心血管疾病是全球范围内的首要死因。血管钙化在心血管疾病的发病率和死亡率负担中起着重要作用。本方案描述了一种简单的方法，用于定量分析血管平滑肌细胞介导的钙沉淀 体外 通过荧光成像。
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方法文章
一种半自动化且可重复的基于生物学方法定量钙沉积的技术 体外
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
血管钙化涉及一系列退行性病理过程，包括炎症、细胞表型改变、细胞死亡以及钙化抑制因子的缺失，这些因素共同导致血管弹性和功能的丧失。血管钙化在多种疾病中是导致发病和死亡的重要因素，包括慢性肾病、糖尿病和动脉粥样硬化。目前用于研究血管钙化的模型存在局限性，仅适用于钙化晚期阶段的研究。 体内. 体外 用于研究血管钙化的工具通常依赖终点测量，这增加了对生物材料的需求，并可能给科研带来变异性风险。我们展示了新型荧光标记探针的应用，该探针可特异性结合 体外 人血管平滑肌细胞的钙化进展，并确定其钙化的实时发展过程 体外 钙化。在本方案中，我们描述了新开发的钙化检测方法的应用，这是一种在疾病建模中具有潜在转化应用价值的新工具。我们预计该检测方法在更广泛的矿物质沉积研究领域具有相关性，包括骨、软骨或牙科研究中的应用。
引言
血管钙化（VC）是心血管疾病发病率和死亡率的独立危险因素1,2,3。过去长期认为VC是一种异位矿物质沉积的被动化学过程，但现在发现其更像是一种可调控的组织修复反应，涉及多种细胞的主动参与，其中活化的血管平滑肌细胞（hVSMC）是推动该疾病发展的关键因素4,5。体内血管钙化可通过多层螺旋CT扫描进行检测，以评估动脉粥样硬化负荷6,7,8。目前，研究范式正在发生转变，血管钙化的严重程度逐渐被认可为心血管疾病、II型糖尿病、慢性肾病以及衰老等多种病理状态中的重要风险因素9,10,11,12,
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方案
1. 细胞接种、培养与成骨诱导
- 培养原代细胞时，应使用超净工作台、手套和无菌器械。操作前后均需对手部和工作区域进行消毒。除非有明确证据表明无害，否则应将所有原代细胞和培养基视为潜在生物危害物。建议在丢弃前对多余的细胞和培养基进行高压灭菌处理。不得先化学灭活再进行高压灭菌，以免释放有毒气体。
- 将人血管平滑肌细胞接种于未包被的细胞培养板上。
- 常规使用生长培养基培养人血管平滑肌细胞（hVSMC），培养基成分为添加10%-20%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（Pen/Strep）的M199培养基，于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2.
- 当细胞融合度达到70%–90%时进行传代。
- 传代时，用 PBS 将人血管平滑肌细胞（hVSMCs）洗涤 2 次。加入胰蛋白酶，于 37 °C 孵育 2–5 分钟。在显微镜下观察细胞是否脱落。
- 通过加入含血清的培养基终止胰蛋白酶反应。将细胞在350 x g条件下离心 g 孵育4分钟，将沉淀重悬于维持培养基中。人血管平滑肌细胞采用1:2传代方案。
- 开始钙化实验时，按照传代培养的说明处理细胞（步骤 1.4.1）。重悬后计数细胞，并以每孔 10–15 × 10⁵ 的密度接种至 48 孔板中。3 细胞/厘米²2接种....
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结果
结果包括经HOECHST染色的细胞核原始图像、RFP标记的钙化图像以及明场图像。可检测并分析从低（图2）到高（图3）不同阶段的钙化。通常可在光学显微镜下观察到黑色斑点状的钙化区域（图2D 和 图3B，箭头指示钙化），这些图像适用于初步评估以及确定成像起始时间。为提高信噪比，应分析经处理的RFP图像以定量钙化程度（图2F 和 图3D，箭头指示钙化）。最终，数据可呈现为柱状图，比较同一时间点下两种或多种条件，并附代表性图像（图4A、B、C）。数据应以细胞数量归一化后展示（例如，每细胞的钙化面积）。数据也可呈现为时间序列图，显示同一条件在不同时间点的变化（.......
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讨论
在本文中，我们描述了一种半自动化的实验方法 体外 钙化测定。该方法中，人血管平滑肌细胞（hVSMC）钙化的三个关键步骤需要优化。首先，细胞密度对hVSMC钙化的发展至关重要。hVSMC密度过低将导致钙化缓慢或无法发生，并在钙化条件下因细胞间接触不足及应激而引发细胞死亡。21高细胞密度会导致过度汇合，随后细胞进入衰老状态22 钙化发展停止。在用于后续钙化发展的培养板中，接种时细胞汇合度应控制在约70%，以确保人血管平滑肌细胞（hVSMCs）的增殖能力和细胞间连接。
其次，用于诱导钙化的细胞培养基需要优化。在血管钙化研究中，已有多种不同的条件和培养基成分被报道可用于诱导人血管平滑肌细胞（hVSMCs）钙化。23,24我们认为该方法适用于检测各种类型的 体外介导的钙化，已用于检测钙、磷酸盐或钙-磷酸盐诱导的沉积物。无论采用何种钙化诱导方式，钙.......
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披露
Leon Schurgers 收到了来自拜耳（Bayer）、勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）、NattoPharma 和 IDS 的机构资助。Leon Schurgers 持有 Coagulation Profile 的股份。Willi Jahnen-Dechent 是 CALCISCON AG 的联合创始人及股东。
致谢
本研究由欧盟“地平线2020”研究与创新计划根据玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议第722609号和764474号，以及荷兰科学研究组织ZonMw（MKMD 40-42600-98-13007）资助。本研究得到BioSPX的支持。WJ-D获得德国研究基金会（DFG，德国研究基金会）TRR219项目（项目编号322900939）和项目编号403041552的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化钙，93%，无水 | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6孔透明TC处理培养板 | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 系统 | BioTek, Abcoude, 荷兰 | ||
| 胎牛血清 | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | 实验室自制 | ||
| Gen5 软件 v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342，三盐酸盐 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X)，pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红 | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
参考文献
- Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American Colleg....
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