידות בתיווך hVSMC יכולה להיות מאתגרת ולדרוש ניסויים לפני שהושגה עמידות הבדיקות. חוקר צריך להיות מסוגל לקבוע את התזמון האופטימלי לפני תחילת הדמיה רגילה, אשר יכול לקחת עד 1 שבוע. ניתן לקבוע לוח זמנים קבוע להדמיה מתחילת הניסוי, אם כי זה עשוי להפיק תמונות רבות ללא קריאות דיפרנציאליות, להשתמש בכמות גדולה יחסית של אחסון נתונים עבור תמונות, ולגזול זמן רב בניתוח.

ההליך המתואר בפרוטוקול זה הוא אחת הדרכים לבצע את הניתוח של בדיקת ההסתיידות. למטרות אחרות, יש להתאים את הנוהל בהתאם. הניתוח שלנו באמצעות פלטפורמת ההדמיה האוטומטית המוזכרת מבטיח יכולת שחזור, אם כי ניתן לבצע ניתוח באמצעות כל תא חי ומכשיר הדמיה מבוקר טמפרטורה ו- CO2. בנוסף, חבילות התוכנה המסחריות המתאימות ממוטבות לסינון וניתוח סלולרי בעל תוכן גבוה, המתאימות באופן אידיאלי למדידת נטייה להסתיידות לאורך זמן. פתרונות תוכנה אחרים, כגון התוכנה החופשית ImageJ, יכולים לספק ניתוח תמונה ולכמת גם פיתוח הסתיידות.

ההדמיה של לוחות הסתיידות בשלב מאוחר יכולה להיות קשה עקב בעיות במיקוד אוטומטי במקרה שהתרבית נתקלת בפסולת צפה, וכתוצאה מכך מספר התמונות החדות והשכפולים מופחת. ניתוח תמונות צריך להיות מותאם בהתאם, וכמה פתרונות פותחו בתוכנה המשמשת בפרוטוקול זה כדי לשפר ולפשט את הניתוח.

ההטרוגניות התאית ממלאת תפקיד מכריע בכימות ההסתיידות במבחנה. בפלטפורמה זו, אנו משתמשים ב-hVSMCs כביוסנסורים לפיתוח הסתיידות. hVSMCs ראשוניים נגזרים מתורמים שונים עם פתולוגיות וסקולריות בסיסיות שונות; לכן, בדיקה זו עדיין כפופה לשונות גבוהה בשל ההטרוגניות של אצוות VSMCs. פתרון אפשרי הוא שימוש בקווי תאים אימורטליים או שימוש ב-hVSMCs שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים.

מגבלה נוספת היא ששיטת הכימות עדיין רגישה לסובייקטיביות. סובייקטיביות במבחני הסתיידות נובעת ממבחני נקודת קצה, שהיו זמינים רק עד לאחרונה. על החוקרים להחליט מתי להפסיק את הניסוי ולמדוד הסתיידות, מה שמגדיל את הסובייקטיביות של הבדיקה. אנו מאמינים שהשיטה שהוצגה בכתב יד זה עדיפה כפי שאנו מודדים לאורך זמן ויכולה להשוות התפתחות הסתיידות בתקופה מסוימת. בהקשר זה, יש להתאים את הגדרת התאורה לכל נקודת זמן בנפרד בשל הירידה באות לאורך זמן. בשל כך, כמות האות המיוצגת בתמונה עדיין מתנדנדת על ידי דעתו של אדם. חיוני שהתאורה תבוצע עם יחסי האות לרעש הגבוהים ביותר, כך שניתן יהיה לבצע ניתוח לאחר התמונה באופן אובייקטיבי ככל האפשר.

למרות שאנו רואים את הסובייקטיביות של בדיקה זו כמגבלה, אנו מאמינים כי היא עדיפה על שיטות אחרות של הסתיידות במבחנה . בניגוד לשיטות הקיימות, לבדיקת ההסתיידות האוטומטית למחצה שלנו יש יתרון בכך שניתן לנתח תמונות באופן אנונימי, ובכך לספק דעה עיוורת עצמאית. בנוסף, ניתן לנתח את התמונות בשלב מאוחר יותר עם אותן הגדרות מוגדרות על פני ערכת נתונים, ובכך להפחית את הסובייקטיביות.

