Summary
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache. Gefäßverkalkungen tragen wesentlich zur Belastung durch kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität bei. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Quantifizierung der durch vaskuläre glatte Muskelzellen vermittelten Kalziumfällung in vitro durch fluoreszierende Bildgebung.
Abstract
Gefäßverkalkung beinhaltet eine Reihe von degenerativen Pathologien, einschließlich Entzündungen, Veränderungen des zellulären Phänotyps, Zelltod und das Fehlen von Verkalkungsinhibitoren, die gleichzeitig zu einem Verlust der Gefäßelastizität und -funktion führen. Gefäßverkalkung ist ein wichtiger Faktor für Morbidität und Mortalität in vielen Pathologien, einschließlich chronischer Nierenerkrankungen, Diabetes mellitus und Atherosklerose. Aktuelle Forschungsmodelle zur Untersuchung der Gefäßverkalkung sind begrenzt und nur in den späten Stadien der Verkalkungsentwicklung in vivo realisierbar. In-vitro-Werkzeuge zur Untersuchung von Gefäßverkalkungen verwenden Endpunktmessungen, was die Anforderungen an biologisches Material erhöht und die Einführung von Variabilität in Forschungsstudien riskiert. Wir demonstrieren die Anwendung einer neuartigen fluoreszenzmarkierten Sonde, die an die In-vitro-Verkalkungsentwicklung an menschliche vaskuläre glatte Muskelzellen bindet und die Echtzeitentwicklung der In-vitro-Verkalkung bestimmt. In diesem Protokoll beschreiben wir die Anwendung unseres neu entwickelten Verkalkungsassays, eines neuartigen Werkzeugs in der Krankheitsmodellierung, das potenzielle translationale Anwendungen hat. Wir gehen davon aus, dass dieser Assay in einem breiteren Spektrum der Mineralablagerungsforschung relevant ist, einschließlich Anwendungen in der Knochen-, Knorpel- oder Zahnforschung.
Introduction
Vaskuläre Verkalkung (VC) ist ein unabhängiger Risikofaktor für kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität 1,2,3. Lange Zeit als passiver chemischer Prozess der ektopischen Mineralablagerung betrachtet, erscheint es nun als modifizierbare Gewebeheilungsreaktion, die den aktiven Beitrag verschiedener Zellen einschließlich aktivierter vaskulärer glatter Muskelzellen (hVSMC) als Treiber der Krankheit beinhaltet 4,5. Im lebenden Organismus VC kann durch Multislice-CT-Scans als Beurteilung der atherosklerotischen Belastung gemessen werden 6,7,8. Derzeit ist ein Paradigmenwechsel im Gange, bei dem der Schweregrad von VC als Risikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-II-Diabetes, chronische Nierenerkrankungen und das Altern anerkannt wird 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMCs sind der häufigste Zelltyp im Herz-Kreislauf-System und ein Hauptakteur bei der Entwicklung von VC. In-vitro-hVSMC-induzierte Verkalkung ist ein weit verbreitetes Krankheitsmodell zur Untersuchung kardiovaskulärer Erkrankungen16,17. Die meisten Protokolle zum Nachweis von In-vitro-Verkalkung verwenden jedoch Endpunktmessungen, die die Datenerfassung einschränken, eine stärkere Verwendung von Zellmaterial erfordern und die Forschung verlangsamen können. Gängige Methoden zum Nachweis von in vitro hVSMC-Verkalkung umfassen den o-Cresolphthalein-Assay, der die solubilisierte Calciumablagerung gegen das Gesamtprotein misst und eine Zelllyse erfordert18. Außerdem wird Alizarin-Rot-Färbung verwendet, die direkt an Kalziumablagerungen auf festen Zellen oder Gewebe bindet19. Um die hVSMC-Verkalkung im Laufe der Zeit mit o-Cresolphthalein oder Alizarinrot zu untersuchen, sind Chargen von Replikaten pro Zeitpunkt erforderlich, was den Bedarf an biologischem Material erhöht und damit die Wahrscheinlichkeit einer Variabilität erhöht.
In diesem Artikel beschreiben wir die Methode für die Anwendung eines neuartigen Assays, der hVSMCs mit einer fluoreszierenden Bildgebungssonde verwendet, um die In-vitro-VC-Progression zu bestimmen und als singulärer Verkalkungsassay im Endstadium zu fungieren. Wir haben bereits gezeigt, dass dieser Assay direkt mit den o-Cresolphthalein- und Alizarin-Rot-Methoden vergleichbar ist und zur Unterscheidung zwischen unterschiedlichen Kulturbedingungen verwendet werden kann20. Zusätzlich zu Echtzeitmessungen kann dieser Assay verwendet werden, um die Neigung von Serum- oder Plasmaproben als Surrogatmarker für die klinische VC-Entwicklung zu bestimmen20. Dies wird bei der Anwendung biologischer Strategien der kardiovaskulären Wissenschaften und der Krankheitsmodellierung helfen. Eine weitere Anwendung des Assays kann als translationales BioHybrid-System zur Beurteilung des Schweregrads oder der Progression von VC aus Blutbestandteilen wie Serum oder Plasma erfolgen.
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Protocol
1. Zellaussaat, -erhaltung und -induktion
- Verwenden Sie für die Kultivierung von Primärzellen einen Laminar-Airflow-Schrank, Handschuhe und sterile Geräte. Desinfizieren Sie Hände und Arbeitsbereich vor und nach der Durchführung von Arbeiten. Behandeln Sie alle Primärzellen und Kulturmedien als potenzielle biologische Gefahr, sofern nicht das Gegenteil bewiesen wird. Vorzugsweise überschüssige Zellen und Medien vor der Entsorgung autoklavieren. Nicht chemisch inaktivieren und autoklavieren, da dadurch giftige Dämpfe freigesetzt werden.
- Kultur hVSMC auf unbeschichteten Zellkulturplatten.
- Routinemäßig hVSMC in Wachstumsmedium bestehend aus M199-Medium, ergänzt mit 10% -20% FBS und 1% Pen/Streptokokken, aufrechterhalten und bei 37 °C und 5%CO2 inkubieren.
- Teilen Sie die Zellen nach 70% -90% Konfluenz.
- Zum Teilen waschen Sie die hVSMCs 2x mit PBS. Trypsin zugeben und 2-5 min bei 37 °C inkubieren. Überprüfen Sie, ob sich Zellen unter dem Mikroskop ablösen.
- Hemmen Sie die Trypsinreaktion durch Zugabe von serumhaltigem Medium. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 x g für 4 min und resuspendieren Sie das Pellet im Erhaltungsmedium. hVSMCs folgen einem 1:2-Splitting-Schema.
- Um das Verkalkungsexperiment zu starten, bereiten Sie die Zellen gemäß den Anweisungen für eine Spaltung vor (Schritt 1.4.1). Nach der Resuspension zählen Sie die Zellen und säen sie in eine 48-Well-Platte mit einer Dichte von 10-15 x 103 Zellen / cm2. Säen Sie die Zellen aus und vermeiden Sie die Verwendung der äußeren Vertiefungen, wie in der ergänzenden Abbildung 1 empfohlen.
- Lassen Sie die Zellen anhaften und erholen Sie sich für 24 h (über Nacht), während sie bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert werden.
- Waschen Sie die Zellen vorsichtig 2x mit PBS und saugen Sie alle verbleibenden PBS nach dem 2. Waschgang vorsichtig an.
- Kalzifikationsmedium vorsichtig zugeben und bei 37 °C und 5%CO2 weiter inkubieren. Das Verkalkungsmedium muss einen Verkalkungsreiz, fluoreszenzmarkierten Fetuin-A (z. B. mit rot fluoreszierendem Protein [RFP]) (1 μg/ml) und HOECHST 33342 (0,1 μg/ml) Kernfärbung oder eine ähnliche lebende fluoreszierende Kernfärbung enthalten. Verwenden Sie DAPI nicht, da dies nicht durchlässig ist.
- Überprüfen Sie täglich mit einem Lichtmikroskop, bis eine Verkalkung auftritt.
HINWEIS: Hinweise zur Zellkultur und Wartung von hVMSCs finden Sie in Supplemental File 1.
2. Abgrenzung von Verkalkungen durch Bildgebung
HINWEIS: Das folgende Protokoll enthält die allgemeinen Schritte zur Vorbereitung, Bildgebung und Datenanalyse. Screenshots, die die Anweisungen für jeden Schritt mit einer automatisierten Bildgebungsplattform und der entsprechenden Bildanalysesoftware unterstützen (siehe Materialverzeichnis für Details), sind in Supplemental File 2 und Supplemental File 3 enthalten. Andere bildgebende Instrumente und Bildverarbeitungswerkzeuge können verwendet werden, um dieses Protokoll anzuwenden. Eine wiederholte Bildgebung an derselben Stelle in jedem Bohrloch ist jedoch entscheidend für eine aussagekräftige Datenerfassung. Die Erstellung eines Protokolls zur Bildverkalkung und Wiederverwendung bei jedem Bildgebungsschritt ist notwendig, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Wenn Sie die Methode zum ersten Mal anwenden, führen Sie die folgenden Schritte aus, um sich vor der Bildgebung vorzubereiten.
- Protokoll-Setup
- Öffnen Sie die Software, und wählen Sie dann Protokolle und Neu erstellen aus.
- Wählen Sie Verfahren und klicken Sie auf Temperatur einstellen. Stellen Sie im Popup-Fenster die Temperatur auf 37 °C und den Farbverlauf auf 1 °C ein und klicken Sie auf OK. Wählen Sie den gewünschten Plattentyp aus dem Dropdown-Menü aus. Fügen Sie den Imaging-Schritt hinzu, indem Sie auf Image klicken. Wählen Sie den invertierten Imager aus und klicken Sie auf OK.
- Fügen Sie drei Bildkanäle hinzu und stellen Sie sie auf DAPI (377, 447 nm), RFP (531, 593 nm) und Hellfeld ein. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Montage und legen Sie die gewünschte Anzahl und Position der Bilder fest. 2 x 2 für eine 48-Well-Platte ist eine häufige Wahl. Ändern Sie die Überlappung, um eine bessere Abdeckung jedes Bohrlochs darzustellen. Wählen Sie aus, welche Vertiefungen abgebildet werden sollen. Es öffnet sich ein neues Fenster, in dem die interessierenden Brunnen ausgewählt werden können.
- Klicken Sie auf Fokusoptionen, um den Fokusmodus festzulegen. Es öffnet sich ein neues Fenster. Stellen Sie jeden Kanal einzeln ein. Im Allgemeinen werden Wells automatisch auf den "DAPI"-Kanal fokussiert. Stellen Sie alle anderen Kanäle auf Festbrennweite vom ersten Kanal ein und legen Sie sie fest, indem Sie auf OK klicken. Schließen Sie das Fenster.
- Starten Sie die voreingestellten Datenreduktionsschritte, indem Sie auf Datenreduktion klicken und Bildvorverarbeitung auswählen. Das Einrichten dieses Schritts reduziert den Fluoreszenzhintergrund. Übernehmen Sie die Standardeinstellungen, indem Sie OK auswählen. Es wird ein neuer Satz von Bildern mit dem Präfix "TSF" erstellt. Die Originalbilder bleiben erhalten.
- Richten Sie einen Schritt zum Zählen der Zellen ein, indem Sie Zellanalyse auswählen. Wählen Sie TSF DAPI-Images aus dem Dropdown-Menü Channel aus. Stellen Sie weitere Details ein, nachdem die Bildgebung durchgeführt wurde. Dieser Schritt kann auch als Datenreduktion betrachtet werden; Stellen Sie immer sicher, dass Sie die Originalbilder behalten.
- Bereiten Sie die Analyse des RFP-Signals (Verkalkung) vor, indem Sie Statistik auswählen. Kennzeichnen Sie im Popup-Fenster Step und wählen Sie TSF RFP als Eingangskanal aus. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Oberer Wert und Unterer Wert. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für Gesamtfläche in der unteren Liste. Wählen Sie in der Spalte Farbeffekt die Option Keine aus. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Benutzerdefiniert und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Hintergrund. Dadurch werden die Ergebnisse zur einfachen Beurteilung von niedrig bis hoch farblich gekennzeichnet. Drücken Sie OK.
- Für eine faire Anzeige normalisieren Sie das RFP-Signal pro Zelle. Dabei wird eine Gesamtfläche pro Zelle aufgeteilt. Um diesen Schritt einzurichten, drücken Sie Ratio auf der linken Seite. Wählen Sie im Popup-Fenster für die Dateneingabe 1 RFP-Quantifizierung: Gesamtfläche aus dem Dropdown-Menü aus. Wählen Sie außerdem Cell Count als Dateneingabe 2 aus.
- Wählen Sie abschließend einen neuen Datensatznamen aus und drücken Sie erneut OK und OK. Wählen Sie Farbeffekt wie zuvor beschrieben. Wählen Sie in der oberen linken Ecke Datei aus, und speichern Sie die Datei als Protokoll (Dateityp .prt).
- Täglich nach der ersten Verkalkung
- Wiederholen Sie diese Schritte für jeden Zeitpunkt. Klicken Sie in der Startsoftware auf Jetzt lesen und Vorhandenes Protokoll.... Wählen Sie das Protokoll aus, das im vorherigen Schritt erstellt wurde. Das Programm fordert Sie auf, das Experiment zu speichern. Dies kann in diesem Schritt, aber auch bei jedem späteren Schritt manuell erfolgen, indem Sie oben links auf die Schaltfläche Speichern klicken.
- Ein Popup-Fenster fordert Sie auf, zu warten, bis sich das System erwärmt hat. Schalten Sie den CO2 Gasregler ein und stellen Sie ihn auf 5%.
- Sobald das System die eingestellte Temperatur erreicht hat, wird eine Aufforderung angezeigt, eine Platte einzulegen und zu lesen. Drücken Sie Abbrechen. Dies liegt daran, dass für jeden Zeitpunkt die Belichtung jedes Fluorochroms individuell angepasst werden muss.
- Transportieren Sie die Platte vom Inkubator zum Imager in einem Safe, der gegen Brechen und Verschütten schützt und den lokalen Biosicherheitsvorschriften für den Transport lebender Zellen im Falle eines Unfalls entspricht. Legen Sie die Platte in das Plattenlesegerät.
- Klicken Sie nach dem Abbruch auf Verfahren. Wählen Sie im Popup-Fenster Pre-Set Imaging Step (Voreingestellter Imaging-Schritt) aus. Passen Sie zuerst den Fokus und die Belichtung auf dem DAPI-Kanal an. Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Automatische Belichtung auf allen Kanälen. Klicken Sie dann auf das Mikroskopsymbol neben dem DAPI-Kanal . Es öffnet sich ein neues Fenster.
- Wählen Sie den Brunnen aus, auf den Sie sich konzentrieren möchten. Verwenden Sie für diesen Schritt einen Brunnen mit mittlerer bis hoher Verkalkung. Wenn bereits ein Signal sichtbar ist, klicken Sie zuerst auf Autofokus und dann auf Autobelichtung. Wenn nicht, erhöhen Sie zuerst die Belichtung und wiederholen Sie Autofokus und Autobelichtung. Falls gewünscht, kann die Belichtung manuell angepasst werden, indem Sie das Dropdown-Menü Belichtung auswählen. Überprüfen Sie die Einstellungen für mehrere Bohrlöcher. Wenn Sie zufrieden sind, speichern Sie die Einstellungen.
- Stellen Sie die Belichtung für alle Kanäle auf die gleiche Weise ein.
VORSICHT: Konzentrieren Sie sich nicht auf andere Kanäle; Passen Sie nur die Belichtung an. Die Fokusebene sollte für alle Kanäle gleich sein. - Schließen Sie das Prozedurfenster. Wählen Sie die grüne Schaltfläche Jetzt lesen in der oberen Taskleiste aus. Speichern Sie das Experiment wie von der Software angegeben.
HINWEIS: Die Software liest nun automatisch alle ausgewählten Wells in den ausgewählten Einstellungen.
3. Datenanalyse
HINWEIS: Detaillierte Screenshots zur Durchführung der Datenanalyse mit einer automatisierten Bildgebungsplattform und einer entsprechenden Bildanalysesoftware (siehe Materialverzeichnis für Details) finden Sie in Zusatzdatei 4. Wenn Sie alternative Bildgebungsinstrumente oder Analysesoftware verwenden, sollten die Bilder exportiert und stapelweise verarbeitet werden, wobei sicherzustellen ist, dass die Belichtung, die Fluoreszenzschwelle oder die Intensität für alle Bilder in einem Vergleichsdatensatz gleichermaßen angepasst werden.
- Während das System die Platte liest, werden alle Bilder automatisch im Hintergrund verarbeitet. Passen Sie die Einstellungen für die Zellanzahl an, indem Sie die anzuzeigenden TSF-DAPI-Bilder auswählen. Wählen Sie den Brunnen Ihrer Wahl durch Doppelklick aus. Es öffnet sich ein neues Fenster. Wählen Sie eines der Bilder aus.
- Wählen Sie die Registerkarte Analyse aus. Wählen Sie im Popup-Fenster Zellanalyse: Zellanzahl aus. Klicken Sie auf OK. Deaktivieren Sie die RFP- und Hellfeldkanäle. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Objekte hervorheben .
- Klicken Sie auf Optionen , um das Menü zu öffnen. Passen Sie den Größen- und Intensitätsschwellenwert so an, dass er alle Kerne einschließt, aber Trümmer ausschließt. Klicken Sie auf OK. Klicken Sie unten links auf Änderungen übernehmen , um die Einstellungen auch auf alle anderen Bilder zu übertragen.
- Wählen Sie auf ähnliche Weise wie zuvor eine Vertiefung und ein Bild mit mittlerer bis hoher Verkalkung aus, um das Signal-Rausch-Verhältnis am besten einzustellen. Klicken Sie im Aufgabenmenü auf die Registerkarte Analyse .
- Wählen Sie diesmal Bildstatistik. Deaktivieren Sie den DAPI- und Hellfeldkanal. Klicken Sie auf Optionen , um das Menü zu öffnen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Schwellenwertausreißer. Passen Sie die oberen und unteren Werte des Schwellenwerts an. Zählen Sie das Signal nur, wenn es sich über dem Hintergrund befindet, und schließen Sie es aus, wenn Trümmer / Artefakte vorhanden sind.
- Um einen nicht subjektiven Schwellenwert für das Signal über dem Hintergrund festzulegen, wählen Sie das Linienwerkzeug aus der Taskleiste aus. Es öffnet sich ein Fenster. Zeichnen Sie eine Linie durch ein Signalfeld, aber stellen Sie sicher, dass Sie auch einen Hintergrundbereich einschließen.
HINWEIS: Im Popup-Fenster wird ein Diagramm angezeigt, das eine Spitze zeigt, die das Signal über der Hintergrundlinie darstellt. Der Spitzenhöhenwert von 25 % stellt den empfohlenen Schwellenwert dar. Es wird auch empfohlen, mehrere Signalfelder zu messen, um die Auswahl des richtigen Schwellenwerts sicherzustellen. Bei der Auswahl von Signalfeldern kann die Auswahl von Regionen mit sehr hoher Signalstärke zu einem Schwellenwert führen, der mittlere und/oder niedrigere Signale vernachlässigt. Es wird daher empfohlen, Patches mit mittlerem bis niedrigem Signal über dem Hintergrund auszuwählen. Beispiele für zu hohe, zu niedrige und genaue Schwellenwerte sind in der Zusatzdatei 4 aufgeführt. - Wenn Sie zufrieden sind, klicken Sie auf OK und Änderungen übernehmen , um die Einstellungen auf alle anderen Wells zu übertragen. Überprüfen Sie, ob der Schwellenwert in den anderen Vertiefungen genau ausgewählt ist.
- Sobald die Zellzahl und die RFP-Schwellenwerte festgelegt sind, exportieren Sie die Daten. Wählen Sie die gewünschte Platte aus. Im Dropdown-Menü können mehrere Parameter für den Export ausgewählt werden. Von Relevanz könnten die Zellanzahl, der RFP-Bereich und die "Fläche / Zelle" sein, die Metrik, die für den Vergleich zwischen Gruppen verwendet wird. Klicken Sie auf die Excel-Schaltfläche neben dem Dropdown-Menü, um die Daten direkt in eine Tabelle zu exportieren.
HINWEIS: Im Dropdown-Menü können die berechneten Werte für die Zellanzahl, die Gesamtfläche des RFP-Signals (die den Bereich der Verkalkung widerspiegelt) sowie das normalisierte Verhältnis der Gesamtfläche des RFP-Signals pro Zelle nun einzeln ausgewählt und in eine Tabelle exportiert werden. Zeigen Sie die Ergebnisse als Verhältnis der Gesamtfläche des RFP-Signals pro Zelle an und visualisieren Sie sie (z. B. Balkendiagramme). Wenden Sie einen ungepaarten Student's t-Test an, um zwei Gruppen zu vergleichen, oder eine ungepaarte ANOVA, um verschiedene Gruppen zum gleichen Zeitpunkt zu vergleichen. Der Vergleich derselben Gruppe zu verschiedenen Zeitpunkten erfordert möglicherweise eine gepaarte statistische Analyse.
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Representative Results
Das Ergebnis umfasst Originalbilder von HOECHST-gefärbten Kernen, RFP-markierter Verkalkung und Hellfeldbildern. Verschiedene Verkalkungsstadien von niedrig (Abbildung 2) bis hoch (Abbildung 3) können erkannt und analysiert werden. Verkalkungen können normalerweise als schwarze Sprenkel mittels Lichtmikroskopie erkannt werden (Abbildung 2D und Abbildung 3B, Pfeile zeigen Verkalkung an), die für die primäre Beurteilung und zur Bestimmung des Zeitpunkts für den Beginn der Bildgebung nützlich sind. Für ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis sollten die verarbeiteten RFP-Bilder analysiert werden, um die Verkalkung zu quantifizieren (Abbildung 2F und Abbildung 3D, Pfeile zeigen Verkalkung an). Schließlich können die Daten als Balkendiagramm dargestellt werden, das zwei oder mehr Bedingungen zu einem Zeitpunkt vergleicht, begleitet von repräsentativen Bildern (Abbildung 4A, B, C). Die Daten sollten normalisiert auf Zellzahl angezeigt werden (z. B. als Verkalkungsfläche pro Zelle). Daten können auch als Zeitreihendaten angezeigt werden, die den gleichen Zustand zu verschiedenen Zeitpunkten zeigen (Abbildung 4D).
Abbildung 1: Visuelle Zusammenfassung der Schritte zur halbautomatischen Verkalkungserkennung und -analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Beispiel für eine Verkalkung im Frühstadium. (A) Das Overlay-Bild kann als (B) separate DAPI (Kerne), (C) RFP (Verkalkung) und (D) Hellfeldbilder angezeigt und analysiert werden. (E) Kerne werden von der Software identifiziert und können als gelbe Kreise hervorgehoben werden, um die Einstellungen anzupassen. (F) Für die Analyse des RFP-Signals werden Bilder vorverarbeitet, um das Hintergrundsignal zu reduzieren, und (G) anschließend kann ein Schwellenwert eingestellt werden, um das Signal zu messen. Pfeile zeigen Verkalkung im (D) Hellfeld und (F & G) transformierten RFP-Bildern an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Beispiel für eine Verkalkung im späteren Stadium . (A) Das Overlay-Bild kann als separate (B) Hellfeld-, (C) RFP- (Verkalkung) und (E) DAPI-Bilder (Kerne) angezeigt und analysiert werden. (D) Für die Analyse des RFP-Signals werden Bilder vorverarbeitet, um das Hintergrundsignal zu reduzieren. Pfeile zeigen Verkalkung in den (B) Hellfeld- und (D) transformierten RFP-Bildern an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentativer Vergleich zwischen niedriger und hoher Verkalkung von hVSMC nach 14 Tagen in Kultur mit Verkalkungsmedium. In der Regel können Daten als Balkendiagramm angezeigt und mit dem ungepaarten Student's t-Test analysiert werden. Repräsentative Bilder von (A) geringer Verkalkung und (B) hoher Verkalkung. Das rote Signal (RFP) zeigt die Verkalkung an, und das blaue Signal (HOECHST) zeigt Kerne an. (C) Verkalkung dargestellt als fetuin A-RFP positives Signal (Gesamtfläche) pro Zelle. (D) Beispiel für einen über die Zeit gemessenen Verkalkungstest. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Beispiel einer Reihe von Vertiefungen, die für ein Verkalkungsexperiment mit hVSMCs verwendet werden. Der äußere Ring der Vertiefungen wird nicht für das Verkalkungsexperiment verwendet, sondern mit Flüssigkeit gefüllt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Zusatzdatei 1: Hinweise zur Zellkultur und Pflege von hVMSC. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 2: Automatisiertes Imaging-Protokoll. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 3: Bildanalyseprotokoll. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 4: Datenanalyseprotokoll. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
In diesem Manuskript beschreiben wir eine halbautomatische Methode zur in vitro Verkalkungsbestimmung. Für diese Methode sollten drei kritische Schritte der hVSMC-Verkalkung optimiert werden. Erstens ist die Zelldichte entscheidend für die Entwicklung der hVSMC-Verkalkung. Niedrige Dichten von hVSMCs führen zu langsamer oder keiner Verkalkung und Zelltod aufgrund des fehlenden Zell-zu-Zell-Kontakts und des Stresses, der unter kalzifizierenden Bedingungen induziert wird21. Hohe Zelldichten führen zu einer Überkonfluenz, wonach die Zellen seneszierendwerden 22 und die Verkalkungsentwicklung stoppt. Es ist wichtig, etwa 70% Konfluenz in der Bohrlochplatte zu säen, die für die anschließende Verkalkungsentwicklung verwendet wird, um die Proliferationskapazität und die zellulären Verbindungen von hVSMCs sicherzustellen.
Zweitens müssen die Zellkulturmedien, die für die Verkalkungsinduktion verwendet werden, optimiert werden. Im Rahmen der Gefäßverkalkungsforschung wurde eine Vielzahl von Zuständen und Medienzusammensetzungen berichtet, um hVSMCs23,24 zu verkalken. Wir glauben, dass die Methode geeignet ist, um alle Arten von in vitro-vermittelter Verkalkung nachzuweisen, und sie wurde verwendet, um Kalzium-, Phosphat- oder Calciumphosphat-stimulierte Ablagerungen nachzuweisen. Unabhängig vom Modus der Verkalkungsinduktion ist die Optimierung der kalzifizierenden Medien entscheidend. Im vorgestellten Protokoll haben wir die Kalzinkinduktion optimiert, indem wir M199 mit einer Gesamtcalciumkonzentration von 4,5 mM Ca2+ mit 2,5% FBS verwendet haben.
Schließlich wurden lokale Unterschiede in den Platten während der Verkalkung beobachtet. Es ist wichtig, technische Replikate nach dem Zufallsprinzip zu laden, um Stichprobenverzerrungen zu vermeiden. Darüber hinaus sollte eine Belastung der äußeren Bohrgassen vermieden werden, da diese Bohrlöcher in der 48-Well-Einstellung immer schneller verkalken. Dies wird möglicherweise durch die Dysregulation der Intraplattenfeuchtigkeit verursacht, wobei der Verzicht auf die äußersten Bohrlöcher und das Laden dieser Vertiefungen mit großen Flüssigkeitsmengen zur Kontrolle beiträgt.
Während der Kalzifizierungsassay selbst mehrere Optimierungsschritte erfordern kann, um die Reproduzierbarkeit mit einem bestimmten Aufbau sicherzustellen, wird dies nach der Inbetriebnahme einfach. Kalzifizierungsassays können gleichzeitig und wiederholt unter etablierten Bedingungen durchgeführt werden, ohne dass weitere Optimierungen erforderlich sind. hVSMC-vermittelte Verkalkung kann eine Herausforderung darstellen und Experimente erfordern, bevor die Robustheit der Assays erreicht ist. Ein Forscher sollte in der Lage sein, den optimalen Zeitpunkt zu bestimmen, bevor er mit der regulären Bildgebung beginnt, die bis zu 1 Woche dauern kann. Ein fester Bildgebungsplan kann von Beginn des Experiments an erstellt werden, obwohl dies viele Bilder ohne differentielle Auslesungen erzeugen kann, eine relativ große Menge an Datenspeicher für Bilder verwendet und zeitaufwendig in der Analyse sein kann.
Das in diesem Protokoll beschriebene Verfahren ist eine Möglichkeit, die Analyse des Verkalkungstests durchzuführen. Für andere Zwecke sollte das Verfahren entsprechend angepasst werden. Unsere Analyse mit der referenzierten automatisierten Bildgebungsplattform gewährleistet die Reproduzierbarkeit, obwohl die Analyse mit jeder lebenden Zelle und einem temperatur- und CO 2-gesteuerten Bildgebungsgerät durchgeführt werden kann. Darüber hinaus sind die entsprechenden kommerziellen Softwarepakete für High-Content-Zell-Screening und -Analyse optimiert, ideal geeignet für die Messung der Verkalkungsneigung im Zeitverlauf. Auch andere Softwarelösungen, wie die Freeware ImageJ, können Bildanalysen liefern und die Verkalkungsentwicklung quantifizieren.
Die Bildgebung von Verkalkungsplatten im Spätstadium kann aufgrund von Problemen mit dem Autofokus schwierig sein, wenn die Kultur auf schwimmende Trümmer trifft, was zu einer reduzierten Anzahl scharfer Bilder und Replikate führt. Die Bildanalyse sollte entsprechend angepasst werden, und in der in diesem Protokoll verwendeten Software wurden einige Lösungen entwickelt, um die Analyse zu verbessern und zu vereinfachen.
Zelluläre Heterogenität spielt eine entscheidende Rolle bei der Quantifizierung von Verkalkungen in vitro. In dieser Plattform verwenden wir hVSMCs als Biosensoren für die Entwicklung von Verkalkungen. Primäre hVSMCs stammen von verschiedenen Spendern mit unterschiedlichen zugrunde liegenden vaskulären Pathologien; Daher unterliegt dieser Assay aufgrund der Heterogenität der VSMC-Chargen immer noch einer hohen Variabilität. Eine mögliche Lösung ist die Verwendung von immortalisierten Zelllinien oder die Verwendung von hVSMCs, die aus pluripotenten Stammzellen gewonnen werden.
Eine weitere Einschränkung ist, dass die Quantifizierungsmethode immer noch empfindlich auf Subjektivität reagiert. Subjektivität in Kalzifizierungsassays entsteht durch Endpunktassays, die bis vor kurzem nur verfügbar waren. Die Forscher müssen entscheiden, wann das Experiment gestoppt und die Verkalkung gemessen werden soll, was die Subjektivität des Assays erhöht. Wir glauben, dass die in diesem Manuskript vorgestellte Methode überlegen ist, da wir über die Zeit messen und die Verkalkungsentwicklung in einem bestimmten Zeitraum vergleichen können. In diesem Zusammenhang muss die Beleuchtungseinstellung für jeden Zeitpunkt separat angepasst werden, da das Signal im Laufe der Zeit abnimmt. Aus diesem Grund wird die Menge des in einem Bild dargestellten Signals immer noch von der Meinung eines Individuums beeinflusst. Es ist entscheidend, dass die Beleuchtung mit den höchsten Signal-Rausch-Verhältnissen durchgeführt wird, damit die Analyse nach dem Bild so objektiv wie möglich durchgeführt werden kann.
Obwohl wir die Subjektivität dieses Assays als Einschränkung betrachten, glauben wir, dass er anderen In-vitro-Verkalkungsmethoden überlegen ist. Im Gegensatz zu den bisherigen Methoden hat unser halbautomatischer Kalzifizierungstest den Vorteil, dass Bilder anonym analysiert werden können und somit eine unabhängige verblindete Meinung abgegeben wird. Darüber hinaus können die Bilder zu einem späteren Zeitpunkt mit den gleichen definierten Einstellungen über einen Datensatz hinweg analysiert werden, wodurch die Subjektivität reduziert wird.
Die derzeitigen Methoden der Verkalkungsbestimmung beruhen auf Endpunktmessungen oder es fehlt die vaskuläre Komponente25,26,27. Innerhalb der Klinik sind Werkzeuge wie Computertomographie, intravaskulärer Ultraschall und Magnetresonanztomographie teuer und belastend für die Patienten. Die Biomarkerforschung hat ihre Verwendung nachgewiesen, spiegelt aber nicht die Kalzifizierungslast der Patienten wider. Wir glauben, dass dieser halbautomatische Assay nicht nur einen einzigen Biomarker verwendet, sondern eine Sammlung zirkulierender Komponenten, die den kardiovaskulären Status eines Patienten widerspiegeln. Damit kann als Biosensor eine Verkalkungsreaktion gemessen werden. Mögliche weitere Anwendungen der beschriebenen Methode umfassen das Serumscreening von Patienten auf die in vitro Verkalkungsentwicklung als Surrogatmarker für die personalisierte Entwicklung von Gefäßverkalkungen. Die Plattform hat ihre Sensibilität für Dialyse- und Vitamin-K-Behandlungen sowie für metabolische und nicht-metabolische Erkrankungen unter Beweis gestellt, die mit Patienten mit schlechtem kardiovaskulärem Status und schlechter Prognose in Verbindung gebrachtwerden 20. Da das Prinzip des Assays auf dem Nachweis von Kalziumkristallen basiert, vermuten wir, dass es auch in anderen Forschungsbereichen relevant sein könnte, in denen Mineralisierung von Bedeutung sein könnte, wie Osteoarthritis, Osteoporose, knochenregenerative Medizin oder zahnmedizinische Forschung.
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Disclosures
Leon Schurgers erhielt institutionelle Zuschüsse von Bayer, Boehringer Ingelheim, NattoPharma und IDS. Leon Schurgers besitzt Anteile an Coagulation Profile. Willi Jahnen-Dechent ist Mitgründer und Aktionär der CALCISCON AG.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch die Forschungs- und Innovationsprogramme Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie Sklodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung Nr. 722609 und 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007), finanziert. Diese Forschung wurde von BioSPX unterstützt. WJ-D erhielt Förderung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR219-Projekt-ID 322900939 und Projekt-ID 403041552
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
References
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