一种半自动化且可重复的基于生物学方法定量钙沉积的技术 体外

摘要

心血管疾病是全球范围内的首要死因。血管钙化在心血管疾病的发病率和死亡率负担中起着重要作用。本方案描述了一种简单的方法，用于定量分析血管平滑肌细胞介导的钙沉淀 体外 通过荧光成像。

摘要

血管钙化涉及一系列退行性病理过程，包括炎症、细胞表型改变、细胞死亡以及钙化抑制因子的缺失，这些因素共同导致血管弹性和功能的丧失。血管钙化在多种疾病中是导致发病和死亡的重要因素，包括慢性肾病、糖尿病和动脉粥样硬化。目前用于研究血管钙化的模型存在局限性，仅适用于钙化晚期阶段的研究。 体内. 体外 用于研究血管钙化的工具通常依赖终点测量，这增加了对生物材料的需求，并可能给科研带来变异性风险。我们展示了新型荧光标记探针的应用，该探针可特异性结合 体外 人血管平滑肌细胞的钙化进展，并确定其钙化的实时发展过程 体外 钙化。在本方案中，我们描述了新开发的钙化检测方法的应用，这是一种在疾病建模中具有潜在转化应用价值的新工具。我们预计该检测方法在更广泛的矿物质沉积研究领域具有相关性，包括骨、软骨或牙科研究中的应用。

引言

血管钙化（VC）是心血管疾病发病率和死亡率的独立危险因素^1,2,3。过去长期认为VC是一种异位矿物质沉积的被动化学过程，但现在发现其更像是一种可调控的组织修复反应，涉及多种细胞的主动参与，其中活化的血管平滑肌细胞（hVSMC）是推动该疾病发展的关键因素^4,5。体内血管钙化可通过多层螺旋CT扫描进行检测，以评估动脉粥样硬化负荷^6,7,8。目前，研究范式正在发生转变，血管钙化的严重程度逐渐被认可为心血管疾病、II型糖尿病、慢性肾病以及衰老等多种病理状态中的重要风险因素^{9,10,11,12,13,14,15}。

人血管平滑肌细胞（hVSMCs）是心血管系统中最丰富的细胞类型，也是血管钙化（VC）发生发展的主要参与者。体外诱导hVSMC钙化是一种广泛使用的疾病模型，用于研究心血管疾病^16,17。然而，目前大多数检测体外钙化的方法均为终点检测，这会限制数据的获取，需要消耗更多的细胞材料，并可能延缓研究进程。常用的体外hVSMC钙化检测方法包括邻甲酚酞络合酮法，该方法通过测定溶解性钙沉积量与总蛋白的比值来评估钙化程度，但需裂解细胞¹⁸；此外，也常使用茜素红染色法，该方法可直接与固定后的细胞或组织中的钙沉积物结合¹⁹。若采用邻甲酚酞络合酮法或茜素红染色法进行时间序列研究，则每个时间点均需设置独立的重复样本组，从而增加生物材料的消耗，并进一步加大实验变异的可能性。

本文详细介绍了利用人血管平滑肌细胞（hVSMCs）结合荧光成像探针以测定某指标的新型检测方法 体外 VC进展以及作为单一终末期钙化检测方法的功能。我们先前已证明，该检测方法与邻甲酚酞络合酮法和茜素红法具有直接可比性，可用于区分不同的培养条件²⁰除了实时测量外，该检测还可用于确定血清或血浆样本发生钙化倾向的能力，作为临床血管钙化（VC）发展的替代标志物²⁰这将有助于心血管科学和疾病建模中的生物学策略的应用。该检测方法的另一应用可能是作为转化型生物杂合系统，利用血清或血浆等血液成分评估血管钙化的严重程度或进展。

方案

1. 细胞接种、培养与成骨诱导

1. 培养原代细胞时，应使用超净工作台、手套和无菌器械。操作前后均需对手部和工作区域进行消毒。除非有明确证据表明无害，否则应将所有原代细胞和培养基视为潜在生物危害物。建议在丢弃前对多余的细胞和培养基进行高压灭菌处理。不得先化学灭活再进行高压灭菌，以免释放有毒气体。
2. 将人血管平滑肌细胞接种于未包被的细胞培养板上。
3. 常规使用生长培养基培养人血管平滑肌细胞（hVSMC），培养基成分为添加10%-20%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（Pen/Strep）的M199培养基，于37 °C、5% CO₂条件下孵育。₂.
4. 当细胞融合度达到70%–90%时进行传代。
   1. 传代时，用 PBS 将人血管平滑肌细胞（hVSMCs）洗涤 2 次。加入胰蛋白酶，于 37 °C 孵育 2–5 分钟。在显微镜下观察细胞是否脱落。
   2. 通过加入含血清的培养基终止胰蛋白酶反应。将细胞在350 x g条件下离心 g 孵育4分钟，将沉淀重悬于维持培养基中。人血管平滑肌细胞采用1:2传代方案。
5. 开始钙化实验时，按照传代培养的说明处理细胞（步骤 1.4.1）。重悬后计数细胞，并以每孔 10–15 × 10⁵ 的密度接种至 48 孔板中。³ 细胞/厘米²²接种细胞时，避免使用外周孔，建议如 补充图1.
6. 让细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时（过夜），以贴壁并恢复生长₂.
7. 用 PBS 轻柔洗涤细胞 2 次，每次洗涤后小心吸净残留的 PBS^nd 洗涤。
8. 轻轻加入钙化培养基，于37 °C、5% CO₂条件下继续培养。₂钙化培养基必须含有钙化刺激物、荧光标记的胎球蛋白A（例如，用红色荧光蛋白[RFP]标记）（1 µg/mL）以及HOECHST 33342（0.1 µg/mL）核染料或类似的活细胞荧光核染料。请勿使用DAPI，因其不具备细胞膜通透性。
9. 每天用光学显微镜观察，直至出现钙化。
   ​注意：有关hVMSCs细胞培养与维持的说明，请参见 补充文件 1.

2. 通过成像检测钙化

注意：以下方案提供了在准备、成像和数据分析过程中所需遵循的一般步骤。使用自动化成像平台及相应的图像分析软件（详见材料表）进行各步骤操作的截图见于补充文件2和补充文件3。也可采用其他成像仪器和图像处理工具来实施本方案。然而，每次在每个孔的相同位置重复成像对于获得有意义的数据至关重要。为获得可重复的结果，必须建立一个用于成像钙化并能在每次成像步骤中重复使用的方案。首次应用该方法时，请按照以下步骤在成像前完成准备工作。

1. 实验方案设置
   1. 打开软件，然后选择 Protocols 和 Create New。
   2. 选择 Procedure 并点击 Set Temperature。在弹出窗口中，将温度设置为 37 °C，梯度设置为 1 °C，然后点击 OK。从下拉菜单中选择所需的板类型。通过点击 Image 添加成像步骤。选择倒置成像仪，然后点击 OK。
   3. 添加三个成像通道，并将其设置为 DAPI（377, 447 nm）、RFP（531, 593 nm）和明场。勾选 Montage 框，并设置所需图像数量和位置。对于 48 孔板，通常选择 2 × 2。调整重叠区域以更好地覆盖每个孔。选择需要成像的孔。将打开一个新窗口，可在其中选择感兴趣的孔。
   4. 点击 Focus Options 以设置对焦模式。将打开一个新窗口。为每个通道单独设置。通常，孔在 "DAPI" 通道上自动对焦。将所有其他通道设置为 Fixed Focal Height From First Channel ，然后点击 OK 进行确认。关闭该窗口。
   5. 通过点击 Data Reduction 并选择 Image Preprocessing，开始预设数据缩减步骤。设置此步骤可降低荧光背景。通过选择 OK 接受默认设置。将生成一组带有前缀 "TSF" 的新图像。原始图像将被保留。
   6. 通过选择 Cellular Analysis 设置细胞计数步骤。从 Channel 下拉菜单中选择 TSF DAPI 图像。在完成成像后设置更多详细信息。此步骤也可视为数据缩减；务必始终保留原始图像。
   7. 通过选择 Statistics 来准备对 RFP（钙化）信号的分析。在弹出窗口中，标记 Step ，并将输入通道选择为 TSF RFP。勾选 Upper Value 和 Lower Value 框。在下方列表中勾选 Total Area 框。在 Color Effect 列中选择 None 。在弹出窗口中，点击 Custom 并勾选 Background 框。这将对结果进行低至高的颜色编码，便于评估。按 OK。
   8. 为了获得公平的读数，需将 RFP 信号按细胞数进行归一化处理。具体做法是将总面积除以细胞数。要设置此步骤，请在左侧点击 Ratio 。在弹出窗口中，从下拉菜单中选择数据输入 1 为 RFP Quantification: Total Area。再选择 Cell Count 作为数据输入 2。
   9. 最后，选择一个 New Data Set Name ，然后点击 OK 并再次点击 OK。如前所述选择 Color Effect。在左上角选择 File ，并将文件保存为协议（.prt 文件类型）。
2. 首次出现钙化后的每一天
   1. 对于每个时间点，重复这些步骤。在启动软件后，点击 Read Now 和 Existing Protocol...。选择之前步骤中创建的协议。程序将提示保存实验。此操作可在当前步骤完成，也可在后续任意时间通过点击左上角的 Save 按钮手动完成。
   2. 弹出窗口将提示等待系统加热。打开 CO₂ 气体控制器，并将其设置为 5%。
   3. 当系统达到设定温度后，将出现提示要求插入板并读取。点击 Cancel。这是因为每个时间点的每种荧光染料的曝光时间必须单独调整。
   4. 将板从培养箱转移到成像仪时，应使用防破碎、防泄漏的安全箱，并符合中国台湾当地关于活细胞运输的生物安全规定，以防意外发生。将板放入板式读数仪中。
   5. 取消后，点击 Procedure。在弹出窗口中选择 Pre-Set Imaging Step。首先调整 DAPI 通道的对焦和曝光。取消勾选所有通道的 Auto Exposure 框。然后点击 DAPI 通道旁边的 Microscope 图标。将打开一个新窗口。
   6. 选择用于对焦的孔。此步骤应选择钙化程度中等至较高的孔。如果已可见信号，先点击 Autofocus ，然后点击 Autoexposure。如果不可见，先增加曝光时间，再重复 Autofocus 和 Autoexposure。如有需要，可通过选择曝光下拉菜单手动调整曝光。在多个孔上检查设置。确认满意后，保存设置。
   7. 以相同方式调整所有通道的曝光。
      CAUTION：不要在其他通道上对焦；仅调整曝光。所有通道的焦平面应保持一致。
   8. 关闭程序窗口。在顶部任务栏中点击绿色的 Read Now 按钮。按照软件提示保存实验。
      ​NOTE: 软件现在将自动读取所选设置中的所有选定孔。

3. 数据分析

注意：有关如何使用自动化成像平台及相应的图像分析软件进行数据分析的详细截图（详见材料表），请参见补充文件4。如果使用其他成像仪器或分析软件，应导出图像并进行批量处理，确保在比较数据集中所有图像的曝光、荧光阈值或强度均被同等调整。

1. 系统读取酶标板的同时，所有图像将在后台自动进行处理。通过选择 TSF DAPI 图像来调整细胞计数设置。通过双击选择目标孔。新窗口将弹出，选择其中一张图像。
2. 选择 分析 选项卡。在弹出窗口中，选择 细胞分析：细胞计数。点击 确定。取消选中 RFP 和明场通道。勾选 高亮对象 复选框。
3. 点击 选项 以打开菜单。调整大小和强度阈值，以包含所有细胞核并排除碎片。点击 确定。点击左下角的 应用更改 ，将设置同步至所有其他图像。
4. 参照之前的方法，选择一个钙化程度中等到较高的孔及对应图像，以最佳调整信噪比；点击任务菜单中的 分析 选项卡。
   1. 此次选择 图像统计。取消选中 DAPI 和明场通道。点击 选项 以打开菜单。勾选 阈值剔除离群值 复选框。调整阈值的上下限。仅当信号高于背景时进行计数，若存在碎片或伪影则予以排除。
   2. 为设定高于背景信号的客观阈值，从任务栏中选择线工具。窗口将弹出。在信号区域画一条线，但需确保同时包含部分背景区域。
      注：弹出窗口中将显示一条曲线，其中峰值代表高于背景的信号。峰值高度的 25% 值为推荐的阈值。建议测量多个信号区域，以确保正确选择阈值。在选择信号区域时，若选择信号过强的区域，可能导致阈值设置过高，从而忽略中等或较低强度的信号。因此，建议选择背景之上中等到偏低强度的信号区域。过高、过低及准确阈值的示例如 补充文件 4 所示。
   3. 确认设置无误后，点击 确定 和 应用更改，将设置同步至所有其他孔。检查其他孔中阈值是否准确选定。
5. 设定好细胞计数和 RFP 阈值后，导出数据。选择目标酶标板。在下拉菜单中，可选择多个参数进行导出。相关参数可能包括细胞计数、RFP 面积以及 "面积/细胞"，后者是用于组间比较的指标。点击下拉菜单旁的 Excel 按钮，将数据直接导出至电子表格。
   注：在下拉菜单中，现在可单独选择并导出细胞计数、RFP 信号总面积（反映钙化面积）以及每细胞 RFP 信号总面积的归一化比值，并将其以每细胞 RFP 信号总面积的比值形式展示结果（例如柱状图）。使用非配对 Student t 检验比较两组，或使用非配对 ANOVA 同时比较多个组。若比较同一组在不同时间点的数据，可能需要采用配对统计分析方法。

结果

结果包括经HOECHST染色的细胞核原始图像、RFP标记的钙化图像以及明场图像。可检测并分析从低（图2）到高（图3）不同阶段的钙化。通常可在光学显微镜下观察到黑色斑点状的钙化区域（图2D 和 图3B，箭头指示钙化），这些图像适用于初步评估以及确定成像起始时间。为提高信噪比，应分析经处理的RFP图像以定量钙化程度（图2F 和 图3D，箭头指示钙化）。最终，数据可呈现为柱状图，比较同一时间点下两种或多种条件，并附代表性图像（图4A、B、C）。数据应以细胞数量归一化后展示（例如，每细胞的钙化面积）。数据也可呈现为时间序列图，显示同一条件在不同时间点的变化（...

讨论

在本文中，我们描述了一种半自动化的实验方法 体外 钙化测定。该方法中，人血管平滑肌细胞（hVSMC）钙化的三个关键步骤需要优化。首先，细胞密度对hVSMC钙化的发展至关重要。hVSMC密度过低将导致钙化缓慢或无法发生，并在钙化条件下因细胞间接触不足及应激而引发细胞死亡。²¹高细胞密度会导致过度汇合，随后细胞进入衰老状态²² 钙化发展停止。在用于后续钙化发展的培养板中，接种时细胞汇合度应控制在约70%，以确保人血管平滑肌细胞（hVSMCs）的增殖能力和细胞间连接。

其次，用于诱导钙化的细胞培养基需要优化。在血管钙化研究中，已有多种不同的条件和培养基成分被报道可用于诱导人血管平滑肌细胞（hVSMCs）钙化。^23,24我们认为该方法适用于检测各种类型的 体外介导的钙化，已用于检测钙、磷酸盐或钙-磷酸盐诱导的沉积物。无论采用何种钙化诱导方式，钙...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钙，93%，无水	Thermo Fisher Scientific	349615000
Costar 6孔透明TC处理培养板	Corning	3516
Cytation 3 系统	BioTek, Abcoude, 荷兰
胎牛血清	Merck	F7524-100ML
Fetuin-A-Alexa Fluor-546	实验室自制
Gen5 软件 v3.10	BioTek
Gibco Medium 199	Thermo Fisher Scientific	11150059
Hoechst 33342，三盐酸盐	Thermo Fisher Scientific	H3570
PBS (10X)，pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	70011044
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红	Thermo Fisher Scientific	25300062