השיטות הנוכחיות לקביעת הסתיידות מסתמכות על מדידות נקודת קצה או חסרות את הרכיב הווסקולרי25,26,27. בתוך המרפאה, כלים כגון טומוגרפיה ממוחשבת, אולטרסאונד תוך וסקולרי והדמיית תהודה מגנטית הם יקרים ומהווים נטל על המטופלים. מחקר סמנים ביולוגיים הוכיח את השימוש בו אך אינו משקף את נטל ההסתיידות של המטופלים. אנו מאמינים כי בדיקה חצי אוטומטית זו משתמשת לא רק בסמן ביולוגי אחד אלא באוסף של רכיבים במחזור, המשקפים את מצב הלב וכלי הדם של המטופל. זה יכול לשמש למדידת תגובת הסתיידות כביו-סנסור. יישומים פוטנציאליים נוספים של השיטה המתוארת כוללים בדיקת סרום של מטופלים לפיתוח הסתיידות חוץ גופית כסמן פונדקאי לפיתוח מותאם אישית של הסתיידות כלי דם. הפלטפורמה הוכיחה את רגישותה לטיפולי דיאליזה וויטמין K, בנוסף למחלות מטבוליות ולא מטבוליות הקשורות לחולים עם מצב קרדיווסקולרי ירוד ופרוגנוזה20. מאחר שהעיקרון של הבדיקה מבוסס על זיהוי של גבישי סידן, אנו משערים שהוא עשוי להיות רלוונטי גם בתחומי מחקר אחרים שבהם מינרליזציה עשויה להיות רלוונטית, כגון דלקת מפרקים ניוונית, אוסטאופורוזיס, רפואה רגנרטיבית של העצם או מחקר דנטלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ליאון שורגר קיבל מענקים מוסדיים מבאייר, בוהרינגר אינגלהיים, נאטופארמה ו-IDS. ליאון שורגרס מחזיק במניות פרופיל קרישה. וילי ג'הנן-דכנט הוא מייסד שותף ובעל מניות ב- CALCISCON AG.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי תוכניות המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענקים מארי סקלודובסקה-קירי No 722609 and 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). מחקר זה נתמך על ידי BioSPX. WJ-D קיבל מימון מ-Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) TRR219-מזהה פרויקט 322900939 ומזהה פרויקט 403041552

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcium chloride, 93%, anhydrous Thermo Fisher Scientific 349615000
Costar 6-well Clear TC-treated well plates Corning 3516
Cytation 3 System BioTek, Abcoude, The Netherlands
Fetal Bovine Serum Merck F7524-100ML
Fetuin-A-Alexa Fluor-546 Prepared in-house
Gen5 Software v3.10 BioTek
Gibco Medium 199 Thermo Fisher Scientific 11150059
Hoechst 33342, Trihydrochloride Thermo Fisher Scientific H3570
PBS (10X), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 70011044
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25300062

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
  2. Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
  3. Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
  4. Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
  5. Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
  6. Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
  7. Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
  8. Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
  9. Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
  10. Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
  11. Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
  12. Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
  13. Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
  14. Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
  15. Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
  16. Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
  17. Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
  18. Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
  19. Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
  20. Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
  21. Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
  22. Wang, X. -R., Zhang, J. -J., Xu, X. -X., Wu, Y. -G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
  23. Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
  24. Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
  25. Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
  26. Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
  27. Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).

Tags

ביוכימיה גיליון 184
שיטה חצי אוטומטית וניתנת לשחזור ביולוגית לכימות תצהיר סידן <em>במבחנה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jaminon, A. M. G., Rapp, N.,… More

Jaminon, A. M. G., Rapp, N., Akbulut, A. C., Dzhanaev, R., Reutelingsperger, C. P., Jahnen-Dechent, W., Schurgers, L. J. A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro. J. Vis. Exp. (184), e64029, doi:10.3791/64029 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter